DE3611168A1

DE3611168A1 - Neue tpi genannte chemische verbindungen, deren herstellung und deren verwendung als physiologisch wirksame substanzen

Info

Publication number: DE3611168A1
Application number: DE19863611168
Authority: DE
Inventors: Masashi Awata; Kenji Mishima Shizuoka Kinoshita; Masaki Shizuoka Takada; Satoshi Yaginuma
Original assignee: Toyo Jozo KK
Current assignee: Asahi Kasei Corp
Priority date: 1985-04-02
Filing date: 1986-04-01
Publication date: 1986-11-06
Anticipated expiration: 2006-04-02
Also published as: FR2579599B1; GB2174696B; FR2579599A1; DE3611168C2; GB8608046D0; GB2174696A; US4801697A

Description

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Patentanwälte O C 1 1 1 £ ο

European Patent Attorneys ν 0 I I IDO

Franz G. Holländer, Dipl.-Geophysiker · Ludgerus A. Meyer, Dipl.-Ingenieur Jungfernstieg 38, 2000 Hamburg 36, Tel.: (040) 34 36 36, Telegramme: Fraghollaender Hamburg, Telex: 214 811 hoku d

Toyo Jozo Kabushiki Kaisha Hamburg, 29.03.86

632-1, Mifuku, Ohito-cho

Tagata-gun, Shizuoka-ken, Japan 303186

Neue TPI genannte chemische Verbindungen, deren Herstellung und deren Verwendung als physiologisch wirksame Substanzen

Die Erfindung bezieht sich auf neue chemische Verbindungen, die als TPI bezeichnet werden, Verfahren zu deren Herstellung sowie deren Verwendung als physiologisch wirksame Substanzen, die inhibierende Wirkung auf Phosphodiesterase für cyclisches Adenosin-3¹ ,5 '-monophosphat haben.

Es ist bekannt, daß cyclisches Adenosin-3¹ ,5'-monophosphat (das nachstehend als cycl.AMP bzw. c-AMP bezeichnet wird) im lebenden Organismus als sogenannter "zweiter Bote" für Zellmembran-Funktion sowie auf Zellwachstum oder Differenzierung zu wirken vermag. Ein Enzym, das den Abbau von c-AMP zu 5'-Adenosinmonophosphat (nachstehend als 5'-AMP bezeichnet) katalysiert, ist cyclisches Adenosin-3' ,5'-monophosphat-phosphodiesterase (nachstehend als PDE bezeichnet) , und ein Inhibitor für PDE kann den c-AMP -

Spiegel in vivo erhöhen. Es ist bekannt, daß dadurch zahlreiche Effekte bewirkt und/oder beeinflußt werden können, beispielsweise Dilatation der Bronchien, Kontraktilität des Herzmuskels, Spannung von glatter Muskulatur und Freisetzung von Hormonen.

Man kennt schon aus Mikroorganismen hergestellte PDE-Inhibitoren, beispielsweise PDE-I und PDE II (Agr. Biol. Chem., 42 (7), 1331-1336 (1978)), Tterferol (J. Antibiotics, 37 (1), 6-9 (1984)), CC-1065 (ebenda, 33(8), 902-903 (198O)) und Reticulol (ebenda, 28(7), 558-560 (1975)), hergestellt aus Streptomycas. Auch mittels Bakterien gewonnene Substanzen sind bereits bekannt, beispielsweise APD-I, APD-II und APD-III (ebenda, 36 194-196 (1983)). Es sind weiterhin synthetische Chemikalien, zum Beispiel Theophyllin und Papaverin, als PDE-Inhibitoren bekannt. Diese werden beispielsweise als Bronchodilatatoren und Vasodilatatoren eingesetzt.

Es ist im Hinblick auf medizinische Behandlungsmöglichkeiten aus serordentlich wichtig, Mikroorganismen zu finden, die physiologisch aktive Substanzen zu produzieren vermögen, und besonders wichtig für die medizinische Anwendung und für Forschungszwecke zur Untersuchung von c-AMP ist es, daß man daraus einzelne Zellen zu reinen Kulturen zu vermähren in der Lage ist, aus denen sich PDE-Inhibitoren gewinnen lassen.

Erfindungsgemäß wurden überraschend neue chemische Substanzen gefunden, die sich durch Mikroorganismen gewinnen lassen, und die als physiologisch aktive Substanzen verwendet werden können, welche Hemmwirkung gegen PDE-Aktivität aufweisen. Ein Verfahren zur Herstellung der neuen Substanzen besteht darin, daß man eine Kultur eines Mikroorganismus der Gattung Nodulisporium züchtet

- y-

und daraus die aktiven Bestandteile isoliert, die als neue Substanzen identifiziert wurden. Diesen neuen Substanzen wurden die Bezeichnungen TPI-I, TPI-2, TPI-3 und TPI-4 gegeben, und eine weitere ähnliche erfindungsgemäße Substanz, die durch Abspalten des Zucker-Restes aus diesen Substanzen durch eine Einwirkung von Glykosidase auf eine der Verbindungen TPI-I, TPI-2, TPI-3 und TPI-4 erhalten werden konnte, wurde TPI-5 benannt.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind dementsprechend neue chemische Substanzen der nachstehenden Formel (I)

CH₂(CH₂)₅CH₃

worin R für einen ß-D-Glucopyranosyl-, ß-D-Galaktopyranosyl-, 6'-0-Acatyl-ß-D-glucopyranosyl- oder ö'-O-Acetylß-D-galaktopyranosyl-Rest oder für ein Wasserstoff atom oder für ein Salz davon steht. Diese neuen chemischen Substanzen der Formel (I) werden insgesamt TPI und speziell TPI-I, TPI-2, TPI-3, TPI-4 und TPI-5 genannt, und ein erfindungsgemäßes Verfahren zu deren Herstellung ist dadurch gekennzeichnet, daß man einen TPI-produzierenden Mikroorganismus der Gattung Nodulisporium züchtet und aus der Kultur TPI isoliert.

Die Erfindung betrifft weiterhin die Verwendung der neuen Substanzen als physiologisch aktive Stoffe, die als Inhibitoren gegen PDE-Aktivität zu wirken vermögen.

-λ-

In der nachstehenden Tabelle ist die Zuordnung der Reste R in der Formal (I) zu den einzelnen Benennungen der Substanzen veranschaulicht.

Benennung der _

Substanz

TPI-I ß-D-Glucopyranosyl

TPI-2 ß-D-Galaktopyranosyl

TPI-3 ö'-O-Acetyl-ß-D-glucopyranosyl

TPI-4 6' -O-Acatyl-ß-D-galaktopyränosyl

TPI-5 Wasserstoff

Eine erfindungsgemäße und physiologisch aktive Substanz TPI der nachstehenden Formel (II)

(II)

worin R¹ für einen ß-D-Glucopyranosyl-, einen ß-D-Galaktopyranosyl-, einen 6 '-O-Acetyl-ß-D-glucopyranosyl- oder einen ö'-O-Acetyl-ß-D-galäftopyranosyl-Rest steht, läßt sich mittels eines Mikroorganismus der Spezies M522O gewinnen. Dieser Mikroorganismus hat die folgenden taxonomischen Eigenschaften.

(1) Morphologische Eigenschaften:

Es wurden die folgenden Beobachtungen auf Czapek-Agar-Nährboden, Malzextrakt-Ägar-Nährboden und Kartoffel-Glucose-Agar-Nährboden gemacht.

Das vegetative Myzel hat einzelne haarartige Form oder nebeneinander liegende Fadenform, ist gelblich, gestreckt, 2,5-3 ,um dick und hat glatte Oberfläche. Die Conidiophoren haben eine Abmessung von 50 - 130 χ 2,5 - 3,0 ,um, sind farblos bis hellgelb, verzweigt, mit Septen und glatter Oberfläche. Die Coni dien-Ze Ilen sind singular oder spiralförmig mit 2-3 Spiralen am Kopf der Coni di op höre, haben eine Größe von 6 - 20 χ 2,0 - 2,5 »um und sind farblos bis hellgelb. Ein Typus der Coni die η-Formation ist Sympodulosporae. Gebildete Conidien haben eine Größe von 3,0 - 5,0 χ 2,0 - 2,8 »um, sind unicellular und haben glatte Oberfläche.

(2) Wachstumsbedingungen auf verschiedenen Medien:

Es wurden auf verschiedenen Madien, auf denen 10 Tage lang bei 26 C gezüchtet wurde, die folgenden Beobachtungen gemacht. Die Farbangaben entsprechen denjenigen in dem Methuen Handbook of Colour von A. Korner up und J. H. Wanscher, 3.Edition, Eyre Mathuen, London (1978).

(i) Czapek-Agar-Medium:

Langsames Wachstum mit einem Durchmesser von 11 - 13 mm bei einer 10 Tage - Kultur bei 26°C. Die Kolonien sind flach, etwas samtartig bis leicht baumwollartig. Sie haben dunkelgrüne Färbung (3OF6) . Die Kanten sind glatt. Es entsteht kein Exudat und kein austretendes Pigment. Die Färbund der Rückseite ist dunkelgrün (27F5) .

(ii) Malzextrakt-Agar-Madium:

Langsames Wachstum mit einem Durchmesser von 15 - 17 mm bei einer 10 Tage - Kultur bei 26°C. Die Kolonien sind

dick gewölbt, leicht baumwollartig. Sie haben dunkelgrüne Färbung (27F3) und glatte Kante. Es entsteht kein Exudat und kein austretendes Pigment. Die Färbung der Rückseite ist dunkelgrün (27F3) .

(iii) Kartoffel-Glucose-Agar-Medium: Langsames Wachstum mit einem Durchmesser von 15 - 16 mm bei einer 10 Tage - Kultur bei 26°C. Die Kolonien sind dick gewölbt, leicht baumwollartig. Sie haben dunkelgrüne Färbung (27F3) und glatte Kante. Es entsteht kein Exudat und kein austretendes Pigment. Die Färbung der Rückseite ist dunkelgrün (27F3) .

(3) Physiologische Eigenschaften:

(i) Wachstums-pH-Wert: 1-9,5
Optimal-pH-Wert: 3-7

(ii) Wachstums-Temperatur: 13 - 40°C Optimal-Temperatur: 25 - 30°C

Gemäß den zuvor illustrierten taxonomischen Eigenschaften gehört die vorliegende Spezies, da sie die Eigenschaft hat, asexuelle Sporan und Myzel mit Septen zu bilden, zu Deuteromycotina. Weiterhin handelt es sich bei der vorliegenden Spezies, bei der der Typus der Conidien-Bildung Sympodulosporae ist, die Conidiophoren gut verzweigt und die Conidien-bildenden Zellen häufig spiralförmig sind, um eine zur Gattung Nodulisporium gehörende Art.

Diese zuvor beschriebene Spezies wird als Nodulisporium sp. M522O bezeichnet. Sie wurde hinterlegt beim Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, M.I.T.I., Japan, unter der Depositions No. FERM P-8133.

Die physiologisch aktive Substanz TPI dar Formal (II) läßt sich durch Züchtung gewinnen, beispielsweise dadurch, daß man einen TPI der Formal (II) produzierenden Mikroorganismus der Gattung Nodulisporium züchtet und aus der gezüchteten Masse TPI der Formel (II) isoliert.

Ein Beispiel für einen TPI der Formel (II) produzierenden Mikroorganismus ist die zuvor illustrierte Spezies Nodulisporium sp. M522O, jedoch kann man für die erfindungsgemißen Zwecke auch jede sonstige Art verwenden, die TPI der Formel (II) produzierende Eigenschaften besitzt, einschließlich natürlicher und künstlicher Mutanten.

Für die Züchtung des Spezies kann man beim erfindungsgemäßen Verfahren die gebräuchlichen Mittel für Pilzkulturen einsetzen.

Die Kulturmedien können eine Quelle für assimilierbaren Kohlenstoff, eine Quelle für verwertbaren Stickstoff und erforderlichenfalls anorganische Salze und Vitamine enthalten. Beispiele für Kohlenstoff-Quellen sind Saccharide, wie Glucose, Fructose, Maltose, Saccharose, Lactose, Galaktose, Dextrin, Stärke, Glycerin und Sorbit, und pflanzliche öle, wie Sojabohnenöl, einzeln oder in Kombination. Beispiele für Stickstoff-Quellen sind Pepton, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Sojabohnenpulver, Baumwollsaatpulver, Maisquellwasser, Malzextrakt, Casein, Aminosäuren, Harnstoff, Ammoniumsalze und Nitratsalze, einzeln oder kombiniert. Weiterhin können erforderlichenfalls anorganische Salze von Magnesium, Calcium, Natrium, Kalium, Eisen und Mangan, sowie Vitamine wie Vitamin B und Calciumpantothenat zugesetzt werden.

Vorteilhaft wird mit flüssigem Kulturmedium als Schüttelkultur oder belüftete Kultur gearbeitet. Zweckmäßig liegt

der pH-Wert des Mediums bei pH 3 - 7 und die Temperatur bei 25 - 30°C. Die Züchtungszeit im flüssigen Medium beträgt in der Regel 2-10 Tage, jedoch kann eine maximale Anhäufung von TPI der Formal (II) innerhalb von 5 Tagen erreicht werden, und zweckmäßig beendet man das Züchtungsverfahren in diesem Punkt. Die Kulturbedingungen, wie beispielsweise die Zusammensetzung des Mediums, die Temperatur, die Zeit und dergleichen können je nach Art des Spezies oder sonstiger Verhältnisse modifiziert werden, so daß eine maximale Ausbeute und optimale Qualität erreicht werden. Antischaummittel, wie Silikonöl, pflanzliches öl oder Tenside können sofern erforderlich zugesetzt werden.

Das TPI der Formel (II) ist in der Kulturbrühe enthalten und wird zweckmäßig durch Zugabe von Filterhilfsmittel, wie beispielsweise Celite, Perlite und Hyflosupercel (Handelsname) in eine Kulturbrühe oder durch Zentrifugieren isoliert.

Die Abtrennung bzw. Isolation des TPI der Formel (II) aus dem Kulturfiltrat kann durch Extraktion mit mit Wasser nicht mischbarem organischem Lösungsmittel, wie beispielsweise Ethylacatat, Butylacetat oder Butanol und Konzentrieren des Extraktes vorgenommen werden, und man erhä.lt auf diese Weise rohe TPI-Substanz der Formel (II) Die weitere Reinigung kann durchgeführt werden durch Kombination von Adsorptionschromatographie unter Verwendung von Silikagel, aktivem Aluminiumoxid, aktiver Kohle oder nichtionischer Adsorptionsharze, Ve rte i lungs Chromatographie mit vertauschten Phasen unter Verwendung von Alkylgebundenem Silikagel und Gelfiltration unter Verwendung von Ge If iltrations träger. Beispielsweise kann man rohes TPI der Formel (II) an einer Säule aus Silikagel oder Aluminiumoxid adsorbieren und mit einem Mischlösungsmittel

/β,

-χ-

wie beispielsweise Chloroform-Isopropanol-Essigsäure , Ethylacatat-Isopropanol-Essigsäure oder Ethylacetat-Methanol-Essigsäure eluieren. Die aktive Fraktion kann man mittels Si likagel-Dünns chi cht Chromatographie untersuchen oder unter Verwendung von Rinderherz-PDE einer Prüfung auf Inhibitor-Aktivität unterziehen.

Bei einer solchen Säulenchromatographie kann jede der Substanzen TPI-I, TPI-2, TPI-3 und TPI-4 isoliert werden.

TPI-5, die Substanz, bei der es sich um eine Verbindung der Formel (I) handelt, in der R Wasserstoff bedeutet, und die der nachstehenden Formel (III) entspricht

OR" OH (HO

cooH

CH₂ ( CH₂ ) ₅CH3^CH₂ ( CH₃ )

worin R" für Wasserstoff steht, kann in der Weise hergestellt werden, daß man TPI der Formel (II) oder dessen Salz mit Glykosidase oder deren Modifikation behandelt und dabei enzymatisch die Glykosid-Bindung spaltet.

Beispiele für verwendbare Glykosidasen sind ß-Glucosidase für TPI-I oder TPI-3 und ß-Galaktosidase für TPI-2 oder TPI-4. Als Glykosidase kann ein beliebiges solches Enzym tierischen, pflanzlichen oder mikrobiellen Ursprungs verwendet werden. Solche ß-Glucosidase und ß-Galaktosidase ist im Handel erhältlich. Mikrobielle Enzyme sind Exo- und Endo-Enzyme. Ein Exo-Enzym kann man aus der bei der Züchtung der das Enzym produzierenden Mikroorganismen-Art anfallenden Kulturbrühe durch übliche Reinigungsverfahren gewinnen. Will man Endo-Enzyme einsetzen, kann man die

-JA-

mikrobiellen Zellen als solche verwenden. Behandelte raikrobielle Zellen, beispielsweise getrocknete Zellen, die^aciurch Dehydratation mit mit Wasser nicht mischbarem organischem Lösungsmittel, wie beispielsweise Aceton, Methanol oder Ethanol, Zerkleinern der mikrobiellen Zellen durch eine Zellen-Mahleinrichtung oder Ultraschall und Bildung eines Zell-Lysates durch Behandeln mit Cetylpyridinchlorid und Tensid gewinnen kann, oder Enzyme, die aus diesen behandelten Zellen mittels üblicher Peinigungsverfahren gewonnen worden sind, können für die erfindungsgemäßen Zwecke benutzt werden.

Unter einem wie oben erwähnten modifizierten Enzym sind zahlreiche Materialarten zu verstehen, vorausgesetzt, daß sie Glykosidase-Aktivität haben. Weiterhin gehören dazu immobilisierte Enzyme oder immobilisierte Zellen.

Immobilisiertes Enzym oder Zellen kann man mit üblichen Mitteln zubereiten. Beispielsweise kann man eine Methode benutzen, bei der das Enzym an dem Träger durch kovalente Bindung, ionische Bindung oder Adsorption immobilisiert wird, oder man kann sich einer Methode bedienen, bei der das Enzym oder die Zellen durch Vernetzung immobilisiert werden. Man kann mittels einer Einschlussmethode arbeiten, wobei das Enzym oder die Zellen mittels semipermeabler Membran in Mikrokapseln oder in leere Fasern eingeschlossen werden. Wenn man immobilisiertes Enzym oder Zellen benutzt, kann man die Reaktion kontinuierlich durchführen.

Die zuvor erwähnte enzymatische Reaktion wird zweckmäßig bei einem optimalen pH-Wert durchgeführt. Die Reaktionstemperatur sollte auch den optimalen Bedingungen entsprechen und im allgemeinen bei 25 - 37°C liegen. Die Reaktionszeit läßt sich dadurch bestimmen, daß man das produ-

zierte TPI mittels Diinns chi chtchromatograp hie (TLC) oder Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC) prüft, und man beendet die Reaktion zweckmässig dann, wenn maximale Akkumulation von TPI-5 erreicht ist.

Das so erhaltene enzymatische Reaktionsmedium wird angesäuert, dann wird mit mit Wasser nicht mischbarem organischem Lösungsmittel, wie beispielsweise Ethylacatat, Butylacetat oder Butanol extrahiert, und der Extrakt wird konzentriert, und daraus wird rohes TPI-5 erhalten. Die weitere Reinigung läßt sich durch Chromatographie, Galfiltration und ähnliche Verfahren in gleicher Weise wie für TPI der Formel (II) angegeben vornehmen.

Aus rohem TPI kann in gebräuchlicher Weise ein Salz des TPI gewonnen werden, jedoch wird die Zubereitung eines Salzes vorteilhaft nach der Reinigung vorgenommen. Bevorzugte Salze sind Alkalisalze, wie Natrium- und Kaliumsalze , Erdalkalisalze, wie Calcium- und Magnesiumsalze sowie Aluminium- und sonstige Metallsalze, das Ammoniumsalz, Salze von bekannten basischen Aminosäuren oder Salze von bekannten organischen Aminen.

Die physico-chemischen Eigenschaften von TPI sind nachfolgend veranschaulicht.

-1 7

(1) Farbe und Zustand: welsses Pulver

(2) Natur: saure Substanz

(3) EIementaranalyse (^C34^H4 8°i2 * ³^^{2 H}2°*

C H

gefunden: 60,43% 7,48%

berechnet:6O,44% 7,56%

(4) Molekular fönte Ii Cs₄H₄₈O₁₂

(5) Molekulargewicht (FÄB Massensoektrum) .: 648

(6) Spezifische Rotation:

(<O « -20.6 ^β (c = 1.0, MeOH)

(7) üV-Absorotionsspektrura: (Fig. 1)

in MeOH. o. saurem MeOH;

J..* (nm): 253 (E^I% 250), 311 (schulter) in alkal. MeOH:

4... (nm): 240 (Schulter) ,300 (E^I% 350)

(8) IR-Absorptlonsspektrum: (KBr) (Fig. 2)

340Oi 2930, 2850, 1720, 1590, 1470, 1430, 1370, 1340, 1250, 1170, 1140, 1060 cm -'

(9) ¹H-NHR Spektrum (in Deuterium Methanol, 100 MHz):

δ (ppm): 0.88U.3H), 0.90(t,3H), 1.31(m,20H), 1.6Km,4H), 2.68U.2H) 2.94(t,2H), 3.40-4.00(5H), 4.89(d,lH), 6.42Cd₁IH), 6.6Kd,d,2H), 6.7Kd,IH) QO)¹³C-NMR Spektrumün Deuterium Methanol, 25 MHz):

174.Ks), 168.2 Cs), 164.2Cs), 161.8Cs), 158.4Cs), 156.0Cs), 149.Ks), 145.2(s), 116.5Cd), 116.Ks), 113.5 (s), 112.Kd), 109.3 (d), 103.4Cd)₁ 102.7 (d), 78.6Cd),. 78.4Cd), 75.3(d), 71.6(d), 63.Ott),37.2(0, 35.2(t), 33.3Ct), 33.3Ct), 33.3(t), 33.0(0, 31.1(0, 30.9(0, 30.6(O, 30.6(0, 24.0Ct), 24.0Ct), 14.8Cq). 14.8(q).

Löslichkeit:

löslich! in niedrigem Alkohol wie Methanol,

Ethanol und Butanol, in Ethylacetat, Dime thy Is ulf oxid, wässrigem Alkali; unlöslich : in Hexan, Benzol und Petroläther.

(12) Farbreaktion:

positiv : Kali umpe rmanganat reaktion, Ferrichloridreaktion, Jodreaktion und Molisch-Reaktion;

negativ : Ninhydrin-Reaktion und Jodoformreaktion,

(13) Dünnschi cht Chromatographie: (Tokyo Kasei K.K. Silika-

gel f)

(Fließmittel) (Rf)

Chloroform-Isopropanol-Essigsäurei 0,25

(10 : 4 : 0,1)

Ethylacetat-Isopropanol-Essigsäure: 0,36

(10 : 4 : 0,1)

Ethylacetat-Aceton-Essigsäure: 0,17

(6 : 6 : 0,1)

Chloroform-Mathanol-Essigsäure: 0,38

(10 : 2 : 0,1)

/ TPI-2 /

(1) Farbe und Zustand: weisses Pulver

(2) Natur: saure Substanz

(3) EIementaranalyse ^^C34^H4 8°12 * ^H

	C	,79%	7	H
gefunden:	61	,26%	7	,56%
be re chne t:	61		,51%

(4) Molekular forme 1: 034H₄₈Oi₂

(5) Molekulargewicht (FAB Massenspektrum) : ⁶⁴⁸

(6) Spezi fische Rotation:

ία) £ -12.6° (c = 0.9, MeOH)

(7) UV-Absorptionsspektrum: (Fig. 3)

in MeOH o.saurem MeOH;

A*,x (nm): 253 (E^l% 230), 311 (Schulter) in alkal. MeOH:

/i»»x (nm): 240 (Schulter) ,300 (E¹* 325)

(8) IR-Absorptionsspektrum: (KBr) (Fig. 4)

3400, 2930, 2850, 1720, 1600, 1470, 1410, 1320, 1240, 1170, 1140, 1050 cn -»■

(9) »H-NMRSpektrum (in Deuterium Mathanol, 100 MHz):

ö(ppm): 0.87(t,3H), 0.89(t,3H), 1.31(i»,20H), 1.60(m,4H), 2.68(t,2H) 2.94(t,2H), 3.50-4.00(5H), 4.88(d,lH), 6.42(d,lH), 6.64(d,d,2H), 6.74(d,lH)

(10) ¹³C-NMRSpektrum (in Deuterium Methanol, 25 MHz):

174.Kt), 168.2(s), 164.2(s), 161.8(s), 158.4(s), 156.0(s), 149.Ks), 145.2(s), 116.5(d), 116.Ks), 113.4(s), 112.Kd), 109.4(d), 104.Kd), 102.8(d), 77.4(d), 75.3(d), 72.7(d), 70.5(d), 62.7(0.37.2(0. 35.2(0, 33.3(0, 33.3(0, 33.3(0, 33.0(0, 31.1(0,

31.0(O, 30.6(O, 30.6(O, 24.0(O, 24.0(t), 14.8(q), 14.8(q),

(11) Löslichkeit: löslich:

unlöslich; in niedrigem Alkohol, wie Methanol, Ethanol und Butanol, in Ethylacetat, Dirnethylsulfoxid, wässrigem Alkali; in Hexan, Benzol und Petroläther.

(12) Farbreaktion: positiv :

negativ Kali unpe rmanganatre aktion, Ferrichloridreaktion, Jodreaktion und

Molisch-Reaktion; Ninhydrin-Reaktion und Jodoformreaktion.

(13) DünnschichtChromatographie: (Tokyo Kasei K.K.

Silika-gel f)

(Fließmittel) ·-

Chloroform-Isopropanol-Essigsäure: (10 : 4 : 0,1)

Ethylacatat-Isopropanol-Essigsäure (10 : 4 : 0,1)

Ethylacatat-Aceton-Essigsäure : (6:6: 0,1)

Chloroform-ffethanol-Essigsäure : (10 : 2 : 0,1) (Rf) 0,19

0,21 0,14 0,22

/ TPI-3_7

(1) Farbe und Zustand: weisses Pulver

(2) Natur: saure Substanz

(3) Elementaranalyse:

gefunden: 61,9 3% berechnet : 62,59%

7,36% 7,30%

-χ-

(4) Molekularformal: CatIUoOia

(5) Molekulargewicht (FAB Massenspektrum) : 690

(6) Spezifische Rotation:

O) ^⁵ -19.6^e (c = 0.6, MeOH)

(7) UV-Adsorptionsspektrum: (Fig. 5)

in MeOH;

(nm): 252 (E^1% 184), 310 (Schulter)

(8) IR-Adsorptionsspektrum: (KBr) (Fig. 8) 3400, 2925, 2850, 1720, 1650, 1600, 1460, 1240, 1130, 1040 cm "'

(9) ¹H-NMR Spektrum(in Deuterium ethanol, 100 MHz):

<5(ppra): 0.88(t,3fl), 0.90(t,3H). 1.3Km,20H), 1.6Km,4H), 2.08(s,3H) 2.68(t,2H), 2.94(t,2H), 3.20-4.00(m,3H), 4.00-4.60(m,2H), 4.35(d,lH), 6.44(d,lH), 6.59(d,d,2H), 6.73(d,lH)

(1O)¹³C-NHR Spektrum(in Deuterium Methanol, 25 MHz):

174.2(s),173.Ks), 167.9(s), 164.4(s), 161.7(s), 158.3(s), 156.0(s), 149.2Cs), 145.2(s), 116.5«), 116.3(s), 113.3(s), 112.Kd), 109.4(d), 103.3(d), 103.0«), 78.3«), 75.8«), 75.2«), 71.8«), 65.0(t),37.2(t), 35.2(t), 33.3(0, 33.3(0, 33.3(0. 32.9(0. 31.1(0,

30.9(O, 30.6(O, 30.6(0, 24.0(O, 24.0(O. 21.0(q). 14.8 (q) 14.8Cq).

-χ-

(11) Löslichkeit:

löslich: in niedrigem Alkohol, wie Methanol, Ethanol und Butanol, in Ethylaoatat, Dinethylsulfoxid, wässrigem Alkali; unlöslich: in Hexan, Benzol und Petroläther.

(12) Farbreaktion:

positiv : Kaliumpermanganatreaktion, Ferrichloridreaktion, Jodreaktion und Molisch-Reaktion;

negativ : Ninhydrinreaktion und Jodoformreaktion,

(13) DünnschichtChromatographie : (Tokyo Kasei K.K.

Silika-gel f)

(Fließmittel)

Chloroform-Isopropanol-Essigsäure : (10 : 4 : 0,1)

Ethylace tat-Isopropanol-Essigsäure : (10 : 4 : 0,1)

Ethylacetat-Acaton-Essigsäure : (6:6: 0,1)

Chloroform-Mathanol-Essigsäure: (10 : 2 : 0,1)

(Rf) 0,54 0,51 0,35 0,52

/ TPI-4_/

(1) Farbe und Zustand: weisses Pulver

(2) Natur: saure Substanz

(3) Elementaranalyse:

C H

gefunden: 62,35% 7,5 7% berechnet : 62,5 9% 7,30%

(4) Molekularformal: C₃₆H₅OO₁₃

(5) Molekularaewicht (FAB MassensDektrum) : 690

(6) Spezifische Rotation:

(«O ^zs -13.3° (c = 0.4, MeOH)

(7) UV-Absorptionsspektrum: (Fig. 6)

in MeOH;

(nm): 252 (E^1% 172), 310 (Schulter)

(8) IR-Absorptionsspektrum: (KBr) (Fig. 8)

3420, 2930, 2860, 1730, 1660, 1610, 1470, 1240, 1140, 1040 cm"¹ cm "'

(9) ¹H-NMR Spektrum (in Deuterium Methanol, 100 MHz):

δ (ppm): 0.87(t,3H), 0.90(t,3H), 1.3Km,20H), 1.6Km,4H), 2.03(s,3H) 2.68(t,2H), 2.95(t,2H), 3.20-4.00(m,3H), 4.00-4.60(m,2H), 4.87(d,lH), 6.43(d,lH), 6.60(d,d,2H), 6.73(d,lH) (1O)¹³C-NMR Spektrun.(in Deuterium Methanol, 25 MHz):

174.2(s),173.0(s), 168.0(s), 164.2(s), 161.8(s), 158.4(s), 156.0(s), 149.Ks), 145.2(s), 116.5(d), 116.Ks), 113.5(s), 111.9(d), 109.4(d), 103.7(d), 102.9(d), 75.2(d), 74.7(d), 72.5(d), 70.4(d), 64.9(0,37.2(0. 35.2(0, 33.3(0, 33.3(0, 33.3(0, 33.0(O, 31.1(0, 31.0(O, 30.6(t), 30.6(O, 24.0(O, 24.0(t), 21.0(q), 14.8(q) 14

(11) Löslichkeit:

löslich: in niedrigem Alkohol, wie Methanol, Ethanol und Butanol, in Ethylacetat, Dimathylsulfoxid, wässrigem Alkali, unlöslich: in Hexan, Benzol und Petroläther.

(12) Farbreaktion:

positiv : Kaliumpermanganatreaktion, Ferrichloridreaktion, Jodreaktion und Molisch-Re aktion;

negativ:: Ninhydrinre aktion und Jodoformreaktion.

(13) Dünnschichtchromatographie: (Tokyo Kasei K.K.

Silika-gel f)

(Fließmittel) (Rf)

Chloroform-Isopropanol-Essigsäure: 0,46

(10 : 4 : 0,1)

Ethylacetat-Isopropanol-Essigsäure: 0,43

(10 : 4 : 0,1)

Ethylacetat-Aceton-Essigsäure: 0,29

(6:6: 0,1)

Chloroform-Mathanol-Essigsäure: 0,4 8

(10 : 2 : 0,1)

/ TPI-5_/

(1) Farbe und Zustand: weisses Pulver

(2) Natur: saure Substanz

(3) Elementaranalyse:

C H

gefunden : 69,30% 7,72%

berechnet : 69,11% 7,87%

-V-

(4)Molekularformel: C₂₈H₃BO₇

(5) Molekulargewicht: 486

(6) UV-Absorptionsspektrum: (Fig. 7)

in MeOH;

Λ,,.χ (run): 271 (E¹* 389)
305 (E,c. 243)

(7) IR-Absorptionsspektrum: (KBr)(FIg. 8)

3320, 2920, 2850, 1650, 1600, 1580, 1450, 1300, 1240, 1200, 1140, 1060 cm -^l

(8) ¹H-NMR Spektrumün Deuterium Methanol, 100 MHz):

<5(ppm): 0.85(t,3H), 0.88(t,3H), 1.27(m,20H), 1.60(m,4H), 3.02(t,t) 6.32(S,2H), 6.62(d,lH), 6.74(d,lH), 11.27(S,IH)

(9) ¹³C-NMR Spektruirün Deuterium ethanol, 25 MHz):

174.7(s).169.3(s), 166.3(s), 165.3(s), 161.4(s), 155.0(s), 150.0(s), 149.5(s), 116.2(d), 111.5(d), 109.0(d), 108.7(s), 104.2(s), 101.8(d), 37.3(t), 36.7Ct), 32.3(t), 31.9(t), 31.9(0, 31.9(0, 29.9(0,29.9(0, 29.3(0, 29.2(0, 22.8(0, 22.8(0, 14.2(q), 14.2(q).

(10) Löslichkeit:

löslich: in niedrigem Alkohol, wie Methanol, Ethanol und Butanol, in Chloroform, Ethylacatat, Dinethylsulfoxid, wässrigem Alkali;
unlöslich: in Hexan, Benzol und Petroläther.

(11) Farbreaktion:

negativ : Ninhydrinreaktion und Jodoformreaktion.

(12) DünnschichtChromatographie: (Tokyo Kasei K.K.

Silika-gel f)

(Fließmittel) (Rf)

Chloroform-Isopropanol-Esslgsäure: 0,87 (10 : 4 : 0,1)

Ethylacetat-Isopropanol-Essigsäure: 0,68

(10 : 4 : 0,1)

Ethylacetat-Aceton-Essigsäure: 0,78

(6 : 6 : 0,1)

Chloroform-Methanol-Essigsäure: 0,77

(10 : 2 : 0,1)

Neben den oben angegebenen physico-chemischen Eigenschaften haben die Substanzen TPI-I, TPI-2, TPI-3, TPI-4 und TPI-5 die in Formel (I) illustrierte chemische Struktur.

Die erfindungsgemäßen TPI-Substanzen sind neue chemische Verbindungen, die vollständig verschieden sind von bisher bekannten PDE-Inhibitoren, hergestellt durch Mikroorganismen. Die bekannten PDE-Inhibitoren PDE-I, PDE-II, CC-1065, APD-I, APD-II und APD-III sind Stickstof f-enthaltenda Substanzen, und Reticulol und Terferol sind Verbindungen mit den Molekularformain C₁₁H₁^O₁. bzw. ΰ,_ηΗ-,-.Ο_.

JLl LU D ±9 ±0 O

Alle diese Verbindungen sind verschieden von den erfindungsgemäßen, als TPI bezeichneten Substanzen.

Das erfindungsgemäße TPI hat eine starke PDE-inhibierende Wirkung. Die Inhibitor-Aktivität von TPI auf Rinderherz-PDE wird nachstehend veranschaulicht.

(Methode)

Zu einem Reaktionsgemisch (1,0 ml) wurden 40 mM Tris-HCl-Pufferlösung (pH 7,5), 2 mM Magnesiumchlorid, 0,4 mM c-AMP, PDE (30 ,ug Protein, Produkt von der Firma Boehringer Mannheim Co.) und TPI zugegeben, und es wurde 30 Minuten lang bei 30°C bebrütet. Durch Zusatz von 55%iger Trichloressigsäure (0,1 ml) wurde die Reaktion abgestoppt, und das produzierte 5'-AMP wurde mittels HPLC (Hitachi, 655 System) (Säule: Hitachi #3056, 4 χ 150 mm, Migrationsschicht: 10 mM KH₃PO₄ (pH 2,0) - MeOH (10 : 1), Migrationsgeschwindigkeit: 1,5 ml/Min., Detektor: 262 m.u ) gemessen. Das Inhibierungsverhältnis wird mittels folgender Gleichung berechnet.

Inhibierungs-Verhältnis = (A-B)/A χ 100 (%) worin A: die Menge an 5'-AMP ohne TPI und

B: die Menge an 5'-AMP mit TPI bedeuten.

IC₁-Q, eine Konzentration an TPI, die ein Inhibierungsverhältnis von 50% gibt, wird nachfolgend veranschaulicht.

(Ergebnis)

Substanz ic,-_n - Konzentration ( .ug/ml)

TPI-I 2,8

TPI-2 5,4

TPI-3 2,8

TPI-4 3,5

TPI-5 2,3

Papaverin 25

Nicardipin 6,0

Theophyllin 470

Wenn TPI-I in einer Mange von 100 mg/kg in den Peritonealsack von Mausen injiziert wurde, wurde kein Todesfall festgestellt.

Wie zuvor gezeigt, hat das erfindungsgemäße TPI eine starke inhibierende Aktivität gegen PDE und eine niedrige Toxizität. Es ist daher brauchbar als Bronchodilatator, als herzstärkendes Mittel, als Entspannungsmittel für glatte Muskulatur und als die Hormonausschüttung stimulierendes Mittel.

In den folgenden Beispielen, die keine Einschränkung der Erfindung bedeuten, ist die vorliegende Erfindung noch weiter illustriert.

Bai spiel 1

Ein Medium (pH 6,5, 100 ml, 20 Minuten lang bei 120°C sterilisiert), das 2% Glucose, 1% Pepton, 1% CSL, 0,2% Kaliumdihydrogenphosphat, 0,1% Magnesiumsulfat und 1% Gelite enthielt und sich in einem 500 ml Erlenmeyerkolben befand, wurde mit der in einer Drahtöse vorhandenen Menge an Mikroorganismus der Art Nodulisporium sp. M522O FERM P-8133 beimpft. Es wurde 4 Tage lang bei 26°C bebrütet und so die Saatkultur gewonnen. Die Saatkultur wurde in 3%ige_m Volumverhältnis auf ein Medium (pH 7,0, 100x100 ml), das 5% Glucose, 2% Pharmamedien, 0,5% CSL, 0,1% Kaliummonohydrogenphosphat, 0,1% Magnesiumsulfat, 0,5% Calciumcarbonat, 0,0005% Ferrosulfat, 0,0002% Zinksulfat, O,OOO1% Kobaltchlorid, 0,0003% Mangansulfat und 0,0002% Kupfersulfat enthielt, übergeimpft. Die Fermentation wurde auf einer rotierenden Schütteleinrichtung 5 Tage lang bei 26 C durchgeführt. Die Kulturbrühe (10 Liter) wurde zentrifugiert; es wurde die überstehende Lösung (8,5 Liter) gewonnen. Zu der überstehenden Lösung wurde Ethylacetat

(5 Liter) zugegeben, der pH-Wert wurde durch tropfenweise Zugabe von 2 η HCl auf pH 2 eingestellt, und es wurde die Ethylacetatschicht (4,5 Liter) gewonnen. Zu der Ethylacetatschicht wurde /fässer (3 Liter) zugegeben, und der pH-Wert wurde durch Zusatz von konz. wässrigem Ammoniak auf pH 9 eingestellt, und so wurde das TPI in die wässrige Schicht übergeführt. In die wässrige Schicht (3 Liter) wurde Ethy lace tat (2 Liter) eingegeben, der pH-Wert wurde mit 2 η HCl, die unter Rühren zugegeben wurde, auf pH 2 eingestellt, und es wurde die Ethylacetatschicht (annähernd 2 Liter) gewonnen. Die Ethylacetatschicht wurde durch Zugabe von wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum zu einem bräunlichen Pulver (annähernd 6 g) eingedampft.

Das Pulver an rohem TPI (6 g) , das gemäß Beispiel gewonnen worden war, wurde in Methanol (30 ml) gelöst und mit Silikagel-Pulver (4 g) vermischt. Es wurde gerührt und im Vakuum wurde konzentriert und das Methanol entfernt. Das Gemisch wurde auf eine Silikagel-Säule (400 ml) , die zuvor mit einem Mischlösungsmittel aus Chloroform-Isopropanol-Essigsäure (10:2:0,1) beschickt worden war, aufgebracht, und es wurde mit dem gleichen Mischlösungsmittel eluiert. Jede 20 g - Fraktion wurde mittels TLC mit ChIoroform-Isopropanol-Essigsäure (10:4:0,1) als Laufmittel geprüft. Die Flecken, die Rf=0,54, Rf=0,46, Rf=0,25 und Rf=O,19 zeigten und die durch UV-Absorption unter Verwendung einer Manasule-Lampe (Handelsname) oder durch Entfärbungsreaktion mit Kaliumoermanganat nachgewiesen worden waren, wurden fraktioniert. Die Fraktionen Nr. 13 - Nr.28 enthielten TPI-3 (Rf=O,54) und TPI-4 (Rf=O,46) , die Fraktionen Nr. 71 - Nr. 122 enthielten TPI-I (Rf=O,25) und die Fraktionen Nr. 123 - Nr. 187 enthielten TPI-I (Rf=O,25)und TPI-2 (Rf=0,19).

Die Fraktionen Nr. 13 - Nr. 28 wurden gesammelt, im Vakuum auf 20 ml konzentriert, auf eine Silikagel-Säule (200 ml), die zuvor mit einem Gemisch aus Ethy lace tat-Aceton-Es si gsäure (10:6:0,1) beschickt worden war, aufgegeben, und es wurde mit dem gleichen Lösungsmittel eluiert. Das Eluat wurde fraktioniert zu je 20 g - Fraktionen, durch Silikagel-TLC mit einer Mischung aus Ethylacetat-Aceton-Essigsäure (6:6:0,1) als Laufmittel untersucht, und die Fraktionen, die Flecken entsprechend Rf=O,35 und RF= 0,29 enthielten, wurden gesammelt. Die Fraktionen Nr. 35 - Nr. 40, die Substanz mit Rf=O,35 enthielten, wurden gesammelt und im Vakuum bis zu annähernd 3 ml konzentriert. Zu dem Rückstand wurde η-Hexan gegeben, und es wurde TPI-3 als Substanz ausgefällt. Die TPI-3 - Substanz wurde mit η-Hexan gewaschen und im Vakuum getrocknet, und so wurde TPI-3 (20 mg) gewonnen.

Die Fraktionen Nr. 48 - Nr. 69, die Substanz mit Rf=O,29 enthielten, wurden gesammalt und im Vakuum auf annähernd 3 ml konzentriert. Zu dem Rückstand wurde η-Hexan zugegeben, und es wurde TPI-4 als Substanz ausgefällt. Diese Substanz wurde mit η-Hexan gewaschen und im Vakuum getrocknet, und so wurde TPI-4 (15 mg) gewonnen.

Beispiel 3

Die Fraktionen Nr. 71 - Nr. 122, die TPI-I mit Rf=O,25 enthielten, wurden gesammelt und im Vakuum bis auf 20 ml konzentriert. Durch Zugabe von Ethylacetat wurde auf 200 ml aufgefüllt. Weiterhin wurde Wasser (200 ml) zugegeben, und es wurde stark gerührt. Die Ethy lace tat schicht wurde im Vakuum bis auf annähernd 10 ml konzentriert. Dazu wurde η-Hexan gegeben, und so wurde TPI-I ausgefällt. Die Ausfällung wurde auf ein Glasfilter aufgebracht, es wurde mit η-Hexan gewaschen und im Vakuum konzentriert, und so wurde gereinigtes TPI-I (1,8 g) gewonnen.

Die Fraktionen Nr. 12 3 - Nr. 187, die TPI-I (Rf=0,25) und TPI-2 (Rf=0,19) enthielten, wie sie gemäß Beispiel 2 gewonnen worden waren, wurden gesammelt und im Vakuum eingedampft. Der Rückstand, der in Methanol (20 ml) gelöst wurde, wurde gut mit Silikagel-Pulver (2 g) vermischt. Nachdem das Methanol im Vakuum entfernt worden war, wurde das Gemisch auf eine Säule aus Silikagel (200 ml) , die zuvor mit Chloroform-Methanol-Essigsäure (10:2:0,1) beschickt worden war, aufgebracht, und es wurde mit dem gleichen Lösungsmittelgemisch eluiert. Jede Fraktion (20 g) wurde mittels Silikagel-TLC untersucht; dabei wurde als Laufmittel Chloroform-Isopropanol-Essigsäure (10:4:0,1) verwendet, und die Substanz-Flecken wurden durch UV-Absorption unter Verwendung einer Manasule-Lampe und Entfärbungsreaktion des Kaliumpermanganats sichtbar gemacht. Die Fraktionen Nr. 54 - Nr.130, die lediglich eine Substanz mit Rf=O,19 enthielten, wurden gesammalt und im Vakuum bis auf 20 ml konzentriert. Es wurden Ethylacetat (200 ml) und Wasser (200 ml) hinzugegeben, und es wurde stark gerührt. Das Ethylacetat wurde separiert und im Vakuum bis auf 10 ml konzentriert. Dann wurde η-Hexan dazu gegeben, und es TPI-2 ausgefällt. Das TPI-2 wurde mit Hexan gewaschen und im Vakuum getrocknet, und so wurde TPI-2 (600 mg) gewonnen.

Beispiel 4

Wie in Beispiel 3 beschrieben gewonnenes TPI-I (50 mg) wurde in 0,1 M Phosphat-Puffer (pH 6,5, 4 ml) gelöst, und dazu wurde ß-Glucosidase (Handelsprodukt der Firma Sigma Co. , 4,5 E/mg, 4 mg) zugegeben. Das Gemisch wurde 7 Tage lang bei 26 C bebrütet, und dabei wurden annähernd 50% des TPI-I in TPI-5 umgewandelt. Mit wasserfreiem Natriumsulfat wurde der pH-Wert des Reaktionsgemisches auf pH 3 eingestellt, und es wurde im Vakuum eingedampft. Der Rückstand wurde auf eine Silikagel-Siiule (28 ml) , die zuvor mit einem Gemisch aus Chloroform-Methanol-Essigsäure (20:1:0,1) beschickt worden war, aufgegeben, und es wurde mit dem gleichen Mi sch lösungsmittel eluiert. Das Eluat wurde in je 5 g -

-rf-

Fraktionen gewonnen, und die Fraktionen Nr. 28 - Nr. wurden gesammelt und konzentriert. Es wurde mit n-Hexan gewaschen, und im Vakuum zur Trockene eingedampft, und man erhielt TP1-5 als weisses pulverförmiges Produkt (15 mg) .

In der beiliegenden Zeichnung zeigen:

Fig. 1 Das UV-Absorptionsspektrum von TPI-I,

Fig. 2 das UV-Absorptionsspektrum von TPI-2,

Fig. 3 das IR-Absorptionsspektrum von TPI-I,

Fig. 4 das IR-Absorptionsspektrum von TPI-2,

Fig. 5 das UV-Absorptionsspektrum von TPI-3,

Fig. 6 das UV-Absorptionsspektrum von TPI-4,

Fig. 7 das UV-Absorptionsspektrum von TPI-5,

Fig. 8 das IR-Absorptionsspektrum von TPI-3,

Fig. 9 das IR-Absorptionsspektrum von TPI-4, und

Fig.10 das IR-Absorptionsspektrum von TPI-5.

Übersetzung Form 7

Zertifikat über Mikroorganismen-Deposition

No.: 60 Bikibun No. Datum: 8. Mirz 19 85

Für Toyo Jozo Kabushiki Kaisha Vertreter: Testuo TAKADA

Fermentation Res. Institute Agency of Industrial Sei. Tech.

Jiro OHYAMA

I. Bezeichnung des Mikroorganismus:

(Bezeichnung der Identifikation) (Depositions-Nr.) durch Anmelder

Nodulisporium sp. M5 22O FERM P-8133

II. Wissenschaftliche Eigenschaften und taxonomische

Eigenschaften:

Die folgenden Dokumente sind dem oben genannten Mikroorganismus beigeheftet. ( ) wissenschaftliche Eigenschaften

(x) taxonomische Eigenschaften

III. Empfang und Deposition

Hiermit wurde die Deposition für den obigen, am 8. Wir ζ 19 85 empfangenen Mikroorganismus durchge führt.

Claims

P ate nt an sp r ü ehe

1. Neue chemische Substanz, gekennzeichnet durch die FormaI

COOH

CH₂(CH₂)₅CH₃

worin R für einen ß-D-Glucopyranosyl-, ß-D-Galaktopyranosyl-, 6'-O-Acetyl-ß-D-glucopyranosyl-, 6'-O-Acetyl-ß-D-galaktopyranosyl-Rest oder ein Wasserstoff atom oder ein Salz davon steht, und die als TPI bezeichnet wird.

2. Verfahren zur Herstellung einer Substanz gemäß Anspruch 1 der Formal

COOH CH₂(CH₂)₅CH₃ CH₂(CH₂)₅CH₃

worin R¹ einen ß-D-Glucopyranosyl-, ß-D-Galaktopyranosyl-, 6 ·-O-Acetyl-ß-D-glucopyranosyl- oder 6'-0-Acetyl-ß-D-galaktopyranosyl-Rest oder ein Salz davon bedeutet, dadurch gekennzeichnet, daß man einen eine solche Substanz

produzierenden Mikroorganismus der Gattung Nodulisporium züchtet und die produzierte, TPI genannte Substanz daraus isoliert und erforderlichenfalls zu dem Salz der Verbindung umwandelt.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismus einen Mikroorganismus der Art Nodulisporium sp. M522O FERM P-8133 verwendet.

4. Verfahren zur Herstellung einer Substanz nach Anspruch 1 der Formel

0R^M

CH₂(CH₂)

COOH

CH₂(CH₂)

worin R" Wasserstoff bedeutet, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Verbindung der Formel

OH

COOH

CH₂(CH₂)₅CE₃

worin R¹ für sineη ß-D-Glucopyranosyl-, ß-D-Galaktopyranosyl-, 6 '--O-Acetyl-ß-D-glucopyranosyl- oder 6'-0-Acetylß-D-galaktopyranosyl-Pest oder für ein Salz davon steht, mit Glykosidase oder modifizierter Glykosidase in einem wässrigen Medium behandelt.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man als Glykosidase ß-Glucosidase oder ß-Galaktosidase einsetzt.

6. Verwendung der neuen chemischen Substanzen nach Anspruch 1 als physiologisch aktive Verbindungen zur Inhibierung von PDE-Aktivität.