ES2325309T3 - Reduccion estereoselectiva de oxo-butanos sustituidos. - Google Patents

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Abstract

Un procedimiento estereoselectivo para la preparación de (3S,2R)-1-halo-2-hidroxi-3-amino (protegido)-4-butanos sustituidos representados por la fórmula I ** ver fórmula** en la que Hal es halógeno, R se selecciona del grupo constituido alquilo, alquilo sustituido, arilo y arilo sustituido, y R 1 es un grupo protector para la función amino, que comprende poner en contacto un (3S)-1-halo-2-oxo-3-amino (protegido)-4-butano sustituido representado por la fórmula II ** ver fórmula** en la que Hal, R y R1 son como se ha definido antes, con un microorganismo capaz de catalizar la reducción estereoselectiva del compuesto representado por la fórmula II, en el que dicho microorganismo se selecciona del grupo constituido por Rhodococcus erythropolis ATCC 4277, Rhodococcus erythropolis DSM 6971 y Rhodococcus sp. ATCC 21227, Rhodococcus erythropolis ATCC 27854 y Brevibacterium sp. ATCC 19653, en condiciones tales que se efectúa dicha reducción, y recuperar dicho compuesto representado por la fórmula I.

Description

Reducción estereoselectiva de oxo-butanos sustituidos.
Remisión a solicitudes relacionadas
La presente solicitud reivindica el beneficio de las Solicitudes provisionales de los EE.UU. Números de serie 60/277.531, presentada el 21 de Marzo de 2001, y 60/225.695, presentada el 16 de Agosto de 2000.
Campo de la invención
La presente invención se refiere a un nuevo procedimiento para la preparación de (3S,2R)-1-halo-2-hidroxi-3-amino (protegido)-4-butanos sustituidos por reducción estereoselectiva de los compuestos oxo correspondientes. Los butanos sustituidos producidos según el procedimiento de la invención son precursores de sub-unidades isoésteres de hidroxietilamina presentes en muchas moléculas útiles terapéuticamente como inhibidores de enzima de conversión de angiotensina, renina y proteasa de HIV.
Antecedentes de la invención
Bing-nan Zhou et al. J. Am. Chem. Soc., 105, páginas 5926-5928, 1983, describen la síntesis quimiomicrobiológica de L-carnitina, que juega un papel importante en el metabolismo y transporte humano de ácidos grasos de cadena larga. Particularmente, esta comunicación enseña la reducción por levadura de panadero, es decir, Saccharomyces cerevisiae, de K-cloroacetoacetato de etilo a (S)-4-cloro-3-hidroxibutanoato de etilo.
Kazutoshi Ushio et al. Tetrahedron Letters, Vol. 27, Nº 23, páginas 2657-2660, 1986, revelan la reducción de beta-ceto ésteres por levadura desarrollada en metanol. Esta comunicación enseña que la reacción sujeto causa desviaciones drásticas del exceso de enantiómero del producto resultante en la dirección del isómero D. Este fenómeno se produjo cuando se realizó la reacción utilizando levadura desarrollada en metanol debido a enzimas características de levadura desarrollada en tales medios.
Markus Christen et al. J. Chem. Soc., Chem. Commun. páginas 264-266, 1988, revelan la síntesis de cuatro estereoisómeros de 6-(p-clorofeniltio)-3,4-dihidrohexanoato de metilo en los que la introducción clave de quiralidad se efectuaba por una reducción con levadura apropiada. Se declara ahí que, aunque se ha estudiado extensamente la reducción de beta-ceto ésteres con levadura, permanece difícil predecir la configuración absoluta del(de los) producto(s)
o, en particular, el exceso de enantiómero que se consiga probablemente.
Antonio Trincone et al., Biotechnology and Bioengineering, Vol. 35, páginas 559-564, 1990, describen la reducción asimétrica de cetonas con células en reposo de Sulfolobus solfataricus. Se indica que la capacidad reductora de las células en reposo de este organismo depende fuertemente de la fase de crecimiento de células.
Ramesh Patel et al., Enzyme Microb. Technol., Vol. 13, páginas 906-912, 1991, describen la reducción microbiana estereoespecífica de 4,5-dihidro-4-(4-metoxifenil)-6-(trifluorometil-1H-1)-benzazepin-2-ona. En particular, se revela que se fabricó un compuesto intermedio clave (3R-cis)-1,3,4,5-tetrahidro-3-hidroxi-4-(4-metoxifenil)-6-(triflñuorometil)-2H-1-benzazepina-2-ona por reducción microbiana estereoespecífica de la cetona progenitora. Se indica que era posible obtener por selección de condiciones específicas un isómero único de entre cuatro posibilidades conocidas.
Ramesh Patel et al., Enzyme Microb. Technol., Vol. 15, páginas 1014-1021, 1993, describen la reducción estereoselectiva de un compuesto diceto, éster de metilo de ácido 3,5-dioxo-6-(benciloxi)hexanoico, a un enantiómero único del compuesto dihidroxi resultante.
Ramesh Patel et al., Enzyme Microb. Technol., Vol. 14, páginas 731-738, 1992, describen un procedimiento de tratamiento con calor de Geotrichum candidum para mejorar la pureza óptica del producto hidroxi obtenido de la reducción por él de beta-ceto ésteres.
Kometani et al., Journal of Fermentation and Bioengineering, Vol. 80, Nº 2, páginas 208-210, 1995, enseñan biorreducción mediada por levadura utilizando etanol como fuente de energía. Se examina la relación entre la velocidad de consumo de etanol y la velocidad de reducción de cetona proquiral en levadura de panadero, y se concluye que podría ser aplicable etanol a la producción a gran escala de alcoholes quirales a partir de cetonas proquirales.
Ramesh Patel et al., Patente de los EE.UU. Nº 5.391.495, otorgada el 21 de Febrero de 1995, revelan la reducción estereoselectiva de ciertos compuestos de sulfonamida que contienen ceto para formar los compuestos que contienen grupo hidroxilo correspondientes utilizando un microorganismo o una enzima capaz de catalizar la reducción. Las enzimas nombradas son óxido-reductasa o deshidrogenasa, y los microporganismos se seleccionan preferiblemente entre especies Hansenula, Rhodococcus y Norcardia. Sugawa et al., Patente de los EE.UU. Nº 5.726.047, otorgada el 10 de Marzo de 1998, revelan un procedimiento para producir un derivado de (3S)-1-halo-3-amino-4-fenil-2-butanona poniendo en contacto un derivado de (2R,3S)-1-halo-3-amino-4-fenil-2-butanol con al menos un microorganismo seleccionado del grupo constituido por microorganismos que pertenecen a los géneros Candida, Cryptococcus, Citeromyces, Debaryomyces, Pichia, Williopsiis, Kloeckera, Lipomyces, Rhodosporidium, Rhodotorula, Saccharomycopsis y Wingea.
Ramesh N. Patel, Biocatalytic Synthesis of Chiral Intermediates for Antiviral and Antihypertensive Drugs, Journal American Oil Chemical Society, 1999, Vol. 76, Nº 11, páginas 1275-1281, revelan la reducción microbiana estereoselectiva de éster de 1,1-dimetiletilo de ácido (1S)-[3-cloro-2-oxo-1-(fenilmetil)propil]carbámico a éster de 1,1-dimetiletilo de ácido (1S,2R)-3-cloro-2-hidroxi-1-(fenilmetil)propil]carbámico.
Sumario de la invención
La presente invención se dirige a un nuevo procedimiento estereoselectivo para la preparación de (3S,2R)-1-halo-2-hidroxi-3-amino (protegido)-4-butanos sustituidos mediante reducción del correspondiente grupo ceto que contienen compuestos por ciertas especies de Rhodococcus y Brevibacterium. Los productos se obtienen con alto rendimiento y con excelente pureza diastereómera.
Descripción detallada de la invención
El procedimiento de la presente invención proporciona una síntesis ventajosa para los (3S,2R)-1-halo-2-hidroxi-3-amino (protegido)-4-butanos sustituidos representados por la fórmula
1
en la que Hal es un halógeno, preferiblemente cloro, R se selecciona del grupo constituido por alquilo, alquilo sustituido, arilo y arilo sustituido, y R_{1} es un grupo protector para la función amino.
Los butanos sustituidos representados por la fórmula I son útiles como compuestos intermedios en la síntesis de moléculas que son inhibidoras de ACE, renina y proteasas de HIV. La actividad de tales moléculas contra proteasas de HIV las hace muy valiosas en el tratamiento de infecciones retrovíricas tales como SIDA. Tales compuestos y su uso se revelan, por ejemplo, en la Patente de los EE.UU. Nº 5.849.911.
Un compuesto de SIDA particularmente importante revelado en la Patente de los EE.UU. Nº 5.849.911 es éster de dimetilo de ácido [3S-(3R*,8R*,9R*,12R*)]-3,12-bis(1,1-dimetiletil)-8-hidroxi-4,11-dioxo-9-(fenilmetil)-6-{[4-(2-piridinil)fenil]metil}-2,3,6,10,13-pentaazaretetradecanodioico. Este compuesto puede sintetizarse directamente a partir de los (3S,2R)-1-halo-2-hidroxi-3-amino (protegido)-4-butanos sustituidos representados por la fórmula I. El hecho de que el procedimiento de la presente invención produzca un rendimiento muy alto del enantiómero trans (3S,2R) de los butanos sustituidos representados por la fórmula I los hace muy importante para la eficacia final de la síntesis del compuesto terapéutico descrito antes.
Según se utiliza en la presente memoria, los siguientes términos tienen las definiciones dadas seguidamente. El término "alquilo" se refiere a grupos hidrocarburos saturados de cadena recta o ramificada, opcionalmente sustituidos, que tienen de 1 a 7 átomos de carbono, preferiblemente de 1 a 4 átomos de carbono. La expresión "alquilo inferior" se refiere a grupos alquilo opcionalmente sustituidos que tienen de 1 a 4 átomos de carbono.
La expresión "alquilo sustituido" se refiere a un grupo alquilo sustituido con, por ejemplo, uno a cuatro sustituyentes, tales como halo, trifluorometilo, trifluorometoxi, hidroxi, alcoxi, cicloalquiloxi, heterociclooxi, oxo, alcanoilo, arilo, ariloxi, aralquilo, alcanoiloxi, amino, alquilamino, arilamino, aralquilamino, cicloalquilamino, heterocicloamino y amino disustituido. Las definiciones dadas en la presente memoria para alquilo y alquilo sustituido son de aplicación también a la porción alquilo de grupos alcoxi.
El término "arilo" se refiere a grupos hidrocarburos aromáticos monocíclicos o bicíclicos que tienen de 6 a 12 átomos de carbono en la porción de anillo, por ejemplo, grupos fenilo, naftilo, bifenilo y difenilo, cada uno de los cuales puede estar sustituido.
El término "aralquilo" se refiere a un grupo arilo unido a una entidad mayor a través de un grupo alquilo, por ejemplo, un radical bencilo.
La expresión "arilo sustituido" se refiere a un grupo arilo sustituido con, por ejemplo, uno a cuatro sustituyentes tales como alquilo; alquilo sustituido, halo, trifluorometilo, trifluorometoxi, hidroxi, alcoxi, cicloalquiloxi, heterociclooxi, alcanoilo, alcanoiloxi, amino, alquilamino, dialquilamino, aralquilamino, cicloalquilamino, heterocicloamino alcanoilamino, tiol, alquiltio, cicloalquiltio, heterociclotio, ureido, nitro, ciano, carboxi, carboxialquilo, carbamilo, alcoxicarbonilo, alquiltiono, ariltiono, alquilsulfonilo, sulfonamido, ariloxi y similares. El sustituyente puede sustituirse adicionalmente con uno o más miembros seleccionados del grupo constituido por halo, hidroxi, alquilo, alcoxi, arilo, alquilo sustituido, arilo sustituido y aralquilo.
El término "halógeno" o "Hal" se refiere a cloro, bromo, flúor e yodo, prefiriéndose cloro.
La expresión "grupo protector en la función amino" se refiere a un grupo de restos reconocido en la técnica que puede incorporarse a un grupo amino para abstenerlo de estar implicado en reacciones que tienen lugar en cualquier lugar de la molécula a la que está incorporado. Se prefiere entre tales grupos t-butoxicarbonilo (BOC), pero pueden usarse también grupos protectores de la función amino reconocidos en la técnica, generalmente grupos alcoxicarbonilo tales como benciloxicarbonilo.
Los materiales de partida para el procedimiento del procedimiento sujeto para preparar los (3S,2R)-1-halo-2-hidroxi-3-amino (protegido)-4-butanos sustituidos representados por la fórmula I son los correspondientes compuestos que contienen grupo ceto representados por la fórmula
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en la que Hal, R y R_{1} son como se ha definido antes. Los compuestos representados por la fórmula II pueden prepararse mediante técnicas descritas en la bibliografía y conocidas por lo de experiencia ordinaria en la técnica. Un procedimiento preferido para formar los compuestos representados por la fórmula II se revela en la solicitud de patente en tramitación junto con la presente Docket GY55.
En este procedimiento, un éster de arilo representado por la fórmula
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en la que R y R_{1} son como se ha definido antes y R_{2} es hidrógeno o nitro y puede sustituirse en la posición orto o para en el anillo fenilo se hace reaccionar con un iluro de azufre, es decir, un compuesto que contiene una función representada por la fórmula
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para producir un compuesto ceto iluro intermedio representado por la fórmula
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en la que R y R_{1} son como se ha definido antes y R_{3} y R_{4} se seleccionan del grupo constituido por alquilo, alquilo sustituido y arilo. El compuesto ceto iluro representado por la fórmula anterior se convierte después en los compuestos que contienen grupo ceto representados por la fórmula II por reacción con una fuente de cloruro, preferiblemente una fuente básica de cloruro, más preferiblemente cloruro de litio, y un ácido orgánico, por ejemplo, ácido metanosulfónico.
Los compuestos (3S,2R)-1-halo-2-hidroxi-3-amino (protegido)-4-butanos sustituidos representados por la fórmula I anterior son compuestos intermedios importantes en la síntesis de moléculas que son inhibidoras de ACE, renina y proteasas de HIV. La actividad de tales moléculas contra proteasas de HIV las hace muy valiosas en el tratamiento de infecciones retrovíricas tales como SIDA. Específicamente, los (3S,2R)-1-halo-2-hidroxi-3-amino (protegido)-4-butanos sustituidos representados por la fórmula I se tratan con una base adecuada para convertirlos en los epóxidos correspondientes representados por la fórmula mostrada a continuación.
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Los compuestos epóxidos representados por la fórmula mostrada antes son compuestos intermedios que pueden convertirse en el importante compuesto de SIDA éster de dimetilo de ácido [3S-(3R*,8R*,9R*,12R*)]-3,12-bis(1,1-dimetiletil)-8-hidroxi-4,11-dioxo-9-(fenilmetil)-6-{[4-(2-piridinil)fenil]metil}-2,3,6,10,13-pentaazaretetradecanodioico como se revela en la Patente de los EE.UU. Nº 5.849.911.
La reducción estereoselectiva de los (3S)-1-halo-2-oxo-3-amino (protegido)-4-butanos sustituidos representados por la fórmula II anterior para formar los (3S,2R)-1-halo-2-hidroxi-3-amino (protegido)-4-butanos sustituidos representados por la fórmula I se realiza según la presente invención por reacción con una enzima óxidoreductasa o, preferiblemente, un microorganismo que suministre una enzima óxidoreductasa capaz de catalizar la reducción enzimática de las cetonas representadas por la fórmula II. Las células del microorganismo pueden estar en forma de células húmedas intactas o células secas tales como células liofilizadas, secadas por pulverización o secadas con calor, o en forma de material de células tratado tal como células rotas o extractos de células. Aunque se conoce un número grande y variado de microorganismos que suministran alguna forma de óxidoreductasa, se ha encontrado según la presente invención que sólo especies seleccionadas de Rhodococcus y Brevibacterium catalizan la reducción del compuesto representado por la fórmula II para formar los (3S,2R)-1-halo-2-hidroxi-3-amino (protegido)-4-butanos sustituidos deseados con alto rendimiento cuantitativo y enantiómero. Estas especies son Rhodococcus erythropolis ATCC 4277, Rhodococcus erythropolis DSM 6971 y Rhodococcus sp. ATCC 21227, Rhodococcus erythropolis ATCC 27854 y Brevibacterium sp. ATCC 19653. El término "ATCC" según se usa aquí se refiere al número de admisión del depositario para el organismo particular, es decir, la American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852. El término "DSM" se refiere a la German Collection of Microorganisms and Cell Cultures, Branschweig, Alemania.
El procedimiento de reducción enzimática de la presente invención puede realizarse después de la fermentación del microorganismo empleado, es decir, como una fermentación y reducción de dos fases, o simultáneamente con ella, es decir, como una fermentación y reducción de fase única o in situ. En la última, el microorganismo puede desarrollarse en un medio apropiado, especialmente uno que contenga fuentes de nitrógeno y carbono, hasta que se realice suficiente crecimiento, y se añade después a ello un compuesto seleccionado de los compuestos representados por la fórmula II. La reducción enzimática se continúa seguidamente hasta alcanzar conversión virtualmente completa del compuesto representado por la fórmula II.
En la metodología de dos fases, el microorganismo se desarrolla inicialmente en un medio adecuado como se ha descrito antes hasta que presenta un nivel predeterminado de actividad enzimática, en cuyo punto se cosechan las células por técnicas de separación convencionales y se preparan a partir de ellas suspensiones de células microbianas que contienen agentes de tamponación apropiados y similares. Los agentes de tamponación adecuados incluyen tampones fosfato, particularmente tampón de fosfato potásico, tris-HCl, acetato sódico y similares. También puede usarse agua para preparar suspensiones de células microbianas. Se añade después a ello el compuesto representado por la fórmula II y se continúa la reducción enzimática hasta que la conversión es virtualmente completa. En cualquier caso, el medio de crecimiento apropiado incluirá, como se ha indicado previamente, fuentes de carbono y nitrógeno y elementos en trazas. Pueden añadirse también inductores. Como saben los de experiencia ordinaria en la técnica, el término inductor significa cualquier compuesto que inicie o aumente la actividad enzimática, es decir, oxidorreductasa, deseada dentro de la célula para producir el producto deseado. Los (3S)-1-halo-2-oxo-3-amino (protegido)-4-butanos sustituidos representados por la fórmula II se considerarían un inductor, particularmente cuando se añaden en pequeñas cantidades durante el crecimiento del microorganismo.
Las fuentes de carbono adecuadas para el medio pueden incluir azúcares, tales como maltosa, lactosa, glucosa, fructosa, glicerol, sorbitol, sacarosa, almidón, manitol, propilenglicol y similares, ácidos orgánicos y sus sales tales como acetato sódico, citrato sódico y similares, aminoácidos y sus sales, tales como glutamato sódico y similares, y alcoholes, tales como etanol, propanol y similares. Las fuentes de nitrógeno adecuadas pueden incluir N-Z amina A, licor de maíz macerado, harina de haba de soja, extractos de carne de vaca, melaza, levadura de panadero, triptona, nutrisoy, peptona, yeastamin, nitrato sódico, sulfato amónico y similares. Los elementos en trazas adecuados pueden incluir fosfatos, y sales de magnesio, manganeso, calcio, cobalto, níquel, hierro, sodio y potasio. Los medios apropiados utilizados según la presente invención pueden incluir una pluralidad de constituyentes seleccionados de cualquiera de estas categorías. Los medios preferidos representativos incluyen, sin limitación deseada, medios acuosos que contienen los siguientes, en porcentaje en peso:
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El pH dado antes para los medios es post-esterilización. Antes de la esterilización, se ajusta preferiblemente el pH de aproximadamente 6 a 8, más preferiblemente alrededor de pH 6,5. Se esterilizan después los medios, por ejemplo, calentando a una temperatura de aproximadamente 121ºC durante 30 minutos. Después de la esterilización, se ajustan los medios en pH 6,5 a 7,5, más preferiblemente alrededor de pH 7,0. Durante el crecimiento microbiano y el procedimiento de reducción, se mantiene el pH entre aproximadamente 4,0 y 9,0, preferiblemente entre alrededor de pH 6,0 y 8,0. Puede utilizarse convenientemente para ajuste del pH una base apropiada o sal ácida de entre los constituyentes nombrados antes.
La temperatura de la mezcla de reacción es una medida de la energía térmica disponible para el procedimiento de reducción y, por esta razón, debe mantenerse una temperatura adecuada para asegurar que hay suficiente energía disponible para que el procedimiento llegue a completarse. Un intervalo de temperatura adecuado para el procedimiento de la invención está en el intervalo de alrededor de 15ºC a aproximadamente 60ºC, preferiblemente de alrededor de 25ºC a aproximadamente 40ºC. Se sabe que la presión es crítica para la práctica del procedimiento de la invención y se mantiene típicamente por conveniencia aproximadamente la presión atmosférica.
El procedimiento de la presente invención se realiza preferiblemente en condiciones aeróbicas. La agitación y aireación de la mezcla de reacción también es beneficiosa para el procedimiento sujeto porque afecta a la cantidad de oxígeno disponible para la biotransformación. El procedimiento se realiza ventajosamente, por ejemplo, en cultivos en matraces de sacudidas o depósitos fermentadores durante el crecimiento de los microorganismos en un procedimiento de fase única o de dos fases como se ha descrito antes. Se prefiere agitación en el intervalo de aproximadamente 50 a 1000 rpm, siendo más preferido de aproximadamente 50 a 500 rpm. Se prefiere aireación de aproximadamente 0,1 a 10 volúmenes de aire por volumen de medio y por minuto (v/Vt.), siendo particularmente preferida aireación de aproximadamente 5 volúmenes por volumen de medio y por minuto.
La conversión completa del compuesto representado por la fórmula II puede requerir, por ejemplo, de aproximadamente 4 a 48 horas, típicamente de aproximadamente 4 a 24 horas, medidas desde el momento de adición al medio del compuesto representado por la fórmula II. Se prefiere que el medio sea de base acuosa, aunque puede utilizarse también un líquido orgánico o una mezcla de líquidos orgánico/acuoso miscibles o inmiscibles, es decir, bifásica.
El procedimiento de reducción enzimática estereoselectiva de la presente invención puede realizarse usando un co-factor tal como dinucleótido de nicotinamida adenina (NADH), especialmente cuando se utiliza una enzima aislada. El NADH, por ejemplo, puede regenerarse y reutilizarse seguidamente. Puede emplearse una enzima adicional que regenera el NADH in situ, tal como formiato deshidrogenasa o glucosa deshidrogenasa. Los donantes de hidrógeno adecuados incluyen hidrógeno molecular, un formiato (por ejemplo, un formiato de metal alcalino o amonio), glucosa, un hipofosfito o una reducción electroquímica en presencia de un viológeno, por ejemplo metil viológeno. También es posible regenerar NADH sin enzimas adicionales usando, por ejemplo, etanol o formiato.
Se prefiere adicionalmente añadir el compuesto de fórmula II al medio de reacción de manera que sea de alrededor de 0,2% a aproximadamente el 5% en peso, en base al peso combinado de compuesto de partida y medio. El inóculo de microorganismo, con relación a la cantidad de material de partida, es suficiente para proporcionar la reducción enzimática del compuesto representado por la fórmula II con los tiempos descritos antes, generalmente con una concentración de células de alrededor del 5% en peso a aproximadamente el 30% en peso. La utilización los parámetros de reacción preferidos descritos antes con los microorganismos dados proporcionará un rendimiento de reacción mayor del 70%, óptimamente por encima del 99% e, inesperadamente, una pureza diastereómera mayor del 93%, óptimamente superior al 99% del enantiómero deseado del compuesto representado por la fórmula I. El producto del procedimiento de reducción de la presente invención, es decir, los compuestos representados por la formula I, puede recuperarse por cualesquiera procedimientos adecuados para aislamiento y/o purificación, por ejemplo, metodologías tales como extracción, destilación, cristalización, cromatografía de columna y similares.
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Ejemplo 1 Reducción enzimática estereoselectiva: Uso de células completas - Procedimiento de fase única
Se inocularon células de Rhodococcus erythropolis ATCC 4277 (1 ml) en 100 ml de Medio 1 como se ha señalado antes en un matraz de 500 ml y se incubaron a 28ºC y 200 rpm en un sacudidor durante 22 horas. Se ajustó el pH de caldo de 50 células en pH 7,0 con tampón de fosfato potásico 1 M. Se añadió glucosa al caldo de células a razón de 25 mg/ml y se añadfieron a ello 50 mg de éster de ter-butilo de ácido (3S)-[N-(1-bencil-2-oxo-3-cloro)propil]carbámico (el sustrato). Las biotransformaciones (reducciones) se realizaron a 28ºC y 200 rpm en un sacudidor. En tiempos predeterminados se enfriaron rápidamente las mezclas de reacción con dos volúmenes de una mezcla 60:40 de t-butil metil éter y tolueno, y la fase orgánica separada se filtró a través de un filtro de 0,2 micrómetros y se recogió. Dos ml de la fase orgánica se evaporaron a sequedad bajo una corriente de nitrógeno y se absorbió el residuo con 1 ml de acetonitrilo, se filtró y se analizó por HPLC el éster de t-butilo de ácido (3S,2R)-[N-(1-bencil-2-hidroxi-3-cloro)propil]carbámico (el producto). Los resultados se resumen en la siguiente Tabla 1.
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TABLA 1
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Ejemplo 2 Uso de células completas: Procedimiento de dos fases
El sustrato y el producto para este Ejemplo fueron como se describe en el Ejemplo 1. Se inocularon individualmente células de Rhodococcus erythropolis ATCC 4277 y Rhodococcus erythropolis DSM 6971 (1 ml) en porciones de 100 ml de Medio I como se ha indicado antes en un matraz de 500 ml y se incubaron a 25ºC y 280 rpm en un sacudidor durante 48 horas. Se inocularon una vez cien ml de cada cultivo en 15 ml de Medio I combinados en un fermentador. El crecimiento en el fermentador se realizó a 25ºC, aireación de 15 lpm (litros por minuto) y agitación de 500 rpm durante 36 horas. Se cosecharon las células del fermentador y se usaron para conversión enzimática (biotransformación) de éster de ter-butilo de ácido (3S)-[N-(1-bencil-2-oxo-3-cloro)propil]carbámico (el sustrato) en éster de t-butilo de ácido (3S,2R)-[N-(1-bencil-2-hidroxi-3-cloro)propil]carbámico (el producto). Se prepararon suspensiones de células suspendiendo las células, 20 gramos en 100 ml de tampón de fosfato potásico 64 mM, pH 7,0. Se añadieron a cada suspensión 25 mg/ml de glucosa y una concentración predeterminada de sustrato. La biotransformación del sustrato en el producto se realizó a 28ºC y 160 rpm en un sacudidor. En tiempos predeterminados se enfriaron rápidamente las mezclas de reacción y el producto obtenido, y se analizaron como se ha descrito en el Ejemplo 1. Los resultados se resumen en la siguiente Tabla 2.
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TABLA 2
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Los resultados de las Tablas 1 y 2 demuestran que se obtiene el producto deseado por el procedimiento de la invención con alto rendimiento y con muy alta pureza diastereómera.
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Ejemplo 3 Uso de diversas cepas microbianas para biotransformación: Células completas
Se utilizó una serie de microorganismos para realizar la biotransformación según el procedimiento del Ejemplo 1. Los resultados se muestran en la Tabla 3.
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TABLA 3
10
TABLA 3 (continuación)
11
TABLA 3 (continuación)
12
Los resultados de la Tabla 3 demuestran que los microorganismos de la invención causan claramente producción del producto con rendimientos aceptables, es decir, por encima del 70%, y pureza diastereómera aceptable, es decir, superior al 90%.
Ejemplo 4 Uso de extractos de células y co-factor
El sustrato para este procedimiento y el producto fueron como en los Ejemplos previos. Se desarrollaron células de Rhodococcus erythropolis ATCC 4277 en Medio I como se ha descrito antes. Las células (150 gramos) se suspendieron en 100 ml de tampón de fosfato potásico, pH 7,0. Las suspensiones de células se desintegraron a 4ºC mediante el uso de un microfluidizador a una presión de 914,16 kg/cm^{2}. La suspensión de células desintegradas se centrifugó a 12.000 rpm durante 30 minutos. Se utilizó el sobrenadante claro ("extractos de células") para la biotransformación del sustrato en el producto.
Se suplementaron porciones (10 ml) de extracto de células con 10 mg de sustrato, glucosa deshidrogenasa (35 unidades), NAD^{+} (dinucleótido de nicontinamida adenina) 0,7 mM y 200 mg de glucosa. La reacción se efectuó a un pH fijado en pH 6,0, agitación de 150 rpm y 30ºC. Se retiraron periódicamente muestras del medio de reacción y se analizaron. Se obtuvo el producto con un rendimiento del 95% y una pureza diastereómera > 98%. En este ejemplo, el cofactor NADH se regeneró usando glucosa deshidrogenasa, NAD^{+} y glucosa como se muestra a continuación.
13

Claims (8)

1. Un procedimiento estereoselectivo para la preparación de (3S,2R)-1-halo-2-hidroxi-3-amino (protegido)-4-butanos sustituidos representados por la fórmula I
14
en la que Hal es halógeno, R se selecciona del grupo constituido alquilo, alquilo sustituido, arilo y arilo sustituido, y R_{1} es un grupo protector para la función amino, que comprende poner en contacto un (3S)-1-halo-2-oxo-3-amino (protegido)-4-butano sustituido representado por la fórmula II
15
en la que Hal, R y R_{1} son como se ha definido antes, con un microorganismo capaz de catalizar la reducción estereoselectiva del compuesto representado por la fórmula II, en el que dicho microorganismo se selecciona del grupo constituido por Rhodococcus erythropolis ATCC 4277, Rhodococcus erythropolis DSM 6971 y Rhodococcus sp. ATCC 21227, Rhodococcus erythropolis ATCC 27854 y Brevibacterium sp. ATCC 19653, en condiciones tales que se efectúa dicha reducción, y recuperar dicho compuesto representado por la fórmula I.
2. Un procedimiento según la reivindicación 1, en el que Hal es cloro, R es fenilo y R_{1} es t-buitoxicarbonilo.
3. Un procedimiento según la reivindicación 1, realizado como una fermentación de una fase.
4. Un procedimiento según la reivindicación 1, realizado como una fermentación de dos fases.
5. Un procedimiento según la reivindicación 1, realizado en presencia de un inductor.
6. Un procedimiento según la reivindicación 5, en el que el inductor es un compuesto representado por la fórmula I que se añade durante el crecimiento de dicho microorganismo.
7. Un procedimiento según la reivindicación 1, en el que el compuesto representado por la fórmula I se obtiene con un rendimiento de al menos el 70% y una pureza diastereómera de al menos el 93%.
8. Un procedimiento según la reivindicación 5, en el que el compuesto representado por la fórmula I se obtiene con un rendimiento de al menos el 95% y una pureza diastereómera de al menos el 99%.
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