KR20040031674A - 치환된 옥소-부탄의 입체선택성 환원 - Google Patents

치환된 옥소-부탄의 입체선택성 환원 Download PDF

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KR20040031674A
KR20040031674A KR10-2003-7002257A KR20037002257A KR20040031674A KR 20040031674 A KR20040031674 A KR 20040031674A KR 20037002257 A KR20037002257 A KR 20037002257A KR 20040031674 A KR20040031674 A KR 20040031674A
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Abstract

본 발명의 방법은 특정 종의 로도코커스 및 브레비박테리아를 이용하여 1-할로-2-옥소-3-(보호된)아미노-4-치환된-부탄을 입체선택성 효소적 환원하는 방법에 관한 것이다. ACE, 레닌 및 HIV 프로테아제의 저해제인 화합물의 합성에서 중간체로서 유용한 생성물 1-할로-2-히드록시-3-(보호된)아미노-4-치환된-부탄을 높은 수율 및 매우 높은 부분입체이성질체 순도로 수득한다. 상기 방법은 유리하게 생성물의 1S, 2S 거울상 이성질체에 대해 매우 선택적이다.

Description

치환된 옥소-부탄의 입체선택성 환원 {Stereoselective Reduction of Substituted Oxo-Butanes}
문헌 [Bing-nan Zhou et al. J. Am. Chem. Soc., 105, pages 5926-5928, 1983]은 인간 대사 및 장쇄 지방산의 운반에서 중요한 역할을 하는 L-카르니틴의 화학미생물학적 합성법을 개시하고 있다. 특히, 상기 논문은 제빵 효모, 즉 사카로마이시스 세레비재 (Saccharomyces cerevisae)에 의해 에틸 K-클로로아세토아세테이트를 에틸 (S)-4-클로로-3-히드록시부타노에이트로 환원시키는 것을 교시한다.
문헌 [Kazutoshi Ushio et al. Tetrahedron Letters, Vol.27, No.23, pages 2657-2660, 1986]은 메탄올 성장 효모에 의한 베타-케토 에스테르의 환원을 개시하고 있다. 상기 논문은 상기 반응이 생성된 물질의 광학 순도 (enantiomeric excess)를 D-이성질체 쪽으로 크게 이동시킴을 교시한다. 메탄올에서 성장된 효모를 사용하여 반응을 수행하는 경우 상기 배지에서 성장된 효모의 효소 특성 때문에 이런 현상이 발생되었다.
문헌 [Markus Christen et al. J. Chem. Soc., Chem. Commun. pages 264-266, 1988]은 적절한 효모 환원에 의해 키랄특성의 주된 도입을 수행하는 메틸-6-(p-클로로페닐티오)-3,4-디히드로헥사노에이트의 4 개의 입체이성질체의 합성법을 개시하고 있다. 상기 문헌에서는 효모를 사용한 베타-케토 에스테르의 환원을 광범위하게 연구하였지만, 생성물(들)의 완전한 배위 또는 특히 달성할 수 있는 광학 순도를 예측하는 것에 대한 어려움이 남아있다는 것을 언급하고 있다.
문헌 [Antonio Trincone et al., Biotechnology and Bioengineering, Vol. 35, pages 559-564, 1990]은 술폴로버스 솔파타리쿠스 (Sulfolobus solfataricus)의 휴면 세포를 사용한 케톤의 비대칭 환원을 개시하고 있다. 상기 유기체의 휴면 세포의 환원 능력이 세포 성장의 주기에 의존한다는 것을 언급하고 있다.
문헌 [Ramesh Patel et al., Enzyme Microb. Technol., Vol. 13, pages 906-912, 1991]은 4,5-디히드로-4-(4-메톡시페닐)-6-(트리플루오로메틸-1H-1)-벤즈아제핀-2-온의 입체특이성 미생물 환원을 개시한다. 특히, 핵심 중간체 (3R-시스)-1,3,4,5-테트라히드로-3-히드록시-4-(4-메톡시페닐)-6-(트리플루오로메틸)-2H-1-벤즈아제핀-2-온이 모 케톤의 입체선택성 미생물 환원에 의해 제조되었음을 개시하고 있다. 특정 조건의 선택에 의해 4 개의 알려진 가능한 이성질체 중에서 한 가지의이성질체를 수득하는 것이 가능함을 언급하고 있다.
문헌 [Ramesh Patel et al., Enzyme Microb. Technol., Vol. 15, pages 1014-1021, 1993]은 디케토 화합물인 3,5-디옥소-6-(벤질옥시)헥산산 메틸 에스테르를 생성된 디히드록시 화합물을 단일 거울상이성질체로 입체선택성 환원하는 것을 개시하고 있다.
문헌 [Ramesh Patel et al., Enzyme Microb. Technol., Vol. 14, pages 731-738, 1992]은 게오트리컴 캔디덤 (Geotrichum candidum)을 열처리하여 베타-케토 에스테르의 환원으로부터 수득한 히드록시 생성물의 광학 순도를 개선하는 방법을 개시하고 있다.
문헌 [Kometani et al., Journal of Fermentation and Bioengineering, Vol.80, No.2, pages 208-210, 1995]은 에너지원으로서 에탄올을 사용하는 효모-매개의 생물환원을 교시한다. 에탄올 소모 속도와 제빵 효모의 선구키랄성 케톤 환원 속도 사이의 관계를 조사하고 에탄올이 선구키랄성 케톤으로부터 키랄 알콜의 대량 생산에 적용가능하다는 결론을 얻었다.
1995년 2월 21일 라메쉬 파텔 (Ramesh Patel) 등에게 허여된 미국 특허 제5,391,495호는 환원을 촉매할 수 있는 미생물 또는 효소를 사용하여 특정 케토-함유 술폰아미드 화합물을 입체선택성 환원하여 상응하는 히드록실 기-함유 화합물을 형성하는 것을 개시하고 있다. 상기 효소는 산화환원효소 또는 탈수소효소이고 상기 미생물은 한세눌라 (Hansenula), 로도코커스 (Rhodococcus) 및 노카디아 (Norcardia) 종으로부터 선택되는 것이 바람직하다.
발명의 요약
본 발명은 로도코커스 및 브레비박테리아 (Brevibacterium)의 특정 종에 의한 화합물을 함유하는 상응하는 케토 기를 환원시켜 (1S,2S)-1-할로-2-히드록시-3-(보호된)아미노-4-치환된 부탄의 신규 입체선택성 제조 방법에 관한 것이다. 상기 생성물을 높은 수율 및 우수한 부분입체이성질체 순도로 수득한다.
본 출원은 2001년 3월 21일 출원된 미국 가출원 제60/277,531호 및 2000년 8월 16일 출원된 동 제60/225,695호의 이점을 청구한다.
본 발명은 상응하는 옥소 화합물의 입체선택성 환원에 의한 (1S,2S)-1-할로-2-히드록시-3-(보호된)아미노-4-치환된 부탄의 신규 제조 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법에 따라 제조된 치환된 부탄은 안지오텐신 전환 효소, 레닌 및 HIV-프로테아제의 저해제로서 치료에 유용한 많은 분자에 존재하는 히드록시에틸아민 등가근 (isostere) 서브-유닛의 전구체이다.
본 발명의 방법은 하기 화학식 I의 (1S,2S)-1-할로-2-히드록시-3-(보호된)아미노-4-치환된 부탄에 대한 바람직한 합성법을 제공한다.
상기 식에서,
Hal은 할로겐, 바람직하게는 염소이고,
R은 알킬, 치환된 알킬, 아릴 및 치환된 아릴로 이루어진 군 중에서 선택되고,
R1은 아미노 관능기에 대한 보호기이다.
화학식 I의 치환된 부탄은 ACE, 레닌 및 HIV 프로테아제의 저해제인 분자의 합성에서 유용한 중간체이다. 상기 분자는 HIV 프로테아제에 대해 활성을 갖기 때문에 AIDS와 같은 레트로바이러스 감염의 치료에 매우 유용하다. 상기 화합물 및 그의 용도는, 예를 들어 개시 내용이 본원에 참고로 인용된 미국 특허 제5,849,911호에 개시되어있다. 미국 특허 제5,849,911호에 개시된 특히 중요한 AIDS 화합물은 [3S-(3R*,8R*,9R*,12R*)]-3,12-비스(1,1-디메틸에틸)-8-히드록시-4,11-디옥소-9-(페닐메틸)-6-{[4-(2-피리디닐)페닐]메틸}-2,3,6,10,13-펜타아자레테트라데칸디온산 디메틸 에스테르이다. 상기 화합물은 화학식 I의 (1S,2S)-1-할로-2-히드록시-3-(보호된)아미노-4-치환된 부탄으로부터 직접 합성할 수 있다. 본 발명의 방법이 화학식 I의 치환된 부탄의 트랜스(1S,2S) 거울상이성질체를 높은 수율로 생성시킨다는 사실은 상기 개시된 치료용 화합물의 최종 합성 효율에 매우 중요하다.
본원에 사용한 하기 용어는 하기 제공된 정의를 갖는다. 용어 "알킬"은 1 내지 7 개의 탄소 원자, 바람직하게는 1 내지 4 개의 탄소 원자를 갖는 임의로 치환된 직쇄 또는 분지쇄 포화 탄화수소 기를 나타낸다. 표현 "저급 알킬"은 1 내지 4 개의 탄소 원자를 갖는 임의로 치환된 알킬 기를 나타낸다.
용어 "치환된 알킬"은, 예를 들어 할로, 트리플루오로메틸, 트리플루오로메톡시, 히드록시, 알콕시, 시클로알콕시, 헤테로시클로옥시, 옥소, 알카노일, 아릴, 아릴옥시, 아랄킬, 알카노일옥시, 아미노, 알킬아미노, 아릴아미노, 아랄킬아미노, 시클로알킬아미노, 헤테로시클로아미노 및 이치환된 아미노와 같은 1 내지 4 개의 치환체로 치환된 알킬 기를 나타낸다. 본원에 제공된 알킬 및 치환된 알킬에 대한 정의는 알콕시 기의 알킬 부분에도 적용된다.
용어 "아릴"은 각각 치환될 수 있는 고리 부분, 예를 들어 페닐, 나프틸, 비페닐 및 디페닐 기에 6 내지 12 개 탄소 원자를 갖는 모노시클릭 또는 비시클릭 방향족 탄화수소 기를 나타낸다.
용어 "아랄킬"은 알킬 기를 통해 더 큰 화합물과 결합하는 아릴 기, 예를 들어 벤질 라디칼을 나타낸다.
용어 "치환된 아릴"은, 예를 들어 1 내지 4 개의 치환체, 예를 들어 알킬, 치환된 알킬, 할로, 트리플루오로메틸, 트리플루오로메톡시, 히드록시, 알콕시, 시클로알킬옥시, 헤테로시클로옥시, 알카노일, 알카노일옥시, 아미노, 알킬아미노, 디알킬아미노, 아랄킬아미노, 시클로알킬아미노, 헤테로시클로아미노, 알카노일아미노, 티올, 알킬티오, 시클로알킬티오, 헤테로시클로티오, 우레이도, 니트로, 시아노, 카르복시, 카르복시알킬, 카르바밀, 알콕시카르보닐, 알킬티오노, 아릴티오노, 알킬술포닐, 술폰아미도, 아릴옥시 등으로 치환된 아릴 기를 나타낸다. 상기 치환체는 할로, 히드록시, 알킬, 알콕시, 아릴, 치환된 알킬, 치환된 아릴 및 아랄킬로 이루어진 군 중에서 선택된 하나 이상의 구성원으로 추가로 치환될 수 있다.
용어 "할로겐" 또는 "Hal"은 염소, 브롬, 플루오르 및 요오드를 나타내고, 바람직하게는 염소를 나타낸다.
용어 "아미노 관능기의 보호기"는 아미노 기와 결합하여 반응에서 떨어져 있게 하고 결합된 분자의 다른 곳에서 반응이 일어나게 하는 당업계 공지된 잔기를 나타낸다. 상기 기 중에서 바람직한 기는 t-부톡시카르보닐 (BOC)이나, 당업계 공지된 아미노 관능 보호기, 일반적으로 알콕시카르보닐 기, 예를 들어 벤질옥시카르보닐이 또한 사용될 수 있다.
화학식 I의 (1S,2S)-1-할로-2-히드록시-3-(보호된)아미노-4-치환된 부탄을 제조하기 위한 상기 방법의 과정에서 출발 물질은 하기 화학식 II의 상응하는 케토 기-함유 화합물이다.
상기 식에서, Hal, R 및 R1은 상기 정의된 바와 같다.
화학식 II의 화합물은 문헌에 개시되고 당업계의 통상적인 기술로 공지된 전문기술에 의해 제조될 수 있다. 화학식 II의 화합물을 형성하기 위한 바람직한 방법은 개시 내용이 본원에 참고로 인용된 동시 계류중인 특허 출원 제GY55호에 개시되어 있다. 이런 방법에서, 화학식의 화합물 (이 때, R 및 R1은 상기 정의된 바와 같고, R2는 수소 또는 니트로이고 페닐 고리의 오르토 또는 파라 위치에서 치환될 수 있음)의 아릴 에스테르를 황 일리드, 즉 화학식의 관능기를 함유하는 화합물과 반응시켜 화학식의 중간체 케토 일리드 화합물 (이 때, R 및 R1은 상기 정의된 바와 같고, R3및 R4는 알킬, 치환된 알킬 및 아릴로 이루어진 군 중에서 선택됨)을 제조한다. 이어서 상기 화학식의 케토 일리드 화합물을 염소원, 바람직하게는 염소의 염기성원, 가장 바람직하게는 염화 리튬 및 메탄술폰산과 같은 유기산과 반응시켜 화학식 II의 케토 기-함유 화합물로 전환시킨다.
상기 화학식 I의 (1S,2S)-1-할로-2-히드록시-3-(보호된)아미노-4-치환된 부탄은 ACE, 레닌 및 HIV 프로테아제의 저해제인 분자의 합성에서 중요한 중간체이다. 상기 화합물은 HIV 프로테아제에 대해 활성을 갖기 때문에 AIDS와 같은 레트로바이러스 감염의 치료에 매우 효과적이다. 구체적으로, 상기 화학식 I의 (1S,2S)-1-할로-2-히드록시-3-(보호된)아미노-4-치환된 부탄을 적합한 염기로 처리하여 화학식의 상응하는 에폭시드로 전환시킨다.
상기 화학식의 에폭시드 화합물은 개시 내용이 본원에 참고로 인용된 미국 특허 제5,849,911호에 개시된 바와 같이 중요한 AIDS 화합물 [3S-(3R*,8R*,9R*,12R*)]-3,12-비스(1,1-디메틸에틸)-8-히드록시-4,11-디옥소-9-(페닐메틸)-6-{[4-(2-피리디닐)페닐]메틸}-2,3,6,10,13-펜타아자레테트라데칸디온산 디메틸 에스테르로 전환될 수 있는 중간체이다.
화학식 I의 (1S,2S)-1-할로-2-히드록시-3-(보호된)아미노-4-치환된 부탄을 형성하기 위한 화학식 II의 (1S)-1-할로-2-옥소-3-(보호된)아미노-4-치환된 부탄의 입체선택성 환원을 산화환원 효소 또는 바람직하게는 화학식 II의 케톤의 효소적 환원을 촉매할 수 있는 산화환원 효소를 공급하는 미생물과 반응시켜 본 발명에 따라 수행한다. 미생물 세포는 온전 습윤 세포 또는 건조된 세포, 예를 들어 동결 건조, 분무 건조 또는 열 건조된 세포의 형태 또는 처리된 세포 물질, 예를 들어 파열된 세포 또는 세포 추출물의 형태일 수 있다. 다수의 다양한 미생물이 몇몇 산화환원 효소의 형태를 공급하는 것으로 알려져 있지만, 선택된 종인 로도코커스 및 브레비박테리아만이 화학식 II의 화합물의 환원을 촉매하여 높은 정량적인 수율 및 거울상이성질체 수율로 원하는 (1S,2S)-1-할로-2-히드록시-3-(보호된)아미노-4-치환된 부탄을 형성시킨다는 것이 본 발명에 따라 밝혀졌다. 이들 종은 로도코커스 에리스로폴리스 (Rodococcus erythropolis) ATCC 기탁번호 제4277호, 로도코커스 에리스로폴리스 DSM 기탁번호 제6971호 및 로도코커스 종 ATCC 기탁번호 제21227호, 로도코커스 에리스로폴리스 ATCC 기탁번호 제27854호 및 브레비박테리아 종 ATCC 기탁번호 제19653호이다. 본원에 사용된 용어 "ATCC"는 특정 조직체, 즉 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (American Type Culture Collection) (미국 20852 마릴랜드주 로크빌 파크로운 드라이브 12301에 소재)에 기탁한 기탁 번호를 나타낸다. 용어 "DSM"은 게르만 콜렉션 오브 마이크로오가니즘 앤드 셀 컬쳐 (German Collection of Microorganism and Cell Cultures) (독일 브란쉬바이크에 소재)를나타낸다.
본 발명의 효소적 환원 방법은 사용된 미생물의 발효 후에, 즉 2 단계 발효 및 환원으로 또는 그것들을 동시에, 즉 단일 단계로 또는 발효와 환원을 동일 반응계에서 수행할 수 있다. 동시에 발효 및 환원시키는 경우, 미생물을 적절한 배지, 특히 질소원 및 탄소원을 함유하는 배지에서 충분히 성장할 때까지 성장시킬 수 있고, 이어서 화학식 II의 화합물로부터 선택된 화합물을 거기에 첨가한다. 그 후에 효소적 환원을 지속하여 화학식 II의 화합물을 실질적으로 완전히 전환시킨다.
2 단계 방법에서, 미생물을 상기 개시한 적합한 배지에서 초기에 성장시켜 미리 결정한 수준의 효소적 활성에 도달하게 하고 그 시점에서 세포를 통상적인 분리 기술로 수확하고, 이것으로부터 적절한 완충제 등을 함유한 미생물 세포 현탁액을 제조하였다. 적합한 완충제에는 인산 완충용액, 특히 인산 칼륨 완충용액, tris-HCl, 아세트산 나트륨 등이 포함된다. 물을 또한 사용하여 미생물 세포의 현탁액을 제조할 수 있다. 이어서 화학식 II의 화합물을 거기에 첨가하고 효소적 환원을 지속하여 전환을 실질적으로 완료시킨다. 둘 다의 경우에, 적절한 성장 배지에는 상기 탄소원과 질소원 및 미량 원소가 포함될 것이다. 유도제가 또한 첨가될 수 있다. 당업자가 알고 있는 바와 같이, 유도제라는 용어는 세포내에서 원하는 효소적, 즉 산화환원적 활성을 개시하거나 증가시켜 원하는 생성물을 생성시키는 임의의 화합물을 의미한다. 화학식 II의 (1S)-1-할로-2-옥소-3-(보호된)아미노-4-치환된 부탄을 특히 미생물이 성장하는 동안 소량으로 첨가한 경우에 유도제로 생각할 수 있다.
배지에 적합한 탄소원에는 당류, 예를 들어 말토스, 락토스, 글루코스, 프룩토스, 글리세롤, 소르비톨, 수크로스, 전분, 만니톨, 프로필렌 글리콜 등; 유기산 및 그의 염, 예를 들어 아세트산 나트륨, 시트르산 나트륨 등; 아미노산 및 그의 염, 예를 들어 나트륨 글루타메이트 등; 및 알콜, 예를 들어 에탄올, 프로판올 등이 포함될 수 있다. 적합한 질소 공급원에는 N-Z 아민 A, 옥수수 침지수 농축물, 대두박, 소고기 추출물, 효모 추출물, 당밀, 제빵 효모, 트립톤, 누트리소이, 펩톤, 이스타민, 질산 나트륨, 황산 암모늄 등이 포함될 수 있다. 적합한 미량 원소에는 인산염, 및 마그네슘, 망간, 칼슘, 코발트, 니켈, 철, 나트륨 및 칼륨 염이 포함될 수 있다. 본 발명에 따라 사용된 적절한 배지에는 상기 임의의 카테고리로부터 선택된 대부분의 성분이 포함될 수 있다. 대표적인 바람직한 배지에는 하기 중량부를 함유하는 수성 배지가 포함되나 이에 제한되지 않는다.
성분 중량부
제1 pH 7.0 맥아 추출물 1 ％
효모 추출물 1 ％
펩톤 1 ％
글루코스 2 ％
제2 pH 7.0 맥아 추출물 1 ％
효모 추출물 1 ％
펩톤 0.3 ％
글루코스 4 ％
제3 pH 7.0 맥아 추출물 1 ％
효모 추출물 1 ％
펩톤 0.3 ％
글루코스 2 ％
제4 pH 7.0 맥아 추출물 1 ％
효모 추출물 1 ％
펩톤 0.3 ％
숙신산 나트륨 2 ％
배지에 대한 상기 pH는 멸균 후의 pH이다. 멸균 전에, pH를 바람직하게는 약 6 내지 8로, 가장 바람직하게는 pH 6.5로 맞춘다. 이어서 배지를, 예를 들어약 121 ℃의 온도에서 30 분 동안 가열하여 멸균하였다. 멸균 후, 배지를 pH 6.5 내지 7.5, 바람직하게는 약 7.0으로 맞추었다. 미생물 성장 및 환원 방법 동안, pH는 약 4.0 내지 9.0으로, 바람직하게는 약 6.0 내지 8.0으로 유지시킨다. 상기 언급된 성분 중 적절한 염기 또는 산 염을 pH를 맞추기 위해 용이하게 사용할 수 있다.
반응 혼합물의 온도는 환원 과정 동안 이용가능한 열 에너지의 측정량이고, 따라서 적합한 온도를 유지하여 상기 과정을 완료시키기에 충분한 이용가능 에너지를 확보해야 한다. 본 발명의 방법에 적합한 온도 범위는 약 15 ℃ 내지 약 60 ℃, 바람직하게는 약 25 ℃ 내지 약 40 ℃의 범위이다. 압력은 본 발명의 방법의 실시에 결정적인 것으로 알려져 있지 않고 편의상 거의 대기압을 유지하는 것이 일반적이다.
본 발명의 방법을 호기성 조건에서 수행하는 것이 바람직하다. 반응 혼합물의 교반 및 통기는 또한 생체전환에 이용가능한 산소의 양에 영향을 받는 상기 방법에 유리하다. 상기 방법을, 예를 들어 상기 개시된 단일 단계 또는 2 단계로 미생물을 성장시키는 동안 진탕-플라스크 배양 또는 발효기 탱크에서 수행하는 것이 바람직하다. 약 50 내지 1000 RPM 범위의 교반이 바람직하고, 약 50 내지 5000 RPM이 가장 바람직하다. 1 분 당 배지 1 부피 당 약 0.1 내지 10 부피 (v/Vt.)의 공기로 통기하는 것이 바람직하고, 1 분 당 배지 1 부피 당 약 5 부피의 공기로 통기하는 것이 특히 바람직하다.
화학식 II의 화합물의 완전한 전환에는, 예를 들어 화학식 II의 화합물을 배지에 첨가하는 시점으로부터 측정된 약 4 내지 48 시간, 일반적으로 약 4 내지 24 시간이 필요할 수 있다. 배지가 수성 기재인 것이 바람직하지만, 유기 용액 또는 혼화성 또는 비혼화성, 즉 이상성 유기/수용성 액체 혼합물을 또한 사용할 수 있다.
본 발명의 입체선택성 효소적 환원 방법을 특히 단리된 효소를 이용하는 경우 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 (NADH)와 같은 보조 인자를 사용하여 수행할 수 있다. 그 후에 NADH는, 예를 들어 재생성하고 재사용할 수 있다. 동일 반응계에서 NADH를 재생성하는 추가의 효소, 예를 들어 포르메이트 탈수소효소 또는 글루코스 탈수소효소를 사용할 수 있다. 적합한 수소 공여체에는 수소 분자, 포르메이트 (예를 들어, 알칼리 금속 또는 암모늄 포르메이트), 글루코스, 하이포아인산염 또는 메틸 비올로겐과 같은 비올로겐 존재하의 전기화학적 환원이 포함된다. 추가의 효소 없이 에탄올 또는 포르메이트를 사용하여 NADH를 재생성하는 것이 또한 가능하다.
출발 화합물 및 배지의 혼합 중량을 기준으로 약 0.2 중량 ％ 내지 약 5 중량 ％의 화학식 II의 화합물을 반응 배지에 첨가하는 것이 또한 바람직하다. 출발 물질의 양에 대한 미생물 접종물은 일반적으로 약 5 중량 ％ 내지 약 30 중량 ％ 세포 농도로, 상기 개시된 시기에 화학식 II의 화합물의 효소적 환원에 제공하기에 충분하다. 제공된 미생물과 함께 상기 개시된 바람직한 반응 파라미터를 이용하는 것은 70 ％가 넘는 반응 수율, 최적으로 99 ％가 넘는 반응 수율, 예상외로 화학식 I의 화합물의 원하는 거울상 이성질체의 93 ％가 넘는 부분입체이성질체 순도, 최적으로 99 ％가 넘는 순도를 제공할 것이다. 본 발명의 환원 방법의 생성물, 즉 화학식 I의 화합물을 단리 및(또는) 정제하기 위한 임의의 적합한 방법, 예를 들어 추출, 증류, 결정화, 칼럼 크로마토그래피 등과 같은 방법으로 회수할 수 있다.
본 발명의 실시에서 다양한 다른 실시양태 및 변형은 명백할 것이고, 상기 개시된 본 발명의 범위 및 의도로부터 벗어나지 않으면서 당업계 통상적인 기술로 쉽게 제조될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 따라서, 본원에 첨부된 청구항의 범위를 상기 기재한 정확한 설명으로 제한하려는 것은 아니나, 청구항은 관련 당업자에 의해 동등물로 간주되는 모든 특징 및 실시양태를 비롯한, 본 발명 내에 있는 특허가능한 신규의 모든 특성을 포함하는 것으로 해석된다. 본 발명을 하기 실험과 관련하여 추가로 개시한다.
실시예 1
입체선택성 효소적 환원: 전(全)세포의 사용-단일 단계 방법
로도코커스 에리스로폴리스 ATCC 기탁번호 제4277호 세포 (1 ml)를 500 ml 플라스크에서 100 ml의 상기 언급한 배지 1에 접종하고 28 ℃ 및 200 RPM의 진탕기에서 22 시간 동안 인큐베이션하였다. 50 개 세포 브로쓰의 pH를 1 M 인산 칼륨 완충용액을 사용하여 pH 7.0으로 맞추었다. 글루코스를 25 mg/ml로 세포 브로쓰에 첨가하고 또한 50 mg의 (1S)-[N-(1-벤질-2-옥소-3-클로로)프로필]카르바민산 t-부틸 에스테르 (기질)를 첨가하였다. 생체전환 (환원)을 28 ℃ 및 200 RPM의 진탕기에서 수행하였다. 미리 결정한 시간에 반응 혼합물을 t-부틸 메틸 에테르와 톨루엔의 60 : 40 혼합물 2 부피로 켄칭하고, 유기상을 분리하고 0.2 ㎛ 필터로 여과하고 수집하였다. 2 ml의 유기상을 질소 스트림하에서 증발시켜 건조하고 잔류물을 아세토니트릴 1 ml에 녹이고, 여과하며 (1S,2S)-[N-(1-벤질-2-히드록시-3-클로로)프로필]카르바민산 t-부틸 에스테르 (생성물)에 대해 HPLC로 분석하였다. 그 결과를 하기 표 1에 요약하였다.
실시예 2
전세포의 사용: 2 단계 방법
이 실시예에서 기질 및 생성물은 실시예 1에 개시한 바와 같다. 로도코커스 에리스로폴리스 ATCC 기탁번호 제4277호 및 로도코커스 에리스로폴리스 DSM 기탁번호 제6971호 (1 ml)의 세포를 500 ml 플라스크에서 100 ml의 상기 언급한 배지 1로 각각 접종하고 25 ℃ 및 280 RPM의 진탕기에서 48 시간 동안 인큐베이션하였다. 100 ml의 각각의 배양물을 발효기에서 혼합한 15 ml의 배지 1로 접종하였다. 25 ℃, 통기 15 LPM (ℓ/분) 및 교반 500 RPM에서 36 시간 동안 발효기에서의 성장을 수행하였다. 세포를 발효기로부터 수확하고 (1S)-[N-(1-벤질-2-옥소-3-클로로)프로필]카르바민산 t-부틸 에스테르 (기질)를 (1S,2S)-[N-(1-벤질-2-히드록시-3-클로로)프로필]카르바민산 t-부틸 에스테르 (생성물)로의 효소적 전환 (생체전환)에 사용하였다. 세포 현탁액을 pH 7.0의 64 mM 인산 칼륨 완충용액 100 ml 중 세포 20 그램을 현탁하여 제조하였다. 각각의 현탁액에 글루코스 25 mg/ml 및 미리 측정한 농도의 기질을 첨가하였다. 기질의 생성물로의 생체전환을 28 ℃ 및 160 RPM의 진탕기에서 수행하였다. 미리 결정한 시간에 반응 혼합물을 켄칭하고 생성물을 수득하고 실시예 1에 개시한 바와 같이 분석하였다. 그 결과를 하기 표 2에 요약하였다.
표 1 및 표 2의 결과는 본 발명의 방법에 의해 높은 수율 및 매우 높은 부분입체이성질체 순도로 원하는 생성물을 수득한다는 것을 입증한다.
실시예 3
생체전환을 위한 각종 미생물 균주의 사용: 전세포
한 계열의 미생물을 이용하여 실시예 1의 방법에 따라 생체전환을 수행하였다. 그 결과를 하기 표 3에 나타내었다.
표 3의 결과는 본 발명의 미생물이 허용가능한 수율, 즉 70 ％가 넘는 수율 및 허용가능한 부분입체이성질체 순도, 즉 90 ％가 넘는 순도로 생성물을 생성시킴을 입증한다.
실시예 4
세포 추출물 및 보조 인자의 사용
본 방법의 기질 및 생성물은 상기 실시예에서와 같다. 로도코커스 에리스로폴리스 ATCC 기탁번호 제4277호의 세포를 상기 개시한 배지 1에서 성장시켰다. 세포 (150 그램)를 pH 7.0의 인산 칼륨 완충용액 100 ml에 현탁시켰다. 세포 현탁액을 13,000 psi 압력의 마이크로플루다이저를 사용하여 4 ℃에서 분해시켰다. 분해된 세포 현탁액을 30 분 동안 12,000 RPM에서 원심분리하였다. 투명한 현탁액 ("세포 추출물")을 기질의 생성물로의 생체전환에 사용하였다.
세포 추출물의 일부 (10 ml)를 기질 10 mg, 글루코스 탈수소효소 (35 단위), 0.7 mM NAD+ (니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드) 및 글루코스 200 mg으로 보충하였다. 반응을 pH 6.0의 pH 스탯 (stat)으로 교반 150 RPM 및 30 ℃에서 수행하였다. 샘플을 반응 배지로부터 주기적으로 회수하고 분석하였다. 95 ％ 수율 및 >98 ％ 부분입체이성질체 순도로 생성물을 수득하였다. 이 실시예에서, NADH 보조 인자를 하기 나타낸 바와 같이 글루코스 탈수소효소, NAD+ 및 글루코스를 사용하여 재생성시켰다.

Claims (15)

  1. 하기 화학식 II의 화합물을, 하기 화학식 II의 (1S)-1-할로-2-옥소-3-(보호된)아미노-4-치환된 부탄의 입체선택성 환원을 촉매할 수 있으며 로도코커스 에리스로폴리스 (Rodococcus erythropolis) ATCC 기탁번호 제4277호, 로도코커스 에리스로폴리스 DSM 기탁번호 제6971호 및 로도코커스 종 ATCC 기탁번호 제21227호, 로도코커스 에리스로폴리스 ATCC 기탁번호 제27854호 및 브레비박테리아 (Brevibacterium) 종 ATCC 기탁번호 제19653호로 이루어진 군 중에서 선택되는 미생물과 상기 환원이 일어나는 조건하에서 접촉시키고, 하기 화학식 I의 (1S,2S)-1-할로-2-히드록시-3-(보호된)아미노-4-치환된 부탄을 회수하는 것을 포함하는 하기 화학식 I의 화합물의 입체선택성 제조 방법.
    <화학식 I>
    <화학식 II>
    상기 식에서,
    Hal은 할로겐이고,
    R은 알킬, 치환된 알킬, 아릴 및 치환된 아릴로 이루어진 군 중에서 선택되고,
    R1은 아미노 관능기에 대한 보호기이다.
  2. 제1항에 있어서, Hal이 염소이고, R이 페닐이며 R1이 t-부톡시카르보닐인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 미생물이 로도코커스 에리스로폴리스 ATCC 기탁번호 제4277호인 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 미생물이 로도코커스 에리스로폴리스 DSM 기탁번호 제6971호인 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 미생물이 로도코커스 종 ATCC 기탁번호 제21227호인 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 미생물이 로도코커스 종 ATCC 기탁번호 제27854호인방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 미생물이 브레비박테리아 종 ATCC 기탁번호 제19653호인 방법.
  8. 제1항에 있어서, 1-단계 발효로 수행하는 방법.
  9. 제1항에 있어서, 2-단계 발효로 수행하는 방법.
  10. 제1항에 있어서, 유도제 존재하에 수행하는 방법.
  11. 제10항에 있어서, 유도제가 상기 미생물을 성장시키는 동안 첨가되는 화학식 I의 화합물인 방법.
  12. 제1항에 있어서, 화학식 I의 화합물이 70 ％ 이상의 수율 및 93 ％ 이상의 부분입체이성질체 순도로 수득되는 것인 방법.
  13. 제10항에 있어서, 화학식 I의 화합물이 95 ％ 이상의 수율 및 99 ％ 이상의 부분입체이성질체 순도로 수득되는 것인 방법.
  14. 화학식의 아릴 에스테르 (이 때, R은 알킬, 치환된 알킬, 아릴 및 치환된 아릴로 이루어진 군 중에서 선택되고, R1은 아미노 관능기에 대한 보호기이고, R2는 수소 또는 니트로이고 페닐 고리의 오르토 또는 파라 위치에서 치환할 수 있음)를 화학식의 관능기를 함유한 황 일리드 화합물 (이 때, R3및 R4는 알킬, 치환된 알킬 및 아릴로 이루어진 군 중에서 선택됨)과 반응시켜 화학식의 중간체 케토 일리드 화합물 (이 때, R, R1, R3및 R4는 상기 정의된 바와 같음)을 생성하고,
    화학식 III의 상기 화합물을 염소원 및 유기 산으로 처리하여 화학식의 1-치환된-2-아미노-3-옥소-4-클로로 부탄 화합물 (이 때, R 및 R1은 상기 정의된 바와 같음)을 형성하고,
    상기 화합물을 환원시켜 화학식의 1-클로로-2-히드록시-3-아미노-4-치환된 부탄 화합물 (이 때, R 및 R1은 상기 정의된 바와 같음)을 형성하고
    상기 히드록시 화합물을 염기와 반응시켜 화학식의 에폭시 화합물 (R 및 R1은 상기 정의된 바와 같음)을 형성하는 것을 포함하는 상기 에폭시 화합물의 제조 방법에 있어서, 상기 1-클로로-2-옥소-3-아미노-4-치환된 부탄의 환원을 제1항에 따라 수행하여 70 ％ 이상의 수율 및 93 ％ 이상의 부분입체이성질체 순도로 상기 1-클로로-2-히드록시-3-아미노-4-치환된 부탄 화합물을 수득하는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제14항에 있어서, 화학식 I의 화합물이 95 ％ 이상의 수율 및 99 ％ 이상의 부분입체이성질체 순도로 수득되는 것인 방법.
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