CN117304032A - 断节参中一种甾体皂苷元化合物及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了断节参中一种甾体皂苷元化合物及其制备方法与应用，属于中药提取分离、植物化学及医药技术领域。本发明提供了从断节参中制备的一种甾体皂苷元化合物，将其命名为断节参皂苷元，经研究发现该化合物具有抗肿瘤活性；同时本发明还提供一种针对该化合物的简便、快速的提取分离方法。本发明提取分离工艺操作简单、易于控制，适合工业化生产；所得断节参皂苷元具有抗肿瘤的作用，在制备治疗胃癌、肝癌、结肠癌、卵巢癌和肺癌的药物中具有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于中药提取分离、植物化学及医药技术领域，具体涉及断节参中一种甾体皂苷元化合物及其制备方法与应用。
背景技术
传统中药材断节参为萝藦科鹅绒藤属(Asclepiadaceae CynanchumLinn.)植物昆明杯冠藤(Cynanchum wallichiiWight.)的根。断节参具有补肾壮腰，强筋骨，解毒之功效；常用于肾虚腰痛，足膝无力，跌打损伤，骨折，狂犬咬伤。
现代药理研究表明断节参具有α-葡萄糖苷酶活性，但未见关于断节参抗肿瘤的研究。断节参中所含化学成分复杂多样，目前从断节参中分离得到的主要为苯乙酮类、甾体类化合物，而对于甾体类化合物主要为甾体皂苷类化合物，对其苷元研究很少，仅有告达庭、青阳参皂苷元、加加明、喙牛（女弥）菜明、去酰基萝藦苷元5种化合物（结构式如下），但尚未见到8、14位开环形成酮基类甾体皂苷元化合物成分的报道。
发明内容
基于背景技术所述，本发明目的之一在于提供从断节参中制备一种甾体皂苷元化合物，该化合物具有新型结构与药理活性，为断节参药理作用研究提供了物质基础。
本发明目的之二在于提供从断节参中制备该化合物的方法，整个制备工艺操作简单、易于控制，适合工业化生产。
本发明目的之三在于提供该化合物抗肿瘤的作用，为发掘潜在的抗肿瘤新药提供有力依据。
为实现上述目的，本发明具体采用如下技术方案：
本发明提供了从断节参中制备的一种甾体皂苷元化合物，将其命名为断节参皂苷元，经研究发现该化合物具有抗肿瘤活性。
所述化合物的分子式为C30H36O7，化学结构式如下所示：
。
本发明还提供了上述甾体皂苷元化合物的制备方法，包括如下步骤：
步骤1、用硫酸乙醇溶液对断节参回流提取，将提取液减压浓缩得到无醇干浸膏；
步骤2、无醇干浸膏加水混悬，然后采用乙酸乙酯萃取，将所得乙酸乙酯萃取液减压浓缩，得到乙酸乙酯萃取浓缩物；
步骤3、取步骤2所得乙酸乙酯萃取浓缩物经硅胶柱层析，以三氯甲烷-甲醇为洗脱剂梯度洗脱，经薄层色谱检视合并得到9个馏分；
其中，洗脱剂三氯甲烷-甲醇体积配比为50：1、20：1、17：1、15：1、12：1、10：1、7：1、5：1、3：1；
步骤4、取步骤3所得其中一个馏分经硅胶柱层析，以石油醚-乙酸乙酯为洗脱剂梯度洗脱，经薄层色谱检视合并得到4个馏分；
其中，洗脱剂石油醚-乙酸乙酯体积配比为8：1、6：1、4：1、2：1、1：1、0：1；
步骤5、取步骤4所得其中一个馏分经C18中压柱层析，以甲醇-水为洗脱剂梯度洗脱，经高效液相色谱检视合并得到5个馏分；
其中，洗脱剂甲醇-水体积配比为10：90、30：70、50：50、60：40、70：30、80：20、100：0；
步骤6、取步骤5所得其中一个馏分经反相高效制备液相色谱，以乙腈-0.01%三氟乙酸为流动相，制备得到甾体皂苷元化合物；
其中，流动相乙腈-0.01%三氟乙酸体积比为33：67，体积流量为20 mL/min；
作为优选，步骤1、步骤2减压浓缩条件均为：温度50℃，转速60 rpm，真空度40mbar。
本发明还提供了上述甾体皂苷元化合物在制备用于治疗癌症的药物中的应用。
作为优选，所述癌症为胃癌、肝癌、结肠癌、卵巢癌或肺癌。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1、本发明从断节参药材中制备得到了一种结构新颖的甾体皂苷元化合物，还根据氢谱碳谱等相关数据确定了其分子构型。
2、本发明以断节参药材为原料，通过硫酸乙醇回流提取、减压浓缩、萃取、色谱分离等步骤得到该甾体皂苷元化合物，整个制备工艺操作简单、易于控制，适合工业化生产。
3、体外生物活性实验表明，本发明断节参皂苷元对胃癌、肝癌、结肠癌、卵巢癌或肺癌细胞均具有明显的抑制作用，在制备治疗癌症的药物中具有良好的应用前景。
附图说明
图1为化合物断节参皂苷元的结构图。
图2为断节参皂苷元的高分辨质谱图。
图3为断节参皂苷元的UV光谱图。
图4为断节参皂苷元的1H-NMR谱图。
图5为断节参皂苷元的13C-NMR谱图。
图6为断节参皂苷元的HSQC谱图。
图7为断节参皂苷元的HMBC谱图。
图8为断节参皂苷元的1H-1H COSY谱图。
图9为断节参皂苷元的NOESY谱图。
具体实施方式
下面将结合本申请实施例中的附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。以下对至少一个示例性实施例的描述实际上仅仅是说明性的，决不作为对本申请及其应用或使用的任何限制。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。
实施例1 断节参中断节参皂苷元的提取分离
1、取断节参9.5 kg，粉碎后用硫酸与75%乙醇的混合溶液（硫酸占乙醇体积的0.5%）回流提取2次，每次2小时，合并提取液减压浓缩得到无醇干浸膏。无醇干浸膏加入其20倍重量的去离子水混悬得到混悬液，采用乙酸乙酯萃取三次，合并乙酸乙酯萃取液并减压浓缩至干，得到乙酸乙酯萃取浓缩物213.2 g。
2、取所得乙酸乙酯萃取浓缩物，经硅胶柱（硅胶粒度100-200目）层析，用三氯甲烷-甲醇（体积比50：1、20：1、17：1、15：1、12：1、10：1、7：1、5：1、3：1）为洗脱剂梯度洗脱（每个梯度体积比洗脱时间均为0.5 h）。收集洗脱液，每1 L收集一份并依次编号，将收集的洗脱液依次经薄层色谱检视，合并相近的组分，得到9个馏分记为F1~F9；其中得到38.42 g馏分F6，馏分F6为第37-43份洗脱液合并得到。
3、取所得馏分F6经硅胶柱（硅胶粒度100-200目）层析，用石油醚-乙酸乙酯（体积比8：1、6：1、4：1、2：1、1：1、0：1）为洗脱剂梯度洗脱（每个梯度体积比洗脱时间均为1.5 h）。收集洗脱液，每500 mL收集一份并依次编号，将收集的洗脱液依次经薄层色谱检视，合并相近的组分，得到4个馏分记为F6-1~F6-4；其中得到11.43 g馏分F6-4，馏分F6-4为第28-35份洗脱液合并得到。
4、取所得馏分F6-4经C18中压柱层析，用甲醇-水（体积比10：90、30：70、50：50、60：40、70：30、80：20、100：0）为洗脱剂梯度洗脱（每个梯度体积比洗脱时间均为2 h）。收集洗脱液，每500 mL收集一份并依次编号，将收集的洗脱液依次经高效液相色谱检视，合并相近的组分，得到5个馏分记为F6-4-1~F6-4-5；其中得到192.33 mg馏分F6-4-4，馏分F6-4-4为第23-29份洗脱液合并得到。
5、取所得馏分F6-4-4经反相高效制备液相色谱，以乙腈-0.01%三氟乙酸（体积比33：67，流量为20 mL/min）为流动相，制备得到断节参皂苷元（16.85 mg）。
实施例2 结构解析与鉴定
取实施例1所得断节参皂苷元，其为白色粉末，溶于甲醇，Perkin-Elmer 341旋光仪测定 [α]20 D为+35.8 (c0.155, MeOH)；UV-260紫外分光光度计测定紫外UV (MeOH)λ max(logε): 202.2 nm, 217.2 nm, 280.6 nm；通过Waters ACQUITY UPLC/Xevo G2 Q TOF测得HRESIMSm/z507.2382 [M－H]－(calcd for C30H35O7, 507.2383)，确定其分子式为C30H36O7。
1H-NMR谱显示了3个甲基氢信号δ H0.85 (3H, s)、1.91 (3H, s)和2.58 (3H, s)，一个烯烃质子氢信号δ H5.23 (1H, m)，两个连氧次甲基[δ H3.78 (1H, m)和5.82 (1H, dd,J= 1.2, 10.2 Hz)]，以及1组肉桂酰基信号，[δ H6.83 (1H, d,J= 15.6 Hz, H-2′ ), 7.35(3H, m, H-5′, 7′, 9′), 7.64 (2H, m, H-6′, 8′)和8.01 (1H, d, J = 16.2 Hz, H-3′)]。
13C-NMR谱揭示了30个信号，包括6个芳烃碳(δ C135.3，131.3，2个129.8和2个129.2)、4个烯烃碳(δ C146.4，143.4，2个118.6)、3个含氧烷基碳(δ C86.5，71.1和70.6)和4个羰基碳(δ C215.5，210.6，210.2和167.5)，并通过HSQC谱归属了每个碳谱对应的氢谱化学位移。
在1H-1H COSY谱中显示存在C-1(δ C38.1)-C-2(δ C32.2)-C-3(δ C70.6)-C-4(δ C42.7)，C-6(δ C118.6)-C-7(δ C41.9)，C-9(δ C56.3)-C-11(δ C25.4)-C-12(δ C71.1)，C-15(δ C34.2)-C-16(δ C29.5)片段，同时HMBC谱显示H-12(δ H5.82)和C-1′(δ C167.5)相关，H-7(δ H3.29)和C-5(δ C143.4)、C-6(δ C118.6)、C-8(δ C210.6)相关，H-21(δ H2.58)和C-20(δ C210.2)、C-17(δ C86.5)相关，H-18(δ H1.91)和C-12(δ C71.1)、C-13(δ C63.1)、C-14(δ C215.5)、C-17(δ C86.5)相关，H-4(δ H2.63)和C-2(δ C32.2、C-3(δ C70.6)、C-5(δ C143.4)、C-6(δ C118.6)、C-10(δ C43.6)相关。
在NOESY谱中，H-9与H-12、H-21、H-2a相关，H-3与H-2a相关，说明3位、12位、17位羟基均β构型。
断节参皂苷元的高分辨质谱图如图2所示；UV光谱图如图3所示；1H-NMR谱、13C-NMR谱、HSQC谱、HMBC谱、1H-1H COSY谱、NOESY谱、分别见图4-图9，由图4-图9确证了本发明断节参皂苷元的结构。
表1为断节参皂苷元的核磁数据：1H-NMR(600 MHz)与13C-NMR(150 MHz)在CD3OD中。
表1 断节参皂苷元的1H-NMR、13C-NMR核磁数据
实施例3 断节参皂苷元体外抗肿瘤活性测试
测试原理：MTT法：活细胞线粒体中存在着与NAPP（烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸，辅酶Ⅱ）相关的脱氢酶，琥珀酸脱氢酶能使外源性黄色的噻唑蓝MTT（3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四唑）还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，死细胞中此酶消失，MTT不被还原。用二甲亚砜（DMSO）溶解甲瓒后可用酶标仪在570 nm，630 nm处检测吸光度，光密度值与活细胞数成正比。
所用细胞株为：BGC-823（人胃癌细胞）、7721（人肝癌细胞）、HCT-8（人结肠癌细胞)、A2780（人卵巢癌细胞）和A549（人肺癌细胞)。
试验方法：MTT法：取对数生长细胞，消化后充分吹打成单细胞悬液，计数后稀释成1×105个/mL，接种于96孔培养板中，每孔加入100 μL细胞悬液，置于37℃、5% CO2的培养箱中培养24小时后，弃去原培养液。每一样品设计6个浓度梯度，然后在试验孔中加入100 μL含有各浓度梯度的样品的培养基，每一浓度平行6孔。将96孔培养板置于37℃、5% CO2饱和湿度培养箱中培养72小时后，每孔加入新鲜配制的含5 mg/mL MTT的无血清培养基20 μL，37℃下继续培养4小时后，去除上清液。每孔加入150 μL DMSO溶解甲瓒沉淀，震荡5分钟，在酶标仪上测定570 nm，630 nm处的吸光度，可反映活细胞数量。通过SPSS软件计算药物的抑制浓度（IC50）值。
计算公式如下：肿瘤细胞生长抑制率（%）=（1-试验孔测定值/对照孔测定值）×100%。
表2 断节参皂苷元对BGC-823（人胃癌细胞）的抑制作用
表3 断节参皂苷元对7721（人肝癌细胞）的抑制作用
表4 断节参皂苷元对A2780（人卵巢癌细胞）的抑制作用
表5断节参皂苷元对A549（人肺癌细胞）的抑制作用
表6 断节参皂苷元对HCT-8（人结肠癌细胞）的抑制作用
可见，断节参皂苷元对BGC-823（人胃癌细胞）、7721（人肝癌细胞）、HCT-8（人结肠癌细胞）、A2780（人卵巢癌细胞）和A549（人肺癌细胞）均有明显的抑制作用，可用作治疗或用于研究治疗癌症或肿瘤的药物。
最后需要强调的是，以上所述仅为本发明的优选实施例，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种变化和更改，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (6)
1.从断节参中制备的一种甾体皂苷元化合物，其特征在于，所述甾体皂苷元化合物的化学结构式如下所示：
。
2.如权利要求1所述甾体皂苷元化合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1、用硫酸乙醇溶液对断节参回流提取，将提取液减压浓缩得到无醇干浸膏；
步骤2、无醇干浸膏加水混悬，然后采用乙酸乙酯萃取，将所得乙酸乙酯萃取液减压浓缩，得到乙酸乙酯萃取浓缩物；
步骤3、取步骤2所得乙酸乙酯萃取浓缩物经硅胶柱层析，以三氯甲烷-甲醇为洗脱剂梯度洗脱，经薄层色谱检视合并得到9个馏分；
其中，洗脱剂三氯甲烷-甲醇体积配比为50：1、20：1、17：1、15：1、12：1、10：1、7：1、5：1、3：1；
步骤4、取步骤3所得其中一个馏分经硅胶柱层析，以石油醚-乙酸乙酯为洗脱剂梯度洗脱，经薄层色谱检视合并得到4个馏分；
其中，洗脱剂石油醚-乙酸乙酯体积配比为8：1、6：1、4：1、2：1、1：1、0：1；
步骤5、取步骤4所得其中一个馏分经C18中压柱层析，以甲醇-水为洗脱剂梯度洗脱，经高效液相色谱检视合并得到5个馏分；
其中，洗脱剂甲醇-水体积配比为10：90、30：70、50：50、60：40、70：30、80：20、100：0；
步骤6、取步骤5所得其中一个馏分经反相高效制备液相色谱，以乙腈-0.01%三氟乙酸为流动相，制备得到甾体皂苷元化合物；
其中，流动相乙腈-0.01%三氟乙酸体积比为33：67，体积流量为20 mL/min。
3.根据权利要求2所述制备方法，其特征在于，步骤1、步骤2减压浓缩条件均为：温度50℃，转速60 rpm，真空度40 mbar。
4.一种药物组合物，其特征在于，其包含作为活性成分的权利要求1所述的甾体皂苷元化合物，以及可药用载体或赋形剂。
5.权利要求1中甾体皂苷元化合物在制备用于治疗癌症的药物中的应用。
6.根据权利要求5所述应用，所述癌症为胃癌、肝癌、结肠癌、卵巢癌或肺癌。
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