CN103893191B

CN103893191B - 甾体化合物在制备抗肿瘤化疗药物增效剂中的应用

Info

Publication number: CN103893191B
Application number: CN201210570767.9A
Authority: CN
Inventors: 胡英杰; 沈小玲; 符林春; 艾香英; 田汝华; 朱瑞静; 戴琳玲; 张艳平
Original assignee: INST OF TROPICAL MEDICINE GUANGZHOU CHINESE MEDICINE COLLEGE
Current assignee: INST OF TROPICAL MEDICINE GUANGZHOU CHINESE MEDICINE COLLEGE
Priority date: 2012-12-25
Filing date: 2012-12-25
Publication date: 2020-02-28
Anticipated expiration: 2032-12-25
Also published as: CN103893191A

Abstract

本发明公开了甾体化合物在制备抗肿瘤化疗药物增效剂中的应用。通过在细胞模型和荷瘤裸鼠模型水平的药理学研究，以紫杉醇作为抗癌药的代表药物，发现了具有通光散苷元乙化学结构骨架的甾体衍生物具有显著的体内、体外增效抗癌药的作用，可作为研制结构明确、疗效显著的癌症化疗药增效剂的原料药。

Description

甾体化合物在制备抗肿瘤化疗药物增效剂中的应用

技术领域

本发明涉及一类化合物的新应用，特别涉及具有通光散苷元乙化学结构骨架特征的甾体衍生物在制备抗肿瘤化疗药物增效剂中的应用。

背景技术

化疗药物在恶性肿瘤的治疗中发挥着重要的作用，但源自肿瘤化疗药物化学结构所产生的毒副作用与耐药性问题难以解决。一方面，多数化疗药物都有不同程度的毒副作用，在抑制肿瘤的同时也对正常的人体细胞有不同程度的杀伤作用；另一方面，肿瘤细胞对药物的耐药性（drug resistance）是取得理想疗效的巨大障碍，恶性肿瘤化疗失败的主要原因是肿瘤细胞本身就存在的或在化疗中产生的耐药作用。

药物的联合运用是在实验与临床治疗肿瘤中实现“增效减毒”的主要途径。选择两种或两种作用机制不同的抗肿瘤药合用以获得协同作用，减少耐药性，提高疗效。例如治疗乳腺癌、卵巢癌和非小细胞肺癌时，采用微管类化疗药物多西他赛与一些其他类型的抗肿瘤药如长春瑞滨、环磷酰胺、依托泊苷、氟尿嘧啶联用。联用时还要必须考虑尽可能使各药的毒性不重复和叠加，因为毒性的叠加对机体会造成更加严重的损害。因此真正“高效低毒”的肿瘤化疗药物联用方案十分有限。由此设想：常规化疗药与某些无细胞毒或低细胞毒的药物配伍，如果能增强抗肿瘤疗效，或能降低化疗药物毒性，或者既增效又减毒，或许就能实现通过配伍达到肿瘤治疗的理想境界。

有研究发现甾体抗炎药地塞米松可以增效肿瘤化疗药物的作用。体内实验表明，地塞米松可增加卡铂和吉西他滨的抗癌活性，减少对荷乳腺癌瘤裸鼠的毒性；并增强阿霉素的治疗效果，作用机理与调节肿瘤相关细胞因子的表达、增强阿霉素引起的细胞凋亡、抑制阿霉素引起的NF-κB活化等因素有关（见文献：Wang H,et al.IntJOncol.2007,30:947-53）。Phenoxodiol是一种人工合成的染料木黄酮（genistein）的结构修饰产物，可通过抑制拓扑异构酶II活性对癌细胞造成生长抑制，还可竞争性结合雌激素受体表现出雌激素拮抗作用，从而促进癌细胞对卡铂、紫杉醇和吉西他滨的敏感性，诱导细胞凋亡。针对复发性卵巢癌，已被美国食品药品管理局(FDA)批准为紫杉醇与顺铂的化疗增效剂候选新药进入临床研究（见文献：Silasi DA,et al.Expert Opin Pharmacother2009,10:1059-1067）。在肿瘤药物的使用和研发中“增效减毒”是不可或缺的理念；是医学、药学工作者和癌症患者共同追求的理想。研制结构明确、疗效卓著的肿瘤药物增效剂新药则是实现理想的途径之一，但迄今天然来源的肿瘤化疗药物增效剂尚无研制成为商品药物的实例。

通光散(Marsdenia Tenacissima)是萝藦科牛奶菜属药用植物，在我国云南、贵州等省有分布，具有清热解毒等功效，民间用于治疗支气管炎、癌症等症（见文献：江苏新医学院.中药大辞典.下册,p1976，上海:科学技术出版社,1977）。通光散的水溶性提取物是用于制造中成药“消癌平注射液”的原料药，以绿原酸作为定量质控指标；消癌平注射液可用于食道癌、胃癌、肺癌等的治疗和放、化疗的辅助治疗[见文献：中华人民共和国国家药品监督管理局药品标准WS-10630(ZD-0630)-2002]。其临床应用有较多报道，包括，（1）在治疗晚期食管癌和胃癌时有9.8%的患者可获得完全和部分缓解等；（2）抑制体外培养的人肝癌BeI740细胞、HepG2细胞的生长，并降低人肝癌细胞甲胎蛋白(AFP)的分泌水平；（3）治疗14例晚期胃癌患者，2个疗程的治疗有效率为50%；对腺癌，鳞癌，印戎细胞癌的有效率分别为57.9％，40％和50%，多数患者的临床症状得到缓解（依次见文献：王志良,等.中药通光藤治疗食管癌胃癌的临床观察附112例报告.河南肿瘤学杂志,1995,8:202-203；孙珏,等.“消癌平”对人肝癌细胞治疗作用的实验研究.上海中医药杂志,2000,34:12-14；袁秀英,等.消癌平注射液治疗14例晚期胃癌的临床观察.上海医药,1996,(6):12-13）。

但是，以通光散的单个化学成分（通光散单体成分）为药效物质基础开展抗肿瘤作用与机理研究的研究报道仍然稀缺，究竟有哪些成分拥有经得起重复验证的抗癌作用特别体内抗癌活性，以及放疗、化疗增效活性，一直没有明确结论。通光散化学成分的研究报道始于二十世纪七十年代，迄今已有30多年历史，从不同产地采集的植物样品中分离鉴定的化学成分多达50多个，主要是C21甾体（即：孕甾烷）类化合物及其去氧糖苷。其中以通光散苷元乙(Tenacigenin B)的衍生物数量居多，如17β-Tenacigenin B，11α-Tigloyl-12β-acetyl tenacigenin B，11α,12β-Ditigloyl tenacigenin B，11α-Benzoyl-12β-acetyltenacigenin B，11α-O-2-Methylbutanoyl-12β-O-benzoyl tenacigenin B，通光散新甙A-C(TenacissimosideA-C)，Tenacissoside A-E，Marsdeno-side A-K等。但公开报道的具有抗肿瘤相关活性的通光散苷元乙衍生物很少。文献公开报道了：（1）在细胞水平显示出有细胞毒活性的C21甾体成分，有11α-O-2-Methylbutyryl-12β-O-tigloyl-tenacigenin B、11α-O-2-Methyl-butyryl-12β-O-benzoyl-tenacigenin B和11α-,12β-O,O-Ditigloyl-17β-tenacigenin B，这3个化合物在体外对KB-VI细胞显示细胞毒作用（见文献：Luo SQ,etal.Phytochemistry.1993,34,1615–1620）；未见其他文献报道或验证通光散苷元乙衍生物具有明显或显著的细胞毒作用。（2）本身没有明显细胞毒活性的C21甾体成分，但能提高P-gp介导的多药耐药肿瘤细胞对抗癌药的敏感性，例如从通光散中分离出的Tenacissimoside A和11α-O-benzoyl-12β-O-acetyl-tenacigenin B，这两个化合物在体外对人肝癌细胞HepG2和其多药耐药亚株HepG2/Dox的半数抑制浓度都大于80μg/mL，表明细胞毒作用很弱，但却有显著的增效抗癌药抑制多药耐药细胞HepG2/Dox生长的作用：在20μg/mL浓度水平，Tenacissimoside A能使长春碱、阿霉素、嘌呤霉素和紫杉醇对耐药细胞的药物敏感性提高10、18、11、6倍；而11α-O-benzoyl-12β-O-acetyl-tenacigenin B逆转肿瘤多药耐药的作用更强，相应的数据为54、15.8、15.9和315.2倍；作用机理与干扰P-糖蛋白(P-gp)与底物结合的位点、抑制P-gp对抗癌药的外排有关（见文献：Hu YJ,et al.J NatProd,2008,71:1049-1051；中国发明专利ZL200610037029.2）。

不同肿瘤细胞的耐药性源自不同分子机理。药用植物通光散中是否存在着对肿瘤的临床治疗意义更大、应用范围更加广泛的肿瘤药物增效剂（而不仅仅是P-gp功能抑制剂）也是未知的。文献报道了：（1）“消癌平”注射液对紫杉醇联合顺铂治疗非小细胞肺癌疗效具有一定程度的增效作用：患者给药42天，两种化药组合的有效率为51.7%；两种化药组合再配伍消癌平的有效率为63.0%，略有提高；同时改善了患者的生活质量及NK细胞免疫功能（见文献：王文玉,等.消癌平注射液联合化疗治疗晚期非小细胞肺癌的临床观察.临床肿瘤学杂志2009,14:936-938）；（2）消癌平注射液的氯仿可溶部位，即通光散水提取的氯仿可溶物与抗肿瘤药吉非替尼(Gefitinib)联合给药，能够修复耐药性非小细胞肺癌对吉非替尼的敏感性，揭示了通光散提取物作为肺癌吉非替尼化疗增效剂的可能前景。作者还采用HPLC/MS法检测了提取物的化学成分，认为：色谱峰1、2代表了通光散苷元丙(TenacigeninC)的衍生物3β-O-Pachbiosyl-tenacigenin C及其异构体；色谱峰3代表了通光散苷元甲(Tenacigenin A)的衍生物3β-O-Pachbiosyl-tenacigeninA，也可能是通光散苷元乙的衍生物TenacissimosideA，或Tenacissoside F即Tenacissimoside A，说明该色谱峰代表的分子并未确定。其他峰则认为是包括Tenacissoside A、B、H、I、G在内的10种通光散苷元乙衍生物（见文献：Han SY,et al.Lung Cancer.2012;75:30-37）。需要指出的是：由于通光散中存在分子量相同但结构不同的化合物，在没有用已知化合物进行对照、没有成分分离及其核磁共振波谱分析的情况下，文献中用HPLC/MS法获得的成分组成存在变数；而且未说明测得成分的含量占氯仿可溶物的比例，也没有针对所说的通光散单体成分开展药理研究。

发明内容

本发明的目的在于提供具有通光散苷元乙化学结构骨架特征的甾体衍生物在制备抗肿瘤化疗药物增效剂中的应用。

发明人通过在细胞模型和荷瘤裸鼠模型水平的药理学研究，以紫杉醇作为抗癌药的代表药物，发现了具有通光散苷元乙化学结构骨架的C21甾体衍生物具有显著的体内、体外增效抗癌药的作用，可作为研制结构明确、疗效显著的癌症化疗药增效药物。

具有通光散苷元乙化学结构骨架的C21甾体衍生物的通式为：

式中，粗实线表示为β取代基，虚线表示为α取代基，波纹线表示为α取代基或β取代基；Me为甲基；

取代基X、Y、Z分别独立为羟基、乙酸酯、丙酸酯、异丁酸酯、正丁酸酯、2-甲基丁酸酯、2-甲基丁烯酸酯、正戊酸酯、苯甲酸酯、对甲基苯甲酸酯、对羟基苯甲酸酯、对甲氧基苯甲酸酯、对氨基苯甲酸酯、对甲基氨基苯甲酸酯、对二甲基氨基苯甲酸酯、苯丙烯酸酯、对羟基苯丙烯酸酯、对甲氧基苯丙烯酸酯、对氨基苯丙烯酸酯、对甲基氨基苯丙烯酸酯或对二甲基氨基苯丙烯酸酯；

取代基X还可以独立为：3-O-甲基-6-脱氧-β-D-阿洛吡喃糖基(1-4)-β-D-夹竹桃吡喃糖基、3-O-甲基-6-脱氧-β-D-阿洛吡喃糖基(1-4)-β-D-磁麻吡喃糖基、β-D-葡萄吡喃糖基(1-4)-3-O-甲基-6-脱氧-β-D-阿洛吡喃糖基(1-4)-β-D-夹竹桃吡喃糖基或β-D-葡萄吡喃糖基(1-4)-3-O-甲基-6-脱氧-β-D-阿洛吡喃糖基(1-4)-β-D-磁麻吡喃糖基。

特别的，甾体化合物选自11α-O-Tigloyl-12β-O-acetyl tenacigenin B（M-3）、11α-O-Benzoyl-12β-O-acetyl tenacigenin B（M-4）、11α-O-2-Methyl-butanoyl-12β-O-tigloyl-tenacigenin B（M-5）、通光散新甙A（M-6）、Tenacissoside I（M-7）、Tenacissoside E（M-8）、11α-O-2-Methyl-butanoyl-12β-O-benzoyl-tenacigenin B（M-9）、11α-O-2-Methyl-butanoyl-12β-O-acetyl-tenacigenin B（M-11）、通光散新甙C（M-12）、MarsdenosideA（M-13）、Marsdenoside C（M-14）、3β-O-苯甲酰通光散苷元乙（M-15）和3β,11α,12β-O,O,O-三苯甲酰通光散苷元乙（M-16）。

通过对通光散分离获得的单个的化合物和由通光散苷元乙半合成的单个的酯基衍生物进行体外和体内药效学实验研究，发现并首次公开了具有通光散苷元乙化学结构骨架的C21甾体衍生物可用于制造抗癌药增效药物，同时公开了通光散植物中具有抗癌增效作用的活性分子的化学结构。为肿瘤的临床化疗实现“增效减毒”的理想提供药物新选择，有广泛的应用前景。

上述的甾体化合物，既可以单独使用，也可以由两种或多种混合使用，制备成药物制剂，与抗肿瘤化疗药物共同作用，达到增加抗肿瘤化疗药物疗效的目的。

附图说明

图1是具有通光散苷元乙骨架结构的抗肿瘤化疗药增效剂的结构通式；

图2是通光散提取物ME增强紫杉醇对宫颈癌HeLa实体瘤的生长抑制作用图；

图3是通光散提取物ME增强紫杉醇对口腔上皮癌KB-3-1实体瘤的生长抑制作用图；

图4是通光散单体成分M-3增强紫杉醇对宫颈癌HeLa实体瘤的抑制作用图；

图5是通光散单体成M-3增强紫杉醇对口腔上皮癌KB-3-1实体瘤的抑制作用图；

图6是通光散单体成分M-9、M-11、M-13增强紫杉醇对HeLa实体瘤的抑制作用图。

具体实施方式

具有通光散苷元乙化学结构骨架特征的甾体衍生物（通式如图1所示）的制备和表征可以根据现有技术进行，这些现有技术包括但不限于：

Miyakawa S,et al.Phytochemistry，1986,25:2861-2865；Luo SQ,etal.Phytochemistry，1993,34:1615-1620；Qiu SX,et al.Phytochemistry，1996,41:1385-1388；蒋毅,等.中国医药工业杂志,1996,27:391-395；Chen JJ,et al.Acta BotanicaYunnanica,1999,21:369-377；Deng J,et al.Phytochemistry，2005,66:1040-1051；胡英杰,等.中国发明专利,2009,专利号:ZL200610037029.2。

以下，示例性地说明部分具有通光散苷元乙化学结构骨架特征的甾体衍生物的制备和结构表征。

通光散提取物及其中单体成分M-6、M-7、M-8、M-12、M-13、M-14、M-17的分离和结构鉴定

取通光散藤茎粉碎成粗粉，加80％乙醇回流提取，合并乙醇提取液，减压浓缩至流浸膏，加水使混悬，加石油醚萃取脱脂，水相加乙酸乙酯萃取，分取有机相，减压浓缩，得到乙酸乙酯浸膏，干燥，制成粉末，即得通光散提取物（以代号ME表示）。定性反应试验表明，通光散提取物ME的Liebermann-Burchard反应和Keller-Kiniani反应分别呈污绿色和深紫-蓝色，表示均为阳性，提示富含C21甾体去氧糖苷类化合物。

将通光散提取物ME120g用硅胶（200-300目）进行多次柱层析分离；相继用氯仿:甲醇（100:0-50:50）以及石油醚:丙酮（90:10-10:90）梯度洗脱，得到8个部分，各部分再分别用ODS柱进行烷化硅胶反相柱层析，以甲醇:水（40:60-60:40）梯度洗脱，相继得到M-6、M-7、M-8、M-12、M-13、M-14和M-17，得率0.003%至0.12%。

M-6白色粉末，易溶于氯仿、甲醇、丙酮等有机溶剂，不溶于水，[α]_D ²⁵：-26.3°(CHCl₃；c0.076)；分子式为C₄₂H₆₄O₁₄，ESI-MS:m/z815.2([M+Na]⁺)，¹³C NMR数据见表1。

M-7白色粉末，易溶于氯仿、乙酸乙酯、甲醇、丙酮等有机溶剂，不溶于水，[α]_D ²⁵：-25.3°(CHCl₃；c0.075)；分子式为C₃₅H₅₆O₁₂，ESI-MS:m/z691.3([M+Na]⁺)，¹³CNMR数据见表1。

M-8白色粉末，溶于氯仿、乙酸乙酯、甲醇、丙酮等有机溶剂，不溶于水。[α]_D ²⁵-17.2(CH₃OH；c0.029)，分子式为C₅₃H₇₈O₁₉。¹³C NMR数据见表1。

M-12白色粉末，溶于氯仿、乙酸乙酯、甲醇、丙酮等有机溶剂，不溶于水。分子式为C₄₂H₆₆O₁₄，ESI-MS:m/z817.2([M+Na]⁺)，¹³C NMR数据见表1。

M-13白色粉末，易溶于氯仿、乙酸乙酯、甲醇、丙酮等有机溶剂，不溶于水。分子式为C₄₅H₇₀O₁₄，ESI-MS:m/z857.3([M+Na]⁺)，¹³C NMR数据见表1。

M-14白色无定型粉末，易溶于氯仿、乙酸乙酯、甲醇、丙酮等有机溶剂，不溶于水。分子式为C₄₇H₆₈O₁₄，ESI-MS:m/z879.3([M+Na]⁺)，¹³C NMR数据见表1。

M-17白色粉末，易溶于氯仿、乙酸乙酯、甲醇、丙酮等有机溶剂，不溶于水，[α]_D ²⁵：-13.2°(CHCl₃；c0.136)；分子式为C₃₉H₆₀O₁₄，ESI-MS:m/z775.3([M+Na]⁺)，¹³C NMR数据见表1。

上述化合物的化学结构依次鉴定为通光散新甙A（M-6）、3β-O-Pachbiosyl-tenacigenin B即Tenacissoside I（M-7）、Tenacissoside E（M-8）、通光散新甙C（M-12）、Marsdenoside A（M-13）、Marsdenoside C（M-14）和Marsdenoside E（M-17）。结构鉴定系通过对各化合物测定的核磁共振（1D-,2D-NMR）、质谱(ESI-MS、EI-MS、HR-ESI-MS)等波谱数据进行分析并与文献相对照完成。

表1化合物M-6～M-8、M-12～M-14、M-17的¹³C NMR数据

100MHz,TMS为内标。

通光散单体成分M-3、M-4、M-5、M-9和M-11的制备和结构鉴定

取通光散提取物ME80g，加500ml甲醇和500ml0.05mol/L硫酸水溶液，置80℃水浴加热回流1小时，冷却，加10％碳酸钠溶液中和至pH7，减压蒸去甲醇，加乙酸乙酯萃取3次，取乙酸乙酯溶液，真空浓缩，得到ME酸水解物41.0g。将ME酸水解物用硅胶（200-300目）进行多次柱层析分离；相继用氯仿:甲醇（100:0-50:50）以及石油醚:丙酮（90:10-10:90）梯度洗脱，得到8个部分，各部分再分别用ODS柱进行烷化硅胶反相柱层析，以甲醇:水（40:60-60:40）梯度洗脱，相继得到M-3（276.8mg）、M-4（47.4mg）、M-5（169mg）和M-9(93mg)。

M-3无色针状结晶，易溶于氯仿、乙酸乙酯、甲醇、丙酮等有机溶剂，不溶于水，[α]_D：＋0.5°(CHCl₃；c0.39)。分子式为C₂₈H₄₀O₇，ESI-MS:m/z511.5([M+Na]⁺)，¹³C NMR数据见表2。

M-4白色粉末，易溶于氯仿、乙酸乙酯、甲醇、丙酮等有机溶剂，不溶于水，[α]_D：－5°(CHCl₃；c0.12)。分子式为C₃₀H₃₈O₇，ESI-MS:m/z533.5([M+Na]⁺)，¹³CNMR数据见表2。

M-5无色针状结晶，易溶于氯仿、乙酸乙酯、甲醇、丙酮等有机溶剂，不溶于水。分子式为C₃₁H₄₆O₇，ESI-MS:m/z553.4([M+Na]⁺)，¹³C NMR数据见表2。

M-9白色无定型粉末，易溶于氯仿、乙酸乙酯、甲醇、丙酮等有机溶剂，不溶于水。分子式为C₃₃H₄₄O₇，ESI-MS:m/z575.3([M+Na]⁺)，¹³C NMR数据见表2。

M-11白色粉末，易溶于氯仿、乙酸乙酯、甲醇、丙酮等有机溶剂，不溶于水。分子式为C₂₈H₄₂O₇，ESI-MS:m/z513.1([M+Na]⁺)，¹³C NMR数据见表2。

上述化合物的化学结构依次鉴定为11α-O-Tigloyl-12β-O-acetyl tenacigeninB（M-3）、11α-O-Benzoyl-12β-O-acetyl tenacigenin B（M-4）、11α-O-2-Methyl-butanoyl-12β-O-tigloyl-tenacigenin B（M-5）、11α-O-2-Methyl-butanoyl-12β-O-benzoyl-tenacigenin B（M-9）和11α-O-2-Methyl-butanoyl-12β-O-acetyl-tenacigenin B（M-11）。结构鉴定系通过对各化合物测定的核磁共振、质谱等波谱数据进行分析并与文献相对照完成。

通光散单体成分M-1、M-2、M-10、M-15和M-16的制备和结构鉴定

取通光散提取物ME70g，照实施例2的方法制成ME酸水解物，加400ml0.2mol/L的氢氧化钾甲醇溶液，置80℃水浴加热回流1小时，冷却，加0.5mol/L硫酸水溶液中和至pH7，减压蒸去甲醇，加乙酸乙酯萃取3次，取乙酸乙酯溶液，真空浓缩，得到皂化产物29.8g。将皂化产物用硅胶（200-300目）进行柱层析分离，用石油醚:丙酮（90:10-50:50）梯度洗脱，依次得到M-10(439mg)、M-2(1.5g)和M-1（460mg）。

取210mg的M-2，放入100ml的圆底烧瓶中，加15ml四氢呋喃，待样品完全溶解后，再依次加15ml苯甲酰氯、3ml吡啶，加热回流5h，冷却圆底烧瓶至室温，加100ml乙酸乙酯将反应物溶出至分液漏斗，加5％碳酸钠溶液中和，取乙酸乙酯层，浓缩，与适量硅胶拌样，过硅胶柱（200-300目）分离，石油醚:丙酮(95:5-85:15)洗脱，依次得M-15(30mg)、M-16(35.4mg)。

M-1白色无定型粉末，mp226-230℃，[α]²² _D-6.2°(MeOH；c0.6)，易溶于氯仿、乙酸乙酯、甲醇、丙酮等有机溶剂，不溶于水。分子式为C₂₁H₃₂O₅，ESI-MS:m/z387.2([M+Na]⁺)，¹³CNMR数据见表2。

M-2无色针状结晶，易溶于氯仿、乙酸乙酯、甲醇、丙酮等有机溶剂，不溶于水。mp229-231℃，[α]²² _D-85.7°(MeOH；c0.18)，分子式为C₂₁H₃₂O₅，ESI-MS：m/z387.3([M+Na]⁺)，¹³CNMR数据见表2。

M-10白色针状结晶，mp255-260℃，易溶于氯仿、乙酸乙酯、甲醇、丙酮等有机溶剂，不溶于水。分子式为C₂₁H₃₂O₅，¹³C NMR数据见表2。

化合物M-1与M-2分别鉴定为Tenacigenin B与17β-Tenacigenin B；化合物M-10鉴定为通光散苷元甲（Tenacigenin A）。

M-15为白色粉末，易溶于氯仿、乙酸乙酯、甲醇、丙酮等有机溶剂，不溶于水，其ESI-MS给出m/z491.0([M+Na]⁺)的准分子离子(基峰)，表明分子量应为468，分子式为C₂₈H₃₆O₆，据此推测为3β-O-苯甲酰-通光散苷元乙（3β-O-benzoyl-tenacigenin B）。

M-16为白色粉末，易溶于氯仿、乙酸乙酯、甲醇、丙酮等有机溶剂，不溶于水。ESI-MS:m/z698.9([M+Na]⁺)，说明分子式为C₄₂H₄₄O₈，分子量应为676。¹³CNMR(DEPT)光谱数据显示含有44个碳原子，包括3个甲基，7个亚甲基，21个次甲基和11个季碳，与M-1和M-2数据相比较可以看出是由C21+C7+C7+C7片断构成。¹³CNMR（DEPT）谱中可见：C-20酮基(δ_C211.0)；三个苯甲酰基（δ_C166.2、166.0×2、132.9、132.8、132.7、130.7、129.9、129.0、129.5×4、129.4×2、128.2×2、128.1×4）；8β、14β环氧(δ_C66.9和71.6)。¹H NMR谱中，在δ7～8ppm出现了15个H的信号峰，此为三个苯甲酰基上的氢信号。由此确定为3β,11α,12β-O,O,O-三苯甲酰通光散苷元乙（3β,11α,12β-O,O,O-tribenzoyl-tenacigenin B）。该化合物其余特征信号有δ_H4.892(1H,m,3α-H)，δ_H5.793(1H,t,J＝10.0Hz,11β-H)，δ_H5.360(1H,d,J＝10.0Hz,12α-H)，δ_H3.010(1H,d,J=7.2Hz,17β-H)，δ_H1.213(3H,s,18-CH₃)，δ_H1.201(3H,s,19-CH₃)，δ_H2.268(3H,s,21-CH₃)。其¹³C NMR核磁共振光谱数据见表2。

结构鉴定系通过对各化合物测定的核磁共振、质谱等波谱数据进行分析并与文献相对照完成。

表2化合物M-1～M-5、M-9～M-11和M-16的¹³C NMR数据

100MHz,TMS为内标。

增效实验：

实验一、通光散提取物与单体成分增强紫杉醇抗肿瘤作用的体外试验

1、药物与试剂

工具药紫杉醇(paclitaxel)、MTT及其它化学试剂购自Sigma/Aldrich公司(St.Louis,MO,USA)；高糖DMEM培养基、RPMI1640培养基、胎牛血清(FBS)为GibcoBRL产品(Invitrogen Coporation,USA)。

拟开展药理活性测试的样品：通光散提取物ME，通光散单体成分M-1、M-2、M-3、M-4、M-5、M-6、M-7、M-8、M-9、M-10、M-11、M-12、M-13、M-14、M-15、M-16和M-17。

拟开展药理活性测试的样品中，单体化合物的含量经高效液相色谱(HPLC)法检测，均不小于95%。所用HPLC-UV法检测条件：ODS柱，柱温30℃；流动相为乙腈-水(65-45:35-55)，流速为1mL/min；检测波长为210-280nm；所用HPLC-ELSD法检测条件：ODS柱，柱温30℃；流动相为甲醇-水(65-45:35-55)，流速为1mL/min；漂移管的温度80℃；载气为N₂，载气流速1.9L\min。

表3用于抗癌增效试验的通光散苷元乙衍生物

Pachbiosyl:3-O-甲基-6-脱氧-β-D-阿洛吡喃糖基(1-4)-β-D-夹竹桃吡喃糖基[3-O-Methyl-6-deoxyallopyrano-syl-(1-4)-β-D-oleandropyranosyl]

Tenacitriosyl:β-D-葡萄吡喃糖基(1-4)-3-O-甲基-6-脱氧-β-D-阿洛吡喃糖基(1-4)-β-D-夹竹桃吡喃糖基[β-D-Glucopyranosyl(1-4)-3-O-methyl-6-deoxy-β-D-allopyranosyl(1-4)-β-D-oleandropyranosyl]

2、细胞系与细胞培养

人宫颈癌细胞株HeLa、人肝癌细胞株HepG2以及人鼻咽癌细胞株CNE生长于含10%FBS的RPMI1640培养基中；人口腔上皮癌细胞株KB-3-1生长于含10%FBS的高糖DMEM培养基中；人结直肠腺癌细胞株HCT-15生长于添加了2mM L-谷氨酰胺、1.5g/L碳酸氢钠、4.5gL葡萄糖、10mM HEPES和1.0mM丙酮酸钠的RPMI1640培养基中。置于饱和湿度，含5%二氧化碳的37°C培养箱中培养。

3、细胞增殖抑制试验

3.1药物应用：收集对数生长期的细胞用完全培养液配成每毫升含1×10⁵个细胞的单细胞悬液，按100μL/孔接种于96孔板后置于37°C培养箱中培育24小时使细胞贴壁，再将培养液更换成含不同浓度药物的新鲜培养液，每3孔为一个检测浓度。实验同时设培养液空白对照孔及未加药处理的细胞对照孔。药物与细胞作用48小时，MTT法测定药物细胞毒性。

3.2MTT法测定药物对细胞生长的半数抑制浓度（IC₅₀）：药物作用44小时后取出96孔板，按10μL/孔加入用PBS配制的5mg/mL的MTT溶液，于37°C培养箱中反应4小时。取出培养板，吸去培养基。每孔加入150μL二甲基亚砜，待生成的色素完全溶解后于492nm处测定每孔吸收值A。根据吸收值计算细胞存活率和药物对细胞增殖的半数抑制浓度IC₅₀。细胞存活率（%）=（实验孔A值-空白对照孔A值）/（细胞对照孔A值-空白对照孔A值）×100%，IC₅₀为细胞存活率为50%时的药物浓度。所有试验至少重复三次，最后结果以“平均值±标准差”表示。

4、增效作用效果评价

分别测定紫杉醇单独作用于肿瘤细胞时的IC₅₀(a)值，以及在无毒浓度的通光散提取物或者通光散单体成分存在下紫杉醇对肿瘤细胞的IC₅₀(c)值。比较二者的差值。若IC₅₀(c)<IC₅₀(a)，则说明被测定样品对紫杉醇具有增效作用。

5、实验结果

通光散提取物ME和通光散单体成分M-1~M-21对肿瘤细胞增殖作用的影响以半数抑制浓度IC₅₀表示，结果见表4。

通光散提取物ME或通光散单体成分的存在与否对紫杉醇抑制肿瘤细胞增殖作用的影响，见表5。

表4通光散提取物和单体成分对肿瘤细胞增殖作用的影响（IC₅₀）

表5通光散的提取物和单体成分对紫杉醇抑制肿瘤细胞增殖的影响

结果表明：

（1）对于所试验的宫颈癌、肝癌、鼻咽癌、口腔上皮癌及结直肠腺癌细胞株，一部分通光散单体成分有一定的肿瘤细胞增殖抑制作用即细胞毒活性，它们的IC₅₀≤50μM。这些具有一定细胞毒活性的通光散单体成分的结构往往在11位和12位有酯基取代，多数在3位有糖链取代，糖链中包含了D-2,6-双去氧己醛糖。这类有一定体外抑制肿瘤细胞增殖作用的通光散单体化合物是M-8、M-9、M-12、M-13、M-14、M-16和M-17。

（2）对于所试验的宫颈癌、肝癌、口腔上皮癌、口腔上皮癌及结直肠腺癌细胞株，通光散提取物ME和一些通光散单体成分没有明显的肿瘤细胞增殖抑制作用，或者说其细胞毒活性极弱（IC₅₀≥100μg/mL或IC₅₀≥100μM）。这些无细胞毒活性或低细胞毒活性的通光散单体成分的结构多数在3位没有糖链取代，这些通光散单体化合物是M-1、M-2、M-3、M-4、M-5、M-6、M-7、M-10、M-11和M-15。

（3）因此，在后续的体外抗癌增效试验中，通光散提取物ME，以及低或无细胞毒活性的通光散单体成分的工作浓度分别选定为无毒浓度的10μg/mL和10μM；具有一定细胞毒作用的通光散单体成分，其工作浓度选择为5μM。经试验测定，在选定的工作浓度下，通光散提取物ME和通光散单体成分M-1~M-17对肿瘤细胞增殖的抑制率均小于10%。

（4）表5数据为在无细胞毒浓度的的通光散提取物ME（10μg/mL）或通光散单体成分M-n（10μM、5μM）存在下，紫杉醇对肿瘤细胞增殖的半数抑制浓度IC₅₀（c）。该数值与紫杉醇单独作用于细胞时的IC₅₀(a)值比较可以发现，三种通光散单体M-1、M-2和M-10在10μM浓度时对紫杉醇抗癌作用没有影响；但通光散提取物ME和其它的通光散单体成分在其工作浓度下都显著减小了紫杉醇对细胞增殖的半数抑制浓度，表现出抗癌增效作用。

6、结论

通光散提取物ME和单体成分M-3、M-4、M-5、M-6、M-7、M-8、M-9、M-11、M-12、M-13、M-14、M-15、M-16和M-17能在体外增强紫杉醇对HeLa、HepG2、HCT-15和CNE细胞的增殖抑制作用；但3、11、12位没有酯基或没有糖链取代的通光散苷元乙衍生物M-1、M-2，以及不具备通光散苷元乙化学结构骨架类型的化合物M-10都不能增强紫杉醇对肿瘤细胞的增殖抑制作用。

实验二、通光散提取物ME增强紫杉醇对HeLa实体瘤生长的抑制作用

1.药物和试剂：紫杉醇注射液（30mg,5mL）为施贵宝公司产品。通光散提取物ME用0.5%的羧甲基纤维素钠研磨，配成20mg/mL的混悬液，灭菌备用。

2.动物：BALB/C裸鼠，雌性，4-5周龄，广州中医药大学实验动物中心提供，正常饲养于SPF级实验室适应环境7天后开始接种肿瘤细胞。

3.肿瘤模型建立：胰酶消化法收集对数生长期的HeLa，加PBS洗涤2次、不含血清的RPMI1640洗涤1次，再用不含血清的RPMI1640制成5×10⁷/mL的单细胞悬液，按每只100μL（5×10⁶个细胞）接种于裸鼠背部左侧皮下，建立荷瘤裸鼠模型。

4.分组和治疗：接种12天后，选择肿瘤生长良好的小鼠随机分为溶剂对照组、紫杉醇（10mg/kg）治疗组、紫杉醇(10mg/kg)联合ME(200mg/kg)治疗组、ME(200mg/kg)治疗组。每组7只。分别进行治疗。

给药：将紫杉醇用注射用水稀释成1mg/mL，按小鼠每10g给予100μL行腹腔注射，隔日一次，一共给药5次。ME混悬液在注射紫杉醇前1小时按小鼠每10g体重100μL灌服，每日1次，一共10次。溶剂对照组每天给予等量的空白溶剂。

5.数据观察和分析：每4天记录一次体重和瘤体尺寸。肿瘤体积V=L×W²/2，其中L为长度，W为宽度。结束实验时处死小鼠，剥取瘤体称重。数据表达为平均值±标准变差。数据分析采用ONE-WAY ANOVA法。

6.结果

实验结果如图2所示，图中，

（A）不同治疗组肿瘤生长曲线图；

（B）实验结束时各组肿瘤重量图；

（C）试验过程中小鼠体重变化图；

*：与溶剂对照组比较有显著性差异，P<0.05。

（1）实验过程中溶剂对照组、紫杉醇单独治疗组、紫杉醇联合ME治疗组以及ME单独治疗组的肿瘤体积都持续增长，其中溶剂对照组、紫杉醇单独治疗组和ME单独治疗组增长速度基本一致，但是紫杉醇联合ME治疗组肿瘤体积增长较其他三组缓慢。见图2A。

（2）实验结束时，各组肿瘤体积为：溶剂对照组（1086±220）mm³，紫杉醇组（1153±189）mm³，ME组（1272±284）mm³，联合用药组（782±89）mm³。溶剂对照组、紫杉醇组和ME组肿瘤体积组间差异无统计学意义。紫杉醇联合ME组的肿瘤体积则显著较其余三组为低（P<0.05）。见图2A。

（3）实验结束时剥取肿瘤称重。溶剂对照组瘤重（0.70±0.18）g，紫杉醇治疗组和ME治疗组肿瘤重量分别为（0.73±0.21）g和（0.74±0.27）g，三组间瘤重基本无差异；但是紫杉醇联合ME组肿瘤重量为（0.47±0.20）g，显著小于溶剂对照组、紫杉醇组和ME治疗组（P<0.05）。见图2B。

（4）实验过程中各组小鼠无死亡；各组间小鼠体重差异无统计学意义。说明各种测试药物在所用剂量下具有良好安全性。通光散ME在增加紫杉醇疗效的同时，并未减轻小鼠体重。见图2C。

7.结论：通光散提取物ME可显著增强紫杉醇对HeLa实体瘤生长的抑制作用。

实验三、通光散提取物ME增强紫杉醇对KB-3-1实体瘤的生长抑制作用

1.药物和试剂：同实验二。

2.动物：同实验二。

3.肿瘤模型建立：胰酶消化法收集对数生长期KB-3-1细胞，PBS洗涤2次，不含血清的高糖DMEM洗涤1次，再用不含血清的DMEM制成2×10⁷/mL的细胞悬液，按每只100μL（2×10⁶个细胞）接种于裸鼠背部左侧皮下，建立荷瘤裸鼠模型。

4.分组和治疗：接种肿瘤细胞48小时后，小鼠随机分为溶剂对照组、紫杉醇（10mg/kg）治疗组、紫杉醇(10mg/kg)联合ME(200mg/kg)组、ME(200mg/kg)治疗组。每组8只。分别进行治疗。给药方式：同实验二。

5.数据观察和分析：隔日记录体重和瘤体尺寸，记录死亡情况。肿瘤体积V=L×W²/2，其中L为长度，W为宽度。结束实验时处死小鼠，剥取瘤体称重。数据表达为平均值±标准变差。数据分析采用ONE-WAY ANOVA法。

6.结果

实验结果如图3所示，图中，

（A）不同治疗组肿瘤生长曲线图；

（B）实验结束时各组肿瘤重量图；

（C）试验过程中小鼠体重变化图

**：与溶剂对照组比较有显著性差异，P<0.01

****：与溶剂对照组比较有非常显著的差异，P<0.0001

▲▲▲▲：与紫杉醇治疗组比较有非常显著的差异，P<0.0001。

（1）实验过程中溶剂对照组、紫杉醇单独治疗组和ME单独治疗组肿瘤体积都持续增长，其中溶剂对照组和ME单独治疗组增长速度基本一致，紫杉醇单独治疗组则增长速度较溶剂对照组和ME单独治疗组缓慢。紫杉醇联合ME治疗组肿瘤的体积在整个实验过程中维持缓慢负增长，和其他三组有明显不同。见图3A。

（2）实验结束时，溶剂对照组肿瘤体积为（1778±425）mm³。ME单独治疗组（1999±647）mm³与之无显著性差异，紫杉醇组肿瘤体积（1101±319）mm³显著小于溶剂对照组和ME单独治疗组（P<0.001）。而紫杉醇联合ME治疗组肿瘤体积仅为（48±39）mm³，极其显著地小于紫杉醇单独治疗组（P<0.0001）。

（3）实验结束时剥取肿瘤称重，结果和肿瘤体积一致。溶剂对照组和ME治疗组肿瘤分别重（1.02±0.34）g和（1.21±0.39）g，二者之间差异无统计学意义。紫杉醇治疗组肿瘤重（0.65±0.22）g，显著小于溶剂对照组（P<0.01）而联合用药组肿瘤重仅为（0.01±0.01）g，极其显著地小于紫杉醇单独治疗组（P<0.0001）。见图3B。

（4）实验过程中各组小鼠无死亡；各组间小鼠体重差异无统计学意义。说明各种测试药物在所用剂量下具有良好安全性。通光散ME在增加紫杉醇疗效的同时，并未减轻小鼠体重。见图3C。

7.结论：通光散提取物ME可显著增强紫杉醇对KB-3-1实体瘤生长的抑制作用。

实验四、通光散单体成分M-3增强紫杉醇对HeLa实体瘤生长的抑制作用

1.药物和试剂：紫杉醇注射液（同实验二），M-3用等比混合的无水乙醇-聚氧乙烯醚蓖麻油（Cremophor EL）溶解成100mg/mL的储备液。临用前用水稀释到工作浓度。

2.动物：同实验二。

3.肿瘤模型建立：同实验二。

4.分组和治疗：接种肿瘤细胞12天后，选择肿瘤生长良好的小鼠随机分为溶剂对照组、紫杉醇（10mg/kg）组、M-3（50mg/kg）组以及紫杉醇（10mg/kg）联合M-3（50mg/kg）组，每组6只。分别给予治疗。

给药方式：紫杉醇和M-3分别用水稀释到1mg/mL和5mg/mL的工作浓度，按小鼠每10g体重100μL行腹腔注射。其中紫杉醇（10mg/kg）隔日一次，一共给药5次。M-3(50mg/kg)每日一次，一共给药10次。溶剂对照组每天给予等量空白溶剂。

5.数据观察和分析：同实验二。

6.结果

实验结果如图4所示，图中，

（A）不同治疗组肿瘤体积增长率；

（B）实验结束时各组肿瘤重量；

（C）试验过程中小鼠体重变化图。

*：与溶剂对照组比较有显著性差异，P<0.05；

**：与溶剂对照组比较有显著性差异，P<0.01；

****：与溶剂对照组比较有非常显著的差异，P<0.0001

（1）图4A显示，实验过程中溶剂对照组和M-3治疗组肿瘤体积稳步增长，两组的增长率基本无差异。紫杉醇组肿瘤保持生长但速度则较为缓慢；紫杉醇联合M-3组在治疗过程中体积逐步减小，到药物治疗结束（第10天）时肿瘤生长率已经明显较模型组和M-3组低。更值得关注的是在药物治疗结束后，紫杉醇组小鼠肿瘤体积开始反弹，而紫杉醇联合M-3组肿瘤体积持续减小。

（2）第16天实验结束时，四组肿瘤体积增长率分别为：溶剂对照组（138.2±24.3）%，M-3组（120.2±27.1）%，紫杉醇组（39.9±36.7）%，紫杉醇联合M-3组（-15.6±12.4）%。和溶剂对照组比较，紫杉醇治疗可显著抑制肿瘤生长（P<0.01），但肿瘤依然存在。单独采用50mg/kg/d的M-3治疗则对肿瘤生长基本无影响。当采用M-3与而紫杉醇联合治疗时，肿瘤的生长不仅受到完全的抑制，且肿瘤出现萎缩，联合作用的抑瘤效果显著强于紫杉醇单独使用时的效果（P<0.001）。

（3）图4B所示为实验结束时各组肿瘤重。分别为：溶剂对照组（0.318±0.070）g，M-3组（0.264±0.053）g，紫杉醇组（0.121±0.042）g，紫杉醇联合M-3组（0.001±0.002）g。尤其是紫杉醇联合M-3组有肿瘤消失。M-3对紫杉醇的增效作用十分显著（P<0.001）。

（4）实验过程中各组小鼠无死亡；各组小鼠体重增长趋势一致。说明各种测试药物在所用剂量下具有良好安全性。化合物M-3在治疗剂量无论单用还是联用都对小鼠体重无产生影响。见图4C。

7.结论：M-3可显著增强紫杉醇对HeLa实体瘤生长的抑制作用。

实验五、通光散单体成分M-3增强紫杉醇对KB-3-1实体瘤生长的抑制作用

1.药物：紫杉醇和M-3同实验四。

2.动物：同实验二。

3.肿瘤模型建立：胰酶消化收获对数生长期的KB-3-1细胞，以PBS洗涤两次，不含血清的高糖DMEM培养基洗涤一次。再用不含血清的培养基稀释，配成每毫升含有4×10⁷个细胞的单细胞悬液。取100μL的细胞悬液接种于小鼠背部右侧皮下，建立荷瘤裸鼠模型。

4.分组和治疗：接种肿瘤细胞48小时后，小鼠随机分为溶剂对照组、紫杉醇（10mg/kg）组、M-3（50mg/kg）组以及紫杉醇（10mg/kg）联合M-3（50mg/kg）组，每组6只。分别给予治疗。

给药方式：同实验二。

5.数据观察和分析：同实验二。

6.结果：

实验结果如图5所示，图中：

（A）不同治疗组肿瘤生长曲线；

（B）实验结束时各组肿瘤重量；

（C）试验过程中小鼠体重变化图；

**：与溶剂对照组比较有显著差异，P<0.01；

▲▲：与紫杉醇治疗组比较有显著差异，P<0.01。

（1）实验过程中溶剂对照组、紫杉醇组和M-3组小鼠的肿瘤体积持续增长。其中，溶剂对照组和M-3组肿瘤生长速度基本无差异；紫杉醇组肿瘤保持生长但速度则较为缓慢；而紫杉醇联合M-3组在整个试验期间小鼠的肿瘤体积保持缓慢下降，和其他三组明显不同。见图5A。

（2）实验结束时各组肿瘤体积分别为：溶剂对照组（536.8±144.2）mm³，M-3组（484.5±272.6）mm³，紫杉醇组（185.4±168.1）mm³，紫杉醇联合M-3组（1.9±1.8）mm³。和溶剂对照组比较，M-3治疗组肿瘤体积未见明显减小，紫杉醇治疗组肿瘤体积则显有著降低（P<0.01）；而在紫杉醇联合M-3组，肿瘤的生长则受到了完全的抑制，肿瘤体积显著小于紫杉醇组(P<0.01)。

（3）实验结束时各组肿瘤重：溶剂对照组（0.75±0.23）g，紫杉醇组（0.30±0.30）g，M-3组（0.70±0.30）g，紫杉醇联合M-3组（0.01±0.00）g。与溶剂对照组比较，M-3组肿瘤重量无差异，紫杉醇组的肿瘤显著减轻(P<0.01)；而紫杉醇联合M-3组则见到肿瘤萎缩和消失，与紫杉醇组比较其抑瘤效果十分明显（P<0.01）。见图5B。

（4）实验过程中各组小鼠无死亡；溶剂对照组、紫杉醇组和联合用药组小鼠体重增长趋势一致；仅M-3组体重增长略慢于其它三组，但差异不具备统计学意义。见图5C。

7.结论：连续10天腹腔注射50mg/kg/d的M-3不能抑制KB-3-1肿瘤的生长，连续10天两天一次注射10mg/kg的紫杉醇可显著减慢肿瘤的生长，但不能完全抑制其生长。但M-3与紫杉醇按照上述剂量联用时，肿瘤生长完全受到抑制，甚至出现肿瘤消失。说明M-3（50mg/kg/d）对紫杉醇（10mg/kg/d）有很强的抗肿瘤增效作用。

实验六、通光散单体成分M-9、M-11、M-13增强紫杉醇对HeLa实体瘤生长的抑制作用

1.药物和试剂：紫杉醇注射液同前。通光散单体成分M-9、M-11和M-13分别用等比混合的无水乙醇-聚氧乙烯醚蓖麻油（Cremophor EL）溶解成100mg/mL的储备液。临用前用水稀释到工作浓度。

2.动物：同实验二。

3.肿瘤模型建立：同实验二。

4.分组和治疗：接种肿瘤细胞12天后，选择肿瘤生长良好的小鼠随机分为溶剂对照组、紫杉醇组、M-9组、M-11组、M-13组、紫杉醇联合M-9组、紫杉醇联合M-11组、紫杉醇联合M-13组。每组7只。分别给予治疗。

治疗方式：腹腔注射。其中紫杉醇10mg/kg，两天一次,连续5次；M-9、M-11和M-13剂量为30mg/kg，每天1次，连续10次。

5.数据观察和分析：同实验二。

6.结果

实验结果如图6所示，图中：

（A）不同治疗组肿瘤体积；

（B）实验结束时各组肿瘤重量；

（C）试验过程中小鼠体重变化图；

*：与溶剂对照组比较有显著性差异，P<0.05

***：与溶剂对照组比较有非常显著的差异，P<0.001

▲▲▲：与紫杉醇治疗组比较有非常显著的差异，P<0.001。

（1）见图6A所示，M-9治疗组、M-11治疗组和M-13治疗组肿瘤体积稳步增长，增长趋势和溶剂对照组一致，组间差异不明显；紫杉醇单独治疗组肿瘤体积增长速度较溶剂对照组缓慢；紫杉醇联合M-9组、紫杉醇联合M-11组以及紫杉醇联合M-13组的肿瘤体积增长速度则明显较紫杉醇单独治疗组缓慢，尤其是紫杉醇联合M-11组以及紫杉醇联合M-13组，肿瘤体积出现负增长。

（2）实验结束时，各组肿瘤体积分别为：溶剂对照组（1533±484）mm³，M-9组（1489±684）mm³，M-11组（1450±509）mm³，M-13组（1518±593）mm³，紫杉醇组（1194±222）mm³，紫杉醇联合M-9组（639±420）mm³，紫杉醇联合M-11组（394±310）mm³，紫杉醇联合M-13组（349±157）mm³。与溶剂对照组比较，连续10d腹腔注射30mg/kg/d的M-9或M-11或M-13不能使小鼠肿瘤体积减小，连续5次腹腔注射10mg/kg的紫杉醇（隔日一次）可一定程度地减小肿瘤体积，但与溶剂对照组比较，差异不具备统计学意义。当紫杉醇与M-9联用时，肿瘤体积得以显著降低（与溶剂对照组比较P<0.01）。紫杉醇与M-9或M-13联用效果更加显著，肿瘤体积不仅极其显著地小于溶剂对照组（P<0.001），也显著小于紫杉醇单独治疗组（P<0.001）。

（3）图6B显示，实验结束时各种肿瘤重量分别为：溶剂对照组（1.06±0.27）g，M-9组（1.14±0.29）g，M-11组（1.09±0.32）g，M-13组（1.21±0.36）g，紫杉醇组（0.81±0.15）g，紫杉醇联合M-9组（0.25±0.13）g，紫杉醇联合M-11组（0.21±0.12）g，紫杉醇联合M-13组（0.21±0.18）g。与溶剂对照组比较，M-9、M-11或M-13治疗组瘤重相当，紫杉醇治疗组瘤重明显变轻（P<0.05）；值得注意的是，紫杉醇联合M-9组、紫杉醇联合M-11组以及紫杉醇联合M-13组的瘤重不仅显著轻于溶剂对照组（P<0.001），也显著轻于紫杉醇单独治疗组（P<0.001）。

（4）实验过程中各组小鼠无死亡；M-9，M-11和M-13组体重和溶剂对照组一致。紫杉醇组体重较溶剂对照组略有下降，联合用药组体重和紫杉醇组比较，差异不具备统计学意义。说明M-9，M-11和M-13在所用剂量下对小鼠体重无影响。见图6C。

7.结论：通光散单体成分M-9、M-11、M-13可显著增强紫杉醇对HeLa实体瘤生长的抑制作用。

Claims

1.甾体化合物在制备用于抗肿瘤化疗药物增效剂中的应用，所述甾体化合物选自11α-O-Tigloyl-12β-O-acetyl-tenacigenin B、11α-O-Benzoyl-12β-O-acetyl-tenacigeninB、11α-O-2-Methyl-butanoyl-12β-O-tigloyl-tenacigenin B、通光散新甙A、Tenacissoside I、Tenacissoside E、11α-O-2-Methyl-butanoyl-12β-O-benzoyl-tenacigenin B、11α-O-2-Methyl-butanoyl-12β-O-acetyl-tenacigenin B、通光散新甙C、Marsdenoside A、Marsdenoside C、3β-O-苯甲酰通光散苷元乙和3β,11α,12β-O,O,O-三苯甲酰通光散苷元乙，抗肿瘤化疗药物为紫杉醇，所述肿瘤为人宫颈癌细胞株HeLa、人肝癌细胞株HepG2、人鼻咽癌细胞株CNE、人口腔上皮癌细胞株KB-3-1或人结直肠腺癌细胞株HCT-15。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述甾体化合物单独使用，或由两种或多种混合使用。