JP2001258587A - 光学的に活性な３−ヒドロキシピロリジン誘導体の微生物による製造方法 - Google Patents
光学的に活性な３−ヒドロキシピロリジン誘導体の微生物による製造方法Info
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
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- C12P41/002—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture by oxidation/reduction reactions
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
- C12P17/10—Nitrogen as only ring hetero atom
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 光学的に活性な３−ヒドロキシピロリジン誘
導体の製造方法を提供する。 【解決手段】 クンニンハメラ・エキヌラタ（Ｃｕｎｎ
ｉｎｇｈａｍｅｌｌａｅｃｈｉｎｕｌａｔａ）属の種又
はアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属の微生
物によって製造される酵素の存在下で式（Ｉ）： 【化１】
導体の製造方法を提供する。 【解決手段】 クンニンハメラ・エキヌラタ（Ｃｕｎｎ
ｉｎｇｈａｍｅｌｌａｅｃｈｉｎｕｌａｔａ）属の種又
はアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属の微生
物によって製造される酵素の存在下で式（Ｉ）： 【化１】
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、光学的に活性な３
−ヒドロキシピロリジン誘導体の微生物学的な製造方法
に関する。より具体的には、本発明は、ピロリジン−１
−カルボン酸フェニルエステル〔式（Ｉ）で表される化
合物〕と前記式（Ｉ）で表される化合物をヒドロキシル
化することのできる適当な微生物とを接触させ、そして
選択的に形成され蓄積される光学的に活性な３−ヒドロ
キシピロリジン誘導体〔式（II）及び式（III）で表さ
れる化合物〕を回収することを含む方法に関する。本発
明の別の観点は、ケトン前駆体を不整還元することによ
る、光学的に活性な３−ヒドロキシピロリジン誘導体の
微生物学的な製造方法に関する。
−ヒドロキシピロリジン誘導体の微生物学的な製造方法
に関する。より具体的には、本発明は、ピロリジン−１
−カルボン酸フェニルエステル〔式（Ｉ）で表される化
合物〕と前記式（Ｉ）で表される化合物をヒドロキシル
化することのできる適当な微生物とを接触させ、そして
選択的に形成され蓄積される光学的に活性な３−ヒドロ
キシピロリジン誘導体〔式（II）及び式（III）で表さ
れる化合物〕を回収することを含む方法に関する。本発
明の別の観点は、ケトン前駆体を不整還元することによ
る、光学的に活性な３−ヒドロキシピロリジン誘導体の
微生物学的な製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】光学的
に活性な３−ヒドロキシピロリジン誘導体の製造方法に
関して、いくつかの方法が開示されている。それらの方
法のいくつかは、光学的に活性な有機酸と塩を形成する
ことによって３−ヒドロキシピロリジン誘導体のラセミ
体を分割することを包含している。特願平２−１０３９
６５（Ｊ．Ｐ．Ａ．Ｎ．９６−１０３９６５）、特願平
４−７７７４９（Ｊ．Ｐ．Ａ．Ｎ．９２−７７７４
９）、及び特願昭５９−１８５５８３（Ｊ．Ｐ．Ａ．
Ｎ．８４−１８５５８３）各明細書には、いずれも、光
学的に活性な有機酸を用いて３−ヒドロキシピロリジン
誘導体のラセミ体を分割する方法が記載されている。ま
た、３−ヒドロキシピロリジン誘導体のラセミ体を酵素
により分割する方法も開示されている〔Ｈａｓｅｇａｗ
ａら，Ｅｎａｎｔｉｏｍｅｒ，２（３−４）：３１１−
３１４（１９９７）；特願昭６２−３０１０５２（Ｊ．
Ｐ．Ａ．Ｎ．８７−３０１０５２）〕。酵素によるこれ
らの方法は、加水分解酵素を用いてＮ−ベンジル−３−
アシルオキシピロリジンのラセミ体を立体選択的に加水
分解することを包含している。別の方法は、光学的に活
性な前駆体を化学的に変形することを包含している。欧
州特許出願番号（Ｅ．Ｐ．Ａ．Ｎ．）９５−１１０６８
５明細書は、光学的に活性な３−ヒドロキシピロリジン
−２，５−ジオンを活性化アルカリボロハイドライドを
用いて還元することによって、光学的に活性な３−ヒド
ロキシピロリジン誘導体を調製する方法を開示してい
る。別の方法は、光学的に活性なブタノエート誘導体を
化学的に変形することを包含する（Ｅ．Ｐ．Ａ．Ｎ．９
１−３０３２４５）。また、真菌であるクンニンハメラ
・ベルチシラタ（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍｅｌｌａ ｖｅ
ｒｔｉｃｉｌｌａｔａ）ＶＫＭ Ｆ−４３０を用いてフ
ェニル−ピロリジン−１−イル−メタノンから（−）−
（３−ヒドロキシ−ピロリジン−１−イル）−フェニル
−メタノンを調製するための微生物学的方法が報告され
ている〔Ｐａｒｓｈｉｋｏｖら，Ｋｈｉｍｉｙａ Ｇｅ
ｔｅｒｏｔｓｉｋｌｉｃｈｅｓｋｉｋｈ Ｓｏｅｄｉｎ
ｅｎｉｉ，２：１９５−１９９（１９９２）〕。別の微
生物学的方法は、シュードモナス・オレオボランス（Ｐ
ｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｏｌｅｏｖｏｒａｎｓ）Ｇｐｏ１
及び他種の細菌を用いてＮ−ベンジルピロリジンをヒド
ロキシル化することによる光学的に活性なＮ−ベンジル
−３−ヒドロキシピロリジンの調製を報告している〔Ｌ
ｉら，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ：Ａｓｙｍｍｅｔｒｙ，
１０：１３２３−１３３３（１９９９）〕。
に活性な３−ヒドロキシピロリジン誘導体の製造方法に
関して、いくつかの方法が開示されている。それらの方
法のいくつかは、光学的に活性な有機酸と塩を形成する
ことによって３−ヒドロキシピロリジン誘導体のラセミ
体を分割することを包含している。特願平２−１０３９
６５（Ｊ．Ｐ．Ａ．Ｎ．９６−１０３９６５）、特願平
４−７７７４９（Ｊ．Ｐ．Ａ．Ｎ．９２−７７７４
９）、及び特願昭５９−１８５５８３（Ｊ．Ｐ．Ａ．
Ｎ．８４−１８５５８３）各明細書には、いずれも、光
学的に活性な有機酸を用いて３−ヒドロキシピロリジン
誘導体のラセミ体を分割する方法が記載されている。ま
た、３−ヒドロキシピロリジン誘導体のラセミ体を酵素
により分割する方法も開示されている〔Ｈａｓｅｇａｗ
ａら，Ｅｎａｎｔｉｏｍｅｒ，２（３−４）：３１１−
３１４（１９９７）；特願昭６２−３０１０５２（Ｊ．
Ｐ．Ａ．Ｎ．８７−３０１０５２）〕。酵素によるこれ
らの方法は、加水分解酵素を用いてＮ−ベンジル−３−
アシルオキシピロリジンのラセミ体を立体選択的に加水
分解することを包含している。別の方法は、光学的に活
性な前駆体を化学的に変形することを包含している。欧
州特許出願番号（Ｅ．Ｐ．Ａ．Ｎ．）９５−１１０６８
５明細書は、光学的に活性な３−ヒドロキシピロリジン
−２，５−ジオンを活性化アルカリボロハイドライドを
用いて還元することによって、光学的に活性な３−ヒド
ロキシピロリジン誘導体を調製する方法を開示してい
る。別の方法は、光学的に活性なブタノエート誘導体を
化学的に変形することを包含する（Ｅ．Ｐ．Ａ．Ｎ．９
１−３０３２４５）。また、真菌であるクンニンハメラ
・ベルチシラタ（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍｅｌｌａ ｖｅ
ｒｔｉｃｉｌｌａｔａ）ＶＫＭ Ｆ−４３０を用いてフ
ェニル−ピロリジン−１−イル−メタノンから（−）−
（３−ヒドロキシ−ピロリジン−１−イル）−フェニル
−メタノンを調製するための微生物学的方法が報告され
ている〔Ｐａｒｓｈｉｋｏｖら，Ｋｈｉｍｉｙａ Ｇｅ
ｔｅｒｏｔｓｉｋｌｉｃｈｅｓｋｉｋｈ Ｓｏｅｄｉｎ
ｅｎｉｉ，２：１９５−１９９（１９９２）〕。別の微
生物学的方法は、シュードモナス・オレオボランス（Ｐ
ｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｏｌｅｏｖｏｒａｎｓ）Ｇｐｏ１
及び他種の細菌を用いてＮ−ベンジルピロリジンをヒド
ロキシル化することによる光学的に活性なＮ−ベンジル
−３−ヒドロキシピロリジンの調製を報告している〔Ｌ
ｉら，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ：Ａｓｙｍｍｅｔｒｙ，
１０：１３２３−１３３３（１９９９）〕。
【０００３】
【課題を解決するための手段】或る態様では、本発明
は、式（Ｉ）：
は、式（Ｉ）：
【化１２】 で表される化合物から、式（II）：
【化１３】 で表される化合物を製造する方法であって、微生物によ
って生成されるヒドロキシル化酵素少なくとも１種類の
存在下で前記式（Ｉ）で表される化合物をヒドロキシル
化することを含む、前記製造方法に関する。
って生成されるヒドロキシル化酵素少なくとも１種類の
存在下で前記式（Ｉ）で表される化合物をヒドロキシル
化することを含む、前記製造方法に関する。
【０００４】好ましい態様では、本発明は、前記微生物
が、アスペルギルス・オクラセウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌ
ｌｕｓ ｏｃｈｒａｃｅｕｓ）ＡＴＣＣ１８５００、ス
トレプトミセス・オウレオファシエンス（Ｓｔｒｅｐｔ
ｏｍｙｃｅｓ ａｕｒｅｏｆａｃｉｅｎｓ）ＡＴＣＣ１
０７６２、クンニンハメラ・エキヌラタ・バラエティー
・エレガンズ（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍｅｌｌａ ｅｃｈ
ｉｎｕｌａｔａ ｖ． ｅｌｅｇａｎｓ）ＡＴＣＣ８６
８８ｂ、クンニンハメラ・エキヌラタ・バラエティー・
エレガンズ（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍｅｌｌａ ｅｃｈｉ
ｎｕｌａｔａ ｖ． ｅｌｅｇａｎｓ）ＡＴＣＣ８６８
８ａ、クンニンハメラ・エキヌラタ・バラエティー・エ
キヌラタ（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍｅｌｌａ ｅｃｈｉｎ
ｕｌａｔａ ｖ． ｅｃｈｉｎｕｌａｔａ）ＡＴＣＣ９
２４４、クンニンハメラ・ホモタリカ（Ｃｕｎｎｉｎｇ
ｈａｍｅｌｌａ ｈｏｍｏｔｈａｌｌｉｃａ）ＡＴＣＣ
１６１６１、クンニンハメラ・エキヌラタ・バラエティ
ー・エレガンズ（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍｅｌｌａ ｅｃ
ｈｉｎｕｌａｔａ ｖ． ｅｌｅｇａｎｓ）ＡＴＣＣ３
６１１２、クンニンハメラ・エキヌラタ・バラエティー
・エキヌラタ（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍｅｌｌａ ｅｃｈ
ｉｎｕｌａｔａ ｖ． ｅｃｈｉｎｕｌａｔａ）ＡＴＣ
Ｃ３６１９０、クンニンハメラ・エキヌラタ・バラエテ
ィー・エレガンズ（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍｅｌｌａ ｅ
ｃｈｉｎｕｌａｔａ ｖ． ｅｌｅｇａｎｓ）ＡＴＣＣ
１００２８ｂ、クンニンハメラ・エキヌラタ・バラエテ
ィー・エレガンズ（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍｅｌｌａ ｅ
ｃｈｉｎｕｌａｔａ ｖ． ｅｌｅｇａｎｓ）ＡＴＣＣ
９２４５、クンニンハメラ・エキヌラタ・バラエティー
・エレガンズ（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍｅｌｌａ ｅｃｈ
ｉｎｕｌａｔａ ｖ． ｅｌｅｇａｎｓ）ＡＴＣＣ８９
８３、クンニンハメラ・エキヌラタ・バラエティー・エ
レガンズ（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍｅｌｌａ ｅｃｈｉｎ
ｕｌａｔａ ｖ． ｅｌｅｇａｎｓ）ＡＴＣＣ２６２６
９、ピソミセス・シノドンチス（Ｐｉｔｈｏｍｙｃｅｓ
ｃｙｎｏｄｏｎｔｉｓ）ＡＴＣＣ２６１５０、アブシ
ジア・グラウカ（Ａｂｓｉｄｉａ ｇｌａｕｃａ）ＡＴ
ＣＣ２２７５２、ボーベリア・バシアナ（Ｂｅａｕｖｅ
ｒｉａ ｂａｓｓｉａｎａ）ＡＴＣＣ７１５９、ノカル
ジア種（Ｎｏｃａｒｄｉａ ｓｐ．）ＡＴＣＣ５３７５
８、ストレプトミセス・リモサス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙ
ｃｅｓ ｒｉｍｏｓｕｓ）ＡＴＣＣ５５０４３、及びス
トレプトミセス・リモサス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ
ｒｉｍｏｓｕｓ）ＡＴＣＣ２３９５５からなる群から
選択した微生物である方法に関する。
が、アスペルギルス・オクラセウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌ
ｌｕｓ ｏｃｈｒａｃｅｕｓ）ＡＴＣＣ１８５００、ス
トレプトミセス・オウレオファシエンス（Ｓｔｒｅｐｔ
ｏｍｙｃｅｓ ａｕｒｅｏｆａｃｉｅｎｓ）ＡＴＣＣ１
０７６２、クンニンハメラ・エキヌラタ・バラエティー
・エレガンズ（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍｅｌｌａ ｅｃｈ
ｉｎｕｌａｔａ ｖ． ｅｌｅｇａｎｓ）ＡＴＣＣ８６
８８ｂ、クンニンハメラ・エキヌラタ・バラエティー・
エレガンズ（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍｅｌｌａ ｅｃｈｉ
ｎｕｌａｔａ ｖ． ｅｌｅｇａｎｓ）ＡＴＣＣ８６８
８ａ、クンニンハメラ・エキヌラタ・バラエティー・エ
キヌラタ（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍｅｌｌａ ｅｃｈｉｎ
ｕｌａｔａ ｖ． ｅｃｈｉｎｕｌａｔａ）ＡＴＣＣ９
２４４、クンニンハメラ・ホモタリカ（Ｃｕｎｎｉｎｇ
ｈａｍｅｌｌａ ｈｏｍｏｔｈａｌｌｉｃａ）ＡＴＣＣ
１６１６１、クンニンハメラ・エキヌラタ・バラエティ
ー・エレガンズ（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍｅｌｌａ ｅｃ
ｈｉｎｕｌａｔａ ｖ． ｅｌｅｇａｎｓ）ＡＴＣＣ３
６１１２、クンニンハメラ・エキヌラタ・バラエティー
・エキヌラタ（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍｅｌｌａ ｅｃｈ
ｉｎｕｌａｔａ ｖ． ｅｃｈｉｎｕｌａｔａ）ＡＴＣ
Ｃ３６１９０、クンニンハメラ・エキヌラタ・バラエテ
ィー・エレガンズ（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍｅｌｌａ ｅ
ｃｈｉｎｕｌａｔａ ｖ． ｅｌｅｇａｎｓ）ＡＴＣＣ
１００２８ｂ、クンニンハメラ・エキヌラタ・バラエテ
ィー・エレガンズ（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍｅｌｌａ ｅ
ｃｈｉｎｕｌａｔａ ｖ． ｅｌｅｇａｎｓ）ＡＴＣＣ
９２４５、クンニンハメラ・エキヌラタ・バラエティー
・エレガンズ（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍｅｌｌａ ｅｃｈ
ｉｎｕｌａｔａ ｖ． ｅｌｅｇａｎｓ）ＡＴＣＣ８９
８３、クンニンハメラ・エキヌラタ・バラエティー・エ
レガンズ（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍｅｌｌａ ｅｃｈｉｎ
ｕｌａｔａ ｖ． ｅｌｅｇａｎｓ）ＡＴＣＣ２６２６
９、ピソミセス・シノドンチス（Ｐｉｔｈｏｍｙｃｅｓ
ｃｙｎｏｄｏｎｔｉｓ）ＡＴＣＣ２６１５０、アブシ
ジア・グラウカ（Ａｂｓｉｄｉａ ｇｌａｕｃａ）ＡＴ
ＣＣ２２７５２、ボーベリア・バシアナ（Ｂｅａｕｖｅ
ｒｉａ ｂａｓｓｉａｎａ）ＡＴＣＣ７１５９、ノカル
ジア種（Ｎｏｃａｒｄｉａ ｓｐ．）ＡＴＣＣ５３７５
８、ストレプトミセス・リモサス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙ
ｃｅｓ ｒｉｍｏｓｕｓ）ＡＴＣＣ５５０４３、及びス
トレプトミセス・リモサス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ
ｒｉｍｏｓｕｓ）ＡＴＣＣ２３９５５からなる群から
選択した微生物である方法に関する。
【０００５】別の態様では、本発明は、式（Ｉ）：
【化１４】 で表される化合物から、式（II）：
【化１５】 で表される化合物を製造する方法であって、クンニンハ
メラ種（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍｅｌｌａ ｓｐｅｃｉｅ
ｓ）の微生物によって生成されるヒドロキシル化酵素少
なくとも１種類の存在下で前記式（Ｉ）で表される化合
物をヒドロキシル化することを含む、前記製造方法に関
する。
メラ種（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍｅｌｌａ ｓｐｅｃｉｅ
ｓ）の微生物によって生成されるヒドロキシル化酵素少
なくとも１種類の存在下で前記式（Ｉ）で表される化合
物をヒドロキシル化することを含む、前記製造方法に関
する。
【０００６】前記の方法は、前記のクンニンハメラ種
が、クンニンハメラ・エキヌラタ・バラエティー・エレ
ガンズであることが好ましい。更に、前記の方法は、前
記のクンニンハメラ・エキヌラタ種（Ｃｕｎｎｉｎｇｈ
ａｍｅｌｌａ ｅｃｈｉｎｕｌａｔａ ｓｐｅｃｉｅ
ｓ）が、クンニンハメラ・エキヌラタ・バラエティー・
エレガンズＡＴＣＣ８６８８ｂであることが好ましい。
が、クンニンハメラ・エキヌラタ・バラエティー・エレ
ガンズであることが好ましい。更に、前記の方法は、前
記のクンニンハメラ・エキヌラタ種（Ｃｕｎｎｉｎｇｈ
ａｍｅｌｌａ ｅｃｈｉｎｕｌａｔａ ｓｐｅｃｉｅ
ｓ）が、クンニンハメラ・エキヌラタ・バラエティー・
エレガンズＡＴＣＣ８６８８ｂであることが好ましい。
【０００７】別の態様では、本発明は、式（Ｉ）：
【化１６】 で表される化合物から、式（III）：
【化１７】 で表される化合物を製造する方法であって、アスペルギ
ルス属（ｇｅｎｕｓ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）の微生
物を培養することによって生成されるヒドロキシル化酵
素少なくとも１種類の存在下で前記式（Ｉ）で表される
化合物をヒドロキシル化することを含む、前記製造方法
に関する。
ルス属（ｇｅｎｕｓ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）の微生
物を培養することによって生成されるヒドロキシル化酵
素少なくとも１種類の存在下で前記式（Ｉ）で表される
化合物をヒドロキシル化することを含む、前記製造方法
に関する。
【０００８】前記の方法は、前記のアスペルギルス培養
物が、アスペルギルス・フラビペス（Ａｓｐｅｒｇｉｌ
ｌｕｓ ｆｌａｖｉｐｅｓ）であることが好ましい。更
に、前記の方法は、前記のアスペルギルス・フラビペス
培養物が、アスペルギルス・フラビペスＡＴＣＣ１６７
９５であることが好ましい。
物が、アスペルギルス・フラビペス（Ａｓｐｅｒｇｉｌ
ｌｕｓ ｆｌａｖｉｐｅｓ）であることが好ましい。更
に、前記の方法は、前記のアスペルギルス・フラビペス
培養物が、アスペルギルス・フラビペスＡＴＣＣ１６７
９５であることが好ましい。
【０００９】別の態様では、本発明は、式（IV）：
【化１８】 で表される化合物から、式（II）：
【化１９】 で表される化合物を製造する方法であって、クンニンハ
メラ属（ｇｅｎｕｓ Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍｅｌｌａ）
の微生物を培養することによって生成される還元酵素少
なくとも１種類の存在下で前記式（IV）で表される化合
物を選択的に還元することを含む、前記製造方法に関す
る。
メラ属（ｇｅｎｕｓ Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍｅｌｌａ）
の微生物を培養することによって生成される還元酵素少
なくとも１種類の存在下で前記式（IV）で表される化合
物を選択的に還元することを含む、前記製造方法に関す
る。
【００１０】好ましい態様では、本発明は、前記のクン
ニンハメラ属の微生物が、クンニンハメラ・エキヌラタ
・バラエティー・エレガンズである方法に関する。別の
好ましい態様では、本発明は、前記のクンニンハメラ種
の微生物が、クンニンハメラ・エキヌラタ・バラエティ
ー・エレガンズＡＴＣＣ８６８８ｂである方法に関す
る。
ニンハメラ属の微生物が、クンニンハメラ・エキヌラタ
・バラエティー・エレガンズである方法に関する。別の
好ましい態様では、本発明は、前記のクンニンハメラ種
の微生物が、クンニンハメラ・エキヌラタ・バラエティ
ー・エレガンズＡＴＣＣ８６８８ｂである方法に関す
る。
【００１１】別の好ましい態様では、クンニンハメラ・
エキヌラタ由来の酵素によって前記式（III）で表され
る化合物を前記式（II）で表される化合物に変換するこ
とを含む方法によって、式（II）で表される化合物と式
（III）で表される化合物との混合物から式（II）で表
される化合物を製造する。
エキヌラタ由来の酵素によって前記式（III）で表され
る化合物を前記式（II）で表される化合物に変換するこ
とを含む方法によって、式（II）で表される化合物と式
（III）で表される化合物との混合物から式（II）で表
される化合物を製造する。
【００１２】
【発明の実施の形態】本発明は、光学的に活性な３−ヒ
ドロキシピロリジン誘導体の微生物学的な製造方法に関
する。より具体的には、本発明は、ピロリジン−１−カ
ルボン酸フェニルエステル〔式（Ｉ）で表される化合
物〕と前記式（Ｉ）で表される化合物をヒドロキシル化
することのできる適当な微生物とを接触させ、そして選
択的に形成され蓄積される光学的に活性な３−ヒドロキ
シピロリジン誘導体〔式（II）及び式（III）で表され
る化合物〕を回収することを含む方法に関する。本発明
の別の観点は、ケトン前駆体を不整還元することによ
る、光学的に活性な３−ヒドロキシピロリジン誘導体の
微生物学的な製造方法に関する。この方法は、式（I
V）：
ドロキシピロリジン誘導体の微生物学的な製造方法に関
する。より具体的には、本発明は、ピロリジン−１−カ
ルボン酸フェニルエステル〔式（Ｉ）で表される化合
物〕と前記式（Ｉ）で表される化合物をヒドロキシル化
することのできる適当な微生物とを接触させ、そして選
択的に形成され蓄積される光学的に活性な３−ヒドロキ
シピロリジン誘導体〔式（II）及び式（III）で表され
る化合物〕を回収することを含む方法に関する。本発明
の別の観点は、ケトン前駆体を不整還元することによ
る、光学的に活性な３−ヒドロキシピロリジン誘導体の
微生物学的な製造方法に関する。この方法は、式（I
V）：
【化２０】 で表される３−オキソ−ピロリジン−１−カルボン酸フ
ェニルエステルと、そのケトン基を選択的に還元して式
（II）で表される化合物を形成及び蓄積することができ
る適当な微生物とを接触させることを含む。また、式
（II）で表される化合物と式（III）で表される化合物
とのラセミ体混合物から式（II）で表される化合物を製
造する方法も開示する。この方法は、式（II）で表され
る化合物と式（III）で表される化合物とのラセミ体混
合物と、式（III）で表される（Ｒ）−異性体を式（I
I）で表される（Ｓ）−異性体に選択的に変換すること
ができる適当な微生物とを接触させることを含む。光学
的に活性な３−ヒドロキシピロリジン誘導体は、製剤学
的化合物及び農芸化学的化合物の合成に有用な中間体で
ある。
ェニルエステルと、そのケトン基を選択的に還元して式
（II）で表される化合物を形成及び蓄積することができ
る適当な微生物とを接触させることを含む。また、式
（II）で表される化合物と式（III）で表される化合物
とのラセミ体混合物から式（II）で表される化合物を製
造する方法も開示する。この方法は、式（II）で表され
る化合物と式（III）で表される化合物とのラセミ体混
合物と、式（III）で表される（Ｒ）−異性体を式（I
I）で表される（Ｓ）−異性体に選択的に変換すること
ができる適当な微生物とを接触させることを含む。光学
的に活性な３−ヒドロキシピロリジン誘導体は、製剤学
的化合物及び農芸化学的化合物の合成に有用な中間体で
ある。
【００１３】ピロリジン−１−カルボン酸フェニルエス
テル〔式（Ｉ）で表される化合物〕から光学的に活性な
３−ヒドロキシピロリジン−１−カルボン酸フェニルエ
ステル〔式（II）及び式（III）で表される化合物〕へ
の微生物学的ヒドロキシル化は、式（Ｉ）で表される化
合物と適当な微生物の培養物とを接触させることによっ
て実施することができる。あるいは、前記微生物からそ
の酵素を精製するか部分的に精製することができるか、
又は、前記微生物の細胞フラグメントを用いることがで
きる。また、前記微生物の固定化細胞も用いることがで
きる。
テル〔式（Ｉ）で表される化合物〕から光学的に活性な
３−ヒドロキシピロリジン−１−カルボン酸フェニルエ
ステル〔式（II）及び式（III）で表される化合物〕へ
の微生物学的ヒドロキシル化は、式（Ｉ）で表される化
合物と適当な微生物の培養物とを接触させることによっ
て実施することができる。あるいは、前記微生物からそ
の酵素を精製するか部分的に精製することができるか、
又は、前記微生物の細胞フラグメントを用いることがで
きる。また、前記微生物の固定化細胞も用いることがで
きる。
【００１４】ピロリジン−１−カルボン酸フェニルエス
テル、すなわち、式（Ｉ）：
テル、すなわち、式（Ｉ）：
【化２１】 で表される化合物と、前記微生物クンニンハメラ・エキ
ヌラタＡＴＣＣ８６８８ｂとを接触させると、その結果
として、（Ｓ）−３−ヒドロキシピロリジン−１−カル
ボン酸フェニルエステル、すなわち、式（II）：
ヌラタＡＴＣＣ８６８８ｂとを接触させると、その結果
として、（Ｓ）−３−ヒドロキシピロリジン−１−カル
ボン酸フェニルエステル、すなわち、式（II）：
【化２２】 で表される化合物を形成し、そして蓄積する。
【００１５】（Ｒ）−３−ヒドロキシピロリジン−１−
カルボン酸フェニルエステル、すなわち、式（III）：
カルボン酸フェニルエステル、すなわち、式（III）：
【化２３】 で表される化合物は、ピロリジン−１−カルボン酸フェ
ニルエステル〔式（Ｉ）で表される化合物〕と、前記微
生物アスペルギルス・フラビペスＡＴＣＣ１６７９５の
培養物とを接触させることによって、形成され、そして
蓄積される。
ニルエステル〔式（Ｉ）で表される化合物〕と、前記微
生物アスペルギルス・フラビペスＡＴＣＣ１６７９５の
培養物とを接触させることによって、形成され、そして
蓄積される。
【００１６】また、式（II）で表される（Ｓ）−３−ヒ
ドロキシピロリジン−１−カルボン酸フェニルエステル
は、式（IV）：
ドロキシピロリジン−１−カルボン酸フェニルエステル
は、式（IV）：
【化２４】 で表される３−オキソ−ピロリジン−１−カルボン酸フ
ェニルエステルと、前記微生物クンニンハメラ・エキヌ
ラタＡＴＣＣ８６８８ｂの培養物とを接触させることに
よっても、形成され、そして蓄積される。
ェニルエステルと、前記微生物クンニンハメラ・エキヌ
ラタＡＴＣＣ８６８８ｂの培養物とを接触させることに
よっても、形成され、そして蓄積される。
【００１７】また、式（II）で表される（Ｓ）−３−ヒ
ドロキシピロリジン−１−カルボン酸フェニルエステル
は、式（II）で表される化合物と式（III）で表される
化合物とのラセミ体混合物と、前記微生物クンニンハメ
ラ・エキヌラタＡＴＣＣ８６８８ｂの培養物とを接触さ
せることによっても、形成され、そして蓄積される。
ドロキシピロリジン−１−カルボン酸フェニルエステル
は、式（II）で表される化合物と式（III）で表される
化合物とのラセミ体混合物と、前記微生物クンニンハメ
ラ・エキヌラタＡＴＣＣ８６８８ｂの培養物とを接触さ
せることによっても、形成され、そして蓄積される。
【００１８】
【実施例１】《式（Ｉ）で表されるピロリジン−１−カ
ルボン酸フェニルエステルの微生物によるヒドロキシル
化に関するスクリーニング》式（Ｉ）で表されるピロリ
ジン−１−カルボン酸フェニルエステルをヒドロキシル
化する下記微生物の能力は、以下の方法によって確認し
た。種々の微生物の細胞を、デキストロース・栄養ダイ
ズ粉（ｎｕｔｒｉｓｏｙ ｆｌｏｕｒ）培地〔２％デキ
ストロース、０．５％栄養ダイズ粉、０．５％酵母抽出
物、０．５％ＮａＣｌ、及び０．５％Ｋ2ＨＰＯ4；ｐＨ
７．０〕２．５ｍＬを含有する管中で生長させた。前記
培地のｐＨは、滅菌前に調整し、接種後は制御していな
い。個々の管に、冷凍グリセロール懸濁液として貯蔵し
ておいた種々の微生物の胞子又は栄養細胞（胞子又は栄
養細胞の約１％ｗ／ｖ保存培養物）を接種し、そして回
転式振とう器上で２２０ｒｐｍで攪拌しながら約２８℃
でインキュベートした。約４８時間後、エタノール中の
ピロリジン−１−カルボン酸フェニルエステル（２０ｍ
ｇ／ｍＬ）の溶液０．０２５ｍＬを各管に加えた。基質
を加えた後に前記管を約４日間インキュベートし、その
後、内容物を酢酸エチル（ＥＴＯＡｃ）で抽出した。そ
の酢酸エチル抽出物を窒素流下で乾燥し、アセトニトリ
ル（ＡＣＮ）：水（１：１，ｖ／ｖ）１ｍＬ中で再構成
し、そしてＩｎｅｒｔｓｉｌ（商標）Ｃ８カラムＣカラ
ムエンジニアリング社（オンタリオ州，カナダ）（内径
４．６ｍｍ×２５０ｍｍ）を用いる逆相高速液体クロマ
トグラフィー（ＨＰＬＣ）によって分析した。前記分析
は、２０ｍＭ−ＮａＨ2ＰＯ4（ｐＨ４．５）とＡＣＮと
の混合物を用いる勾配溶出により、以下の条件下で実施
した：０〜２分の間は、２５％ＡＣＮ；２．１分〜１５
分の間は、５０％ＡＣＮ；溶媒の流速は、１ｍＬ／分。
これらの条件下において、基質は、１１．２分の時点で
溶離し、そしてアルコール生成物〔化合物（II）及び
（III）〕は、６．９分の時点で溶離した。生成したア
ルコールを含有する抽出物を乾固し、ヘキサン：イソプ
ロピルアルコール（ｉｐａ）（９：１，ｖ／ｖ）の混合
物中で再構成し、そしてＣｈｉｒａｃｅｌ（商標）ＯＤ
カラム（キラルテクノロジーズ社，Ｅｘｔｏｎ，ペンシ
ルバニア州）（内径４．６ｍｍ×２５０ｍｍ）上におけ
るＨＰＬＣによって分析した。前記Ｃｈｉｒａｃｅｌ
（商標）ＯＤ分析は、１ｍＬ／分の流速で、ヘキサン：
ｉｐａ（９２：８，ｖ／ｖ）を用いる全体に平等な（ｉ
ｓｏｃｒａｔｉｃ）溶出により実施した。これらの条件
下において、式（II）で表される（Ｓ）−３−ヒドロキ
シピロリジン−１−カルボン酸フェニルエステルは、約
３６．１分の時点で溶離し、そして式（III）で表され
る（Ｒ）−３−ヒドロキシピロリジン−１−カルボン酸
フェニルエステルは、約３３．６分の時点で溶離した。
これら逆相ＨＰＬＣ分析及びキラルＨＰＬＣ分析の結果
を、表１にまとめる。
ルボン酸フェニルエステルの微生物によるヒドロキシル
化に関するスクリーニング》式（Ｉ）で表されるピロリ
ジン−１−カルボン酸フェニルエステルをヒドロキシル
化する下記微生物の能力は、以下の方法によって確認し
た。種々の微生物の細胞を、デキストロース・栄養ダイ
ズ粉（ｎｕｔｒｉｓｏｙ ｆｌｏｕｒ）培地〔２％デキ
ストロース、０．５％栄養ダイズ粉、０．５％酵母抽出
物、０．５％ＮａＣｌ、及び０．５％Ｋ2ＨＰＯ4；ｐＨ
７．０〕２．５ｍＬを含有する管中で生長させた。前記
培地のｐＨは、滅菌前に調整し、接種後は制御していな
い。個々の管に、冷凍グリセロール懸濁液として貯蔵し
ておいた種々の微生物の胞子又は栄養細胞（胞子又は栄
養細胞の約１％ｗ／ｖ保存培養物）を接種し、そして回
転式振とう器上で２２０ｒｐｍで攪拌しながら約２８℃
でインキュベートした。約４８時間後、エタノール中の
ピロリジン−１−カルボン酸フェニルエステル（２０ｍ
ｇ／ｍＬ）の溶液０．０２５ｍＬを各管に加えた。基質
を加えた後に前記管を約４日間インキュベートし、その
後、内容物を酢酸エチル（ＥＴＯＡｃ）で抽出した。そ
の酢酸エチル抽出物を窒素流下で乾燥し、アセトニトリ
ル（ＡＣＮ）：水（１：１，ｖ／ｖ）１ｍＬ中で再構成
し、そしてＩｎｅｒｔｓｉｌ（商標）Ｃ８カラムＣカラ
ムエンジニアリング社（オンタリオ州，カナダ）（内径
４．６ｍｍ×２５０ｍｍ）を用いる逆相高速液体クロマ
トグラフィー（ＨＰＬＣ）によって分析した。前記分析
は、２０ｍＭ−ＮａＨ2ＰＯ4（ｐＨ４．５）とＡＣＮと
の混合物を用いる勾配溶出により、以下の条件下で実施
した：０〜２分の間は、２５％ＡＣＮ；２．１分〜１５
分の間は、５０％ＡＣＮ；溶媒の流速は、１ｍＬ／分。
これらの条件下において、基質は、１１．２分の時点で
溶離し、そしてアルコール生成物〔化合物（II）及び
（III）〕は、６．９分の時点で溶離した。生成したア
ルコールを含有する抽出物を乾固し、ヘキサン：イソプ
ロピルアルコール（ｉｐａ）（９：１，ｖ／ｖ）の混合
物中で再構成し、そしてＣｈｉｒａｃｅｌ（商標）ＯＤ
カラム（キラルテクノロジーズ社，Ｅｘｔｏｎ，ペンシ
ルバニア州）（内径４．６ｍｍ×２５０ｍｍ）上におけ
るＨＰＬＣによって分析した。前記Ｃｈｉｒａｃｅｌ
（商標）ＯＤ分析は、１ｍＬ／分の流速で、ヘキサン：
ｉｐａ（９２：８，ｖ／ｖ）を用いる全体に平等な（ｉ
ｓｏｃｒａｔｉｃ）溶出により実施した。これらの条件
下において、式（II）で表される（Ｓ）−３−ヒドロキ
シピロリジン−１−カルボン酸フェニルエステルは、約
３６．１分の時点で溶離し、そして式（III）で表され
る（Ｒ）−３−ヒドロキシピロリジン−１−カルボン酸
フェニルエステルは、約３３．６分の時点で溶離した。
これら逆相ＨＰＬＣ分析及びキラルＨＰＬＣ分析の結果
を、表１にまとめる。
【００１９】
【表１】
【００２０】
【実施例２】《種々の培地中のクンニンハメラ・エキヌ
ラタＡＴＣＣ８６８８ｂによる式（Ｉ）で表されるピロ
リジン−１−カルボン酸フェニルエステルの微生物的ヒ
ドロキシル化》下記のとおりに調製した５種類の培地の
２．５ｍＬアリコートを含有するガラス管（１２５ｍｍ
×内径１６ｍｍ）中で、クンニンハメラ・エキヌラタＡ
ＴＣＣ８６８８ｂを生長させた。培地１は、実施例１に
記載のとおりに、デキストロース及び栄養ダイズ粉を用
いて調製した。培地２は、コーン煎じ液（４％）及びデ
キストロース（２％）を用いて調製し、そして滅菌前に
ｐＨ４．８５に調整した。培地３は、コーン煎じ固形物
（４％）及びデキストロース（２％）を用いて調製し、
そして滅菌前にｐＨ４．８５に調整した。培地４は、フ
ァーマメディア〔Ｐｈａｒｍａｍｅｄｉａ（商標）；ト
レーダーズプロテイン，メンフィス，テネシー州〕（２
％）及びデキストロース（２％）を用いて調製し、そし
て滅菌前にｐＨ７．２に調整した。培地５は、麦芽抽出
物（１％）、デキストロース（１％）、ペプトン（０．
５％）、及び酵母抽出物（０．２％）を用いて調製し、
そして滅菌前にｐＨ７．０に調整した。生長培地１、
３、４、及び５を含有する管にクンニンハメラ・エキヌ
ラタＡＴＣＣ８６８８ｂの胞子を接種し、そして攪拌
（２２０ｒｐｍ）しながら２８℃でインキュベートし
た。約４８時間生長させた後に、式（Ｉ）で表されるピ
ロリジン−１−カルボン酸フェニルエステルの６０ｍｇ
／ｍＬエタノール溶液０．０２５ｍＬを各管に加えた。
基質を加えてから約１０日間その管をインキュベート
し、その後、その内容物を酢酸エチルで抽出した。その
酢酸エチル抽出物を窒素流下で乾燥し、ＡＣＮ：水
（１：１，ｖ／ｖ）混合液中で再構成し、そして実施例
１に記載のとおりに逆相ＨＰＬＣ及びキラルＨＰＬＣに
よって分析した。生長培地２を含有する管を、接種時に
基質を加えること以外は培地１、３、４、及び５に対す
る前記と同じ方法で処理する。前記の逆相ＨＰＬＣ及び
キラルＨＰＬＣの分析結果を表２にまとめる。
ラタＡＴＣＣ８６８８ｂによる式（Ｉ）で表されるピロ
リジン−１−カルボン酸フェニルエステルの微生物的ヒ
ドロキシル化》下記のとおりに調製した５種類の培地の
２．５ｍＬアリコートを含有するガラス管（１２５ｍｍ
×内径１６ｍｍ）中で、クンニンハメラ・エキヌラタＡ
ＴＣＣ８６８８ｂを生長させた。培地１は、実施例１に
記載のとおりに、デキストロース及び栄養ダイズ粉を用
いて調製した。培地２は、コーン煎じ液（４％）及びデ
キストロース（２％）を用いて調製し、そして滅菌前に
ｐＨ４．８５に調整した。培地３は、コーン煎じ固形物
（４％）及びデキストロース（２％）を用いて調製し、
そして滅菌前にｐＨ４．８５に調整した。培地４は、フ
ァーマメディア〔Ｐｈａｒｍａｍｅｄｉａ（商標）；ト
レーダーズプロテイン，メンフィス，テネシー州〕（２
％）及びデキストロース（２％）を用いて調製し、そし
て滅菌前にｐＨ７．２に調整した。培地５は、麦芽抽出
物（１％）、デキストロース（１％）、ペプトン（０．
５％）、及び酵母抽出物（０．２％）を用いて調製し、
そして滅菌前にｐＨ７．０に調整した。生長培地１、
３、４、及び５を含有する管にクンニンハメラ・エキヌ
ラタＡＴＣＣ８６８８ｂの胞子を接種し、そして攪拌
（２２０ｒｐｍ）しながら２８℃でインキュベートし
た。約４８時間生長させた後に、式（Ｉ）で表されるピ
ロリジン−１−カルボン酸フェニルエステルの６０ｍｇ
／ｍＬエタノール溶液０．０２５ｍＬを各管に加えた。
基質を加えてから約１０日間その管をインキュベート
し、その後、その内容物を酢酸エチルで抽出した。その
酢酸エチル抽出物を窒素流下で乾燥し、ＡＣＮ：水
（１：１，ｖ／ｖ）混合液中で再構成し、そして実施例
１に記載のとおりに逆相ＨＰＬＣ及びキラルＨＰＬＣに
よって分析した。生長培地２を含有する管を、接種時に
基質を加えること以外は培地１、３、４、及び５に対す
る前記と同じ方法で処理する。前記の逆相ＨＰＬＣ及び
キラルＨＰＬＣの分析結果を表２にまとめる。
【００２１】
【表２】
【００２２】
【実施例３】《クンニンハメラ・エキヌラタＡＴＣＣ８
６８８ｂのフラスコ培養物における式（Ｉ）で表される
ピロリジン−１−カルボン酸フェニルエステルの微生物
的ヒドロキシル化》実施例２に記載の培地２（０．５
Ｌ）をそれぞれ含有する６個のフェルンバッハフラスコ
に、クンニンハメラ・エキヌラタＡＴＣＣ８６８８ｂの
胞子を接種し、そして回転振とう器（２２０ｒｐｍ）上
で２９℃でインキュベートした。２４時間後に、各フラ
スコに式（Ｉ）で表されるピロリジン−１−カルボン酸
フェニルエステルの６０ｍｇ／ｍＬエタノール溶液５ｍ
Ｌを加え、そして更に１６日間インキュベートした。発
酵ブロスのサンプルを摘出し、酢酸エチルで抽出し、そ
してその抽出物を実施例１に記載のとおりに逆相ＨＰＬ
Ｃ及びキラルＨＰＬＣで分析することによって、フラス
コ６個の内の２個（フラスコＡ及びＢ）において生変換
（ｂｉｏｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ）を監視した。これらの
ＨＰＬＣ分析の結果を表３にまとめる。前記の１６日間
のインキュベーション後に、６個のフラスコ全ての内容
物を貯留（プール）し、そして３重層のチーズクロスを
通してろ過することによって細胞を除去した。次に、そ
のろ液を、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ（商標）ＸＡＤ−１６樹
脂（Ｒｏｈｍ ａｎｄ Ｈａａｓ，フィラデルフィア，
ペンシルバニア州）５０ｇを用いて、２１℃で４．５時
間攪拌した。前記樹脂をろ紙上に収集し、そして酢酸エ
チル０．８Ｌで洗浄した。その酢酸エチル抽出物を水で
洗浄し、無水硫酸マグネシウムを用いて乾燥し、そして
減圧下で濃縮して粗生成物０．９３ｇを得た。この粗生
成物を、５ｇシリカＳｅｐｐａｋ（商標）カートリッジ
（Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，ミルフォー
ド，マサチューセッツ州）に適用し、そして酢酸エチル
とヘキサンとの混合物（２：３，１：１）を用いて溶出
し、そして所望の生成物を含むフラクションを減圧下で
濃縮して、式（II）で表される（Ｓ）−３−ヒドロキシ
ピロリジン−１−カルボン酸フェニルエステル０．６４
ｇ（収率３３％，８９％ｅ．ｅ．）を得た。
６８８ｂのフラスコ培養物における式（Ｉ）で表される
ピロリジン−１−カルボン酸フェニルエステルの微生物
的ヒドロキシル化》実施例２に記載の培地２（０．５
Ｌ）をそれぞれ含有する６個のフェルンバッハフラスコ
に、クンニンハメラ・エキヌラタＡＴＣＣ８６８８ｂの
胞子を接種し、そして回転振とう器（２２０ｒｐｍ）上
で２９℃でインキュベートした。２４時間後に、各フラ
スコに式（Ｉ）で表されるピロリジン−１−カルボン酸
フェニルエステルの６０ｍｇ／ｍＬエタノール溶液５ｍ
Ｌを加え、そして更に１６日間インキュベートした。発
酵ブロスのサンプルを摘出し、酢酸エチルで抽出し、そ
してその抽出物を実施例１に記載のとおりに逆相ＨＰＬ
Ｃ及びキラルＨＰＬＣで分析することによって、フラス
コ６個の内の２個（フラスコＡ及びＢ）において生変換
（ｂｉｏｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ）を監視した。これらの
ＨＰＬＣ分析の結果を表３にまとめる。前記の１６日間
のインキュベーション後に、６個のフラスコ全ての内容
物を貯留（プール）し、そして３重層のチーズクロスを
通してろ過することによって細胞を除去した。次に、そ
のろ液を、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ（商標）ＸＡＤ−１６樹
脂（Ｒｏｈｍ ａｎｄ Ｈａａｓ，フィラデルフィア，
ペンシルバニア州）５０ｇを用いて、２１℃で４．５時
間攪拌した。前記樹脂をろ紙上に収集し、そして酢酸エ
チル０．８Ｌで洗浄した。その酢酸エチル抽出物を水で
洗浄し、無水硫酸マグネシウムを用いて乾燥し、そして
減圧下で濃縮して粗生成物０．９３ｇを得た。この粗生
成物を、５ｇシリカＳｅｐｐａｋ（商標）カートリッジ
（Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，ミルフォー
ド，マサチューセッツ州）に適用し、そして酢酸エチル
とヘキサンとの混合物（２：３，１：１）を用いて溶出
し、そして所望の生成物を含むフラクションを減圧下で
濃縮して、式（II）で表される（Ｓ）−３−ヒドロキシ
ピロリジン−１−カルボン酸フェニルエステル０．６４
ｇ（収率３３％，８９％ｅ．ｅ．）を得た。
【００２３】
【表３】
【００２４】
【実施例４】《クンニンハメラ・エキヌラタＡＴＣＣ８
６８８ｂの発酵器培養物における式（Ｉ）で表されるピ
ロリジン−１−カルボン酸フェニルエステルの微生物的
ヒドロキシル化》実施例２に記載の培地２（０．５Ｌ）
をそれぞれ含有する３個のフェルンバッハフラスコに、
クンニンハメラ・エキヌラタＡＴＣＣ８６８８ｂの胞子
を接種し、そして回転振とう器（２２０ｒｐｍ）上で２
９℃でインキュベートした。約２４時間後に、前記フラ
スコ３個の内容物を一緒にし、そしてこれを使用して発
酵器２個〔それぞれ、培地２（８Ｌ）を含有する〕に接
種した。発酵器（発酵器Ａ及びＢ）は、６００ｒｐｍで
攪拌し、そして毎分８Ｌ通気するようにしながら、２９
℃で運転した。そのｐＨは、６〜７の間に制御した。２
４時間後に、各発酵器に、エタノール２０ｍＬ中に溶解
した基質（Ｉ）４．８ｇを加えることによって生変換を
開始した。前記生変換に続いてサンプルを除去し、酢酸
エチルで抽出し、そして実施例１に記載のとおりに逆相
ＨＰＬＣ及びキラルＨＰＬＣによって分析した。これら
のＨＰＬＣ分析の結果を表４にまとめる。基質添加から
約９日後に、前記発酵器の内容物を貯留し、そして３重
層のチーズクロスを通してろ過した。そのろ液を、ＸＡ
Ｄ−１６樹脂約５００ｇを含有するカラムを通過させ
た。次に、その樹脂を水１Ｌで洗浄し、そして酢酸エチ
ル６Ｌで溶出した。その酢酸エチル溶離液を水で洗浄
し、無水硫酸マグネシウム上で乾燥し、そして減圧下で
濃縮して、粗生成物を得た。この粗生成物を、シリカフ
ラッシュカートリッジ（Ｂｉｏｔａｇｅ Ｈｅｒｔｓ
ＳＧｌ３ ７ＮＷ，英国）に適用し、そして酢酸エチル
とヘキサンとの混合物（２：３，１：１）を用いて、１
０％酢酸エチルで開始し、そして１０％の増加量で８０
％酢酸エチルまで増加させながら溶出した。６０〜８０
％酢酸エチルで溶出したフラクションを一緒にし、そし
て減圧下で濃縮して、式（II）で表される（Ｓ）−３−
ヒドロキシピロリジン−１−カルボン酸フェニルエステ
ル２．９ｇ（収率２８％，８８％ｅ．ｅ．）を得た。
６８８ｂの発酵器培養物における式（Ｉ）で表されるピ
ロリジン−１−カルボン酸フェニルエステルの微生物的
ヒドロキシル化》実施例２に記載の培地２（０．５Ｌ）
をそれぞれ含有する３個のフェルンバッハフラスコに、
クンニンハメラ・エキヌラタＡＴＣＣ８６８８ｂの胞子
を接種し、そして回転振とう器（２２０ｒｐｍ）上で２
９℃でインキュベートした。約２４時間後に、前記フラ
スコ３個の内容物を一緒にし、そしてこれを使用して発
酵器２個〔それぞれ、培地２（８Ｌ）を含有する〕に接
種した。発酵器（発酵器Ａ及びＢ）は、６００ｒｐｍで
攪拌し、そして毎分８Ｌ通気するようにしながら、２９
℃で運転した。そのｐＨは、６〜７の間に制御した。２
４時間後に、各発酵器に、エタノール２０ｍＬ中に溶解
した基質（Ｉ）４．８ｇを加えることによって生変換を
開始した。前記生変換に続いてサンプルを除去し、酢酸
エチルで抽出し、そして実施例１に記載のとおりに逆相
ＨＰＬＣ及びキラルＨＰＬＣによって分析した。これら
のＨＰＬＣ分析の結果を表４にまとめる。基質添加から
約９日後に、前記発酵器の内容物を貯留し、そして３重
層のチーズクロスを通してろ過した。そのろ液を、ＸＡ
Ｄ−１６樹脂約５００ｇを含有するカラムを通過させ
た。次に、その樹脂を水１Ｌで洗浄し、そして酢酸エチ
ル６Ｌで溶出した。その酢酸エチル溶離液を水で洗浄
し、無水硫酸マグネシウム上で乾燥し、そして減圧下で
濃縮して、粗生成物を得た。この粗生成物を、シリカフ
ラッシュカートリッジ（Ｂｉｏｔａｇｅ Ｈｅｒｔｓ
ＳＧｌ３ ７ＮＷ，英国）に適用し、そして酢酸エチル
とヘキサンとの混合物（２：３，１：１）を用いて、１
０％酢酸エチルで開始し、そして１０％の増加量で８０
％酢酸エチルまで増加させながら溶出した。６０〜８０
％酢酸エチルで溶出したフラクションを一緒にし、そし
て減圧下で濃縮して、式（II）で表される（Ｓ）−３−
ヒドロキシピロリジン−１−カルボン酸フェニルエステ
ル２．９ｇ（収率２８％，８８％ｅ．ｅ．）を得た。
【００２５】
【表４】
【００２６】
【実施例５】《アスペルギルス・フラビペスＡＴＣＣ１
６７９５の発酵器培養物における式（Ｉ）で表されるピ
ロリジン−１−カルボン酸フェニルエステルの微生物的
ヒドロキシル化》培地２（実施例２）２．５ｍＬを含有
する管４本にアスペルギルス・フラビペスＡＴＣＣ１６
７９５の胞子を接種し、そして回転振とう器（２１０ｒ
ｐｍ）上で２９℃でインキュベートした。約２４時間後
に、管２本に式（Ｉ）で表されるピロリジン−１−カル
ボン酸フェニルエステルの２０ｍｇ／ｍＬエタノール溶
液０．０２５ｍＬを加え、そして残りの管２本に式
（Ｉ）で表されるピロリジン−１−カルボン酸フェニル
エステルの５０ｍｇ／ｍＬエタノール溶液０．０２５ｍ
Ｌを加えた。基質を添加した後に、前記管を約１０日間
インキュベートし、その後、その内容物を酢酸エチルで
抽出した。その酢酸エチル抽出物を窒素流下で乾燥し、
ＡＣＮ：水（４：１，ｖ／ｖ）混合液中で再構成し、そ
して実施例１に記載のとおりに逆相ＨＰＬＣ及びキラル
ＨＰＬＣによって分析した。これらのＨＰＬＣ分析の結
果を表５にまとめる。
６７９５の発酵器培養物における式（Ｉ）で表されるピ
ロリジン−１−カルボン酸フェニルエステルの微生物的
ヒドロキシル化》培地２（実施例２）２．５ｍＬを含有
する管４本にアスペルギルス・フラビペスＡＴＣＣ１６
７９５の胞子を接種し、そして回転振とう器（２１０ｒ
ｐｍ）上で２９℃でインキュベートした。約２４時間後
に、管２本に式（Ｉ）で表されるピロリジン−１−カル
ボン酸フェニルエステルの２０ｍｇ／ｍＬエタノール溶
液０．０２５ｍＬを加え、そして残りの管２本に式
（Ｉ）で表されるピロリジン−１−カルボン酸フェニル
エステルの５０ｍｇ／ｍＬエタノール溶液０．０２５ｍ
Ｌを加えた。基質を添加した後に、前記管を約１０日間
インキュベートし、その後、その内容物を酢酸エチルで
抽出した。その酢酸エチル抽出物を窒素流下で乾燥し、
ＡＣＮ：水（４：１，ｖ／ｖ）混合液中で再構成し、そ
して実施例１に記載のとおりに逆相ＨＰＬＣ及びキラル
ＨＰＬＣによって分析した。これらのＨＰＬＣ分析の結
果を表５にまとめる。
【００２７】
【表５】
【００２８】
【実施例６】《クンニンハメラ・エキヌラタＡＴＣＣ８
６８８ｂの管培養物における式（IV）で表される３−オ
キソ−ピロリジン−１−カルボン酸フェニルエステルの
微生物による還元》実施例２に記載の培地２（２．５ｍ
Ｌ）を含有する管２本にクンニンハメラ・エキヌラタＡ
ＴＣＣ８６８８ｂの胞子を接種し、そして回転振とう器
（２１０ｒｐｍ）上で２９℃でインキュベートした。約
２４時間後に、各管に式（IV）で表される３−オキソ−
ピロリジン−１−カルボン酸フェニルエステルの２０ｍ
ｇ／ｍＬエタノール溶液０．０２５ｍＬを加えた。基質
を添加した後に、その管を約６日間インキュベートし、
その後、その内容物を酢酸エチルで抽出した。その酢酸
エチル抽出物を窒素流下で乾燥し、ＡＣＮ：水（４：
１，ｖ／ｖ）混合液中で再構成し、そして実施例１に記
載のとおりに逆相ＨＰＬＣ及びキラルＨＰＬＣによって
分析した。これらのＨＰＬＣ分析の結果、７９％の収率
及び９９％より大きいｅ．ｅ．で、式（IV）で表される
化合物が式（Ｉ）で表される化合物に変換したことが明
らかになった。
６８８ｂの管培養物における式（IV）で表される３−オ
キソ−ピロリジン−１−カルボン酸フェニルエステルの
微生物による還元》実施例２に記載の培地２（２．５ｍ
Ｌ）を含有する管２本にクンニンハメラ・エキヌラタＡ
ＴＣＣ８６８８ｂの胞子を接種し、そして回転振とう器
（２１０ｒｐｍ）上で２９℃でインキュベートした。約
２４時間後に、各管に式（IV）で表される３−オキソ−
ピロリジン−１−カルボン酸フェニルエステルの２０ｍ
ｇ／ｍＬエタノール溶液０．０２５ｍＬを加えた。基質
を添加した後に、その管を約６日間インキュベートし、
その後、その内容物を酢酸エチルで抽出した。その酢酸
エチル抽出物を窒素流下で乾燥し、ＡＣＮ：水（４：
１，ｖ／ｖ）混合液中で再構成し、そして実施例１に記
載のとおりに逆相ＨＰＬＣ及びキラルＨＰＬＣによって
分析した。これらのＨＰＬＣ分析の結果、７９％の収率
及び９９％より大きいｅ．ｅ．で、式（IV）で表される
化合物が式（Ｉ）で表される化合物に変換したことが明
らかになった。
【００２９】
【実施例７】《クンニンハメラ・エキヌラタＡＴＣＣ８
６８８ｂの管培養物における（＋／−）−３−ヒドロキ
シ−ピロリジン−１−カルボン酸フェニルエステルの脱
ラセミ化》実施例２に記載の培地２（２．５ｍＬ）を含
有する管２４本にクンニンハメラ・エキヌラタＡＴＣＣ
８６８８ｂの胞子を接種し、そして回転振とう器（２１
０ｒｐｍ）上で２９℃でインキュベートした。約２４時
間後に、管１２本に（＋／−）−３−ヒドロキシ−ピロ
リジン−１−カルボン酸フェニルエステルの６０ｍｇ／
ｍＬエタノール溶液０．０２５ｍＬを加え（処理Ａ）、
そして残りの管１２本に（＋／−）−３−ヒドロキシ−
ピロリジン−１−カルボン酸フェニルエステルの１００
ｍｇ／ｍＬエタノール溶液０．０２５ｍＬを加えた（処
理Ｂ）。その管を、２９℃で、回転振とう器（２１０ｒ
ｐｍ）上で攪拌しながらインキュベートした。インキュ
ベーション後２、４、６、８、１０、及び１２日目に各
処理群から管２本を回収し、そしてその内容物を酢酸エ
チルで抽出した。その酢酸エチル抽出物を窒素流下で乾
燥し、ＡＣＮ：水（４：１，ｖ／ｖ）混合液中で再構成
し、そして実施例１に記載のとおりに逆相ＨＰＬＣ及び
キラルＨＰＬＣによって分析した。これらのＨＰＬＣ分
析の結果を表６にまとめる。
６８８ｂの管培養物における（＋／−）−３−ヒドロキ
シ−ピロリジン−１−カルボン酸フェニルエステルの脱
ラセミ化》実施例２に記載の培地２（２．５ｍＬ）を含
有する管２４本にクンニンハメラ・エキヌラタＡＴＣＣ
８６８８ｂの胞子を接種し、そして回転振とう器（２１
０ｒｐｍ）上で２９℃でインキュベートした。約２４時
間後に、管１２本に（＋／−）−３−ヒドロキシ−ピロ
リジン−１−カルボン酸フェニルエステルの６０ｍｇ／
ｍＬエタノール溶液０．０２５ｍＬを加え（処理Ａ）、
そして残りの管１２本に（＋／−）−３−ヒドロキシ−
ピロリジン−１−カルボン酸フェニルエステルの１００
ｍｇ／ｍＬエタノール溶液０．０２５ｍＬを加えた（処
理Ｂ）。その管を、２９℃で、回転振とう器（２１０ｒ
ｐｍ）上で攪拌しながらインキュベートした。インキュ
ベーション後２、４、６、８、１０、及び１２日目に各
処理群から管２本を回収し、そしてその内容物を酢酸エ
チルで抽出した。その酢酸エチル抽出物を窒素流下で乾
燥し、ＡＣＮ：水（４：１，ｖ／ｖ）混合液中で再構成
し、そして実施例１に記載のとおりに逆相ＨＰＬＣ及び
キラルＨＰＬＣによって分析した。これらのＨＰＬＣ分
析の結果を表６にまとめる。
【００３０】
【表６】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｒ 1:485） Ｃ１２Ｒ 1:485） (Ｃ１２Ｐ 17/10 (Ｃ１２Ｐ 17/10 Ｃ１２Ｒ 1:645） Ｃ１２Ｒ 1:645） (Ｃ１２Ｐ 17/10 (Ｃ１２Ｐ 17/10 Ｃ１２Ｒ 1:365） Ｃ１２Ｒ 1:365） (Ｃ１２Ｐ 17/10 (Ｃ１２Ｐ 17/10 Ｃ１２Ｒ 1:59） Ｃ１２Ｒ 1:59） (Ｃ１２Ｐ 41/00 (Ｃ１２Ｐ 41/00 Ｊ Ｃ１２Ｒ 1:645） Ｃ１２Ｒ 1:645）
Claims (13)
- 【請求項１】 式（Ｉ）： 【化１】 で表される化合物から、式（II）： 【化２】 で表される化合物を製造する方法であって、適当な微生
物によって生成されるヒドロキシル化酵素少なくとも１
種類の存在下で前記式（Ｉ）で表される化合物をヒドロ
キシル化することを含む、前記製造方法。 - 【請求項２】 前記微生物が、アスペルギルス・オクラ
セウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｃｈｒａｃｅｕ
ｓ）ＡＴＣＣ１８５００、ストレプトミセス・オウレオ
ファシエンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｕｒｅｏ
ｆａｃｉｅｎｓ）ＡＴＣＣ１０７６２、クンニンハメラ
・エキヌラタ・バラエティー・エレガンズ（Ｃｕｎｎｉ
ｎｇｈａｍｅｌｌａ ｅｃｈｉｎｕｌａｔａ ｖ． ｅ
ｌｅｇａｎｓ）ＡＴＣＣ８６８８ｂ、クンニンハメラ・
エキヌラタ・バラエティー・エレガンズ（Ｃｕｎｎｉｎ
ｇｈａｍｅｌｌａ ｅｃｈｉｎｕｌａｔａ ｖ． ｅｌ
ｅｇａｎｓ）ＡＴＣＣ８６８８ａ、クンニンハメラ・エ
キヌラタ・バラエティー・エキヌラタ（Ｃｕｎｎｉｎｇ
ｈａｍｅｌｌａ ｅｃｈｉｎｕｌａｔａ ｖ． ｅｃｈ
ｉｎｕｌａｔａ）ＡＴＣＣ９２４４、クンニンハメラ・
ホモタリカ（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍｅｌｌａ ｈｏｍｏ
ｔｈａｌｌｉｃａ）ＡＴＣＣ１６１６１、クンニンハメ
ラ・エキヌラタ・バラエティー・エレガンズ（Ｃｕｎｎ
ｉｎｇｈａｍｅｌｌａ ｅｃｈｉｎｕｌａｔａ ｖ．
ｅｌｅｇａｎｓ）ＡＴＣＣ３６１１２、クンニンハメラ
・エキヌラタ・バラエティー・エキヌラタ（Ｃｕｎｎｉ
ｎｇｈａｍｅｌｌａ ｅｃｈｉｎｕｌａｔａ ｖ． ｅ
ｃｈｉｎｕｌａｔａ）ＡＴＣＣ３６１９０、クンニンハ
メラ・エキヌラタ・バラエティー・エレガンズ（Ｃｕｎ
ｎｉｎｇｈａｍｅｌｌａ ｅｃｈｉｎｕｌａｔａ ｖ．
ｅｌｅｇａｎｓ）ＡＴＣＣ１００２８ｂ、クンニンハ
メラ・エキヌラタ・バラエティー・エレガンズ（Ｃｕｎ
ｎｉｎｇｈａｍｅｌｌａ ｅｃｈｉｎｕｌａｔａ ｖ．
ｅｌｅｇａｎｓ）ＡＴＣＣ９２４５、クンニンハメラ
・エキヌラタ・バラエティー・エレガンズ（Ｃｕｎｎｉ
ｎｇｈａｍｅｌｌａ ｅｃｈｉｎｕｌａｔａ ｖ． ｅ
ｌｅｇａｎｓ）ＡＴＣＣ８９８３、クンニンハメラ・エ
キヌラタ・バラエティー・エレガンズ（Ｃｕｎｎｉｎｇ
ｈａｍｅｌｌａ ｅｃｈｉｎｕｌａｔａ ｖ． ｅｌｅ
ｇａｎｓ）ＡＴＣＣ２６２６９、ピソミセス・シノドン
チス（Ｐｉｔｈｏｍｙｃｅｓ ｃｙｎｏｄｏｎｔｉｓ）
ＡＴＣＣ２６１５０、アブシジア・グラウカ（Ａｂｓｉ
ｄｉａ ｇｌａｕｃａ）ＡＴＣＣ２２７５２、ボーベリ
ア・バシアナ（Ｂｅａｕｖｅｒｉａ ｂａｓｓｉａｎ
ａ）ＡＴＣＣ７１５９、ノカルジア種（Ｎｏｃａｒｄｉ
ａ ｓｐ．）ＡＴＣＣ５３７５８、ストレプトミセス・
リモサス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｒｉｍｏｓｕ
ｓ）ＡＴＣＣ５５０４３、及びストレプトミセス・リモ
サス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｒｉｍｏｓｕｓ）Ａ
ＴＣＣ２３９５５からなる群から選択した微生物であ
る、請求項１に記載の方法。 - 【請求項３】 式（Ｉ）： 【化３】 で表される化合物から、式（II）： 【化４】 で表される化合物を製造する方法であって、クンニンハ
メラ属（ｇｅｎｕｓ Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍｅｌｌａ）
の微生物によって生成される酵素少なくとも１種類の存
在下で前記式（Ｉ）で表される化合物をヒドロキシル化
することを含む、前記製造方法。 - 【請求項４】 前記のクンニンハメラ属の微生物が、ク
ンニンハメラ・エキヌラタ・バラエティー・エレガンズ
である、請求項３に記載の方法。 - 【請求項５】 前記のクンニンハメラ・エキヌラタ種
（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍｅｌｌａ ｅｃｈｉｎｕｌａｔ
ａ ｓｐｅｃｉｅｓ）が、クンニンハメラ・エキヌラタ
・バラエティー・エレガンズＡＴＣＣ８６８８ｂであ
る、請求項４に記載の方法。 - 【請求項６】 式（Ｉ）： 【化５】 で表される化合物から、式（III）： 【化６】 で表される化合物を製造する方法であって、アスペルギ
ルス属（ｇｅｎｕｓ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）の微生
物によって生成される酵素少なくとも１種類の存在下で
前記式（Ｉ）で表される化合物をヒドロキシル化するこ
とを含む、前記製造方法。 - 【請求項７】 前記のアスペルギルス属の微生物が、ア
スペルギルス・フラビペス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ
ｆｌａｖｉｐｅｓ）である、請求項６に記載の方法。 - 【請求項８】 前記のアスペルギルス・フラビペスが、
アスペルギルス・フラビペスＡＴＣＣ１６７９５であ
る、請求項７に記載の方法。 - 【請求項９】 式（IV）： 【化７】 で表される化合物から、式（Ｉ）： 【化８】 で表される化合物を製造する方法であって、クンニンハ
メラ属の微生物によって生成される酵素少なくとも１種
類の存在下で前記式（IV）で表される化合物を選択的に
還元することを含む、前記製造方法。 - 【請求項１０】 前記のクンニンハメラ属の微生物が、
クンニンハメラ・エキヌラタである、請求項９に記載の
方法。 - 【請求項１１】 前記のクンニンハメラ属の微生物が、
クンニンハメラ・エキヌラタＡＴＣＣ８６８８ｂであ
る、請求項１０に記載の方法。 - 【請求項１２】 式（II）： 【化９】 で表される化合物と式（III）： 【化１０】 で表される化合物との混合物から式（II）： 【化１１】 で表される化合物を製造する方法であって、適当な微生
物を培養することによって生成される酵素少なくとも一
種類によって前記式（III）で表される化合物を前記式
（II）で表される化合物に変換することを含む、前記製
造方法。 - 【請求項１３】 前記微生物が、クンニンハメラ・エキ
ヌラタ・バラエティー・エレガンズＡＴＣＣ８６８８ｂ
である、請求項１２に記載の方法。
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|---|---|---|---|
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|---|---|
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|---|---|---|---|
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