CN109608419B - 从青龙衣中提取的二芳基庚烷类化合物及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了四种从青龙衣中提取的二芳基庚烷类新化合物，其具有如式I‑IV所示的结构，并公开了从青龙衣中提取该化合物的方法，以及该化合物在制备治疗肿瘤的药物及保健食品中的应用。

Description

从青龙衣中提取的二芳基庚烷类化合物及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及四种从青龙衣中提取的二芳基庚烷类化合物及其制备方法和在制备治疗肿瘤的药物及保健食品中的应用，属于有机化合物领域。
背景技术
核桃楸(JuglansMandshurica Maxim.)为胡桃科(Juglandaceae)胡桃属植物，其与核桃(Juglansregia L.)的未成熟果实外果皮统称为青龙衣，为我国传统中药，其味甘性温，疗效显著、不良反应少、药用价值高。现代研究表明青龙衣具有良好的消炎、抗菌、抗肿瘤、抗氧化活性。临床上，以青龙衣及其提取物制成的中药复方制剂被广泛用于治疗胃癌、肝癌、消化道癌症等。
青龙衣中化学成分复杂，主要包含黄酮类、萘醌类、二芳基庚烷类、多酚类和萜类等。大部分成分均具有广泛的生物活性，具有良好的研究价值。国内外研究发现，青龙衣中主要成分萘醌类及二芳基庚烷类化合物是其主要抗肿瘤的活性成分。
恶性肿瘤极大威胁着人类生命和健康，其发病率和死亡率在世界许多国家和地区居首位。作为全球较大的公共健康问题之一，恶性肿瘤将成为21世纪人类头号杀手。我国每年新增癌症患者持续增加，死亡率呈急剧上升的趋势，面临的形势也愈发严峻。恶性肿瘤是病因、病理、临床表现以及治疗均比较复杂且尚未明确的一类常见病、多发病，能够彻底治疗癌症是全球医药卫生事业的艰巨任务。抗肿瘤药物是目前治疗肿瘤的主要手段之一，近年来相继研发了不少疗效较好的抗肿瘤新药，但这些药物价格昂贵，且具有较大副作用或长期应用易引起耐药。近年来，丰富的中药资源已得到国内外研究者的重视，从中筛选抗肿瘤活性成分或先导化合物已成为研究的热点，而紫杉醇、喜树碱、长春新碱等已经成功用于众多肿瘤的治疗。我国的药用植物资源非常丰富，从中将抗肿瘤有效成分分离出来，并明确其抗肿瘤作用及机理，对于抗肿瘤药物的研制开发以及肿瘤治疗具有非常重要的意义。
本发明成功从青龙衣中发现并提取获得四种二芳基庚烷类化合物，均表现出较强的抑制肿瘤细胞生长的作用，可用于制备治疗肿瘤的药物及保健食品。
发明内容
本发明主要涉及四种具有抗肿瘤活性的二芳基庚烷类化合物，是从青龙衣的乙醇提取物中获得的，鉴定并命名为juglanin F(式I)，juglanin G(式II)，juglanin H(式III)，juglanin I(式IV)。实验表明，此四种化合物对两种肝癌细胞均表现出不同程度的生长抑制作用。
具体而言，本发明提供了一种从青龙衣中提取的二芳基庚烷类化合物，其具有如下式I所示的结构：
Figure BDA0001914048740000021
本发明还提供了一种从青龙衣中提取的二芳基庚烷类化合物，其具有如下式II所示的结构：
Figure BDA0001914048740000022
本发明还提供了一种从青龙衣中提取的二芳基庚烷类化合物，其具有如下式III所示的结构：
Figure BDA0001914048740000023
本发明还提供了一种从青龙衣中提取的二芳基庚烷类化合物，其具有如下式IV所示的结构：
Figure BDA0001914048740000024
本发明如式I-IV所示的化合物分别鉴定并命名为：juglanin F，juglanin G，juglanin H，juglanin I，均未见文献报道，为新化合物。
本发明还提供了制备如式I-IV所示的四种二芳基庚烷类化合物的方法，包括以下步骤：
(1)将青龙衣干燥，粉碎，利用95vol％的乙醇水溶液回流提取，得到乙醇提取物，减压浓缩得到乙醇提取物浸膏；
(2)将步骤(1)得到的乙醇提取物浸膏进行硅胶柱分离，利用体积比为100:0～0:100的石油醚-丙酮系统进行梯度洗脱，经TLC检识，将相同薄层色谱行为的样品合并，得到Fr.1～Fr.8共8个馏分；
(3)将步骤(2)得到的8个馏分进一步经过ODS柱色谱、sephdax LH-20柱色谱(羟丙基葡聚糖凝胶柱色谱)、HW-40柱色谱及制备液相分离纯化，即得如式I、式II、式III、式IV所示的化合物。
优选的，步骤(1)中所述的回流提取方法为：加热回流提取4次，每次3小时。
优选的，步骤(2)中所述的硅胶柱分离方法包括以下步骤：将步骤(1)得到的乙醇提取物经硅胶柱色谱，按照体积比为100:0，100:0.5，100:1，100:2，100:3，100:4，100:5，100:6，100:8，100:10，100:12，100:14，100:16，100:18，100:20，100:25，100:30，100:50，100:100，0:100的石油醚-丙酮系统进行梯度洗脱，经TLC检识，将相同薄层色谱行为的样品合并，得到Fr.1～Fr.8共8个馏分。
优选的，步骤(3)中所述的液相分离纯化方法包括以下步骤：
(3-1)将步骤(2)得到的馏份Fr.1、Fr.4、Fr.5及Fr.6分别经ODS柱色谱，以体积百分比为10～100vol％的甲醇水溶液作为洗脱剂进行梯度洗脱，经TLC检识，分别将相同薄层色谱行为的样品合并，各得9个馏分，即Fr.1-1～Fr.1-9、Fr.4-1～Fr.4-9、Fr.5-1～Fr.5-9、Fr.6-1～Fr.6-9；
(3-2)将步骤(3-1)中Fr.1及Fr.6的50％洗脱物Fr.1-5及Fr.6-6分别经sephdaxLH-20柱色谱，以甲醇作为洗脱剂进行等度洗脱，即分别得如式I、式II所示的化合物；
(3-3)将步骤(3-1)中Fr.4的60％洗脱物Fr.4-6经HW-40C柱色谱，以体积百分比为20～100vol％的甲醇水溶液作为洗脱剂进行梯度洗脱，经TLC检识，将获得的80％洗脱物，经制备液相分离，以70vol％的甲醇水溶液作为洗脱剂进行等度洗脱，即得如式III所示的化合物；
(3-4)将步骤(3-1)中Fr.5的50％洗脱物Fr.5-7经HW-40C柱色谱，以体积百分比为10～80vol％的甲醇水溶液作为洗脱剂进行梯度洗脱，经TLC检识，将获得的80％洗脱物，经制备液相分离，以65vol％的甲醇水溶液作为洗脱剂进行等度洗脱，即得如式IV所示的化合物。
经波谱技术鉴定，确定所得到的化合物结构如式I、式II、式III、式IV所示。
体外细胞实验表明，如式I、式II、式III、式IV所示的二芳基庚烷类化合物具有抑制肿瘤的作用，对多种癌症细胞的生长具有一定抑制作用，并在发挥抑制作用的同时具有量效关系，可作为抗肿瘤药物的化合物或先导化合物，加入制备不同剂型时所需的各种辅料和药学上可接受的载体后，可制备成任何一种适宜的临床制剂。
因此，本发明还提供了如式I-IV所示的四种二芳基庚烷类化合物在制备治疗肿瘤的药物及保健食品中的应用。
附图说明
图1为化合物I的1H-NMR谱(600MHz，CD3OD)；
图2为化合物I的13C-NMR谱(150MHz，CD3OD)；
图3为化合物I的1H-1H COSY谱(600MHz，CD3OD)；
图4为化合物I的HSQC谱(600MHz，CD3OD)；
图5为化合物I的HMBC谱(600MHz，CD3OD)；
图6为化合物II的1H-NMR谱(600MHz，CDCl3)；
图7为化合物II的13C-NMR谱(150MHz，CDCl3)；
图8为化合物II的1H-1H COSY谱(600MHz，CDCl3)；
图9为化合物II的HSQC谱(600MHz，CDCl3)；
图10为化合物II的HMBC谱(600MHz，CDCl3)；
图11为化合物III的1H-NMR谱(600MHz，CDCl3)；
图12为化合物III的13C-NMR谱(150MHz，CDCl3)；
图13为化合物III的1H-1H COSY谱(600MHz，CDCl3)；
图14为化合物III的HSQC谱(600MHz，CDCl3)；
图15为化合物III的HMBC谱(600MHz，CDCl3)；
图16为化合物IV的1H-NMR谱(600MHz，CD3OD)；
图17为化合物IV的13C-NMR谱(150MHz，CD3OD)；
图18为化合物IV的1H-1H COSY谱(600MHz，CD3OD)；
图19为化合物IV的HSQC谱(600MHz，CD3OD)；
图20为化合物IV的HMBC谱(600MHz，CD3OD)。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1、青龙衣乙醇提取物浸膏的制备方法
将青龙衣干燥，取青龙衣干燥药材10kg，粉碎，利用95vol％的乙醇水溶液浸泡，加热回流提取4次，每次3小时，得到乙醇提取物，减压浓缩得到乙醇提取物浸膏611g。
实施例2、青龙衣乙醇提取物浸膏中二芳基庚烷类单体化合物的分离纯化
仪器材料：柱色谱用硅胶(200-300目)、薄层色谱用硅胶GF254(10-40μm)(青岛海洋化工有限公司生产)、柱色谱ODS：YMC*GEL ODS-A-HG(50μm)、柱色谱用Sephadex LH-20(北京金欧亚科技发展有限公司)、柱色谱用HW-40C：
Figure BDA0001914048740000051
Japan、半制备色谱柱：COSMOSIL 5C18-MS-II 10ID×250mm。
分离纯化流程：将实施例1所制的乙醇提取物浸膏经硅胶柱色谱，按照体积比为100:0，100:0.5，100:1，100:2，100:3，100:4，100:5，100:6，100:8，100:10，100:12，100:14，100:16，100:18，100:20，100:25，100:30，100:50，100:100，0:100的石油醚-丙酮系统进行梯度洗脱，经TLC检识，将相同薄层色谱行为的样品合并，得到Fr.1～Fr.8共8个馏分。
将其中的Fr.1经ODS柱色谱，以体积百分比为10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，90％，100％的甲醇水溶液作为洗脱剂进行梯度洗脱，经TLC检识，将相同薄层色谱行为的样品合并，得到Fr.1-1～Fr.1-9共9个馏分，将其中的50％洗脱物Fr.1-5经sephadexLH-20柱色谱，以甲醇作为洗脱剂进行等度洗脱，得到如式I所示的化合物。
将其中的Fr.4经ODS柱色谱，以体积百分比为10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，90％，100％的甲醇水溶液作为洗脱剂进行梯度洗脱，经TLC检识，将相同薄层色谱行为的样品合并，得到Fr.4-1～Fr.4-9共9个馏分，将其中的60％洗脱物Fr.4-6经HW-40C柱色谱，按照体积百分比为20％，40％，60％，80％，100％的甲醇水溶液作为洗脱剂进行梯度洗脱，经TLC检识，将获得的80％洗脱物，经制备液相分离，以70vol％的甲醇水溶液作为洗脱剂进行等度洗脱，得到如式III所示的化合物。
将其中的Fr.5经ODS柱色谱，以体积百分比为10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，90％，100％的甲醇水溶液作为洗脱剂进行梯度洗脱，经TLC检识，将相同薄层色谱行为的样品合并，得到Fr.5-1～Fr.5-9共9个馏分，将其中的50％洗脱物Fr.5-7经HW-40C柱色谱，按照体积百分比为10％，20％，30％，40％，60％，80％的甲醇水溶液作为洗脱剂进行梯度洗脱，经TLC检识，将获得的80％洗脱物，经制备液相分离，以65vol％的甲醇水溶液作为洗脱剂进行等度洗脱，得到如式IV所示的化合物。
将其中的Fr.6经ODS柱色谱，以体积百分比10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，90％，100％的甲醇水溶液作为洗脱剂进行梯度洗脱，经TLC检识，将相同薄层色谱行为的样品合并，得到Fr.6-1～Fr.6-9共9个馏分，将其中的50％洗脱物Fr.6-6经sephadexLH-20柱色谱，以甲醇作为洗脱剂进行等度洗脱，得到如式II所示的化合物。
实施例3、式I、II、III、IV化合物结构解析
仪器设备：旋光仪：ATAGO SAC-I；核磁共振仪：Bruker，600MHz；圆二色谱仪：MOS-450(Bio-Logic，France)。
式I所示的化合物为淡黄色固体，溶于甲醇，根据理化性质及波谱学数据将此化合物鉴定为：juglanin F，未见文献报道，为新化合物。其NMR(600MHz，CD3OD)数据见表1。
式I化合物的1H-NMR谱(600MHz，CD3OD)、13C-NMR谱(150MHz，CD3OD)；1H-1H COSY谱(600MHz，CD3OD)；HSQC谱(600MHz，CD3OD)以及HMBC谱(600MHz，CD3OD)如图1-5所示。
Figure BDA0001914048740000071
表1、式I化合物的1H、13CNMR数据归属
位点 δ<sub>H</sub>(J,Hz) δ<sub>C</sub>
1 - 127.1
2 - 133.3
3 - 151.2
4 - 143.4
5 6.58(1H,d,J＝2.0) 117.3
6 - 137.9
7 2.61(2H,m) 33.0
8 1.67(2H,m) 26.8
9 1.79(2H,m) 23.2
10 2.66(2H,m) 46.4
11 - 216.2
12 2.75(2H,m) 43.3
13 2.87(2H,m) 29.4
14 - 133.4
15 6.95(1H,dd,J＝8.2,2.3) 130.2
16 6.69(1H,d,J＝8.2) 117.7
17 - 153.3
18 6.63(1H,d,J＝2.3) 134.3
19 6.29(1H,d,J＝2.0) 126.2
4-OCH<sub>3</sub> 3.61(3H,s) 61.4
式II所示的化合物为淡黄色油状物，溶于甲醇。
Figure BDA0001914048740000072
UVλλmax(nm,logε,CH3OH)：256(0.389)，226(0.839)。CD(nm,Δε,CH3OH)：256(-0.354)，226(+1.201)。根据理化性质并结合UV、CD、1HNMR、13CNMR等现代光谱及波谱学数据将此化合物鉴定为：juglanin G，未见文献报道，为新化合物。其NMR(600MHz，CD3OD)数据见表2。
式II化合物的1H-NMR谱(600MHz，CD3OD)、13C-NMR谱(150MHz，CD3OD)；1H-1H COSY谱(600MHz，CD3OD)；HSQC谱(600MHz，CD3OD)以及HMBC谱(600MHz，CD3OD)如图6-10所示。
Figure BDA0001914048740000081
表2、式II化合物的1H、13CNMR数据归属
位点 δ<sub>H</sub>(J,Hz) δ<sub>C</sub>
1 - 130.4
2 - 125,5
3 - 150.5
4 - 153.9
5 7.21(1H,d,J＝2.2) 106.5
6 - 123.4
7 - 200.4
8 3.28(1H,m)2.32(1H,m) 40.5
9 1.87(2H,m) 24.1
10 1.84(1H,m)1.53(1H,m) 38.6
11 4.07(1H,m) 67.4
12 2.24(1H,m)1.62(1H,m) 34.2
13 2.82(2H,m) 26.5
14 - 126.4
15 6.95(1H,dd,J＝8.2,2.3) 129.2
16 6.68(1H,d,J＝8.2) 116.0
17 - 152.4
18 7.11(1H,d,J＝2.3) 132.5
19 7.70(1H,d,J＝2.2) 134.6
4-OCH<sub>3</sub> 3.79(3H,s) 55.1
式III所示的化合物为黄色油状物，溶于甲醇、氯仿，根据理化性质及波谱学数据将此化合物鉴定为：juglanin H，未见文献报道，为新化合物。其NMR(600MHz，CDCl3)数据见表3。
式III化合物的1H-NMR谱(600MHz，CD3OD)、13C-NMR谱(150MHz，CD3OD)；1H-1H COSY谱(600MHz，CD3OD)；HSQC谱(600MHz，CD3OD)以及HMBC谱(600MHz，CD3OD)如图11-15所示。
Figure BDA0001914048740000091
表3、式III化合物的1H、13CNMR数据归属
位点 δ<sub>H</sub>(J,Hz) δ<sub>C</sub>
1 2.72(1H,m)2.61(1H,m) 31.9
2 1.72(2H,m) 39.6
3 3.63(1H,m) 71.5
4 1.52(2H,m) 37.7
5 1.51(1H,m)1.38(1H,m) 25.5
6 1.61(2H,m) 32.0
7 2.57(2H,t,J＝7.6) 35.7
1′ - 134.2
2′ 6.70(1H,d,J＝2.2) 111.2
3′ - 146.6
4′ - 143.9
5′ 6.83(1H,d,J＝7.8) 114.5
6′ 6.72(1H,dd,J＝7.8,2.2) 121.1
1″ - 135.4
2″ 6.69(1H,d,J＝2.0) 112.0
3″ - 149.0
4″ - 149.0
5″ 6.78(1H,d,J＝7.8) 111.5
6″ 6.68(1H,dd,J＝7.8,2.0) 120.3
3′-OCH<sub>3</sub> 3.87(3H,s) 56.0
3″-OCH<sub>3</sub> 3.87(3H,s) 56.1
4″-OCH<sub>3</sub> 3.86(3H,s) 56.2
式IV所示的化合物为黄色油状物，溶于甲醇，根据理化性质及波谱学数据将此化合物鉴定为：juglanin I，未见文献报道，为新化合物。其NMR(600MHz，CDCl3)数据见表4。
式IV化合物的1H-NMR谱(600MHz，CD3OD)、13C-NMR谱(150MHz，CD3OD)；1H-1H COSY谱(600MHz，CD3OD)；HSQC谱(600MHz，CD3OD)以及HMBC谱(600MHz，CD3OD)如图16-20所示。
Figure BDA0001914048740000101
表4、式IV化合物的1H、13CNMR数据归属
位点 δ<sub>H</sub>(J,Hz) δ<sub>C</sub>
1 2.71(1H,m)2.61(1H,m) 31.3
2 1.72(2H,m) 39.5
3 3.61(1H,m) 71.5
4 1.51(2H,m) 37.6
5 1.51(1H,m)1.36(1H,m) 25.4
6 1.61(2H,m) 32.0
7 2.55(2H,t,J＝7.7) 35.8
1′ - 134.4
2′/6′ 7.06(2H,d,J＝8.4) 129.7
3′/5′ 6.75(2H,d,J＝8.4) 115.5
4′ - 153.9
1″ - 134.7
2″ 6.67(1H,d,J＝2.0) 111.2
3″ - 143.8
4″ - 146.5
5″ 6.83(1H,d,J＝7.8) 114.3
6″ 6.68(1H,dd,J＝7.8,2.0) 121.1
4″-OCH<sub>3</sub> 3.88(3H,s) 56.1
实施例4、式I～IV化合物对PLC5肝癌细胞的抑制作用
PLC5肝癌细胞是由恶变的肝上皮细胞形成，是临床上常见的肝癌类型。
将复苏的PLC5细胞扩增培养，直到数量达到实验需求。在96孔板上，接种2000个/孔的PLC5肝癌细胞。24小时后，细胞附壁生长，分别在各孔中加入不同浓度的药物，持续观察细胞形态并在48小时后，利用酶标仪在波长450nm下测量各孔的吸光度值(OD值)。
结果显示，式I、II、III、IV所示的化合物对PLC5肝癌细胞的半数抑制浓度分别为80.5μM、448.7μM、92.6μM、121.2μM，表明这些化合物对PLC5肝癌细胞的生长有一定的抑制作用，并且具有量效关系。
实施例5、式I～IV化合物对Hep3B肝癌细胞的抑制作用
Hep3B肝癌细胞是由恶变的肝上皮细胞形成，是临床上常见的肝癌类型。
将复苏的Hep3B扩增培养，直到数量达到实验需求。在96孔板上，接种2000个/孔的Hep3B肝癌细胞。24小时后，细胞附壁生长，分别在各孔中加入不同浓度的药物，持续观察细胞形态并在48小时后，利用酶标仪在450nm下测量各孔的吸光度值(OD值)。
结果表明：式I、II、III、IV所示的化合物对Hep3B肝癌细胞的半数抑制浓度分别为42.6μM、62.5μM、79.8μM、98.9μM，表明这些化合物对Hep3B肝癌细胞的生长有一定的抑制作用，并且具有量效关系。

Claims (4)

1.一种制备二芳基庚烷类化合物的方法，其特征在于，所述的二芳基庚烷类化合物具有如下式I、式II、式III或式IV所示的结构：
Figure FDA0003905539060000011
所述的方法包括以下步骤：
(1)将青龙衣干燥，粉碎，利用95vol％的乙醇水溶液回流提取，得到乙醇提取物，减压浓缩得到乙醇提取物浸膏；
(2)将步骤(1)得到的乙醇提取物浸膏进行硅胶柱分离，利用体积比为100:0～0:100的石油醚-丙酮系统进行梯度洗脱，经TLC检识，将相同薄层色谱行为的样品合并，得到Fr.1～Fr.8共8个馏分；
(3)将步骤(2)得到的8个馏分进一步经过ODS柱色谱、sephdax LH-20柱色谱、HW-40柱色谱及制备液相分离纯化，即得如式I、式II、式III、式IV所示的化合物。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述的回流提取方法为：加热回流提取4次，每次3小时。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述的硅胶柱分离方法包括以下步骤：将步骤(1)得到的乙醇提取物经硅胶柱色谱，按照体积比为100:0，100:0.5，100:1，100:2，100:3，100:4，100:5，100:6，100:8，100:10，100:12，100:14，100:16，100:18，100:20，100:25，100:30，100:50，100:100，0:100的石油醚-丙酮系统进行梯度洗脱，经TLC检识，将相同薄层色谱行为的样品合并，得到Fr.1～Fr.8共8个馏分。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中所述的液相分离纯化方法包括以下步骤：
(3-1)将步骤(2)得到的馏份Fr.1、Fr.4、Fr.5及Fr.6分别经ODS柱色谱，以体积百分比为10～100vol％的甲醇水溶液作为洗脱剂进行梯度洗脱，经TLC检识，分别将相同薄层色谱行为的样品合并，各得9个馏分，即Fr.1-1～Fr.1-9、Fr.4-1～Fr.4-9、Fr.5-1～Fr.5-9、Fr.6-1～Fr.6-9；
(3-2)将步骤(3-1)中Fr.1及Fr.6的50％洗脱物Fr.1-5及Fr.6-6分别经sephdax LH-20柱色谱，以甲醇作为洗脱剂进行等度洗脱，即分别得如式I、式II所示的化合物；
(3-3)将步骤(3-1)中Fr.4的60％洗脱物Fr.4-6经HW-40C柱色谱，以体积百分比为20～100vol％的甲醇水溶液作为洗脱剂进行梯度洗脱，经TLC检识，将获得的80％洗脱物，经制备液相分离，以70vol％的甲醇水溶液作为洗脱剂进行等度洗脱，即得如式III所示的化合物；
(3-4)将步骤(3-1)中Fr.5的50％洗脱物Fr.5-7经HW-40C柱色谱，以体积百分比为10～80vol％的甲醇水溶液作为洗脱剂进行梯度洗脱，经TLC检识，将获得的80％洗脱物，经制备液相分离，以65vol％的甲醇水溶液作为洗脱剂进行等度洗脱，即得如式IV所示的化合物。
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