CN110078783A - 木通皂苷h及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了三叶木通中一种三萜苷类化合物木通皂苷H及其制备方法，涉及医药技术领域，具体是从三叶木通药材中，经一定的提取分离得到一种新的三萜苷类化合物，命名为木通皂苷H。木通皂苷H经超导核磁共振波谱等多种检测，确定其分子式为C₄₈H₇₈O₂₀，分子量为974，化学结构式为式Ⅰ。本发明公开了木通皂苷H的理化性质，并采用MTT法进行了体外活性筛选，结果表明对人胃癌细胞、人肝癌细胞、人结肠癌细胞、人卵巢癌细胞和人肺癌细胞均有抑制作用，可作为研制新型的抗肿瘤药物的先导化合物，也可作为研制治疗多种临床常见多发癌症的药物。

Description

木通皂苷H及其制备方法

技术领域

本发明涉及医药技术领域，特别是以三叶木通为原料，首次分离到的三萜苷类化合物木通皂苷H及其提取方法和用途。上述化合物对肿瘤细胞株具有抑制作用，可作为研制新的抗肿瘤药物的先导化合物，也可作为研制治疗多种临床常见多发癌症的药物。

背景技术

三叶木通(Akebia trifoliata(Thunb.)Koidz)为木通科(Iardizabala-ceoe)木通属(Akebia)的藤本植物。其质量标准收载于《中华人民共和国药典》2015年版一部。三叶木通味苦，性微寒，归心、小肠、膀胱经；具有利尿通淋、清心除烦、通经下乳的功效，临床上以其良好的利尿作用，广泛的用于治疗淋症、心烦尿赤、水肿、湿热痹痛等。现代药理研究表明木通属具有利尿、抑菌、抗炎及抗血栓等多种作用。

三叶木通所含化学成分复杂且结构多样，主要为三萜及其苷类成分，目前已经从三叶木通植物中分出三萜皂苷类化合物，其苷元类型包括常春藤皂苷元、去甲常春藤皂苷元、齐墩果烷皂苷元、去甲齐墩果烷皂苷元、阿江仁橄酸皂苷元、乌苏烷皂苷元等类型。

发明内容

本发明的一个方面涉及一种式I的三萜苷类化合物，其能够从三叶木通中提取得到。在本文中，式I的化合物可被命名为木通皂苷H，其分子式为C₄₈H₇₈O₂₀，其化学名为:2α,3β,23,29-四羟基齐墩果烷-12-烯-28-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖苷，其化学结构式如下：

本发明的另一方面涉及一种制备上述式I的化合物的方法。所述方法包括以下步骤：(1)乙醇加热回流；(2)浓缩乙醇提取液；(3)氯仿、乙酸乙酯、水饱和正丁醇依次萃取；(4)浓缩水饱和正丁醇萃取液；(5)柱层析分离；以及任选地(6)纯化。具体而言，所述方法包括以下步骤：

(1)用乙醇对三叶木通药材进行加热回流，过滤后得乙醇提取液；

(2)浓缩所述乙醇提取液，得乙醇浸膏；

(3)将所述乙醇浸膏用水溶解后，再用氯仿、乙酸乙酯、水饱和正丁醇依次萃取，保留水饱和正丁醇萃取相，得水饱和正丁醇萃取液；

(4)浓缩所述水饱和正丁醇萃取液，得正丁醇浸膏；

(5)对所述正丁醇浸膏进行柱层析分离，得式I得化合物的粗品；

(6)任选地对所述粗品进行化合物的纯化。

在所述方法的一种实施方式中，在步骤(1)中，优选以阴干的三叶木通药材为原料，经粉碎后用乙醇加热回流提取，过滤后得乙醇提取液。其中所用乙醇优选高浓度乙醇水溶液，例如大于70％，大于80％、大于90％，更优选70％-80％的乙醇水溶液，最优选为75％。

在一种实施方式中，在步骤(2)中，浓缩优选减压浓缩。

在一种实施方式中，在步骤(3)中，溶解使用的所述水优选蒸馏水。

在一种实施方式中，在步骤(4)中，浓缩优选减压浓缩。

在一种实施方式中，在步骤(5)中，柱层析分离优选包括以下步骤：(a)将正丁醇浸膏用水溶解，转入大孔树脂柱，用乙醇-水溶液梯度洗脱，将洗脱液进行薄层检验，浓缩合并类似洗脱馏分，得6个馏分；(b)将第4个馏分与硅胶拌样，转入柱层析，用氯仿-甲醇混合液梯度洗脱，将洗脱液进行薄层检验，浓缩合并类似洗脱馏分，得16个馏分；(c)将第12个馏分与C₁₈拌样，转入C₁₈反相柱层析，用乙腈-水溶液梯度洗脱，将洗脱液进行薄层检验，浓缩合并类似洗脱馏分，得所述式I的化合物的粗品。其中所述“类似洗脱馏分”意指在薄层板相同位置具有相同颜色的斑点，本领域技术人员知晓该术语的含义。其中所述术语“大孔树脂”采本领域公知的含义，是具有大孔结构的树脂，又称全多孔树脂。

其中，在步骤(5)(a)中作为洗脱剂的乙醇-水中，乙醇体积浓度可以为0％～100％；

在步骤(5)(b)中作为洗脱剂的氯仿-甲醇混合液中，氯仿-甲醇体积配比可以为从8:1到1:1；例如为8:1或5:1或3:1或2:1或1:1。在一些实施方式中，在步骤(5)(b)的柱层析中所用硅胶粒度优选为100～200目。

步骤(5)(c)中作为梯度洗脱剂的乙腈-水溶液中，甲醇体积浓度可以为15％～25％。

在一种实施方式中，所述方法的步骤(6)包括：将步骤(5)得到的粗品以乙腈-水为洗脱剂经制备液相色谱进行化合物的纯化。其中，乙腈水溶液的体积浓度可以为18％。步骤(6)也可以额外包括其他进一步的提纯步骤，例如重结晶等。

经步骤(6)纯化后，所得的化合物的纯度可以为，例如，至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、97％、98％、或99％，或更高。

以上工艺步骤(1)-(6)是相对独立的，所以上述各种实施方式可以任意组合，其组合所得技术方案和工艺条件都在本公开范围内。

本申请的式I的化合物的制备方法的一个示例性实施方案示于附图1中。

根据式I的结构，有机合成技术人员也可以适当地设计合成路线，通过有机合成的方法来制备式I的化合物。

发明人已经通过实验(例如测定抑制肿瘤细胞增殖的MTT法等)证明，本发明的化合物对人癌症细胞具有明显的抑制作用，例如对人胃癌细胞、人肝癌细胞、人结肠癌细胞、人卵巢癌细胞和人肺癌细胞均有明显的抑制作用。而且，本发明化合物对癌症的治疗作用体现在多种方面，例如，可以抑制癌细胞的增殖、迁移、侵袭、转移和/或凋亡等，特别是癌细胞的增殖、迁移和/或侵袭。

因此，本发明的另一个方面涉及药物组合物，其包含作为活性成分的式I的化合物以及可药用载体和/或赋形剂。对于可药用载体和赋形剂并无特殊要求，只要其满足相关药品监管规定并且与本发明的化合物相容即可。本领域技术人员可以根据给药途径、剂型等等来选择合适的可药用载体或赋形剂。

本文所用之“可药用载体”旨在包括与药物施用相容的任何及所有溶剂、分散介质、包衣剂、等渗剂和延缓吸收剂等。可药用载体可以是固体或液体的。示例性的固体载体是乳糖、蔗糖、云母、明胶、琼脂、果胶、阿拉伯胶、硬脂酸镁、硬脂酸等。示例性的液体载体是糖浆、花生油、橄榄油、水、药用缓冲液等。

示例性的可药用赋形剂的例子包括下述这些：填料，例如淀粉(例如，玉米淀粉、小麦淀粉、水稻淀粉、马铃薯淀粉等)、糖(包括乳糖、蔗糖、甘露糖醇或山梨糖醇等)；粘合剂，例如羧甲基纤维素和其它纤维素衍生物、褐藻酸盐、明胶和聚乙烯吡咯烷酮；保湿剂，例如甘油；崩解剂，例如聚维酮、乙醇酸淀粉钠、羧甲基纤维素钠、琼脂、碳酸钠和碳酸氢钠；用于延迟分解的试剂，例如石蜡；再吸收加速剂，例如季铵化合物；表面活性剂，例如鲸蜡醇、甘油单硬脂酸酯；吸附性载体，例如，高岭土和斑脱土以及润滑剂，例如，滑石、硬脂酸镁和硬脂酸钙以及固体聚乙二醇。

所述的药物组合物可以被配置为任何合适的剂型，例如液体剂型(例如溶液剂、悬浮剂、糖浆、乳剂等)或半固体剂型(例如软膏剂、凝胶剂等)或固体剂型(例如片剂、丸剂、颗粒、胶囊等)。根据需要，所述药物组合物的施用方式可以为，例如口服、肠胃外、皮内、皮下、肌内、腹膜内等。

本发明化合物可以与其他药物活性物质联合使用。所述其他药物活性物质可以与本发明的化合物同时施用或分别以任何合适次序施用。或者，本发明的药物组合物可含有超过一种活性成分。其它的活性物质可以为，例如抗有丝分裂作用的药物(例如紫杉醇或长春新碱等)、抗代谢药(例如吉西他滨等)、针对DNA的药物(例如阿霉素等)、针对拓扑异构酶的药物(如依托泊苷等)、针对肿瘤细胞中生物靶点的药物(例如郝赛酊等)。

所述药物组合物可以通过将至少一种本发明化合物(作为活性成分)与一种或多种可药用的载体或赋形剂组合来制备，所述载体和赋形剂能协助将活性化合物加工成最终的药物制剂。

本发明进一步涉及一种用于治疗哺乳动物(特别是人)的癌症的方法，所述方法包括如下步骤：向有此需要的对象施用治疗有效量的式I的化合物。

本发明进一步涉及一种用于治疗哺乳动物(特别是人)的癌症的方法，所述方法包括如下步骤：向有此需要的对象施用治疗有效量的本发明的药物组合物，所述药物组合物包含作为活性成分的式I的化合物以及可药用载体和/或赋形剂。

本发明还涉及式I的化合物用于治疗哺乳动物(特别是人)的疾病的用途，优选地，所述疾病为癌症。

本发明还涉及式I的化合物在制备用于治疗哺乳动物(特别是人)的癌症的药物中的用途。

上文所述“癌症”例如为乳癌、前列腺癌、膀胱癌、胰腺癌、肺癌、食管癌、喉癌、肝癌、结肠癌、甲状腺癌、黑素瘤、肾癌、睾丸癌、白血病、卵巢癌、胃癌、肝细胞癌等等。优选地，所述癌症为胃癌、肝癌、结肠癌、卵巢癌和/或肺癌。在一些实施方案中，所述癌症为卵巢癌、结肠癌和/或胃癌。在一些实施方案中，所述癌症为结肠癌。在一些实施方案中，所述癌症为卵巢癌。在一些实施方案中，所述癌症为胃癌。

术语“治疗有效量”在本文中使用时表示：当施用给需要治疗的哺乳动物(特别是人)时，足以起到有效治疗效果的本发明化合物或药物组合物的量。因此，本发明中的治疗有效量可以是足以抑制、减少或消除癌细胞的量。发明人已发现：本发明化合物对人胃癌细胞、人肝癌细胞、人结肠癌细胞、人卵巢癌细胞和人肺癌细胞均有明显的抑制作用。在具体治疗时，医生可以根据发病对象、病情严重程度、并发症的存在与否、是否联合用药等情况来调整并具体确定适合于病人使用的具体剂量。

术语“治疗”在本文中使用时表示：预防、缓解、消除或治愈相应的病症。

除非另有声明，本文中提到的化合物包括其无定形体、其各种晶型、其立体异构体、其互变异构体和经同位素标记的形式。所有这些以不同形式存在的化合物都落入本发明和给出的结构式的范围内。

术语“立体异构体”指具有相同化学组成但是其原子或基团空间排列不同的化合物。除非另有声明，本文所公开的化合物的所有立体异构体(例如对映异构体和非对映异构体及其外消旋混合物)都包含在本发明的化合物的范围内。此外，本文所公开的化合物的所有互变异构体或顺反异构体也都包含在本发明的化合物的范围内。可通过本领域技术人员公知的传统技术(例如分级分离结晶、手性色谱拆分等)来分离本发明化合物的各种异构体。

本发明还涵盖经同位素标记的本发明化合物，其中，一个或多个原子被具有相同原子序数但是原子量或质量数不同于在自然界中通常发现的原子量或质量数的原子替换。适于包括进本发明化合物的同位素的例子包括氢的同位素，例如²H和³H，碳的同位素，例如¹¹C、¹³C和¹⁴C，氧的同位素，例如¹⁵O、¹⁷O和¹⁸O。例如，掺入了放射性同位素的本发明化合物，可用于药物的组织分布研究。放射性同位素氚(即³H)和碳-14(即¹⁴C)特别适用于该目的，因为它们易于掺入并且容易被检测。通常可通过本领域技术人员已知的传统技术，来制备经同位素标记的本发明化合物。

附图说明

图1为本发明的三萜苷化合物木通皂苷H的提取的一个示例性实施方案的流程图。

图2为本发明的三萜苷化合物木通皂苷H的紫外光谱图。

图3为本发明的三萜苷化合物木通皂苷H的高分辨质谱图。

图4为本发明的三萜苷化合物木通皂苷H的¹H-NMR光谱图。

图5为本发明的三萜苷化合物木通皂苷H的¹³C-NMR光谱图。

图6为本发明的三萜苷化合物木通皂苷H的核磁共振HSQC光谱图。

图7为本发明的三萜苷化合物木通皂苷H的核磁共振HMBC光谱图。

图8为本发明的三萜苷化合物木通皂苷H的核磁共振NOESY光谱图。

图9为本发明的三萜苷化合物木通皂苷H的抗肿瘤细胞迁移的图。

图10为本发明的三萜苷化合物木通皂苷H的抗肿瘤细胞侵袭的图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步阐述。必须说明下述实施例是用于说明本发明而不是对本发明的限制。根据本发明的实质对本发明进行的简单改进都属于本发明要求保护的范围。

仪器和试剂

岛津2010系列高效液相色谱仪(日本岛津公司)和Aglient Technologies 1260高效液相色谱仪(美国安捷伦科技有限公司)，安捷伦1200型制备高效液相色谱仪，Perkin-Elmer 341旋光仪(美国PERKIN ELMER有限公司)，Waters ACQUITY UPLC/Xevo G2QTOF质谱仪(美国Waters有限公司)，Varian UNITY INOVA 600型超导核磁共振仪(美国Varian有限公司)，EYELA SB-1000旋转蒸发仪(日本EYELA公司产品)，RY-IG型熔点测定仪(中国天津天光光学仪器有限公司)，C₁₈反相填料为YMC生产，柱层析硅胶、薄层层析硅胶为青岛海洋化工厂生产。

乙腈为色谱纯，水为哇哈哈纯净水，其他试剂均为分析纯。

实施例1：三叶木通中三萜苷类化合物木通皂苷H的提取方法：

三叶木通药材于2016年10月20日采自安徽省六安市霍山县，经江西省药品检验检测研究万林春副主任中药师鉴定为木通科木通属植物三叶木通Akebia trifoliata(Thunb.)Koidz的干燥藤茎。标本保留在江西省药品检验检测研究标本室(标本号JXSYJY20161020)

三萜苷类化合物木通皂苷H的提取分离步骤依次如下：

(1)乙醇加热回流提取：三叶木通阴干后粉碎，经粉碎后的连钱草药材50.0Kg，用75％用乙醇加热回流提取3次，过滤，得75％乙醇提取液；

(2)浓缩75％乙醇提取液：将75％乙醇提取液EYELA SB-1000旋转蒸发仪(日本EYELA公司产品)减压浓缩得乙醇浸膏9.4Kg，在减压浓缩过程中回收乙醇；

(3)萃取：把75％乙醇浸膏用蒸馏水溶解，再依次用氯仿、乙酸乙酯、水饱和正丁醇分别萃取3次，得正丁醇萃取液；

(4)浓缩正丁醇萃取液：将正丁醇提取液EYELA SB-1000旋转蒸发仪(日本EYELA公司产品)减压浓缩得正丁醇浸膏1450g，在减压浓缩过程中回收正丁醇；

(5)柱层析分离：将正丁醇浸膏用水溶解，转入大孔树脂柱，用乙醇-水洗脱液梯度洗脱，乙醇-水体积配比为0:100或10:90或30:70或50:50或70:30或100:0；将洗脱液进行薄层检验，浓缩合并类似洗脱馏分，得6个馏分；将第4个馏分与硅胶拌样，转入柱层析，硅胶粒度100～200目，用氯仿-甲醇洗脱液梯度洗脱，氯仿-甲醇体积配比为8:1或5:1或3:1或2:1或1:1；将洗脱液进行薄层检验，EYELA SB-1000旋转蒸发仪(日本EYELA公司产品)浓缩合并类似洗脱馏分，得16个馏分，第12个馏分与C₁₈拌样，转入C₁₈反相柱层析，用乙腈-水洗脱液梯度洗脱，乙腈体积浓度为15％～25％，将洗脱液进行薄层检验，EYELA SB-1000旋转蒸发仪(日本EYELA公司产品)浓缩合并类似洗脱馏分，得木通皂苷H粗品；

(6)单体化合物的纯化：木通皂苷H粗品经(岛津2010系列高效液相色谱仪(日本岛津公司)或Aglient Technologies 1260高效液相色谱仪(美国安捷伦科技有限公司))确定制备流动相的比例为乙腈-水(18:82，v/v)，以乙腈-水(18:82，v/v，7mL/min)为洗脱液，经(安捷伦1200型制备高效液相色谱仪)制备液相得本发明的木通皂苷H。

实施例2：三萜苷类化合物木通皂苷H的结构鉴定：

鉴定得到一种新三萜苷类化合物，分子式为C₄₈H₇₈O₂₀，命名为木通皂苷H，其化学结构式为：

表1为该新三萜苷化合物的核磁数据(Varian UNITY INOVA 600型超导核磁共振仪(美国Varian有限公司))：¹H-NMR与¹³C-NMR在pyridine-d₅中。

表1：本发明的三萜苷类化合物木通皂苷H的核磁数据。

本发明新三萜苷化合物木通皂苷H的结构鉴定与推导请参阅图2-8。

木通皂苷H：白色粉末，溶于甲醇。经RY-IG型熔点测定仪(中国天津天光光学仪器有限公司)测定熔点为240-241℃，Perkin-Elmer 341旋光仪(美国PERKIN ELMER有限公司)测定[α]²⁰ _D-8.8(c 0.034，MeOH)；UV-260紫外分光光度计(日本岛津公司)测定UV(MeOH)λ_max(logε)：200.80(0.459)nm。通过Waters ACQUITY UPLC/Xevo G2QTOF质谱仪(美国Waters有限公司)测定HRESIMS m/z 973.5004[M–H]^–，(计算值C₄₈H₇₇O₂₀，973.5008)。确定其分子式为C₄₈H₇₈O₂₀。

¹H NMR谱高场区显示6个三萜类特征甲基单峰信号，其中1个分裂的甲基信号δ_H1.70(3H，d，J＝6.0Hz)，和5个甲基单峰信号δ_H 1.17，1.15，1.10，1.08和1.06(各3H，s)，高场区可见一个宽单峰乙烯基质子信号δ_H 5.43(1H，br s)，4个连氧次甲基信号δ_H 4.20(1H，m)，3.70(1H，d，J＝10.2Hz)和3.53(2H，s)，2个羟甲基信号4.27(1H，m)，4.19(1H，m)；以及3个糖上端基质子信号δ_H 6.24(1H，d，J＝8.4Hz)，5.83(1H，s)，5.00(1H，d，J＝7.8Hz)。

¹³C NMR谱显示48个碳信号，除去糖的18个碳信号，剩余30个碳，同时¹³C NMR谱还给出2个烯碳信号δ123.4(C-12)、δ144.9(C-13)，表明该化合物可为齐墩果烷-12-烯型五环三萜。

该化合物用5％H₂SO₄酸水解并将单糖分离，经与标准品进行TLC对照及比旋光度对比，证明所得到的三个糖分别为D-葡萄糖和L-鼠李糖。由其中2个糖端基质子耦合常数分别为(J＝7.2Hz)和(J＝7.8Hz)，判断这2个糖其相对构型为β构型，确定该化合物含2个β-D-葡萄糖。鼠李糖端基碳构型由其C-5的化学位移为70.9，确定该鼠李糖为α构型。

HMBC谱(图7)显示，Glc1-1(δ_H 6.25)与C-28(δ177.2)相关，Glc2-1(δ_H 5.00)与Glc1-6(δ69.7)相关，Rha(δ_H 5.85)与Glc2-4(δ78.7)相关，表明葡萄糖1与三萜母核的C-28位相连，葡萄糖2与葡糖糖1的6位相连，鼠李糖与葡糖糖2的4位相连。母核δ_H 2.30、δ_H 1.37(δ_C 48.3)与δ_C 18.0(C-25)、δ_C 38.8、δ_C 78.7、δ_C 69.5和δ_C 48.7相关；δ_H 3.68(δ_C 67.0)与δ_C 15.0(C-24)、δ_C 44.2、δ_C 48.5和δ_C 78.7相关，得知δ_C 48.3为C-1，δ_C 69.5为C-2，δ_C78.7为C-3，δ_C 44.2为C-4，δ_C 48.5为C-5，δ_C 67.0为C-23。δ_H 3.53(δ_C 74.2)与δ_C 20.2(C-30)、δ_C 29.4、δ_C 36.9和δ_C 41.5相关，δ_H 3.28(H-18)与δ_C 48.0和δ_C 41.5相关，说明δ_C74.2为C-29，δ_C 36.9为C-20，δ_C 41.5为C-19，δ_C 29.4为C-21。

NOESY谱(图8)H-2/H-25，H-3/H-23，H-23/H-5，H-18/H-30均分别有相关，说明2位羟基为α构型，3位羟基为β构型，24，30位甲基均为β构型。综合以上信息，可确定此新三萜苷为上述结构。

实施例3：三萜苷类化合物木通皂苷H的体外抗肿瘤活性测试：

肿瘤细胞生长抑制率(％)＝(空白对照孔测试值-试验孔测定值)/空白对照孔测定值×100％

测试原理：MTT法：活细胞线粒体中存在着与NAPP(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸，辅酶Ⅱ)相关的脱氢酶，琥珀酸脱氢酶能使外源性黄色的噻唑蓝MTT(3-(4,5)-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四唑)还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒(Formazan)并沉积在细胞中，死细胞中此酶消失，MTT不被还原。用二甲亚砜(DMSO)溶解甲瓒后可用酶标仪在570nm，630nm处检测吸光度，光密度值与活细胞数成正比。

试验材料：木通皂苷H、木通皂苷D、木通皂苷E(三个化合物均五为本实验室从三叶木通中分离纯化制得)，紫杉醇(购自中国药品生物制品检定所，编号：1534-200001)，顺铂(购自中国药品生物制品检定所，编号：100401-200501)，环磷酰胺(购自sigma公司，编号：120M1253V)，10％S9混合液:临用前以9ml辅助因子储备液加1ml S9组分混合。

试验细胞：BGC-823(人胃癌细胞)、Bel7404(人肝癌细胞)、HCT-8(人结肠癌细胞)、A2780(人卵巢癌细胞)和A549(人肺癌细胞)(均购自ATCC公司)。

试验方法：MTT法：取对数生长细胞，消化后充分吹打成单细胞悬液，计数后稀释成1×10⁴细胞/mL，接种于96孔培养板中，每孔加入100μL细胞悬液，置于37℃/5％CO₂饱和湿度培养箱中培养24小时后，弃去原培养液。样品组每孔加入100μL含有各浓度梯度的木通皂苷H、木通皂苷D和木通皂苷E的培养基，每个样品设9个浓度梯度；阳性对照组每孔加入100μL含有各浓度梯度的紫杉醇(BGC-823、A2780、A549阳性对照)、顺铂(HCT-8阳性对照)、环磷酰胺(Bel7404阳性对照，每孔加自制的10％S9混合液10μL活化)的培养基，每个阳性对照品设6个浓度梯度；空白对照组加入等体积溶剂；每一浓度平行6孔。将96孔培养板置于37℃，5％CO₂饱和湿度培养箱中培养72小时后，每孔加入新鲜配置的含5mg/mLMTT的无血清培养基20μL，37℃下继续培养4小时后，去除上清液。每孔加入150μLDMSO溶解Formazan沉淀，置微量震荡器上震荡5分钟使其充分溶解。在酶标仪上测定570nm，630nm处的吸光度，可反映活细胞数量。通过SPSS软件计算药物的抑制浓度(IC₅₀)值。

表2木通皂苷H对BGC-823(人胃癌细胞)的抑制作用

表3木通皂苷H对Bel7404(人肝癌细胞)的抑制作用

表4木通皂苷H对HCT-8(人结肠癌细胞)的抑制作用

表5木通皂苷H对A2780(人卵巢癌细胞)的抑制作用

表6木通皂苷H对A549(人肺癌细胞)的抑制作用

结论：木通皂苷H对人BGC-823(人胃癌细胞)、Bel7404(人肝癌细胞)、HCT-8(人结肠癌细胞)、A2780(人卵巢癌细胞)和A549(人肺癌细胞)均有明显的抑制作用，可用作治疗或用于研究治疗癌症或肿瘤的药物。木通皂苷H对BGC-823(人胃癌细胞)、HCT-8(人结肠癌细胞)、A2780(人卵巢癌细胞)显示出比木通皂苷D和E更强的抑制作用。

实施例4木通皂苷H的体外抗肿瘤迁移和侵袭测试

1.迁移测试

所用细胞株为：BGC-823(人胃癌细胞)、A2780(人卵巢癌细胞)。

实验方法：

(1)取出oris-compatible 96孔板，垂直插入配套的stoppers，检查stoppers，确保完全垂直插入对应的孔且紧密密封于孔的底部，然后放入37℃培养箱预热1h。

(2)收集对数期生长的细胞(BGC-823，A2780)制成细胞悬液，调整细胞密度至0.3X10⁶个/ml。

(3)将上述调整好浓度的细胞分别取100ul加入预热的含有stoppers的oris-compatible 96孔板，最终每孔细胞浓度为0.3X10⁵个/孔，加入后轻微水平晃动96孔板使细胞悬液分布均匀，放入5％CO₂，37℃细胞培养箱培养。

(4)实验分组：设含25ng/ml EGF药物组(0.5μmol/L，0.1μmol/L)，25ng/ml EGF药物组(0.5μmol/L，0.5μmol/L)，25ng/ml EGF组，空白组(无EGF)，EGF阳性药组(BB-94)，每组设3个复孔。

(5)待细胞过夜单层贴壁后，垂直取下stoppers，小心吸尽培养基，用PBS清洗两遍。加入不同浓度的含药培养基，培养72h。

(6)72h后取出培养板，每孔加入100μL甲醇固定10min，0.5％结晶紫染色30min，利用荧光倒置显微镜拍照。

2.侵袭测试

所用细胞株为：BGC-823(人胃癌细胞)、A2780(人卵巢癌细胞)

实验方法：

(1)收集对数期生长的细胞(BGC-823，A2780)制成细胞悬液，调整细胞密度至0.5X10⁶个/ml。

(2)将上述调整好的浓度的细胞分别取100ul加入4℃预冷已含有stoppers且用Collagen I包被的oris-compatible 96孔板，最终每孔细胞浓度为0.5X10⁵个/孔，加入后轻微水平晃动96孔板使细胞悬液分布均匀，放入5％CO2，37℃细胞培养箱培养。

(3)实验分组：设含25ng/ml EGF药物组(0.5μmol/L，0.1μmol/L)，25ng/ml EGF药物组(0.5μmol/L，0.5μmol/L)，25ng/mlEGF组，空白组(无EGF)，EGF阳性药组(BB-94)，每组设3个复孔。

(4)待细胞过夜单层贴壁后，垂直取下stopper，小心吸尽培养基，用PBS清洗两遍。取稀释成一定浓度的Oris^TM Pro Collagen I Overlay，每孔加入40μL，将96孔板放入37℃细胞培养箱1h，待Collagen I胶凝固后，取出，加入不同浓度的含药培养基，培养72h。

(5)72h后取出培养板，每孔加入100μL甲醇固定10min，0.5％结晶紫染色30min，利用荧光倒置显微镜拍照。

小结：

在细胞的迁移(见图9)和侵袭(见图10)实验结果中，我们可以看出，经EGF处理72h后的BGC-823，A2780细胞组向中心空白圆形处迁移/侵袭的细胞数明显大于空白组。0.1μmol/L和0.5μmol/L的木通皂苷H均能抑制EGF处理后的细胞迁移和侵袭能力，而0.5μmol/L的木通皂苷H能显示更显著的抑制作用。表明木通皂苷H能对肿瘤细胞的迁移和侵袭能力有抑制作用。

Claims (10)

1.一种式I的化合物

2.一种药物组合物，其包含作为活性成分的权利要求1所述的式I的化合物以及可药用载体或赋形剂。

3.一种制备权利要求1所述的式I的化合物的方法，其包括以下步骤：

(1)用乙醇对三叶木通药材进行加热回流，过滤后得乙醇提取液；

(2)浓缩所述乙醇提取液，得乙醇浸膏；

(3)将所述乙醇浸膏用水溶解后，再用氯仿、乙酸乙酯、水饱和正丁醇依次萃取，保留水饱和正丁醇萃取相，得水饱和正丁醇萃取液；

(4)浓缩所述水饱和正丁醇萃取液，得正丁醇浸膏；

(5)对所述正丁醇浸膏进行柱层析分离，得式I得化合物的粗品；

(6)任选地对所述粗品进行化合物的纯化。

4.根据权利要求3所述的方法，其中步骤(5)包括：

(a)将正丁醇浸膏用水溶解，转入大孔树脂柱，用乙醇-水溶液梯度洗脱，将洗脱液进行薄层检验，浓缩合并类似洗脱馏分，得6个馏分；

(b)将第4个馏分与硅胶拌样，转入柱层析，用氯仿-甲醇混合液梯度洗脱，将洗脱液进行薄层检验，浓缩合并类似洗脱馏分，得16个馏分；

(c)将第12个馏分与C₁₈拌样，转入C₁₈反相柱层析，用乙腈-水溶液梯度洗脱，将洗脱液进行薄层检验，浓缩合并类似洗脱馏分，得式I的化合物的粗品。

5.根据权利要求3或4所述的方法，其中步骤(1)中的乙醇的体积浓度为从60％到90％。

6.根据权利要求4所述的方法，其中步骤(5)(a)中作为洗脱剂的乙醇-水溶液中乙醇的体积浓度为从0％到100％；其中步骤(5)(b)中作为洗脱剂的氯仿-甲醇混合液中氯仿-甲醇的体积配比为从8:1到1:1；和/或其中步骤(5)(c)中作为梯度洗脱剂的乙腈-水溶液中乙腈的体积浓度为从15％到25％。

7.根据权利要求3或4所述的方法，其中步骤(6)包括：将步骤(5)得到的所述粗品以乙腈-水为洗脱剂经制备液相色谱进行化合物的纯化。

8.根据权利要求3或4所述的方法，其中步骤(2)、(4)中的浓缩为减压浓缩。

9.权利要求1所述的式I的化合物在制备用于治疗癌症的药物中的用途。

10.根据权利要求9所述的用途，其中所述癌症选自以下中的一种或更多种：胃癌、肝癌、结肠癌、卵巢癌或肺癌。