CN101456797A - 具有抗癌活性的核桃素及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种具有抗癌活性的核桃素及其制备方法和应用。核桃素为二芳基庚烷类化合物，具有C₂₀H₂₄O₄的分子式，化学结构式用式(I)表示。通过体内外药理活性研究表明该化合物具有较强的抗癌活性，可望开发以核桃素为原料的抗癌新药。

Description

具有抗癌活性的核桃素及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种具有抗癌活性的核桃素及其制备方法和应用。

背景技术

胡桃科核桃属(Juglans L.)植物，全世界约18种，主要分布于北温带，我国有5种，其枝、叶、外果皮、根皮、坚果内核及果仁可入药。核桃对泌尿系统结石、慢性气管炎、皮炎、湿疹及痢疾等疾病疗效很高；核桃及核桃楸的未成熟果实或外果皮(青龙衣)具有清热、解毒、止痢、明目的功效；该属植物普遍具有抗菌、抗肿瘤、镇痛和清除自由基等药理活性。

国内外研究表明截至目前从核桃属植物中分离得到50多种化合物，其中萘醌及其苷类、二芳基庚烷及其苷类化合物具有较强的抗癌及抗氧化活性。

发明内容

本发明的目的在于提供一种具有抗癌活性的新化合物核桃素和该化合物的制备方法和应用。。

我们首次从核桃青皮中提取分离的二芳基庚烷类新化合物核桃素，具有抗癌活性。

一种具有抗癌活性的核桃素，其特征在于核桃素为二芳基庚烷类化合物，具有C₂₀H₂₄O₄的分子式，化学结构式用式(I)表示

本发明提供的化合物核桃素的化学结构经过UV、IR、¹HNMR、¹³CNMR、DEPT、COSY、HMQC、HMBC、HR-ESIMS、X-ray等现代光谱及波谱技术的鉴定得到确认并具有以下理化常数和谱学特征：

C₂₀H₂₄O₄，无色结晶，M.P.182-183℃，

(0.5，MeOH)；HR-ESIMS：m/z＝346.2049[M+NH₄]⁺，C₂₀H2₈O₄N的计算值为346.2018；UV(MeOH)._max(Log)nm256(3.96)，286(3.85)，298(3.81)；IR(KBr)_maxcm^-1：3382，2931，1619，1595，1503，1412；CD(.c＝0.0005，MeOH)Δ(nm)：+33.0(206)，+16.0(225)，-40.3(238)，-43.9(252)，-7.9(272)，-38.0(297)。¹H NMR谱和¹³C NMR谱数据如下：¹H NMR(400MHz，CDCl₃，ppm)：6.75(1H，s，H-5)，2.88(1H，dd，J＝2.0，14.8Hz，H-7a)，2.46(1H，dd，J＝2.0，14.8Hz，H-7b)，1.93(1H，m，H-8a)，1.65(1H，m，H-8b)，1.80(1H，m，H-9a)，1.43(1H，m，H-9b)，1.77(1H，m，H-10a)，1.54(1H，m，H-10b)，4.00(1H，brt，J＝2.8，9.8Hz，H-11)，2.22(1H，dd J＝2.8，13.8Hz，H-12a)，1.70(1H，dd，J＝2.8，13.8Hz，H-12b)，2.91(1H，dd，J＝2.4，17.7Hz，H-13a)，2.80(1H，dd，J＝2.4，17.7Hz)，7.02(1H，dd，J＝7.2，2.4Hz，H-15)，6.82(1H，d，J＝7.2Hz，H-16)，7.21(1H，d，J＝2.4Hz，H-18)，6.77(1H，s，H-19)，3.83(3H，s，CH₃O-4)。¹³C NMR(100MHz，CDCl₃，ppm)：125.5(C-1)，125.6(C-2)，140.2(C-3)，148.0(C-4)，111.2(C-5)，130.9(C-6)，30.0(C-7)，26.4(C-8)，22.7(C-9)，39.5(C-10)，67.3(C-11)，34.5(C-12)，26.5(C-13)，130.8(C-14)，129.4(C-15)，116.2(C-16)，151.4(C-17)，133.6(C-18)，125.4(C-19)，55.6(CH3O-4)。

X单晶衍射数据：晶体呈无色透明块状晶体，衍射实验用晶体大小为0.20×0.40×0.50mm，属正交晶系，空间群为P2₁2₁2₁，晶胞参数：

。晶胞体积

，晶胞内分子数Z＝4。

本发明的核桃素的制备方法，其特征在于包含原料采集加工、浸膏提取、分离纯化三个步骤：

A、原料采集加工：采集核桃青皮或核桃枝叶，干燥，粉碎；

B、浸膏提取步骤：采用70—95％(V/V)乙醇对原料冷浸或回流热提得总浸膏；

C、分离纯化步骤：总浸膏用水混悬，依次用石油醚，乙酸乙酯，正丁醇进行液液分配萃取得到F_A、F_B、F_C三个组分；F_B组分用石油醚和丙酮以不同体积比例混和组成的溶剂，按极性从小到大，梯度洗脱，进行普通硅胶柱色谱分离，收集极性在6:1的组分F_B2；F_B2以石油醚和丙酮按体积比4:1混和溶剂重新进行柱色谱分离得核桃素粗品，以石油醚和丙酮按体积比2:1组成的混和溶剂重结晶得到核桃素。

一种含有抗癌活性的核桃素的注射剂的制备方法，其特征在于核桃素为二芳基庚烷类化合物，具有C₂₀H₂₄O₄的分子式，化学结构式用式(I)表示

该方法按以下步骤进行：

A、核桃素溶解在乙醇中，机械搅拌下加入氢氧化钠或者氢氧化钾溶液使成盐，待盐类析出后过滤，无水乙醇洗涤，干燥得到核桃素的盐类化合物；

B、核桃素的盐类化合物溶解在注射溶媒中形成溶液，调节溶液的pH值，使其在4.5—9范围内，加入活性炭搅拌脱色，过滤，灌封，高压灭菌。

本发明通过体外、体内的药理实验表明核桃素具有较强的抗癌活性。

本发明的优点在于：

1、从核桃青皮中提取分离到具有抗癌活性的化合物核桃素。

2、按本发明提供的制备方法，提取分离制备核桃素，工艺简单，方法可靠，产率高，化合物纯度好。

3、按本发明提供的制备方法，制备核桃素的注射剂，方法简单，制剂稳定，便于临床使用。

附图说明

图1为式I化合物核桃素的分子晶体结构立体图。

图2为式I化合物核桃素分子沿a轴方向的晶胞堆积图

具体实施方式

为了更清楚地理解本发明，以下结合实施例对本发明作进一步的说明，但本发明不限于以下实施例。

实施例1：核桃青皮中核桃素的提取分离

A、原料采集加工步骤：采集核桃青皮适量，阴干，适当粉碎。

B、浸膏提取步骤：取核桃青皮5kg，加入8倍量95％乙醇，冷浸(7d×3)，过滤，减压回收溶剂得总浸膏200g。

C、分离步骤：将200g浸膏浑悬于1000ml水中，用300ml石油醚(60-90℃)萃取3次，回收溶剂的浸膏F_A20g，剩余物用300ml乙酸乙酯萃取3次，回收溶剂得浸膏F_B30g，剩余物用300ml正丁醇萃取3次得浸膏F_D40g。将乙酸乙酯F_B部分浸膏用30g硅胶(100-200目)拌样，600g硅胶(200-300目)上普通玻璃层析柱，石油醚(60-90℃)：丙酮(10:1-2:1)进行梯度洗脱，500ml为一流份，回收溶剂，用薄层色谱在紫外灯(UV)下或喷以5％的硫酸乙醇溶液，加热显色后合并相同组分，得F_B1(4g，10:1)、F_B2(5g，6∶1)、F_B3(3g，2:1)、三个组分。组分F_B2用5g硅胶(100-200目)拌样，40g硅胶(200-300目)上普通玻璃层析柱，石油醚(60-90℃)：丙酮(4:1)洗脱，用薄层色谱在紫外灯(UV)下或喷以5％的硫酸乙醇溶液，加热显色后合并相同组分得核桃素25mg。

实施例2：核桃青皮中核桃素的提取分离

A、原料采集加工步骤：采集核桃青皮适量，阴干，适当粉碎。

B、浸膏提取步骤：取核桃青皮5kg，加入10倍量95％乙醇，回流热提(2h×3)，过滤，减压回收溶剂得总浸膏250g。

C、分离步骤：将250g浸膏浑悬于1000ml水中，用300ml石油醚(60-90℃)萃取3次，回收溶剂的浸膏30g。将浸膏用40g硅胶(100-200目)拌样，400g硅胶(200-300目)上普通玻璃层析柱，石油醚(60-90℃)：丙酮(10:1-2:1)进行梯度洗脱，500ml为一流份，回收溶剂，用薄层色谱在紫外灯(UV)下或喷以5％的硫酸乙醇溶液，加热显色后合并相同组分，得F1(5g，10:1)、F2(10g，8:1)、F3(7g，6:1)、F4(20g，2:1)四个组分。组分F3用5g硅胶(100-200目)拌样，40g硅胶(200-300目)上普通玻璃层析柱，石油醚(60-90℃)：丙酮(6:1)洗脱，用薄层色谱在紫外灯(UV)下或喷以5％的硫酸乙醇溶液，加热显色后合并相同组分得核桃素30mg。

实施例3：核桃素对人肝癌细胞HepG₂和人肝癌细胞BEL—7402的体外细胞毒作用

A、制备人肝癌细胞株HepG₂和人肝癌细胞BEL—7402的悬液：0.25％胰蛋白酶消化，用培养液配成8×10⁴个细胞/ml细胞悬液；接种细胞：每孔

Ｌ接种于96孔板中；

B、预培养：37℃，5％CO₂及饱和湿度下培养24h；

C、将药物核桃素：按0.2、0.4、0.6、1.2、1.6、2.0mol/ml浓度加药，每孔100L，每个浓度设三个复孔。37℃，5％CO₂及饱和湿度下继续培养24h；

D、24h后，取出培养板，每孔加入50％(质量/体积)的三氯乙酸(TCA)50L固定细胞，TCA的终浓度为10％，加在每孔液面上，在4℃冰箱中放置1h；培养板各孔用去离子水洗涤5次，去除TCA，在空气中干燥后，每孔加0.4％的SRB100L，室温下放置10～30min，弃去各孔内液体后用1％乙酸洗涤5次，去除未结合的染料，空气中干燥后用pH为10.5，10mmol/L三羟甲基胺基甲烷溶解，在平板振荡器上振荡5min，在酶联免疫检测仪490nm波长下测定OD值，用空白对照调零，将所获肿瘤细胞生长抑制率定义为药物对肿瘤细胞的体外抑制率。测定药物核桃素C对人肝癌细胞株HepG₂和人肝癌细胞BEL—7402的IC₅₀分别为：0.025mol/ml和

mol/ml。

实施例4：核桃素的二钠盐及其注射剂的制备

A、500mg核桃素加热溶解在100ml　95％乙醇中，机械搅拌下点滴加入4％的氢氧化钠溶液3ml，搅拌。

B、待核桃素的钠盐析出白色固体后，抽滤，无水乙醇20ml洗涤3次，干燥后即得产物539mg，产率95％。

C、核桃素二钠盐240mg，溶解在10ml的生理盐水中，用4％的氢氧化钠溶液调节pH准确测定在8.9，加入含量在0.2％的活性碳，搅拌脱色，抽滤，灌封，高压灭菌。

实施例5：核桃素对小鼠S180肉瘤体内抑瘤活性

A、S180带瘤动物的移植和接种：取传代接种后9-10d龄S180荷瘤小鼠，无菌抽取小鼠腹腔内瘤细胞，置于冰水浴，用冰冷的生理盐水(含100U/ml青霉素和100mg/L链霉素)将抽取的S180细胞浓度调至1.0×10⁷个/ml。在小鼠右前肢腋窝皮下注射0.2ml冷却的细胞悬液，细胞总数为2.0×10⁶个/只。

B、分组及给药：将接种了S180的小鼠按体重随机分为5组，每组16只，即模型对照组、HT低剂量组、HT中剂量组、HT高剂量组。另设空白对照组，空白对照组不接种肿瘤细胞，每日ip.生理盐水；模型对照组，每日ip.生理盐水；低、中、高剂量组，每日分别以15mg/kg、30mg/kg、60mg/kg的剂量ip.核桃素二钠盐注射剂；阳性对照组，每2日i.p.环磷酰胺(CTX)一次，剂量为30mg/kg。连续给药12天，第13天全部小鼠颈椎脱臼处死，取瘤块称重，按下式计算抑瘤率：抑瘤率(％)＝(模型对照组平均瘤重-给药组平均瘤重)/模型对照组平均瘤重×100％。

C、结果经统计分析，核桃素二钠盐对S180肉瘤的抑瘤率分别为：高剂量组66.1％，中剂量组45.7％，低剂量组19.5％。该结果表明核桃素C对小鼠S180肉瘤有一定的抑制作用，对S180荷瘤小鼠的体重增长、肝指数、肾指数、胸腺指数、脾脏指数均没有明显影响。

Claims (3)

1、一种具有抗癌活性的核桃素，其特征在于核桃素为二芳基庚烷类化合物，具有C₂₀H₂₄O₄的分子式，化学结构式用式(I)表示

2、如权利要求1所述核桃素的制备方法，其特征在于包含原料采集加工、浸膏提取、分离纯化三个步骤：

A、原料采集加工：采集核桃青皮或核桃枝叶，干燥，粉碎；

B、浸膏提取步骤：采用70—95％(V/V)乙醇对原料冷浸或回流热提得总浸膏；

C、分离纯化步骤：总浸膏用水混悬，依次用石油醚，乙酸乙酯，正丁醇进行液液分配萃取得到F_A、F_B、F_C三个组分；F_B组分用石油醚和丙酮以不同体积比例混和组成的溶剂，按极性从小到大，梯度洗脱，进行普通硅胶柱色谱分离，收集极性在6:1的组分F_B2；F_B2以石油醚和丙酮按体积比4:1混和溶剂重新进行柱色谱分离得核桃素粗品，以石油醚和丙酮按体积比2:1组成的混和溶剂重结晶得到核桃素。

3、一种含有抗癌活性的核桃素的注射剂的制备方法，其特征在于核桃素为二芳基庚烷类化合物，具有C₂₀H₂₄O₄的分子式，化学结构式用式(I)表示

                               (I)

该方法按以下步骤进行：

A、核桃素溶解在乙醇中，机械搅拌下加入氢氧化钠或者氢氧化钾溶液使成盐，待盐类析出后过滤，无水乙醇洗涤，干燥得到核桃素的盐类化合物；

B、核桃素的盐类化合物溶解在注射溶媒中形成溶液，调节溶液的pH值，使其在4.5—9范围内，加入活性炭搅拌脱色，过滤，灌封，高压灭菌。

Images