TWI764744B

TWI764744B - 化合物及其醫藥組合物、用途及萃取自檸檬黃青黴之方法

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Publication number: TWI764744B
Application number: TW110120064A
Authority: TW
Inventors: 陳日榮; 朱益成; 張峻豪; 廖庠睿; 傅淑玲
Original assignee: 國立陽明交通大學
Priority date: 2021-06-02
Filing date: 2021-06-02
Publication date: 2022-05-11
Also published as: TW202248201A

Abstract

本發明揭露一種化合物及其醫藥組合物、用途及萃取自檸檬黃青黴之方法，該化合物如下所示。

Description

化合物及其醫藥組合物、用途及萃取自檸檬黃青黴之方法

本發明關於一種化合物，特別是一種萃取自檸檬黃氫黴之新穎化合物。

藥物探索(drug discovery)為新藥開發之首要任務，篩選出新穎化合物後，需分析新穎化合物之結構、活性及作用機轉，完成生物有效性及安全性之體外試驗及動物試驗後，才能進入臨床試驗進而上市，因此新藥開發耗時又昂貴，若能從已知具有活性之天然物(如藥用植物或微生物)中萃取純化出具有藥理活性之新穎化合物，可大幅縮短藥物探索所需時間，進而降低新藥開發成本。

本發明之一目的在於提供一種式(I)化合物或其鹽、立體異構物或水合物。

(I)

本發明之另一目的在於提供一種醫藥組合物，其包含式(I)化合物或其醫藥學上可接受之鹽、立體異構物或水合物及醫藥學上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑。

本發明之另一目的在於提供一種式(II)化合物或其醫藥學上可接受之鹽之用途，其用以製備抑制發炎反應之藥物。

(II)

本發明之另一目的在於提供一種式(III)化合物或其醫藥學上可接受之鹽之用途，其用以製備抑制發炎反應之藥物。

(III)

本發明之另一目的在於提供一種式(III)化合物或其醫藥學上可接受之鹽之用途，其用以製備抑制肺癌細胞A549生長之藥物。

(III)

本發明之另一目的在於提供一種式(I)化合物萃取自檸檬黃青黴之方法，其包含：一抽取步驟，將一檸檬黃青黴浸泡於一乙醇溶液中進行抽取，以取得一乙醇抽取液；一第一濃縮步驟，濃縮該乙醇抽取液，以取得一乙醇抽取物；一分離步驟，將該乙醇抽取物溶於一丁醇/水混合液( n-BuOH:Water, 1:1, v/v)，以取得一丁醇抽出液；一第二濃縮步驟，濃縮該丁醇抽出液，以取得一丁醇抽出物；以及一層析步驟，層析該丁醇抽出物，以純化出該式(I)化合物。

本發明揭露之式(I)化合物為一新穎化合物，其立體異構物式(II)化合物及式(III)化合物皆具有抑制發炎反應之活性，此外，式(III)化合物同時具有抑制肺癌細胞A549生長之活性，有助於開發抑制發炎反應及抑制癌細胞生長之藥物。

本發明揭露一種式(I)化合物或其鹽、立體異構物或水合物，以及一種醫藥組合物，其包含式(I)化合物或其醫藥學上可接受之鹽、立體異構物或水合物，較佳地，該醫藥組合物另包含醫藥學上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑，其中該醫藥組合物能以液體、膠囊、片劑或錠劑等不同形式存在。

(I)

式(I)化合物為一色酮衍生物，分子式為C ₃₂H ₂₈O ₁₂，可經由合成方式取得或萃取自天然物，在本實施例中，式(I)化合物萃取自檸檬黃青黴(Penicillium citrinum)，檸檬黃青黴為一種青黴菌。

請參閱第1圖，式(I)化合物萃取自檸檬黃青黴之方法10包含「抽取步驟」11、「第一濃縮步驟」12、「分離步驟」13、「第二濃縮步驟」14及「層析步驟」15。

首先進行一抽取步驟，將一檸檬黃青黴BCRC 09F0458浸泡於一乙醇溶液(ethanol)中進行該抽取步驟，以取得一乙醇抽取液，在本實施例中，BCRC 09F0458購自財團法人食品工業發展研究所生物資源保存及研究中心，菌株於馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA, potato dextrose agar)培養一週後(25°C)採收孢子，孢子於葡萄糖酵母瓊脂培養基(RGY agar, sterilized water-glucose-yeast agar)中振盪培養3天(25°C)，以增殖檸檬黃青黴，檸檬黃青黴培養液與RGY medium混合後接種於1.5公斤米飯中培養21天，再將1.5公斤米飯浸泡於20公升的95%乙醇溶液中反覆進行三次室溫抽取，以取得該乙醇抽取液。

接著進行一第一濃縮步驟，減壓濃縮該乙醇抽取液以取得一乙醇抽取物，該第一濃縮步驟後進行一分離步驟，將該乙醇抽取物溶於一丁醇/水混合液( n-BuOH:Water, 1:1, v/v)中，以分離出一丁醇抽出液及一水層抽出液，接著進行一第二濃縮步驟，減壓濃縮該丁醇抽出液以取得一丁醇抽出物，最後進行一層析步驟，自該丁醇抽出物純化出式(I)化合物，較佳地，該層析步驟包含複數個步驟。

在本實施例中，該丁醇抽取物經由不同的層析步驟後可分別純化出兩個立體異構物，分別為式(II)化合物及式(III)化合物，兩者差異在於甲氧基-2´(OMe-2´)的方向。

(II)

(III)

於該層析步驟中，首先進行管柱層析(CC, column chromatography)，使用一沖提液沖提該丁醇抽出物，以取得一第一流份(fraction)及一第二流份，在本實施例中，該丁醇抽出物充填於一矽膠管柱(70-230 mesh)中，以正己烷/乙酸乙酯混合液( n-Hexane/Ethyl acetate, 25:1-0:1, v/v)進行沖提，分別取得2.38公克的該第一流份及1.28公克的該第二流份，該第一流份及該第二流份後續經由不同的層析流程進行純化後，可分別取得式(II)化合物及式(III)化合物。

首先說明式(II)化合物之純化流程，將該第一流份充填於一矽膠管柱(230-400 mesh)中進行中壓液相層析(MPLC, Middle Pressure Liquid Chromatography)，使用正己烷/丙酮混合液( n-Hexane/Acetone, 1:0-0:1, v/v)沖提該第一流份，取得138毫克的一第一分析物後，將該第一分析物置於薄層層析片(Kieselgel 60, F254, 0.5 mm, Merck)進行高效液相層析(HPLC, High Performance Liquid Chromatography)，使用正己烷/乙酸乙酯混合液( n-Hexane/Ethyl acetate, 1:1, v/v)沖提該第一分析物，以純化出14.6毫克的式(II)化合物。

接著說明式(III)化合物之純化流程，將該第二流份充填於一矽膠管柱(230-400 mesh)中進行MPLC，使用正己烷/丙酮混合液( n-Hexane/Acetone, 1:0–0:1, v/v)沖提該第二流份以取得122毫克的一第二分析物，將該第二分析物置於一薄層層析片(Kieselgel 60, F254, 0.5 mm, Merck)上進行薄層層析(TLC, Thin Layer Chromatography, TLC)，使用正己烷/二氯甲烷/丙酮混合液( n-Hexane/Dichloromethane/Acetone, 5:3:2, v/v)沖提該第二分析物，以純化出13.7毫克的式(III)化合物。

式(II)化合物及式(III)化合物之結構鑑定：

第2及3圖分別為式(II)化合物及式(III)化合物之高解析電噴灑游離質譜(HR-ESI-MS, High-Resolution Electrospray Ionization Mass Spectroscopy)分析圖譜，其中HR-ESI-MS顯示式(II)化合物之偽分子離子峰[M+Na] ⁺為 m/z627.12902，式(II)化合物之偽分子離子峰[M+Na] ⁺為 m/z627.12919。

第4及5圖分別為式(II)化合物及式(III)化合物之紅外線光譜(IR, Infrared Spectroscopy)，其利用珀金埃爾默股份有限公司生產之紅外線光譜儀(Perkin Elmer system 2000 FT-IR Spectrometer)及溴化鉀鹽片(KBr)進行紅外線光譜測定，由IR光譜可知式(II)化合物在3480 cm ^-1有羥基(hydroxyl group)之吸收，在1763 cm ^-1有酯類羰基(ester carbonyl group)之吸收，在1657 cm ^-1有羰基(carbonyl group)之吸收，式(III)化合物在3466 cm ^-1有羥基之吸收，在1761及1740 cm ^-1有酯類羰基之吸收，在1657 cm ^-1有羰基之吸收，顯示式(II)化合物及式(III)化合物具有羥基及羰基。

第6a及6b圖分別為式(II)化合物之氫核磁共振圖譜( ¹H-NMR, ¹H Nuclear Magnetic Resonance, CDCl ₃, 500 MHz)及碳核磁共振圖譜( ¹³C-NMR, ¹³C Nuclear Magnetic Resonance, CDCl ₃, 125 MHz)，根據 ¹H-NMR及 ¹³C-NMR可知式(II)化合物有一個羥基[δ _H12.36 (1H, s, OH-11′)]，兩個甲基[δ _H2.36 (3H, s, H-15) and 2.41 (3H, s, H-15′); δ _C22.1 (C-15)、22.4 (C-15′)]，四個甲氧基[δ _H3.51 (3H, s, OMe-2′), 3.78 (3H, s, H-16), 3.84 (3H, s, H-16′)、3.91 (3H, s, OMe-11)；δ _C52.6 (C-16′)、52.7 (OMe-2′)、52.9 (C-16)、56.3 (OMe-11)]，兩對間位偶合的芳香族質子訊號[δ _H6.58 (1H, br s, H-10)、6.69 (1H, br s, H-8′)、6.69 (1H, br s, H-10′)、6.76 (1H, br s, H-8); δ _C107.5 (C-8′)、108.4 (C-10)、110.7 (C-8)、112.6 (C-10′)]，兩個亞甲基[δ _H2.36 (1H, dd, J= 15.5, 12.7 Hz, H _β-4′)、2.55 (1H, dd, J= 15.5, 5.4 Hz, H _α-4′); δ _C27.1 (C-4′)]，和三個次甲基[δ _H2.82 (1H, ddd, J= 12.7, 8.6, 5.4 Hz, H-3′)、3.77 (1H, dd, J= 8.7, 8.6 Hz, H-3)、5.14 (1H, d, J= 8.9 Hz, H-4); 36.1 (C-4)、46.8 (C-3)、48.4 (C-3′)]。式(II)化合物的C-11上接有甲氧基，可由11-OMe (δ _H3.91)和H-10 (δ _H6.58)之間具有ROESY關係，且11-OMe (δ _H3.91)與C-11 (δ _C160.0)之間具有HMBC關係予以證實，ROESY關係及HMBC關係待後續詳述。

第7a及7b圖分別為式(III)化合物之 ¹H-NMR及 ¹³C-NMR，由此可知式(III)化合物有一個羥基[δ _H12.50 (1H, s, OH-11′)]，兩個甲基[δ _H2.38 (3H, s, H-15) and 2.42 (3H, s, H-15′); δ _C22.1 (C-15)、22.4 (C-15′)]，四個甲氧基[δ _H3.11 (3H, s, OMe-2′), 3.82 (3H, s, H-16), 3.84 (3H, s, H-16′)、3.91 (3H, s, OMe-11)；δ _C52.2 (OMe-2′)、52.8 (C-16′)、53.1 (C-16)、56.4 (OMe-11)]，兩對間位偶合的芳香族質子訊號[δ _H6.59 (1H, br s, H-10)、6.68 (1H, br s, H-10′)、6.69 (1H, br s, H-8′)、6.81 (1H, br s, H-8); δ _C107.3 (C-8′)、108.3 (C-10)、100.9 (C-8)、112.2 (C-10′)]，兩個亞甲基[δ _H2.85 (1H, dd, J= 15.5, 12.7 Hz, H _β-4′)、2.99 (1H, dd, J= 15.5, 5.4 Hz, H _α-4′); δ _C25.5 (C-4′)]，和三個次甲基[δ _H3.06 (1H, ddd, J= 10.5, 8.3, 4.7 Hz, H-3′)、3.48 (1H, dd, J= 10.5, 8.9 Hz, H-3)、4.96 (1H, d, J= 8.9 Hz, H-4); 37.3 (C-4)、43.3 (C-3′)、44.0 (C-3)]。式(III)化合物的C-11上接有甲氧基，可由11-OMe (δ _H3.91)與C-11 (δ _C159.9)之間具有HMBC關係，且11-OMe (δ _H3.91)和H-10 (δ _H6.59)之間具有ROESY關係予以證實，ROESY關係及HMBC關係待後續詳述。

其中，式(II)化合物及式(III)化合物藉由布魯克生命科學股份有限公司生產之超導核磁共振儀(BRUKER AVIII-500及BRUKER AVIII-600 spectrometer)進行核磁共振測定，測定溶媒均使用氘代氯仿(CDCl ₃)，OH均有添加重水(D ₂O)後消失後以證明。

第8圖為式(II)化合物之旋轉坐標系核歐佛豪瑟效應圖譜(ROESY, Rotating Frame Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy)，式(II)化合物之關鍵取代基位置可經由ROESY予以確認：(a) H-3 (δ _H3.77)與H-4 (δ _H5.14)、H-16 (δ _H3.78)、H-3′ (δ _H2.82)、H _α-4′ (δ _H2.55)之間具有ROESY關係；(b) H-8 (δ _H6.76)與H-15 (δ _H2.36)之間具有ROESY關係；(c) H-10 (δ _H6.58)與H-15 (δ _H2.36)、11-OMe (δ _H3.91)之間具有ROESY關係；(d) H-3′ (δ _H2.82)與H _α-4′ (δ _H2.55)、H _β-4′ (δ _H2.36)、2′-OMe (δ _H3.51)之間具有ROESY關係；(e) H _α-4′ (δ _H2.55)與H _β-4′ (δ _H2.36)之間具有ROESY關係；(f) H-15′ (δ _H2.41)與H-8′ (δ _H6.69)、H-10′ (δ _H6.69)之間具有ROESY關係。

第9圖為式(II)化合物之異核化學位移相關圖譜(HMBC, Heteronuclear Multiple-Bond Correlation)，式(II)化合物之關鍵取代基位置可經由HMBC予以確認：(a)H-16′(δ _H3.84)與C-1′(δ _C167.1)之間具有HMBC關係；(b)2′-OMe(δ _H3.51)與C-2′(δ _C111.0)之間具有HMBC關係；(c)H-3′(δ _H2.82)與C-2′(δ _C111.0)之間具有HMBC關係；(d)H _β-4′(δ _H2.36)與C-2′(δ _C111.0)之間具有HMBC關係；(e)H _α-4′(δ _H2.55)與C-2′(δ _C111.0)之間具有HMBC關係；(f)H _β-4′(δ _H2.36)與C-3′(δ _C48.4)之間具有HMBC關係；(g)H _α-4′(δ _H2.55)與C-2′(δ _C111.0)之間具有HMBC關係；(h)H-8′(δ _H6.69)與C-7′(δ _C156.1)之間具有HMBC關係；(i)H-8′(δ _H6.69)與C-15′(δ _C22.4)之間具有HMBC關係；(j)H-15′(δ _H2.41)與C-9′(δ _C147.5)之間具有HMBC關係；(k) H-15′(δ _H2.41)與C-10′(δ _C112.6)之間具有HMBC關係；(l)H-10′(δ _H6.69)與C-11′(δ _C160.5)之間具有HMBC關係；(m)H-4(δ _H5.14)與C-13′(δ _C179.8)之間具有HMBC關係；(n)H-4(δ _H5.14)與C-5(δ _C164.7)之間具有HMBC關係；(o)H-3(δ _H3.77)與C-3′(δ _C48.4)之間具有HMBC關係；(p)H-3(δ _H3.77)與C-2(δ _C91.7)之間具有HMBC關係；(q)H-16(δ _H3.78)與C-1(δ _C171.2)之間具有HMBC關係；(r)H-8(δ _H6.76)與C-7(δ _C159.1)之間具有HMBC關係；(s)H-15(δ _H2.36)與C-9(δ _C145.2)之間具有HMBC關係；(t)H-15(δ _H2.36)與C-10(δ _C108.4)之間具有HMBC關係；(u)H-10(δ _H6.58)與C-11(δ _C160.0)之間具有HMBC關係；(v)11-OMe(δ _H3.91)與C-11(δ _C160.0)之間具有HMBC關係。

第10圖為式(III)化合物之ROESY，式(III)化合物之關鍵取代基位置可經由ROESY予以確認：(a) H-3 (δ _H3.48)與H-4 (δ _H4.96)、H-16 (δ _H3.82)、H-3′ (δ _H3.06)、H _α-4′ (δ _H2.99)之間具有ROESY關係；(b) H-8 (δ _H6.81)與H-15 (δ _H2.38)之間具有ROESY關係；(c) H-10 (δ _H6.59)與H-15 (δ _H2.38)、11-OMe (δ _H3.91)之間具有ROESY關係；(d) H-3′ (δ _H3.06)與H _α-4′ (δ _H2.99)、H _β-4′ (δ _H2.85)之間具有ROESY關係；(e) H _α-4′ (δ _H2.99)與H _β-4′ (δ _H2.85)之間具有ROESY關係；(f) H _β-4′ (δ _H2.85)與2′-OMe (δ _H3.11)之間具有ROESY關係；(g) H-15′ (δ _H2.42)與H-8′ (δ _H6.69)、H-10′ (δ _H6.68)之間具有ROESY關係；(h) H-10′ (δ _H6.68)與11′-OH (δ _H12.50)之間具有ROESY關係。

第11圖為式(III)化合物之HMBC，式(III)化合物之關鍵取代基位置可經由HMBC予以確認：(a)H-16′(δ _H3.84)與C-1′(δ _C168.5)之間具有HMBC關係；(b)2′-OMe(δ _H3.11)與C-2′(δ _C107.6)之間具有HMBC關係；(c)H-3′(δ _H3.06)與C-2′(δ _C107.6)之間具有HMBC關係；(d)H _β-4′(δ _H2.85)與C-2′(δ _C107.6)之間具有HMBC關係；(e)H _α-4′(δ _H2.99)與C-2′(δ _C107.6)之間具有HMBC關係；(f)H _β-4′(δ _H2.85)與C-3′(δ _C43.3)之間具有HMBC關係；(g)H _α-4′(δ _H2.99)與C-2′(δ _C107.6)之間具有HMBC關係；(h)H-8′(δ _H6.69)與C-7′(δ _C155.9)之間具有HMBC關係；(i)H-8′(δ _H6.69)與C-15′(δ _C22.4)之間具有HMBC關係；(j)H-15′(δ _H2.42)與C-9′(δ _C147.3)之間具有HMBC關係；(k) H-15′(δ _H2.42)與C-10′(δ _C112.2)之間具有HMBC關係；(l)H-10′(δ _H6.68)與C-11′(δ _C160.4)之間具有HMBC關係；(m)H-4(δ _H4.96)與C-13′(δ _C180.6)之間具有HMBC關係；(n)H-4(δ _H4.96)與C-5(δ _C166.4)之間具有HMBC關係；(o)H-3(δ _H3.48)與C-3′(δ _C43.3)之間具有HMBC關係；(p)H-3(δ _H3.48)與C-2(δ _C91.6)之間具有HMBC關係；(q)H-16(δ _H3.82)與C-1(δ _C170.5)之間具有HMBC關係；(r)H-8(δ _H6.81)與C-7(δ _C159.2)之間具有HMBC關係；(s)H-15(δ _H2.38)與C-9(δ _C145.1)之間具有HMBC關係；(t)H-15(δ _H2.38)與C-10(δ _C108.3)之間具有HMBC關係；(u)H-10(δ _H6.59)與C-11(δ _C159.9)之間具有HMBC關係；(v)11-OMe(δ _H3.91)與C-11(δ _C159.9)之間具有HMBC關係。

第12及13圖分別為式(II)化合物之異核單量子相關圖譜(HSQC, Heteronuclear Singular Quantum Correlation)及 ¹H- ¹H關聯性磁振頻譜( ¹H- ¹H COSY, ¹H- ¹H Correlation Spectroscopy)，透過HMBC及HSQC圖譜可進一步證實式(II)化合物之 ¹³C-NMR數據，且綜合所有分析資料可推定式(II)化合物為 rac-dimethyl(6a R,6a ¹ S,7 S,8a R,14b R)-1-hydroxy-7,10-dimethoxy-3,12-dimethyl-9,15-dioxo-6,6a,7,9,14b,15-hexahydrodichromeno[3',2':2,3;3'',2'':4,5]indeno[1,7- bc]furan-7,8a(6a ¹ H)-dicarboxylate。

第14及15圖分別為式(III)化合物之HSQC及 ¹H- ¹H COSY，透過HMBC及HSQC圖譜可進一步證實式(III)化合物之 ¹³C-NMR數據，且綜合所有分析資料可推定式(III)化合物為 rac-dimethyl(6a R,6a ¹ S,7 R,8a R,14b R)-1-hydroxy-7,10-dimethoxy-3,12-dimethyl-9,15-dioxo-6,6a,7,9,14b,15-hexahydrodichromeno[3',2':2,3;3'',2'':4,5]indeno[1,7- bc]furan-7,8a(6a ¹ H)-dicarboxylate。

式(II)化合物及式(III)化合物為立體異構物，於化學資料庫搜尋後確認其為新穎化合物，相關活性分析及用途如下所述。

式(II)化合物及式(III)化合物抑制發炎反應之活性分析：

由於 N-甲醯-L-甲硫氨醯-L-亮氨醯-L-苯丙氨酸/細胞鬆弛素B(fMLP/CB, N-formyl-L-methionyl-L-leuckyl-L-phenylalanine/cytochalasin B)可誘導人類嗜中性白血球釋放出超氧陰離子(superoxide anion)，而超氧陰離子與發炎性疾病有關，因此本發明分析式(II)化合物及式(III)化合物對於fMLP/CB誘導嗜中性白血球釋放超氧陰離子的抑制效果，以評估式(II)化合物及式(III)化合物是否具有抑制發炎反應之活性。

正控制組選用布洛芬(Ibuprofen)，其為fMLP受體拮抗劑(fMLP receptor antagonist)，屬於非類固醇消炎藥(NSAIDs, Non-Steroid Anti-Inflammatory Drugs)，布洛芬的半抑制劑量(IC ₅₀)為27.85 ± 3.56 μM，於相同試驗中，式(II)化合物的半抑制劑量(IC ₅₀)為6.39 ± 0.40 μM，式(III)化合物的半抑制劑量(IC ₅₀)為8.28 ± 0.29 μM，證明式(II)化合物及式(III)化合物確實可抑制fMLP/CB誘導嗜中性白血球釋放超氧陰離子，且式(II)化合物及式(III)化合物抑制fMLP/CB誘導嗜中性白血球釋放超氧陰離子的效果優於布洛芬，由此可知，式(II)化合物或其醫藥學上可接受之鹽及式(III)化合物或其醫藥學上可接受之鹽可用以製備抑制發炎反應之藥物，特別是用以製備抑制人類嗜中性白血球釋放超氧陰離子之藥物。

人類嗜中性白血球的製備流程如下。自20-35歲健康捐血者之手肘靜脈採血(約30-80 ml)，利用聚蔗糖梯度(Ficoll gradient)離心法，將嗜中性白血球分離，男性全血離心10分鐘(25℃, 650 g)，女性全血離心8分鐘(25℃, 650 g)，離心後去除上清液，將下層血球與3 %聚葡萄糖(dextran)溶液以等體積混合，於室溫下靜置30分鐘，接著將含有嗜中性白血球的上層覆蓋於裝有等體積聚蔗糖溶液(Histopaque-1077)的50 ml離心管中，離心35分鐘(20℃, 400 g)後取沈澱物(pellet)，利用低張溶液溶血的方法將殘存的紅血球脹破，最後，離心10分鐘(4℃, 400 g)後去除上清液，將分離出的嗜中性白血球懸浮於冰浴的漢克平衡鹽緩衝液(HBSS, Hank’s buffered saline solution)中。

超氧陰離子測定流程簡述如下。將含有0.5 mg/ml亞鐵細胞色素 c(ferricytochrome c)、1 mM 氯化鈣(CaCl ₂)及1 mM 氯化鎂(MgCl ₂)的嗜中性白血球懸浮液(6×10 ⁵cells/ml預熱5分鐘使達37 ℃，分別加入布洛芬、式(II)化合物及式(II)化合物作用5分鐘後，再加入fMLP(0.1 μM)/CB(1 μg/ml))反應10分鐘，使用紫外光分光光度計於波長550 nm下測量其吸光值，嗜中性白血球所釋出的超氧陰離子量(extinction coefficient 21.1/mM/cm)可經由超氧化物歧化酶(SOD, superoxide dismutase, 100 U/ml)抑制亞鐵細胞色素 c還原計算得知。

式(III)化合物之抗癌效果分析：

藉由細胞存活率試驗(MTT assay)觀察式(III)化合物對於肺癌細胞A549的毒殺效果，A549為一種非小細胞肺癌細胞，式(III)化合物對於A549之半抑制濃度(IC ₅₀)為43.82 ± 6.33 μM，本試驗之正控制組選用5-氟尿嘧啶(5-FU, 5-Fluorouracil)，其為現今衛生福利部核准之消化器癌(如胃癌、直腸癌、結腸癌)、肺癌、乳癌等之抗癌藥物，於相同試驗中，5-FU對於A549之IC ₅₀為12.52 ± 2.02 μM。

細胞存活率試驗流程如下。將0.5 mg/mL溴化-3-(4,5-二甲基-2-噻唑)-2,5-二苯基四氮唑(MTT, 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide)試劑加入A549中，MTT可作用於活細胞粒線體中，在琥珀酸脫氫酶(SDH, Succinate dehydrogenase)和細胞色素C (Cytochrome C)的作用下，四氮唑環會開裂並生成紫色的甲䐶結晶，A549培養3小時(37°C)後，加入二甲基亞碸(DMSO, dimethyl sulfoxide)將甲䐶溶解出來，再利用分光光度儀測量570 nm吸光度評估有多少細胞存活，由於甲䐶結晶的生成量與活細胞數目成正比，可間接計算活細胞數目，進而分析式(III)化合物對於549的毒殺效果。

請參閱第16圖，透過細胞群落形成試驗(colony formation assay)可確認式(III)化合物對於A549生長的抑制效果，且25 μM的式(III)化合物可顯著抑制A549增生分化，證明式(III)化合物確實可抑制A549生長，因此式(III)化合物或其醫藥學上可接受之鹽可用以製備抑制A549生長之藥物，於相同試驗中，10 μM的5-FU對A549的IC ₅₀為100%。

細胞群落形成試驗流程如下。A549(3000 cells/well)培養於6孔盤中24小時後，分別加入6.25、12.5、25及50 μM的式(III)化合物及10 μM的5-FU(正控制組)，繼續培養14天後，使用磷酸鹽緩衝生理鹽水(PBS, Phosphate buffered saline)清洗細胞表面，再以99 %甲醇(MeOH)處理30分鐘，以固定貼附於6孔盤表面的細胞，最後以0.2 %結晶紫(crystal violet)使細胞染色，染色細胞以ImageJ軟體進行記數。

式(III)化合物之抗癌機制分析：

藉由西方點墨法(western blot)了解式(III)化合物藉由調控哪些凋亡蛋白質表現量以抑制肺癌細胞A549生長，其中胱天蛋白酶活化(caspase 3 activation)為細胞凋亡的重要特徵，當細胞接收到凋亡刺激時，不具活性的胱天蛋白酶原(pro-caspase 3)會被剪切成具活性的胱天蛋白酶(cleaved-caspase 3)，而B細胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2, B cell lmphoma/leukemia-2)為一抗凋亡蛋白質，可調控細胞粒線體之結構及功能穩定性，以抑制細胞凋亡，反之，Bcl-2相關X(Bax, Bcl-2-associated X)蛋白質為一促凋亡蛋白質，會誘導細胞色素C(cytochrome C)的釋放，且cytochrome C會與凋亡酶激活因素-1(Apaf-1, Apoptosis protease activating factor-1)和凋亡蛋白酶原(pro-caspase 9)形成凋亡小體(apoptosome)，以促進細胞凋亡。

請參閱第17及18圖，由試驗結果可知式(III)化合物確實可調控凋亡蛋白質pro-caspase 3、cleaved-caspase 3、Bcl-2及Bax之表現量，藉由降低pro-caspase 3表現量、增加cleaved-caspase 3表現量、降低Bcl-2蛋白質表現量及增加Bax蛋白質表現量，使A549進入細胞凋亡路徑，因此式(III)化合物或其醫藥學上可接受之鹽可用以製備促進A549凋亡之藥物，進一步說，式(III)化合物或其醫藥學上可接受之鹽可用以製備調控一凋亡蛋白質表現量之藥物，該凋亡蛋白質可為pro-caspase 3、cleaved-caspase 3、Bcl-2或Bax，更進一步說，式(III)化合物或其醫藥學上可接受之鹽可用以製備降低pro-caspase 3表現量、增加cleaved-caspase 3表現量、降低Bcl-2蛋白質表現量或增加Bax蛋白質表現量之藥物。

western blot實驗方法如下。A549(1x10 ⁵cells/well)生長至85-90%匯合狀態(confluent)後，加入6.25、12.5及25μM的式(III)化合物及10 μM的5-FU(正控制組)，處理後收集細胞，並藉由快速裂解緩衝液(RIPA buffer, rapid immunoprecipitation assay buffer)裂解細胞組織，全蛋白裂解物通過12.5 %十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠(SDS-PAGE, sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel)分離後，再將蛋白質轉印至聚偏二氟乙烯(PVDF, polyvinylidene-fluoride)膜，封閉空白部份後進行一級抗體反應(4°C)，隔天以三羥甲基氨基甲烷緩衝生理鹽水(TBST, tris-buffered saline containing 0.1 % Tween 20)清洗PVDF膜後進行二級抗體反應(室溫1小時)，化學冷光呈色後擷取影像並使用ImageJ軟體進行橫紋(band)定量。

結構鑑定結果證實式(I)化合物為一新穎化合物，試驗結果證實立體異構物式(II)化合物及式(III)化合物具有抑制發炎反應之活性，且細胞試驗證實式(III)化合物同時具有抑制A549生長之功效，本發明有助於開發抑制發炎反應及抑制癌細胞生長之藥物。

本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準，任何熟知此項技藝者，在不脫離本發明之精神和範圍內所作之任何變化與修改，均屬於本發明之保護範圍。

10:式(I)化合物萃取自檸檬黃青黴之方法 11:抽取步驟12:第一濃縮步驟 13:分離步驟14:第二濃縮步驟 15:層析步驟

第1圖：依據本發明之一實施例，一種式(I)化合物萃取自檸檬黃青黴之方法流程圖。第2圖：式(II)化合物之高解析電噴灑游離質譜(HR-ESI-MS)。第3圖：式(III)化合物之高解析電噴灑游離質譜(HR-ESI-MS)。第4圖：式(II)化合物之紅外線光譜(IR)。第5圖：式(III)化合物之紅外線光譜(IR)。第6a圖：式(II)化合物之氫核磁共振圖譜( ¹H-NMR)。第6b圖：式(II)化合物之碳核磁共振圖譜( ¹³C-NMR)。第7a圖：式(III)化合物之氫核磁共振圖譜( ¹H-NMR)。第7b圖：式(III)化合物之碳核磁共振圖譜( ¹³C-NMR)。第8圖：式(II)化合物之旋轉坐標系核歐佛豪瑟效應圖譜(ROESY)。第9圖：式(II)化合物之異核化學位移相關圖譜(HMBC)。第10圖：式(III)化合物之旋轉坐標系核歐佛豪瑟效應圖譜(ROESY)。第11圖：式(III)化合物之異核化學位移相關圖譜(HMBC)。第12圖：式(II)化合物之異核單量子相關圖譜(HSQC)。第13圖：式(II)化合物之 ¹H- ¹H關聯性磁振頻譜( ¹H- ¹H COSY)。第14圖：式(III)化合物之異核單量子相關圖譜(HSQC)。第15圖：式(III)化合物之 ¹H- ¹H關聯性磁振頻譜( ¹H- ¹H COSY)。第16圖：細胞群落形成(colony formation assay)試驗結果。第17圖：西方點墨法(western blot)試驗結果。第18圖：西方點墨法(western blot)試驗結果。

10:式(I)化合物萃取自檸檬黃青黴之方法

11:抽取步驟

12:第一濃縮步驟

13:分離步驟

14:第二濃縮步驟

15:層析步驟

Claims

一種式(I)化合物，
或其鹽、立體異構物或水合物。
一種醫藥組合物，其包含式(I)化合物或其醫藥學上可接受之鹽、立體異構物或水合物及醫藥學上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑，
一種式(II)化合物或其醫藥學上可接受之鹽之用途，
其用以製備抑制發炎反應之藥物。
如請求項3之式(II)化合物或其醫藥學上可接受之鹽之用途，其用以製備抑制人類嗜中性白血球釋放超氧陰離子之藥物。
一種式(III)化合物或其醫藥學上可接受之鹽之用途，
其以製備抑制發炎反應之藥物。
如請求項5之式(III)化合物或其醫藥學上可接受之鹽之用途，其用以製備抑制人類嗜中性白血球釋放超氧陰離子之藥物。
一種式(III)化合物或其醫藥學上可接受之鹽之用途，
其用以製備抑制肺癌細胞A549生長之藥物。
如請求項7之式(III)化合物或其醫藥學上可接受之鹽之用途，其用以製備促進肺癌細胞A549凋亡之藥物。
如請求項8之式(III)化合物或其醫藥學上可接受之鹽之用途，其用以製備調控一凋亡蛋白質表現量之藥物，該凋亡蛋白質為胱天蛋白酶原(pro-caspase 3)、胱天蛋白酶(cleaved-caspase 3)、Bcl-2蛋白質或Bax蛋白質。
一種請求項1之式(I)化合物萃取自檸檬黃青黴之方法，其包含：一抽取步驟，將一檸檬黃青黴浸泡於一乙醇溶液中進行抽取，以取得一乙醇抽取液；一第一濃縮步驟，濃縮該乙醇抽取液，以取得一乙醇抽取物；一分離步驟，將該乙醇抽取物溶於一丁醇/水混合液(n-BuOH：Water,1：1,v/v)，以取得一丁醇抽出液；一第二濃縮步驟，濃縮該丁醇抽出液，以取得一丁醇抽出物；以及一層析步驟，層析該丁醇抽出物，以純化出該式(I)化合物。