JPH06233695A - ケトン類の立体選択的還元 - Google Patents
ケトン類の立体選択的還元Info
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- JPH06233695A JPH06233695A JP5293772A JP29377293A JPH06233695A JP H06233695 A JPH06233695 A JP H06233695A JP 5293772 A JP5293772 A JP 5293772A JP 29377293 A JP29377293 A JP 29377293A JP H06233695 A JPH06233695 A JP H06233695A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 ケトン基をもつスルホンアミド化合物を生物
学的変換によって立体選択的に還元し、対応した光学活
性な水酸基をもつスルホンアミド化合物を収率よく又光
学純度よく製造することを提供する。 【構成】式 で示されるケトン化合物を微生物又はその抽出物（酵
素）を用いて生物学的還元を行うと式 で示される不整脈などの治療に有効な化合物を高収量、
高光学純度で得られる。
学的変換によって立体選択的に還元し、対応した光学活
性な水酸基をもつスルホンアミド化合物を収率よく又光
学純度よく製造することを提供する。 【構成】式 で示されるケトン化合物を微生物又はその抽出物（酵
素）を用いて生物学的還元を行うと式 で示される不整脈などの治療に有効な化合物を高収量、
高光学純度で得られる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はケトン基をもつスルホン
アミド化合物を、これに対応した水酸基をもつ化合物に
する立体選択的微生物学的還元に関する。
アミド化合物を、これに対応した水酸基をもつ化合物に
する立体選択的微生物学的還元に関する。
【０００２】
【従来の技術】ラルセン（Ｌａｒｓｅｎ，Ａ．Ａ．）及
びリッシュ（Ｌｉｓｈ，Ｐ．Ｍ．）、（Ｎａｔｕｒｅ，
２０３，１２８３−１２８４（１９６４））はベンゼン
環上にアルキルスルホンアミド基をもった一連のフェネ
チノールアミン類の生物学的な活性について報告した。
この一連の化合物の中にはα−アドレナリン受容体阻害
又は受容体活性化を含むアドレナリン作用及び抗アドレ
ナリン作用をもつ化合物が存在した。Ｄ−（＋）ソタロ
ールはβ−ブロッカーである（ウロス（Ｕｌｏｔｈ，
Ｒ．Ｈ．）、キルク（Ｋｉｒｋ，Ｊ．Ｒ．）、グールド
（Ｇｏｕｌｄ，Ｗ．Ａ．）、及びラルセン（Ｌａｒｓｅ
ｎ，Ａ．Ａ．）、Ｓｕｌｆｏｎａｎｉｌｉｄｅｓ，９，
８８−９６（１９６６））。それは他のβ−ブロッカー
とは異なりクラスＩＩＩの抗不整脈作用を示す（リッシ
ュ（Ｌｉｓｈ，Ｐ．Ａ．）、ベイケル（Ｗｅｉｋｅｌ，
Ｊ．Ｈ．）、及びダンガン（Ｄｕｎｇａｎ，Ｋ．
Ｗ．）、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．ａｎｄ Ｅｘｐｅｒ．Ｔｈｅ
ｒａｐｅｕｔｉｃｓ，１４９，１６１−１７３（１９６
５））。
びリッシュ（Ｌｉｓｈ，Ｐ．Ｍ．）、（Ｎａｔｕｒｅ，
２０３，１２８３−１２８４（１９６４））はベンゼン
環上にアルキルスルホンアミド基をもった一連のフェネ
チノールアミン類の生物学的な活性について報告した。
この一連の化合物の中にはα−アドレナリン受容体阻害
又は受容体活性化を含むアドレナリン作用及び抗アドレ
ナリン作用をもつ化合物が存在した。Ｄ−（＋）ソタロ
ールはβ−ブロッカーである（ウロス（Ｕｌｏｔｈ，
Ｒ．Ｈ．）、キルク（Ｋｉｒｋ，Ｊ．Ｒ．）、グールド
（Ｇｏｕｌｄ，Ｗ．Ａ．）、及びラルセン（Ｌａｒｓｅ
ｎ，Ａ．Ａ．）、Ｓｕｌｆｏｎａｎｉｌｉｄｅｓ，９，
８８−９６（１９６６））。それは他のβ−ブロッカー
とは異なりクラスＩＩＩの抗不整脈作用を示す（リッシ
ュ（Ｌｉｓｈ，Ｐ．Ａ．）、ベイケル（Ｗｅｉｋｅｌ，
Ｊ．Ｈ．）、及びダンガン（Ｄｕｎｇａｎ，Ｋ．
Ｗ．）、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．ａｎｄ Ｅｘｐｅｒ．Ｔｈｅ
ｒａｐｅｕｔｉｃｓ，１４９，１６１−１７３（１９６
５））。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】プロパノロールやソタ
ロールのようなβ−アドレナリン阻害剤は化学的に右旋
性及び左旋性の光学異性体に分割されており、Ｄ（＋）
異性体はＬ（−）異性体の５０倍も活性が強いことが示
されている（ソマニ（Ｓｏｍａｎｉ，Ｐ．）、及びバチ
ャント（Ｂａｃｈａｎｄ，Ｔ．）、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａ
ｒｍａ，７，２３９−２４７（１９６９））。このよう
に、上に述べたスルホンアミド化合物の光学的に純粋な
異性体を得るための容易な立体選択的製造法が切望され
ている。
ロールのようなβ−アドレナリン阻害剤は化学的に右旋
性及び左旋性の光学異性体に分割されており、Ｄ（＋）
異性体はＬ（−）異性体の５０倍も活性が強いことが示
されている（ソマニ（Ｓｏｍａｎｉ，Ｐ．）、及びバチ
ャント（Ｂａｃｈａｎｄ，Ｔ．）、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａ
ｒｍａ，７，２３９−２４７（１９６９））。このよう
に、上に述べたスルホンアミド化合物の光学的に純粋な
異性体を得るための容易な立体選択的製造法が切望され
ている。
【０００４】酵素や微生物を使用して光学活性化合物を
製造することはこの分野では周知のことである。（例え
ば米国特許第５，１０６，７３６号；及び第４，８５
７，４６８号；アキタ（Ａｋｉｔａ，Ｈ）ら、Ｃｈｅ
ｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．，３２（４），１３４２〜
１３４８（１９８４）；ハンメル（Ｈｕｍｍｅｌ，
Ｗ．）、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒ
ｓ，１２（６０），４０３−４０８（１９９０）；及び
シュナイダー（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，Ｍ．Ｐ．）ら、Ｂ
ｉｏｆｌａｖｏｕｒ’８７，ｐｐ４８３−５２９，シュ
ライヤー（Ｓｃｈｒｅｉｅｒ，Ｐ．）編集，Ｄｅ Ｇｒ
ｕｇｔｅｒ出版，Ｂｅｒｌｉｎ（１９８８）を参照）。
しかしながら今までにここに開示したケトン基をもつ化
合物の立体選択的微生物／酵素還元は知られていない。
製造することはこの分野では周知のことである。（例え
ば米国特許第５，１０６，７３６号；及び第４，８５
７，４６８号；アキタ（Ａｋｉｔａ，Ｈ）ら、Ｃｈｅ
ｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．，３２（４），１３４２〜
１３４８（１９８４）；ハンメル（Ｈｕｍｍｅｌ，
Ｗ．）、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒ
ｓ，１２（６０），４０３−４０８（１９９０）；及び
シュナイダー（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，Ｍ．Ｐ．）ら、Ｂ
ｉｏｆｌａｖｏｕｒ’８７，ｐｐ４８３−５２９，シュ
ライヤー（Ｓｃｈｒｅｉｅｒ，Ｐ．）編集，Ｄｅ Ｇｒ
ｕｇｔｅｒ出版，Ｂｅｒｌｉｎ（１９８８）を参照）。
しかしながら今までにここに開示したケトン基をもつ化
合物の立体選択的微生物／酵素還元は知られていない。
【０００５】本発明者らは、Ｎ−（４−（２−クロロア
セチル）フェニル）メタンスルホン酸アミドのようなケ
トン化合物をこれに対応した（＋）−アルカノール化合
物にする立体選択的な微生物による還元法を発見した。
このアルカノールはそれ自身生物学的に活性であるか、
又はＤ−（＋）ソタロールのような心臓血管剤の合成の
重要な光学活性中間体である。
セチル）フェニル）メタンスルホン酸アミドのようなケ
トン化合物をこれに対応した（＋）−アルカノール化合
物にする立体選択的な微生物による還元法を発見した。
このアルカノールはそれ自身生物学的に活性であるか、
又はＤ−（＋）ソタロールのような心臓血管剤の合成の
重要な光学活性中間体である。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明はケトン基を有す
る化合物を、これに対応した水酸基をもつ化合物に立体
選択的に酵素還元する方法を提供する。特に本発明は光
学的に活性なアルカノール化合物である式：
る化合物を、これに対応した水酸基をもつ化合物に立体
選択的に酵素還元する方法を提供する。特に本発明は光
学的に活性なアルカノール化合物である式：
【０００７】
【化４】
【０００８】（式中、Ｒ１は、低級アルキル、アリー
ル、又は置換アリール；Ｒ２は１個又は２個の炭素原子
を介して−Ｘ及び
ル、又は置換アリール；Ｒ２は１個又は２個の炭素原子
を介して−Ｘ及び
【０００９】
【化５】
【００１０】と結合した１〜４個の炭素原子よりなるア
ルキレン基；Ｙは、水素、ハロゲン、水酸基、ニトロ
基、低級アルキルオキシ基、ペンジルオキシ基、置換ベ
ンジルオキシ基、低級アルキル基又はＲ３ＳＯ２ＮＨ−
（式中Ｒ３は独立してＲ１と同義）；Ｘは、塩素、臭
素、ヨウ素、アミノ基、モノアルキルアミノ基、ジアル
キルアミノ基、又はアミノ基、モノアルキルアミノ基、
又はジアルキルアミノ基の塩酸塩である）の製造法を提
供するものであり、その製造法は式：
ルキレン基；Ｙは、水素、ハロゲン、水酸基、ニトロ
基、低級アルキルオキシ基、ペンジルオキシ基、置換ベ
ンジルオキシ基、低級アルキル基又はＲ３ＳＯ２ＮＨ−
（式中Ｒ３は独立してＲ１と同義）；Ｘは、塩素、臭
素、ヨウ素、アミノ基、モノアルキルアミノ基、ジアル
キルアミノ基、又はアミノ基、モノアルキルアミノ基、
又はジアルキルアミノ基の塩酸塩である）の製造法を提
供するものであり、その製造法は式：
【００１１】
【化６】
【００１２】（式中、Ｒ１、Ｘ及びＹは前記と同義であ
り、 １〜４個のアルキレン基である）であるケトン基をもつ
化合物を、式ＩＩの化合物を式Ｉの化合物に立体選択的
に還元することを触媒出来る酵素又は微生物と接触させ
ることを特徴とする。構造式Ｉで示される化合物はβ−
アドレナリン遮断剤として狭心症、不整脈、高血圧の治
療に有用であるか、又はそれらの薬剤の製造のための中
間体として有用である。（例えば米国特許第３，３５
１，５８４号参照）。
り、 １〜４個のアルキレン基である）であるケトン基をもつ
化合物を、式ＩＩの化合物を式Ｉの化合物に立体選択的
に還元することを触媒出来る酵素又は微生物と接触させ
ることを特徴とする。構造式Ｉで示される化合物はβ−
アドレナリン遮断剤として狭心症、不整脈、高血圧の治
療に有用であるか、又はそれらの薬剤の製造のための中
間体として有用である。（例えば米国特許第３，３５
１，５８４号参照）。
【００１３】本明細書で単独に又は他の基の一部として
用いられている“アルキル”なる語は、任意に置換され
ていてもよい、しかし好適には置換されていない直鎖又
は分枝鎖の飽和炭化水素基を意味し、好ましくは炭素原
子１〜１０個の直鎖を意味する。そのような基の非置換
の例としては、メチル基、エチル基、プロピル基、イソ
プロピル基、ｎ−ブチル基、ｉ−ブチル基、ｔ−ブチル
基、ペンチル基、ヘキシル基、イソヘキシル基、ヘプチ
ル基、４，４−ジメチルペンチル基、オクチル基、２，
２，４−トリメチルペンチル基、ノニル基、デシル基な
どを包含する。それらのアルキル基は、本発明にとって
有用な化合物を提供する適宜な置換基で置換されていて
もよい。アルキル基の置換基の例としては１個以上の、
好ましくは３個以下の塩素基、臭素基又はヨウ素基であ
る
用いられている“アルキル”なる語は、任意に置換され
ていてもよい、しかし好適には置換されていない直鎖又
は分枝鎖の飽和炭化水素基を意味し、好ましくは炭素原
子１〜１０個の直鎖を意味する。そのような基の非置換
の例としては、メチル基、エチル基、プロピル基、イソ
プロピル基、ｎ−ブチル基、ｉ−ブチル基、ｔ−ブチル
基、ペンチル基、ヘキシル基、イソヘキシル基、ヘプチ
ル基、４，４−ジメチルペンチル基、オクチル基、２，
２，４−トリメチルペンチル基、ノニル基、デシル基な
どを包含する。それらのアルキル基は、本発明にとって
有用な化合物を提供する適宜な置換基で置換されていて
もよい。アルキル基の置換基の例としては１個以上の、
好ましくは３個以下の塩素基、臭素基又はヨウ素基であ
る
【００１４】本明細書で用いられている“低級アルキ
ル”なる語は、上記のアルキルの項で記述したと同様１
〜４個の炭素原子をもつ直鎖であり任意に置換されてい
る、しかし好ましくは置換されていないものを意味す
る。“低級アルキルオキシ”なる語は上記で述べた低級
アルキル基が酸素（−Ｏ−）を介して結合しているもの
を表わしている。“モノアルキルアミノ”又は“ジアル
キルアミノ”なる語は、１つ又は２つの上で述べたアル
キル基でそれぞれ置換されているアミノ基を意味する。
ル”なる語は、上記のアルキルの項で記述したと同様１
〜４個の炭素原子をもつ直鎖であり任意に置換されてい
る、しかし好ましくは置換されていないものを意味す
る。“低級アルキルオキシ”なる語は上記で述べた低級
アルキル基が酸素（−Ｏ−）を介して結合しているもの
を表わしている。“モノアルキルアミノ”又は“ジアル
キルアミノ”なる語は、１つ又は２つの上で述べたアル
キル基でそれぞれ置換されているアミノ基を意味する。
【００１５】本明細書で使用されている“アリール”な
る語はホモ芳香環基を表わし、好適には１又は２環であ
り又６〜１２員環である。芳香環基の例としてはフェニ
ル基、ビフェニル基、及びナフチル基である。“置換ア
リール”及び“置換ベンジルオキシ”は芳香環が置換さ
れている基を意味する。置換基の例としては、１個又は
それ以上、好ましくは３個又はそれ以下のニトロ基、上
で述べたアルキル基、又は上で述べたアルキル基の置換
基である。
る語はホモ芳香環基を表わし、好適には１又は２環であ
り又６〜１２員環である。芳香環基の例としてはフェニ
ル基、ビフェニル基、及びナフチル基である。“置換ア
リール”及び“置換ベンジルオキシ”は芳香環が置換さ
れている基を意味する。置換基の例としては、１個又は
それ以上、好ましくは３個又はそれ以下のニトロ基、上
で述べたアルキル基、又は上で述べたアルキル基の置換
基である。
【００１６】本発明による製造法は鏡像特異性をもつ化
合物を製造することが出来る利点をもっている。この製
造法はまず第１に好ましい鏡像異性体及び好ましくない
鏡像異性体の混合物であるラセミ体ではなくＤ（＋）鏡
像異性体を生成する。更なる利点は、例えば多段階工程
の化学合成に対応して単段階による鏡像特異的還元であ
る。特に室温で又常圧で還元が触媒された場合、ケトン
化合物は対応したアルコール化合物の所望の鏡像異性体
に高収率で変換し、その光学純度も高いアルコール化合
物が得られる。
合物を製造することが出来る利点をもっている。この製
造法はまず第１に好ましい鏡像異性体及び好ましくない
鏡像異性体の混合物であるラセミ体ではなくＤ（＋）鏡
像異性体を生成する。更なる利点は、例えば多段階工程
の化学合成に対応して単段階による鏡像特異的還元であ
る。特に室温で又常圧で還元が触媒された場合、ケトン
化合物は対応したアルコール化合物の所望の鏡像異性体
に高収率で変換し、その光学純度も高いアルコール化合
物が得られる。
【００１７】酵素及び微生物 本発明に使用できる酵素及び微生物は、本明細書に記載
した立体選択的酵素還元を触媒することが出来る酵素又
は微生物であればよい。酵素材料又は微生物材料はその
ままの状態か又は物理的な吸収又は吸着による支持体へ
の固定化によって使用することが出来る。
した立体選択的酵素還元を触媒することが出来る酵素又
は微生物であればよい。酵素材料又は微生物材料はその
ままの状態か又は物理的な吸収又は吸着による支持体へ
の固定化によって使用することが出来る。
【００１８】適宜な酵素は、その起源又は純度にかかわ
りなく酸化−還元酵素、或いは脱水素酵素に関連した酵
素を包含する。使用される酵素は、例えば細胞懸濁液を
均一化し、続いて砕解、遠心分離、ＤＥＡＥ−セルロー
ズクロマトグラフ、硫酸アンモニウム分配、セフアクリ
ル（アリルデキストランとＮ，Ｎ′−メチレンビスアク
リルアミドの架橋したコポリマー）のようなゲル濾過媒
質を用いたクロマトグラフ法、及びＭｏｎｏ−Ｑ（４級
アミン基を介して陰性にチャージした２分子に結合した
アニオン交換樹脂）を用いたイオン交換クロマトグラフ
法によって微生物から単離した酵素であってもよい。そ
のような酵素の例としては、Ｌ−２−ヒドロキシイソカ
プロン酸脱水素酵素、酪酸脱水素酵素、濃縮イースト酵
素（Ｓｉｇｍａ社製）、及びβ−ヒドロキシブチル酸脱
水素酵素、又は以下に記載する微生物より誘導される酵
素であってもよい。
りなく酸化−還元酵素、或いは脱水素酵素に関連した酵
素を包含する。使用される酵素は、例えば細胞懸濁液を
均一化し、続いて砕解、遠心分離、ＤＥＡＥ−セルロー
ズクロマトグラフ、硫酸アンモニウム分配、セフアクリ
ル（アリルデキストランとＮ，Ｎ′−メチレンビスアク
リルアミドの架橋したコポリマー）のようなゲル濾過媒
質を用いたクロマトグラフ法、及びＭｏｎｏ−Ｑ（４級
アミン基を介して陰性にチャージした２分子に結合した
アニオン交換樹脂）を用いたイオン交換クロマトグラフ
法によって微生物から単離した酵素であってもよい。そ
のような酵素の例としては、Ｌ−２−ヒドロキシイソカ
プロン酸脱水素酵素、酪酸脱水素酵素、濃縮イースト酵
素（Ｓｉｇｍａ社製）、及びβ−ヒドロキシブチル酸脱
水素酵素、又は以下に記載する微生物より誘導される酵
素であってもよい。
【００１９】微生物の使用に関しては、本発明の方法は
本明細書に記載した立体選択的酵素還元を触媒すること
が出来る適宜な微生物材料を用いて行うことが出来る。
例えばそのままのウェット細胞又は凍結乾燥、スプレイ
乾燥又は加熱乾燥した細胞のような乾燥細胞を用いても
よい。適宜な微生物はアクロモバクター、アシネトバク
ター、アクチノミセス、アルカリゲネス、アースロバク
ター、アゾトバクター、バチルス、ブレビバクテリウ
ム、コリネバクテリウム、フラボバクテリウム、メチロ
モナス、ミコバクテリウム、ノカルジア、シュウドモナ
ス、ロドコッカス、ストレフトミセス、キサントモナ
ス、アスペルギルス、カンジダ、フサリウム、ゲオトリ
カム、ハンセヌラ、クロエケエラ、ペニシラム、ピキ
ア、リゾプス、ロドトルラ、サッカロミセス、トリコデ
ルマ、モルチェラ、カニングハメラ、トルロプシス及び
ロドシュウドモナスのようなバクテリア、酵母、及びカ
ビの属であることを特徴とする。
本明細書に記載した立体選択的酵素還元を触媒すること
が出来る適宜な微生物材料を用いて行うことが出来る。
例えばそのままのウェット細胞又は凍結乾燥、スプレイ
乾燥又は加熱乾燥した細胞のような乾燥細胞を用いても
よい。適宜な微生物はアクロモバクター、アシネトバク
ター、アクチノミセス、アルカリゲネス、アースロバク
ター、アゾトバクター、バチルス、ブレビバクテリウ
ム、コリネバクテリウム、フラボバクテリウム、メチロ
モナス、ミコバクテリウム、ノカルジア、シュウドモナ
ス、ロドコッカス、ストレフトミセス、キサントモナ
ス、アスペルギルス、カンジダ、フサリウム、ゲオトリ
カム、ハンセヌラ、クロエケエラ、ペニシラム、ピキ
ア、リゾプス、ロドトルラ、サッカロミセス、トリコデ
ルマ、モルチェラ、カニングハメラ、トルロプシス及び
ロドシュウドモナスのようなバクテリア、酵母、及びカ
ビの属であることを特徴とする。
【００２０】好ましい微生物としては、アースロバクタ
ー シンプレックス、ノカルジアレストリカ、ノカルジ
ア サルモニカラー、ロドコッカス ファシアンス、ロ
ドコッカス ロドクラス、ミコバクテリウム バッカ、
ノカルジア メジテラネイ、ノカルジア オートトロフ
イカ、ロドコッカス エクイ、カンジダ アルビカン
ス、ゲオトリカム カンシダム、モルチエラ アルピ
ナ、ピキア パストリス、ピキア メタノリカ、カニン
グハメラ エキナラテ、トルロプシス ポリスポリウ
ム、トルロプシス グラブラタ及びアシネトバクター
カルコアセチカスを包含し、特にロドコッカス グロベ
ルラス（ＡＴＣＣ ２１５０５）、カンジダギリエルモ
ンジ（ＡＴＣＣ ２０３１８）、ロドコッカス エリス
ロポリス（ＡＴＣＣ ４２７７）、サッカロミセス セ
レビシエ（ＡＴＣＣ ２４７０２）、シユウドモナス
プチダ（ＡＴＣＣ １１１７２）、モルチエラ ラムマ
ニアンナ（ＡＴＣＣ ３８１９１）、ハンセヌラ ファ
ビアンナ（ＡＴＣＣ ５８０４５）、ハンセヌラ ポリ
モルファ（ＡＴＣＣ ２６０１２）、トリコデルマポリ
スポリウム（ＡＴＣＣ ２８０１４）、ロドコッカス
ｓｐ．（ＡＴＣＣ２１２４３，ＡＴＣＣ １２９７５、
及びＡＴＣＣ ２９６７５）、ロドコッカス ファシア
ンス（ＡＴＣＣ ２１９５０）、ロドコッカス エクイ
（ＡＴＣＣ１４８８７）、オウレオバシジュウム プル
ランス（ＡＴＣＣ １６６２３）、ムコール ヒイマリ
ス（ＡＴＣＣ ８９７７ｂ）、及びモルチエラ アルピ
ナ（ＡＴＣＣ ３６９６５）であることを特徴とする。
ー シンプレックス、ノカルジアレストリカ、ノカルジ
ア サルモニカラー、ロドコッカス ファシアンス、ロ
ドコッカス ロドクラス、ミコバクテリウム バッカ、
ノカルジア メジテラネイ、ノカルジア オートトロフ
イカ、ロドコッカス エクイ、カンジダ アルビカン
ス、ゲオトリカム カンシダム、モルチエラ アルピ
ナ、ピキア パストリス、ピキア メタノリカ、カニン
グハメラ エキナラテ、トルロプシス ポリスポリウ
ム、トルロプシス グラブラタ及びアシネトバクター
カルコアセチカスを包含し、特にロドコッカス グロベ
ルラス（ＡＴＣＣ ２１５０５）、カンジダギリエルモ
ンジ（ＡＴＣＣ ２０３１８）、ロドコッカス エリス
ロポリス（ＡＴＣＣ ４２７７）、サッカロミセス セ
レビシエ（ＡＴＣＣ ２４７０２）、シユウドモナス
プチダ（ＡＴＣＣ １１１７２）、モルチエラ ラムマ
ニアンナ（ＡＴＣＣ ３８１９１）、ハンセヌラ ファ
ビアンナ（ＡＴＣＣ ５８０４５）、ハンセヌラ ポリ
モルファ（ＡＴＣＣ ２６０１２）、トリコデルマポリ
スポリウム（ＡＴＣＣ ２８０１４）、ロドコッカス
ｓｐ．（ＡＴＣＣ２１２４３，ＡＴＣＣ １２９７５、
及びＡＴＣＣ ２９６７５）、ロドコッカス ファシア
ンス（ＡＴＣＣ ２１９５０）、ロドコッカス エクイ
（ＡＴＣＣ１４８８７）、オウレオバシジュウム プル
ランス（ＡＴＣＣ １６６２３）、ムコール ヒイマリ
ス（ＡＴＣＣ ８９７７ｂ）、及びモルチエラ アルピ
ナ（ＡＴＣＣ ３６９６５）であることを特徴とする。
【００２１】遺伝子工学による細菌の使用も考慮され
る。ホスト細胞は、本明細書に記載されているように触
媒することの出来る１つ又はそれ以上の酵素を発現する
遺伝子を含むように修飾された大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉ
ｃｈｉａ ｃｏｌｉ）のような細胞であってもよい。特
に好ましくはハンセヌラ属の微生物、特にハンセヌラ
ポリモルファ種、特にハンセヌラ ポリモルファ ＡＴ
ＣＣ ２６０１２株、ハンセヌラ ファビアンナ種、特
にハンセヌラ ファビアンナ ＡＴＣＣ ５８０４５
株、ロドコッカス属、特にロドコッカスｓｐ．ＡＴＣＣ
２１２４３株及びロドコッカス ファシアンス ＡＴ
ＣＣ ２１９５０株及びノカルジア属の微生物である。
本明細書中に使用されている“ＡＴＣＣ”はアメリカン
タイプ カルチャー コレクション（Ａｍｅｒｉｃａ
ｎ Ｔｙｐｅ ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏ
ｎ，１２３０１ Ｐａｒｋｌａｗｎ Ｄｒｉｖｅ，Ｒｏ
ｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ ２０８５２）に寄
託した微生物の登録番号である。細胞抽出物又はこれら
の細菌から単離した酵素の使用も又好適である。勿論２
つまたはそれ以上の酵素及び／又は微生物の組み合わせ
も本発明の範囲に入るものである。
る。ホスト細胞は、本明細書に記載されているように触
媒することの出来る１つ又はそれ以上の酵素を発現する
遺伝子を含むように修飾された大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉ
ｃｈｉａ ｃｏｌｉ）のような細胞であってもよい。特
に好ましくはハンセヌラ属の微生物、特にハンセヌラ
ポリモルファ種、特にハンセヌラ ポリモルファ ＡＴ
ＣＣ ２６０１２株、ハンセヌラ ファビアンナ種、特
にハンセヌラ ファビアンナ ＡＴＣＣ ５８０４５
株、ロドコッカス属、特にロドコッカスｓｐ．ＡＴＣＣ
２１２４３株及びロドコッカス ファシアンス ＡＴ
ＣＣ ２１９５０株及びノカルジア属の微生物である。
本明細書中に使用されている“ＡＴＣＣ”はアメリカン
タイプ カルチャー コレクション（Ａｍｅｒｉｃａ
ｎ Ｔｙｐｅ ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏ
ｎ，１２３０１ Ｐａｒｋｌａｗｎ Ｄｒｉｖｅ，Ｒｏ
ｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ ２０８５２）に寄
託した微生物の登録番号である。細胞抽出物又はこれら
の細菌から単離した酵素の使用も又好適である。勿論２
つまたはそれ以上の酵素及び／又は微生物の組み合わせ
も本発明の範囲に入るものである。
【００２２】本発明による立体選択的酵素還元法は、採
用した微生物の培養につづいて実施される（２工程培養
及び還元）、か又は培養と還元を同時に行う（１工程培
養及び還元）。１工程法に於いては微生物を適宜な培地
中で十分に増殖させる。式ＩＩの化合物をその培地中に
加えそして立体選択的酵素還元を完全に転換するまで培
養を続ける。２工程法に於いては、まず第１に、微生物
を所望の酵素活性（即ち酸化−還元酵素活性）を発現す
るまで適宜な培地中で培養して増殖させる。続いて遠心
分離して細胞を収得し、その細胞を適宜な緩衝液に加え
て細胞懸濁液を調製する。
用した微生物の培養につづいて実施される（２工程培養
及び還元）、か又は培養と還元を同時に行う（１工程培
養及び還元）。１工程法に於いては微生物を適宜な培地
中で十分に増殖させる。式ＩＩの化合物をその培地中に
加えそして立体選択的酵素還元を完全に転換するまで培
養を続ける。２工程法に於いては、まず第１に、微生物
を所望の酵素活性（即ち酸化−還元酵素活性）を発現す
るまで適宜な培地中で培養して増殖させる。続いて遠心
分離して細胞を収得し、その細胞を適宜な緩衝液に加え
て細胞懸濁液を調製する。
【００２３】トリス−塩酸、リン酸塩、酢酸ナトリウム
などを緩衝液として使用してもよい。微生物細胞の懸濁
液の調製に水を使用してもよい。第２の工程では、式Ｉ
Ｉの化合物を微生物細胞懸濁液と混合し、微生物細胞懸
濁液によって立体選択的酵素還元を触媒する。還元は、
好ましくは、すべての、或いは殆んどすべての式ＩＩの
化合物が立体選択的に還元されるまで行う。
などを緩衝液として使用してもよい。微生物細胞の懸濁
液の調製に水を使用してもよい。第２の工程では、式Ｉ
Ｉの化合物を微生物細胞懸濁液と混合し、微生物細胞懸
濁液によって立体選択的酵素還元を触媒する。還元は、
好ましくは、すべての、或いは殆んどすべての式ＩＩの
化合物が立体選択的に還元されるまで行う。
【００２４】微生物の増殖は、好適な培地を使用し、当
業者に周知な方法によって達成してもよい。微生物の増
殖用の好適な培地としては、微生物細胞が増殖するのに
必要な栄養を提供するものを包括する。増殖のための典
型的な培地は、必要な炭素源、窒素源及び微量の成分を
包括する。誘発物質を加えてもよい。本明細書で用いて
いる“誘発物質”なる語は、ケトン基を有する化合物の
ような、微生物細胞中で所望の酵素活性（即ち酸化−還
元酵素活性）を増加させる化合物を包括する。式Ｉの化
合物を微生物の増殖期間中誘発物質として加えてもよ
い。
業者に周知な方法によって達成してもよい。微生物の増
殖用の好適な培地としては、微生物細胞が増殖するのに
必要な栄養を提供するものを包括する。増殖のための典
型的な培地は、必要な炭素源、窒素源及び微量の成分を
包括する。誘発物質を加えてもよい。本明細書で用いて
いる“誘発物質”なる語は、ケトン基を有する化合物の
ような、微生物細胞中で所望の酵素活性（即ち酸化−還
元酵素活性）を増加させる化合物を包括する。式Ｉの化
合物を微生物の増殖期間中誘発物質として加えてもよ
い。
【００２５】炭素源としては、マルトーズ、ラクトー
ズ、グルコース、フルクトース、グリセロール、ソルビ
トール、シュークローズ、でんぷん、マンニトール、プ
ロピレングリコールなどの糖類；酢酸ナトリウム、クエ
ン酸ナトリウムなどの有機酸；グルタミン酸ナトリウム
などのアミノ酸；及びエタノール、プロパノールのよう
なアルコール類を包括することが出来る。
ズ、グルコース、フルクトース、グリセロール、ソルビ
トール、シュークローズ、でんぷん、マンニトール、プ
ロピレングリコールなどの糖類；酢酸ナトリウム、クエ
ン酸ナトリウムなどの有機酸；グルタミン酸ナトリウム
などのアミノ酸；及びエタノール、プロパノールのよう
なアルコール類を包括することが出来る。
【００２６】窒素源としてはＮ−ＺアミンＡ、コーンス
ティープリカー、ソイビーンミール、肉汁、酵母エキ
ス、糖蜜、ベイカー酵母、トリプトン、ニウトリソイ、
ペプトン、イーストアミン、硝酸ナトリウム、硫酸アン
モニウムなどを包括することができる。微量成分として
は、リン酸塩、マグネシウム、マンガン、カルシウム、
コバルト、ニッケル、鉄、ナトリウム又はカリウム塩を
包括することが出来る。使用する培地は２種以上の炭素
源又は窒素源又は他の栄養源を含有していてもよい。
ティープリカー、ソイビーンミール、肉汁、酵母エキ
ス、糖蜜、ベイカー酵母、トリプトン、ニウトリソイ、
ペプトン、イーストアミン、硝酸ナトリウム、硫酸アン
モニウムなどを包括することができる。微量成分として
は、リン酸塩、マグネシウム、マンガン、カルシウム、
コバルト、ニッケル、鉄、ナトリウム又はカリウム塩を
包括することが出来る。使用する培地は２種以上の炭素
源又は窒素源又は他の栄養源を含有していてもよい。
【００２７】好ましい培地は以下のような組成を含む水
性培地を包括する（重量％で示す）培地１ 麦芽エキス １％ 酵母エキス １％ ペプトン １％ グリコース ２％ ｐＨ ７．０培地２ ペプトン ０．３％ グリセロール ４％ 麦芽エキス １％ 酵母エキス １％ ｐＨ ７．０培地３ コハク酸ナトリウム ２％ 麦芽エキス １％ 酵母エキス １％ ペプトン ０．３％ ｐＨ ７．０
性培地を包括する（重量％で示す）培地１ 麦芽エキス １％ 酵母エキス １％ ペプトン １％ グリコース ２％ ｐＨ ７．０培地２ ペプトン ０．３％ グリセロール ４％ 麦芽エキス １％ 酵母エキス １％ ｐＨ ７．０培地３ コハク酸ナトリウム ２％ 麦芽エキス １％ 酵母エキス １％ ペプトン ０．３％ ｐＨ ７．０
【００２８】培地のｐＨは好ましくは６〜８に調節す
る、最も好ましくは６．５に調節する。培地は１２１℃
で３０分滅菌し、滅菌後培地はｐＨ６．５〜７．５、好
ましくは７．０に調節する。本発明による製造法は、式
Ｉの所望の化合物を形成するに好適な条件のもとで行わ
れる。培地のｐＨは、微生物の増殖の間、及び、酵素又
は微生物のいずれを使用する場合でも、立体選択的還元
の工程中４．０〜９．０を維持するのが好ましく、最も
好ましくは６．０〜８．０を維持することである。
る、最も好ましくは６．５に調節する。培地は１２１℃
で３０分滅菌し、滅菌後培地はｐＨ６．５〜７．５、好
ましくは７．０に調節する。本発明による製造法は、式
Ｉの所望の化合物を形成するに好適な条件のもとで行わ
れる。培地のｐＨは、微生物の増殖の間、及び、酵素又
は微生物のいずれを使用する場合でも、立体選択的還元
の工程中４．０〜９．０を維持するのが好ましく、最も
好ましくは６．０〜８．０を維持することである。
【００２９】温度は立体選択的還元工程で必要な熱エネ
ルギーの尺度でありそしてこの工程に必要なエネルギー
を十分供与できるよう維持しなければならない。本発明
による製造工程に対する好適な温度範囲は１５℃〜６０
℃である。好ましい温度範囲は２５℃〜４０℃である。
圧力は、本発明を実施するに当って臨界的であるかどう
かは不明であるが、典型的には大気圧で行なう。
ルギーの尺度でありそしてこの工程に必要なエネルギー
を十分供与できるよう維持しなければならない。本発明
による製造工程に対する好適な温度範囲は１５℃〜６０
℃である。好ましい温度範囲は２５℃〜４０℃である。
圧力は、本発明を実施するに当って臨界的であるかどう
かは不明であるが、典型的には大気圧で行なう。
【００３０】本発明による製造法は、好ましくは好気的
条件下で行われる。反応混合物の振盪、及び通気は１段
階工程又は２段階工程に於いて、例えば振盪フラスコ培
養又はタンク培養で細胞を増殖させて立体選択的還元を
行う間に利用する酸素の量にかかわっている。振盪の範
囲は５０〜１０００ＲＰＭが好ましく、５０〜５００Ｒ
ＰＭが最も好ましい。通気は１分間につき培地の容量の
０．１〜１０倍の量（即ち０．１〜１０ｖ／ｖｔ）が好
ましく、最も好ましくは、１分につき培地の容量の５倍
の通気（即ち５ｖ／ｖｔ）が最も好ましい。
条件下で行われる。反応混合物の振盪、及び通気は１段
階工程又は２段階工程に於いて、例えば振盪フラスコ培
養又はタンク培養で細胞を増殖させて立体選択的還元を
行う間に利用する酸素の量にかかわっている。振盪の範
囲は５０〜１０００ＲＰＭが好ましく、５０〜５００Ｒ
ＰＭが最も好ましい。通気は１分間につき培地の容量の
０．１〜１０倍の量（即ち０．１〜１０ｖ／ｖｔ）が好
ましく、最も好ましくは、１分につき培地の容量の５倍
の通気（即ち５ｖ／ｖｔ）が最も好ましい。
【００３１】式ＩＩの化合物の完全な転換は、例えば、
本明細書に記述したように式ＩＩの化合物を微生物又は
酵素で処理してから測定して４〜４８時間であり、好ま
しくは１２〜２４時間である。本発明による立体選択的
酵素還元は、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド
（ＮＡＤＨ）のような補助因子、特に単離した酵素を使
用する場合そのような補助因子を使用して行ってもよ
い。例えばＮＡＤＨはその後は再生され、再使用され
る。反応溶液中でＮＡＤＨを再生する更なる酵素、例え
ばギ酸脱水素酵素を使用することが出来る。適宜な水素
供与体は分子中の水素、ギ酸塩（即ちアルカリメタル塩
又はアンモニウム塩）、ハイポホスファイト又はビオロ
ゲン、例えばメチルビオロゲンの存在下の電気化学還元
である。更に酵素を使用することなく、例えばエタノー
ル又はギ酸塩を使用してＮＡＤＨを再生することも可能
である。
本明細書に記述したように式ＩＩの化合物を微生物又は
酵素で処理してから測定して４〜４８時間であり、好ま
しくは１２〜２４時間である。本発明による立体選択的
酵素還元は、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド
（ＮＡＤＨ）のような補助因子、特に単離した酵素を使
用する場合そのような補助因子を使用して行ってもよ
い。例えばＮＡＤＨはその後は再生され、再使用され
る。反応溶液中でＮＡＤＨを再生する更なる酵素、例え
ばギ酸脱水素酵素を使用することが出来る。適宜な水素
供与体は分子中の水素、ギ酸塩（即ちアルカリメタル塩
又はアンモニウム塩）、ハイポホスファイト又はビオロ
ゲン、例えばメチルビオロゲンの存在下の電気化学還元
である。更に酵素を使用することなく、例えばエタノー
ル又はギ酸塩を使用してＮＡＤＨを再生することも可能
である。
【００３２】有機溶媒又は水溶性の、又は水不溶性の
（二相性）有機溶媒／水の混合物を使用することも出来
るが、水溶液を反応溶媒として用いるのが好適である。
化合物と反応溶媒の合計の重量を基準として、出発物質
である式ＩＩの化合物０．１〜２５重量％を使用するこ
とが好ましい。酵素又は微生物の出発物質に対する量
は、本発明による立体選択的酵素還元を接媒する能力に
よって定められる。反応生成物が８０％以上である条
件、好ましくは９０％以上与える条件を使用することが
好ましく、又、Ｄ（＋）鏡像異性体の光学純度が約６０
％又はそれ以上、より好ましくは９０％以上、最も好ま
しくは９９％以上となる条件を使用することが好適であ
る。式ＩＩの化合物上の水酸基のような基は、本発明に
よる立体選択的酵素還元法に用いる場合任意に保護して
もよい；そのような基はその後任意に脱保護することが
できるものである。
（二相性）有機溶媒／水の混合物を使用することも出来
るが、水溶液を反応溶媒として用いるのが好適である。
化合物と反応溶媒の合計の重量を基準として、出発物質
である式ＩＩの化合物０．１〜２５重量％を使用するこ
とが好ましい。酵素又は微生物の出発物質に対する量
は、本発明による立体選択的酵素還元を接媒する能力に
よって定められる。反応生成物が８０％以上である条
件、好ましくは９０％以上与える条件を使用することが
好ましく、又、Ｄ（＋）鏡像異性体の光学純度が約６０
％又はそれ以上、より好ましくは９０％以上、最も好ま
しくは９９％以上となる条件を使用することが好適であ
る。式ＩＩの化合物上の水酸基のような基は、本発明に
よる立体選択的酵素還元法に用いる場合任意に保護して
もよい；そのような基はその後任意に脱保護することが
できるものである。
【００３３】分離 本発明による立体選択的還元の生成物は、単離してもよ
いし又抽出、蒸留、結晶化、カラムクロマトグラフ法な
どの周知の方法に従って精製することも出来る。所望の
式Ｉの化合物を反応溶液の残留化合物より分別する好ま
しい方法は抽出法である。抽出技術の例としては、例え
ば生成物が全細胞懸濁液で調製された場合、その懸濁液
を酢酸エチルで抽出し、その有機層はブラインで洗滌
し、溶媒は減圧下留去して油状物質を得、この油状物質
をＣ１８（２５μ）ナショナルカラム（２×１０イン
チ）を用いてＨＰＬＣ分取を行うと所望の化合物（式Ｉ
の化合物）が得られる。以下に示す実施例は本発明を説
明するためのものであってその範囲を限定するためのも
のではない。
いし又抽出、蒸留、結晶化、カラムクロマトグラフ法な
どの周知の方法に従って精製することも出来る。所望の
式Ｉの化合物を反応溶液の残留化合物より分別する好ま
しい方法は抽出法である。抽出技術の例としては、例え
ば生成物が全細胞懸濁液で調製された場合、その懸濁液
を酢酸エチルで抽出し、その有機層はブラインで洗滌
し、溶媒は減圧下留去して油状物質を得、この油状物質
をＣ１８（２５μ）ナショナルカラム（２×１０イン
チ）を用いてＨＰＬＣ分取を行うと所望の化合物（式Ｉ
の化合物）が得られる。以下に示す実施例は本発明を説
明するためのものであってその範囲を限定するためのも
のではない。
【００３４】
〔実施例１〕 立体選択的酵素還元微生物の全細胞を使用する製造法 以下の酵素還元法に使用される基質はＮ−（４−（１−
オキソ−２−クロロエチル）フェニル）メタンスルホン
アミド（化合物Ａ）であり次のような化学構造をもって
いるものであった。
オキソ−２−クロロエチル）フェニル）メタンスルホン
アミド（化合物Ａ）であり次のような化学構造をもって
いるものであった。
【００３５】
【化７】
【００３６】所望の生成物（化合物Ｂ）は構造式：
【００３７】
【化８】
【００３８】をもつものであり、化学名は（＋）Ｎ−
（４−（１−ヒドロキシ−２−クロロエチル）フェニ
ル）メタンスルホンアミドであった。還元に使用した微
生物は表１にまとめられている。
（４−（１−ヒドロキシ−２−クロロエチル）フェニ
ル）メタンスルホンアミドであった。還元に使用した微
生物は表１にまとめられている。
【００３９】採用した微生物を液体窒素中のバイアル中
に維持した。常法で菌の増殖を行うために１バイアルの
菌と５００ｍｌフラスコ中の１００ｍｌの培地１（前記
の組成参照）に接種し、２８℃でシェカー上２８０ＲＰ
Ｍで４８時間培養した。菌の増殖の後１０ｍｌの培地を
１００ｍｌの培地１の入った５００ｍｌフラスコ中に接
種し、シェーカー上２８℃、２５０ＲＰＭで培養した。
に維持した。常法で菌の増殖を行うために１バイアルの
菌と５００ｍｌフラスコ中の１００ｍｌの培地１（前記
の組成参照）に接種し、２８℃でシェカー上２８０ＲＰ
Ｍで４８時間培養した。菌の増殖の後１０ｍｌの培地を
１００ｍｌの培地１の入った５００ｍｌフラスコ中に接
種し、シェーカー上２８℃、２５０ＲＰＭで培養した。
【００４０】細胞を収得し、１００ｍＭリン酸カリ緩衝
液ｐＨ６．０中に懸濁した。２０％ｗ／ｖ細胞懸濁液１
０ｍｌを調製した。細胞懸濁液に２５ｍｇの基質（化合
物Ａ）と７５０ｍｇのグルコースを加え還元（“生物学
的変換”（ｂｉｏｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ））を
２８℃、１５０ＲＰＭ、２２−４０時間行った。１容量
のサンプルをとり２容量の酢酸エチルで抽出し、分離し
た有機相を０．２μｍＬＩＤ／Ｘフィルターで瀘過し集
めた。
液ｐＨ６．０中に懸濁した。２０％ｗ／ｖ細胞懸濁液１
０ｍｌを調製した。細胞懸濁液に２５ｍｇの基質（化合
物Ａ）と７５０ｍｇのグルコースを加え還元（“生物学
的変換”（ｂｉｏｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ））を
２８℃、１５０ＲＰＭ、２２−４０時間行った。１容量
のサンプルをとり２容量の酢酸エチルで抽出し、分離し
た有機相を０．２μｍＬＩＤ／Ｘフィルターで瀘過し集
めた。
【００４１】サンプルはヒュウレットパッカード社のガ
スクロマトグラムを使用し、水素炎イオン化検出器（Ｆ
ＩＤ）を用いて基質と生成物を分析した。ヒュウレット
パッカード社（パロアルト、カリフォルニア）製熔融シ
リカキャピラリカラム（架橋したメチルシリコン、長さ
１５ｍ、フィルムの厚さ０．３３μｍ、直径０．３２ｍ
ｍ）を用い、検出器の温度２５０℃、注入温度１９０℃
で測定した。オブンの最初の温度は１９５℃であり最終
の温度は２０５℃であった。温度は０．５℃／分で上昇
させた。キャリヤーガスとしてヘリウムを５０ｍｌ／分
で使用した。基質（化合物Ａ）の保持時間は１．０２分
でありこれに対応した還元生成物（化合物Ｂ）は９．６
分であった。生成物（化合物Ｂ）の光学純度はキラール
ＨＰＬＣで測定した。ベーカーボンドキラルセルＯＢカ
ラムを室温で使用した。注入量は２０μｌ、移動相は３
５％ｎ−ブタノールを含む６５％ヘキサン、流速０．５
ｍｌ／分、検出波長２３０ｎｍを用いて測定した。保持
時間はＲ−（＋）鏡像異性体が１６．３２分、ｓ−
（−）鏡像異性体が１３．６３分であった。いろいろな
微生物を用い培地１で生育し上記の製造法に従って行っ
た結果が表１に示されている。
スクロマトグラムを使用し、水素炎イオン化検出器（Ｆ
ＩＤ）を用いて基質と生成物を分析した。ヒュウレット
パッカード社（パロアルト、カリフォルニア）製熔融シ
リカキャピラリカラム（架橋したメチルシリコン、長さ
１５ｍ、フィルムの厚さ０．３３μｍ、直径０．３２ｍ
ｍ）を用い、検出器の温度２５０℃、注入温度１９０℃
で測定した。オブンの最初の温度は１９５℃であり最終
の温度は２０５℃であった。温度は０．５℃／分で上昇
させた。キャリヤーガスとしてヘリウムを５０ｍｌ／分
で使用した。基質（化合物Ａ）の保持時間は１．０２分
でありこれに対応した還元生成物（化合物Ｂ）は９．６
分であった。生成物（化合物Ｂ）の光学純度はキラール
ＨＰＬＣで測定した。ベーカーボンドキラルセルＯＢカ
ラムを室温で使用した。注入量は２０μｌ、移動相は３
５％ｎ−ブタノールを含む６５％ヘキサン、流速０．５
ｍｌ／分、検出波長２３０ｎｍを用いて測定した。保持
時間はＲ−（＋）鏡像異性体が１６．３２分、ｓ−
（−）鏡像異性体が１３．６３分であった。いろいろな
微生物を用い培地１で生育し上記の製造法に従って行っ
た結果が表１に示されている。
【００４２】
【表１】
【００４３】〔実施例２〕実施例１と同様本製造法に使
用した基質は化合物Ａであり所望の生成物は化合物Ｂで
あった。ハンセヌラ ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌ
ａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）ＡＴＣＣ ２６０１２の細
胞を培地１ １００ｍｌの入った５００ｍｌフラスコ中
で生育させた。生育は２５℃、４８時間、２８０ＲＰＭ
で行った。１００ｍｌの培地を１５リットルの培地２
（組成は前記参照）に接種した。培養器中での生育は２
５℃、１５リットル／分の通気、５００ＲＰＭの振盪６
０時間で行った。細胞は培養器より収穫し、化合物Ａよ
り化合物Ｂに還元（“生物学的変換”）するために使用
した。
用した基質は化合物Ａであり所望の生成物は化合物Ｂで
あった。ハンセヌラ ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌ
ａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）ＡＴＣＣ ２６０１２の細
胞を培地１ １００ｍｌの入った５００ｍｌフラスコ中
で生育させた。生育は２５℃、４８時間、２８０ＲＰＭ
で行った。１００ｍｌの培地を１５リットルの培地２
（組成は前記参照）に接種した。培養器中での生育は２
５℃、１５リットル／分の通気、５００ＲＰＭの振盪６
０時間で行った。細胞は培養器より収穫し、化合物Ａよ
り化合物Ｂに還元（“生物学的変換”）するために使用
した。
【００４４】細胞（２００ｇ）を１００ｍＭリン酸カリ
ウム緩衝液（ｐＨ６．０）３リットル中に懸濁し、均一
の細胞懸濁液を調製した。１２ｇの化合物Ａと１２０ｇ
のグルコースを細胞懸濁液に加え、化合物Ａから化合物
Ｂへの生物学的変換を２２℃、１６０ＲＰＭ、２４時間
で行った。２４時間後更に３５ｇのグルコースを加え、
生物学的変換を７２時間、２２℃、１６０ＲＰＭで続け
た。サンプルを調製し、実施例１に記載と同様の方法で
生成物の収量及び光学純度を測定した。得られた結果は
以下の表２にまとめられている。
ウム緩衝液（ｐＨ６．０）３リットル中に懸濁し、均一
の細胞懸濁液を調製した。１２ｇの化合物Ａと１２０ｇ
のグルコースを細胞懸濁液に加え、化合物Ａから化合物
Ｂへの生物学的変換を２２℃、１６０ＲＰＭ、２４時間
で行った。２４時間後更に３５ｇのグルコースを加え、
生物学的変換を７２時間、２２℃、１６０ＲＰＭで続け
た。サンプルを調製し、実施例１に記載と同様の方法で
生成物の収量及び光学純度を測定した。得られた結果は
以下の表２にまとめられている。
【００４５】
【表２】
【００４６】〔実施例３〕細胞抽出物及び補助因子の使用 本製造法に於ける基質（化合物Ａ）及び所望の生成物
（化合物Ｂ）は実施例１記載のものと同じであった。ハ
ンセヌラ ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌ
ｙｍｏｒｐｈａ）ＡＴＣＣ ２６０１２を実施例２に記
載したと同様に培地１及び培地２を用いて生育させた。
細胞（１５０ｇ）を０．２Ｍリン酸カリウム緩衝液、ｐ
Ｈ６．０、１．５リットルに懸濁した。均一化した細胞
懸濁液を１３，０００ｐｓｉ加圧下、ミクロフリウダイ
ザー（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ）で４℃にて砕解
した。砕解した細胞懸濁液は１２，０００ＲＰＭで３０
分遠心分離した。澄明な上澄み液（“細胞抽出物”）
は、化合物Ａから化合物Ｂへの生物学的変換に使用し
た。
（化合物Ｂ）は実施例１記載のものと同じであった。ハ
ンセヌラ ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌ
ｙｍｏｒｐｈａ）ＡＴＣＣ ２６０１２を実施例２に記
載したと同様に培地１及び培地２を用いて生育させた。
細胞（１５０ｇ）を０．２Ｍリン酸カリウム緩衝液、ｐ
Ｈ６．０、１．５リットルに懸濁した。均一化した細胞
懸濁液を１３，０００ｐｓｉ加圧下、ミクロフリウダイ
ザー（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ）で４℃にて砕解
した。砕解した細胞懸濁液は１２，０００ＲＰＭで３０
分遠心分離した。澄明な上澄み液（“細胞抽出物”）
は、化合物Ａから化合物Ｂへの生物学的変換に使用し
た。
【００４７】細胞抽出液１リットルに２．５ｇの基質
（化合物Ａ）、ギ酸脱水素酵素（５００単位）、０．７
ｍＭニコチン酸アミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡ
Ｄ）、及びギ酸ナトリウム２５ｇを加えた。反応はｐＨ
６．０、１５０ＲＰＭ振盪、２２℃で行った。定期的に
サンプリングを行ない、実施例１記載と同様化合物Ｂの
収量及び光学純度を分析した。得られた結果は以下の表
３に示されている。
（化合物Ａ）、ギ酸脱水素酵素（５００単位）、０．７
ｍＭニコチン酸アミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡ
Ｄ）、及びギ酸ナトリウム２５ｇを加えた。反応はｐＨ
６．０、１５０ＲＰＭ振盪、２２℃で行った。定期的に
サンプリングを行ない、実施例１記載と同様化合物Ｂの
収量及び光学純度を分析した。得られた結果は以下の表
３に示されている。
【００４８】
【表３】
【００４９】上記の製造過程に於いて、化合物Ａより化
合物Ｂに生物学的変換するために使用されるＮＡＤＨ補
助因子は、生物学的変換と同時に下に図示したようにギ
酸脱水素酵素、ＮＡＤ＋、及びギ酸の存在下再生され
る。
合物Ｂに生物学的変換するために使用されるＮＡＤＨ補
助因子は、生物学的変換と同時に下に図示したようにギ
酸脱水素酵素、ＮＡＤ＋、及びギ酸の存在下再生され
る。
【００５０】
【化９】
【００５１】化合物Ａより化合物Ｂへの変換が完了した
のち、反応混合物はｐＨ７に調節し、同量の酢酸エチル
で３回抽出した。有機相を分離し、０．７Ｍ重炭酸ナト
リウム溶液で２回洗滌した。分離した有機層は無水硫酸
ナトリウムで乾燥し、減圧下酢酸エチルを除去した。得
られた油状物質は減圧下室温で乾燥すると淡白色の固体
が８５％の収量（単離）で得られ、光学純度は９９％で
あった。
のち、反応混合物はｐＨ７に調節し、同量の酢酸エチル
で３回抽出した。有機相を分離し、０．７Ｍ重炭酸ナト
リウム溶液で２回洗滌した。分離した有機層は無水硫酸
ナトリウムで乾燥し、減圧下酢酸エチルを除去した。得
られた油状物質は減圧下室温で乾燥すると淡白色の固体
が８５％の収量（単離）で得られ、光学純度は９９％で
あった。
フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:645） (72)発明者 アミト バネルジー アメリカ合衆国ペンシルベニア州 19067 ヤードレイ クオリー ロード 1600 (72)発明者 クライド ジー マクナミー アメリカ合衆国ニュージャージー州 08648 ローレンスビル テイラー コー ト 11112 (72)発明者 ラズロ ジェー スザルカ アメリカ合衆国ニュージャージー州 08816 イースト ブランスウィック ウ エリントン ロード ５
Claims (21)
- 【請求項１】 式（ＩＩ） 【化１】 〔式中、 Ｒ１は、低級アルキル基、アリール基、又は置換アリー
ル基；Ｘは、塩素、臭素、ヨウ素、アミノ基、モノアル
キルアミノ基又はジアルキルアミノ基、又はアミノ、モ
ノアルキルアミノ、又はジアルキルアミノの塩酸塩；Ｙ
は、水素、ハロゲン、水酸基、ニトロ基、低級アルキル
オキシ基、ベンジルオキシ基、置換ベンジルオキシ基、
低級アルキル又はＲ３ＳＯ２ＮＨ−（式中Ｒ３は独立し
てＲ１と同じ）； ４個よりなるアルキレン基を表わす〕の化合物と、式Ｉ
Ｉの化合物の還元を触媒することが出来る酵素又は微生
物と接触させ、式ＩＩの化合物を立体選択的に還元する
ことにより式（Ｉ） 【化２】 （式中、 Ｒ１、Ｘ及びＹは上記に同じ；Ｒ２は炭素原子１個又は
２個を介して−Ｘ及び 【化３】 と結合する炭素原子１〜４個のアルキレン基を表わす）
の化合物を得る製造法。 - 【請求項２】 Ｌ−２−ヒドロキシイソカプロン酸脱水
素酵素、乳酸脱水素酵素、イースト酵素、及びβ−ヒド
ロキシ酪酸脱水素酵素からなる群より選ばれる酵素によ
って触媒される請求項１記載の製造法。 - 【請求項３】 アクロモバクター属（Ａｃｈｒｏｍｏｂ
ａｃｔｅｒ）、アシネトバクター属（Ａｃｉｎｅｔｏｂ
ａｃｔｅｒ）、アクチノミセス属（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃ
ｅｓ）、アルカリゲネス属（Ａｌｋａｌｉｇｅｎｅ
ｓ）、アースロバクター属（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅ
ｒ）、アゾトバクター属（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ）、
バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ブレビバクテリウム
属（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、コリネバクテリ
ウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、フラボバ
クテリウム属（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、メチ
ロモナス属（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）、ミコバクテ
リウム属（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ノカルジア
属（Ｎｏｃａｒｄｉａ）、シュウドモナス属（Ｐｓｕｅ
ｄｏｍｏｎａｓ）、ロドコッカス属（Ｒｈｏｄｏｃｏｃ
ｃｕｓ）、ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃ
ｅｓ）、キサントモナス属（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａ
ｓ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、
カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、フサリウム属（Ｆｕｓ
ａｒｉｕｍ）、ゲオトリクム属（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕ
ｍ）、ハンセヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、クレッケ
ラ属（Ｋｌｏｅｃｋｅｒａ）、ペニシリウム属（Ｐｅｎ
ｉｃｉｌｌｕｍ）、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、リゾプ
ス属（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）、ロドトルラ属（Ｒｈｏｄｏ
ｔｏｒｕｌａ）、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏ
ｍｙｃｅｓ）、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍ
ａ）、モルチェラ属（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ）、カニ
ングハメラ属（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍｅｌｌａ）、トル
ロプシス属（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）及びロドシュウド
モナス属（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）からな
る群より選ばれる属の微生物によって触媒される請求項
１記載の製造法。 - 【請求項４】 アースロバクター シンプレックス（Ａ
ｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｉｍｐｌｅｘ）、ノカルジ
ア レストリクタ（Ｎｏｃａｒｄｉａ ｒｅｓｔｒｉｃ
ｔａ）、ノカルジア サルモニカラー（Ｎｏｃａｒｄｉ
ａ ｓａｌｍｏｎｉｃｏｌｏｒ）、ロドコッカス ファ
シアンス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓｆａｓｃｉａｎ
ｓ）、ロドコッカス ロドクラス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃ
ｕｓ ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ）、ミコバクテリウム
バッカ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｖａｃｃａ）、
ノカルジア メジテラネイ（Ｎｏｃａｒｄｉａ ｍｅｄ
ｉｔｔｅｒａｎｅｉ）、ノカルジア オートトロフイカ
（Ｎｏｃａｒｄｉａ ａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃａ）、ロ
ドコッカス エクイ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕ
ｉ）、カンジダ アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌ
ｂｉｃａｎｓ）、ゲオトリクム カンジダム（Ｇｅｏｔ
ｒｉｃｈｕｍ ｃａｎｄｉｄｕｍ）、モルチェラ アル
ピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａ）、ピキ
ア パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、
ピキア メタノリカ（Ｐｉｃｈｉａｍｅｔｈａｎｏｌｉ
ｃａ）、カニングハメラ エキナラテ（Ｃｕｎｎｉｎｇ
ｈａｍｅｌｌａ ｅｃｈｉｎａｌａｔｅ）、トルロプシ
ス ポリスポリウム（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ ｐｏｌｙ
ｓｐｏｒｉｕｍ）、トルロプシス グラブラタ（Ｔｏｒ
ｕｌｏｐｓｉｓ ｇｌａｂｒａｔａ）、アシネトバクタ
ー カルコアセチカス（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ
ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ）、ノカルジアグロベルラ
（Ｎｏｃａｒｄｉａ ｇｌｏｂｅｒｕｌａ）、カンジダ
ギリエルモンジ（Ｃａｎｄｉｄａ ｇｕｉｌｌｉｅｒ
ｍｏｎｄｉｉ）、ロドコッカス エリトロポリス（Ｒｈ
ｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）、サ
ッカロミセス セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅ
ｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シュウドモナス プチダ
（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）、モルチエ
ラ ラムマニアンナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ｒａｍ
ｍａｎｉａｎｎａ）、ハンセヌラ ファビアナ（Ｈａｎ
ｓｅｎｕｌａ ｆａｂｉａｎａ）、ハンセヌラポリモル
ファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、
トリコデルマポリスポリウム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ
ｐｏｌｙｓｐｏｒｉｕｍ）、ロドコッカス ファシア
ンス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｓｃｉａｎｓ）、
及びノカルジア レストリクタ（Ｎｏｃａｒｄｉａ ｒ
ｅｓｔｒｉｃｔａ）からなる群より選ばれる微生物によ
って触媒される請求項１記載の製造法。 - 【請求項５】 ロドコッカス グロベルラス（Ｒｈｏｄ
ｏｃｏｃｃｕｓ ｇｌｏｂｅｒｕｌｕｓ）ＡＴＣＣ ２
１５０５、カンジダ ギリエルモンジ（Ｃａｎｄｉｄａ
ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ）ＡＴＣＣ ２０３１
８、ロドコッカス エリスロポリス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃ
ｃｕｓ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）ＡＴＣＣ ４２７
７、サッカロミセス セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍ
ｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＡＴＣＣ ２４７０
２、シュウドモナス プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ
ｐｕｔｉｄａ）ＡＴＣＣ １１１７２、モルチェララ
ムマニアンナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ｒａｍｍａｎ
ｉａｎｎａ）ＡＴＣＣ３８１９１、ハンセヌラ ファビ
アンナ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｆａｂｉａｎａ）ＡＴＣ
Ｃ ５８０４５、ハンセヌラ ポリモルファ（Ｈａｎｓ
ｅｎｕｌａｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）ＡＴＣＣ ２６０１
２、トリコデルマ ポリスポリウム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅ
ｒｍａ ｐｏｌｙｓｐｏｒｉｕｍ）ＡＴＣＣ ２８０１
４、ロドコッカスｓｐ．（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｓ
ｐ．）ＡＴＣＣ ２１２４３、ロドコッカス ファシア
ンス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｓｃｉａｎｓ）Ａ
ＴＣＣ ２１９５０、ロドコッカス エクイ（Ｒｈｏｄ
ｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉ）ＡＴＣＣ １４８８７、オ
ウレオバシジュウム プルランス（Ａｕｒｅｏｂａｓｉ
ｄｉｕｍ ｐｕｌｌｕｌａｎｓ）ＡＴＣＣ １６６２
３、ムコール ハイマリス（Ｍｕｃｏｒ ｈｅｉｍａｌ
ｉｓ）ＡＴＣＣ ８９７７ｂ、モルチェラアルピナ（Ｍ
ｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａ）ＡＴＣＣ ３６
９６５、ロドコッカス種（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｓ
ｐ．）ＡＴＣＣ １２９７５、及びロドコッカス種（Ｒ
ｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）ＡＴＣＣ ２９６５か
らなる群より選ばれる微生物によって触媒される請求項
１記載の製造法。 - 【請求項６】 ハンセヌラ属、ロドコッカス属、及びノ
カルジア属からなる群より選ばれる属の微生物によって
触媒される請求項１記載の製造法。 - 【請求項７】 ハンセヌラ ポリモルファ ＡＴＣＣ
２６０１２、ハンセヌラ フラビアンナＡＴＣＣ ５８
０４５、ロドコッカスｓｐ． ＡＴＣＣ ２１２４３、
及びロドコッカス ファシアンス ＡＴＣＣ ２１９５
０からなる群より選ばれる微生物によって触媒される請
求項１記載の製造法。 - 【請求項８】 Ｒ１が低級アルキル基又はフェニル基、
Ｒ２がエチレン基又はメチレン基、Ｙが水素又は低級ア
ルキル基、そしてＸが塩素又はイソプロピルアミノ塩酸
塩である請求項１記載の製造法。 - 【請求項９】 Ｒ１がメチル基、Ｒ２がメチレン基、Ｙ
が水素、及びＸが塩素である請求項１記載の製造法。 - 【請求項１０】 微生物によって触媒され、１段階醗酵
法によって行われる請求項１記載の製造法。 - 【請求項１１】 微生物によって触媒され、２段階醗酵
法によって行われる請求項１記載の製造法。 - 【請求項１２】 微生物によって触媒され、誘発物質の
存在下行われる請求項１記載の製造法。 - 【請求項１３】 酵素によって触媒され、補助因子の存
在下行われる請求項１記載の製造法。 - 【請求項１４】 微生物によって触媒され、マルトー
ス、ラクトース、グルコース、フルクトース、グリセロ
ール、ソルビトール、シュウクロース、でんぷん、マン
ニトール、プロピレングリコール、酢酸ナトリウム、ク
エン酸ナトリウム、グルタミン酸ナトリウム、エタノー
ル、プロパノールからなる群より選ばれる１つ又はそれ
以上の炭素源を含み；Ｎ−ＺアミンＡ、コーンスティー
プリカー、糖蜜、ベイカーイースト、トリプトン、ニュ
ートリソイ、ペプトン、イーストアミン、硝酸ナトリウ
ム、硫酸アンモンからなる群より選ばれる１つまたはそ
れ以上の窒素源を含み；又リン酸塩、マンガン、カルシ
ウム、コバルト、ニッケル、鉄、ナトリウム塩、カリウ
ム塩からなる群より選ばれる１つ又はそれ以上の微量の
成分を含む培地中で行われる請求項１記載の製造法。 - 【請求項１５】 ｐＨが４〜９及び温度が１５℃〜６０
℃で行われる請求項１記載の製造法。 - 【請求項１６】 ｐＨが６〜８、温度が２５℃〜４０℃
及び時間が４〜４８時間で行われる請求項１記載の製造
法。 - 【請求項１７】 微生物によって触媒され、振盪撹拌す
ることによって行われる請求項１記載の製造法。 - 【請求項１８】 所望の生成物を分離する工程をひきつ
づき加えることによる請求項１記載の製造法。 - 【請求項１９】 分離の工程が抽出、蒸留、結晶化又は
カラムクロマトグラフ法である請求項１８記載の製造
法。 - 【請求項２０】 所望の生成物の収量が８０％以上であ
り、所望の生成物の光学純度が８０％以上である請求項
１記載の製造法。 - 【請求項２１】 所望の生成物の収量が９０％以上であ
り、所望の生成物の光学純度が９０％以上である請求項
１記載の製造法。
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|---|---|
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|---|---|---|---|
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