HU229338B1

HU229338B1 - Stereoselective reduction of substituted oxo-butanes

Info

Publication number: HU229338B1
Application number: HU0300873A
Authority: HU
Inventors: Ramesh N Patel; Linda Chu
Original assignee: Bristol Myers Squibb Holdings Ireland
Priority date: 2000-08-16
Filing date: 2001-07-20
Publication date: 2013-11-28
Also published as: AU2001280698B2; HUP0300873A3; US20020042124A1; PL366098A1; ES2325309T3; EP1309714A1; AU8069801A; US20040058431A1; TWI287579B; IL154376A0; CN1492932A; EP1309714A4; EP1309714B1; WO2002014528A1; BR0113236B1; HUP0300873A2; KR20040031674A; MXPA03001312A; CZ2003758A3; CZ303884B6

Description

(57) Kivonat

A találmány tárgya új eljárás igen nagy disztereomer tisztaságú (2R,3S)-1-halogén-2-hidroxi-3-(védett)amino-4-szubsztituált-butánok előállítására a megfelelő

1-halogén-2-oxo-3-(védett)amino-4-szubsztituált-butánok Rhodococcus és Brevibacterium fajok alkalmazásával történő szelektív, jó kitermeléssel kivitelezhető enzimatikus redukciójával. Az így előállított szubsztituált butánok számos terápiásán hasznosítható hatóanyag, így az angiotenzin konvertáló enzim, renin és HÍV proteázok inhibitoraiként alkalmazható vegyületek szintézisének fontos intermediere.

A találmány tárgya űj eljárás (2P,3S)-ihalogén-z-hidroxi-s-(védettjamíno-4-»zubsztituált butánok előállítására a megfelelő oxovegyúlet sztereoszeiektiv redukciójával. A találmány szerinti eljárással előállított szubsztítuáit butánok a számos terápiásán, hasznosítható molekulában, igy az angíotenzin konvertáló enzim, a renin és a HÍV prcteázek inhibitoraiban jelen levő izoeztér alegység, a (hidroxi-etii)-amin prekurzorai.

Síng-nan 2hou és munkatársai [J. Am., Chem, Soc. 105, a Sietett (1983)] leírtak az L-karnitin — ennek a vegyületnek fontos szerepe van a humán metaboiizmusban és a hosszú szénláneú zsírsavak transzportjában — kemomikrobiológiai szintézisét- Közelebbről meghatározva, a közleményben etil-(4-k.lő.r-acetoacetát 5 Baker-'-féls élesztőgomba (tudományos nevén Saocharomyces oerevisiaeí által történő redukcióját etil-((S)-4-kiór-3~hidroxibatátát] ~tá ismertetik.

Kazutoshi Ushío és munkatársai (Tetrahedron Letters 27(23), 2657-2660 (1933) ] közleményükben β-ketoészterek metanolban tenyésztett élesztőgombával végzett redukciójáról számolnak be., A közleményből megtudhatjuk azt is, hogy ilyen körülmények között a kapott termék az enantiomer felesleg vonatkozásában drámai módón megcáItozfk, mégpedig úgy, hogy a D-izomer irányába tolódik el. Ez a jelenség, ami akkor következik be, ha metanolban tenyésztett élesztőgombát használunk a redukcióhoz, az ilyen tápoldatban tenyésztett élesztőgomba enzimetikus tulajdonságainak tudható be.

Márkus Chr.i.sten és munkatársai ÍJ. Chem. Sec., Chem. Commun,

1588, 264-266] metil -(3, 4-díhi dro -6- í (4 - klór ··· fenil) -tio)-hexanoát} négy sztereóiremetjének a szintézisével — itt a kiralitáscentrum kialakításának knicsiepése egy megfelelő élesztőgombával végzett redukció — kapcsolatban megállapították, hogy bár a β-ketoészterek élesztőgombával történő redukciója igen alaposan tanulmányozott terület, továbbra is nehéz megjósolni a termék vagy termékek abszolút konfigurációját, és különösen nehéz kiszámítani az elérhető enantiomer felesleget.

Antónia Trincone és munkatársai [Biotechnology and Bioengineeríng 35, 559-S64 (1990)j ketonok aszimmetrikus redukcióját itták ie Sulfolobus solfataricus nyugalmi állapotban levő sejtjeivel. Állításuk szerint a megnevezett organizmus nyugalmi állapotban levő sejtjeinek redakálöképessége nagyon nagy mértékben függ attól, hogy a sejtek a sejtciklus melyik fázisában vannak.

Ramesh Patei és munkatársai (Snzyme Microb. Technoi. 13, 906-912 (1991; ] 4, ö-dihídro-4~ (4-metöXi-fenil) -6- (trifluor-metil.) -2H-l~benze.zepin-.2~on sztereospecifikus mikrobiológiai redukcióját Írták le. A. közlemény lényege, hogy a kulcsintermediert, a cisz- (3R) -1,3,4,5-tetrahidro~3~hidroxí ~4~ iá-met oxi-fenil) -6- (trifiuer“matti; -2H-l~benzazepin-2-ont a megfelelő ketonból sztereospecifikus mikrobiológiai redukcióval állítják elő. A szerzők állítása szerint a speciális körülmények megválasztásával sikerült elérniük, hogy a négy lehetséges izomer helyett egyetlen izomert kapjanak, termékként.

Ramesh Patai és munkatársai (Snzyme Ríorob. Technoi. 15,

1019-1021 (1993)) ugyancsak leírták egy diketon, a €~ (benziim. mi-hunen-ut:

fc X fc * fcfcX S * fc * * * . , _Λ * _Λ fcfcfc fcfc * * >

fcfc fc fc ♦ X fc * * * ♦ fc * * fcfcfc * * sztereoszelektív redukcióegyetlen enantiomerét eredΛ

-oxi) -3, S-dioxo-hexánsav-metil-észter ját, ami a megfelelő dihidzoxivegyület ményezte,

Ramesh Patel és munkatársai (Snzyme Microb. Technoi> 14#

731-7.38 (1992)} leírtak egy eljárást# amely szerint Geotríchum candidum. hőkezelésével sikerült javítani a termékként kapott hídroxívegyület optikai tisztaságán# ha β-ketoészfereket ezzel a mi kroor gan 1 zisussa 1. redukál t a k,

Kometani és munkatársai (Journal ef Fermentation and Bioengíneering 80(2), 208-210 <1995}] ezt fedezték fel, hogy élesztőgombával végzett bioredukoiónál az etanol energiaforrásként használható. Baker-féie élesztőgomba esetében vizsgálták az öszszefüggóst az elfogyasztott etanol és a prokirális keton xadukéi ójának a mértéke között# és arra a következtetésre jutottak# hogy az etanol jói használható kirázás alkoholok prokirális ketonokból való nagy léptékű előállításához.

Ramesh Patel és munkatársai ÍÜ.S 5,391,495 számú szabadalmi irat (1995)} bizonyos orocsoportot tartalmazd szuifonamzdszármazekok •mikroorganizmusok vagy a reakciót katalizálni képes enzimek által a megfelelő hidrorivegyüiefékké történő szfereoszeiektiv redukciójára dolgoztak ki eljárást. Az enzimet az oxidoreduktázok vagy dehidrogenázok csoportjából# a mikroorganizmust pedig előnyösen a Hansenula, Rhodooocons és borcardia fajok közül választották.

Sugawa és munkatársai (ö.s. 5,391,495 számú, 1998. március

10-én megadott szabadalmi leírás] közölnek egy eljárást egy • ŐS)-1-halogén-3-amino-9-feniΙ-2-butanon-származék előállítására egy (2R,3S) -•i-halogén-S-amino-é-fenil-^-butan.ol-számazéknak legalább egy, a Canditía, Cryptococcus, Citeromyces, őebaryomyoes, Piohia, Williopsis, Klceckera, Lipcmyces, Rhodosporidium, Rhodotorula, Saccharomycopsis és Wíngea nemzetségekhez tartozó mikroorganizmusok álfal alkotott csoportból kiválasztott mikroorganizmussal való érintkezésbe hozásával.

Ramesh N. tatéi [Siocataiytic Synthesis of Chiral Intermediates fór Antiviral and Antihypertsnsíve Drugs, Journal American Oii Chemical society, vol, 76, No. li, 1275-1281 (1999) j közli (IS)-C3-klór-2~oxo“l~benzil-propii)-karbamídsav-terc-butil-észter sztereoszelektlv mikrcfoiáiis redukcióját (IS, 2R) - (3-kIőr~2-hidroxi···· -1-benzil-propii)-karbamídsav-terc-butii--és2terré.

A találmány bizonyos Hhcdococoos és .Srcvibacteriun fajok alkalmazásával a megfelelő keto-csoport redukciójával egy, a (2R, 53) ~l-haiogén-2-hidroxí~3- (védett) amino···4-szubsztituált-butánok előállítására szolgáló új, sztereoszelektlv eljárásra vonatkozik. A termékeket magas hozammal és kiváló dlasztereomer tisztaságban nyerjük,

A találmány egy előnyős szintézist biztosit az

általános képlete (2R, 3S)U-halegén-2-hidroxi-3- (védett) amino-4-szubsztituáit-butánok — amely képletben

Hal jelentése halogénatom, előnyösen kiöratom;

R jelentése alkil-, szubeztituáit aikii-, aril- vagy szubsztituált. ari.icsopo.rt; és íZ ín/sü.n'Aó-eÁJ

Φ >φ* jelentése amino-védőcsoport — előállítására.

Az (1) általános képlete szubszti teáit petének közt átérnékként hasznosíthatók olyan vegyületek szintézisénél, amelyek a gyógyászatban az ACE, a tenin és ElV-proteázok inhibitoraiként nyernek alkalmazást. Ezeket a HIV-profeázok ellen aktívnak bizonyult vegyületeket az teszi nagyon értékessé, hogy rebrovirusos fertőzések, például az AIDS kezelésére használhatók. Ilyen vegyületeket és alkalmazásukat itták le például az U.S. 1,849,911 számú szabadalmi iratban. Az U.S. 5,849,911 számú szabadalmi iratból egy különösen fontos AlOS-vegyölet, a [33™<3R*,8R*,9Pö, 12RH]~9~ -benzil-3,12-bisz(terc-butil)-8-hidroxi-d, ll-diexo-6-[4-(2-piridii) -benzil]-2,3,6,iö,13-penbaaza-tetradekándisav-dimetil-észter vált ismertté, és ez a vegyület közvetlenül az (1) általános képletü (2R, 33} -l“halogén~2-hidrozi~3~ (védett) amino-4-szabszt i.tuált-butánokfoól szintetizálható. Az a tény, hogy a találmány szerinti eljárás lehetővé feszi az (1) általános képletü szubsztituált fonténők transz-hzR,3S)-enantiemerei.nek nagyon jő kitermeléssel veié előállítását, kiváltképpen fontos eleme a fenti terápiás hatóanyag gazdaságos, hatékony szintézisének.

Itt a leírásban különféle szakkifejezéseket használunk, ezért az alábbiakban megadjuk ezek értelmezését.

Az alkilcsoport kifejezés 1-7, előnyösen 1-4 szénatomos, egyenes vagy elágazó láncú szénhidrogénekből származtatható csoportokra vonatkozik. Rövid széníáncá alkilcsoportnak nevezzük továbbá az 1-4 szénatomos, adott esetben szubsztituált alkilcsoportokat.

X X XX

Szubsztituált alkilcsoport alatt olyan alkíicsoportot értünk, amelynek 1-4 hidrogénatomja helyét valamilyen szehsztituens, például halogénatom, trifluor-metil-, trifincr-rzetoxi-, hidroxi-, alkoxi-, cikloalkii-oxi-, heteroc.ik.lil.-oxi-, oxo-, alkanoii-, aril·, aril-oxi-, aralkil-, a 1 hanoii-oxi amino-, a 1 k i 1 - ami η o -, a r í1-amino-, a ra1ki1-am1no-, c i k 1. oa 1 ki 1 ··· ami no -, heterociklil-amíno- vagy diszubsztituált aminocsoport foglalja ei, Az alkiicsoportra es szubsztituált al ki .'-.csoportra közölt meghatározás értelemszerűen az alkoxicsoportok alkilcsoportjaira is vonatkozik.

Az arilcsoport megnevezés 6-12 gyűrűtag atoxaot tartalmazó mono- vagy bíeíklusos, aromás szsnhidrogencsoportot, például fenil-, naftil-, bifenilil- és difeníicsoportot jelenthet, és ezek mindegyike szubsztituált lehet.

Az aralkilcsoport értelmezésünk szerint egy arilcsoport, amely aikilcsoporton keresztül kapcsolódik a molekula többi részéhez, ilyen például a benzílcsoport,

A szubsztituált. árucsoportként megnevezett csoport olyan arilcsoport, amely 1-4 szufosztituenst hordoz, éa ezek a szubsztituensek a kővetkezőkből kerülhetnek ki; aikil- vagy szabsztítaált alkilcsoport, halogénatom, valamint trifluor-metil-, trif iuor-metoxi-, hidroxi-, alkoxi-, cikloa.lkil-oxi~, heterooiklíi-οχί-, alkanoii-, aikanoii~oxi~_f amino-, alkil-amlno-, d i a 1 k i 1 - ami η o -, a r a 1 ki 1 - amί ηo -, c í k 1 o a i k í i - am i ηo -, h e t e .r o c i k 1 i 1 -amino-, aikanoil-emino-, merkapto-, alkil-tio-, cíkloalkii-tio-, heterocikiii-tio-, ureido-, nitro-, ciano-, karboxi-, karboxi-alkíl-, karbamoil-, alkoxi-karbonii-, aikii-tiokarbcn.il-, aríi7δ. i%0ZB£/&?s2-?Á<í

-tiokarbonll-, slki.i~szulfoni.l-, szulfo.namido- vagy arii-οκΐ-osoport és hasonlók, A szubsztituensek azonfelül maguk is szubsztítuáltak lehetnek, például egy vagy több, a. haiogénatom, hidroxi-, alkil····, alkoxi···, aril···, szubsztituált alkil···, szubszfituált aril- és araiki lesöpörtök közül választható csoporttal.

A halogénatom megnevezés vagy a hal szócska klór-, brőmfluor- vagy jódat omol jelenthet, azonban, előnyösnek a klóratomot tart juk.

Az amino-védöosoport kifejezés a szakterület művelői előtt általánoson ismert értelmezés szerint olyan csoportot jelent, amely egy aminocsoporthoz kapcsolódva meggátolja, hogy a molekula valamely más részén végbemenő reakcióban ez a védett aminocsoport részt vegyen. Előnyős amin-vedőosoport példán! a (tere-butoxi)-karbonil-csoport (BOC), mindazonáltal a szintetikus kémiában használatos amin-védőcsoportok, amelyek általában alkoxi~ka.rbonil-csopo.rtok, igy a (benzi.l~oxi)-karbonil-csoport is megfelelőek.

Az (1) általános képlettel ábrázolt (2R,3S)-l-halogén-2-hidroxí-3-·védett)aminc-4-szufosztituált-foutánok előállítására szolgáló találmány szerinti eljárás kiindulási anyagai az oxo-csoportot tartalmazó megfelelő

nn nemz zom---ή:

általános képlete vegyületek — ahol képletben dal, R és F? a korábban megadott jelentésnek. A (11) általános képleté, vegyületek előállíthatok a szakirodalomban közölt, és a megfelelő képzettφφφ φ * * φφφ φφ segü szakemberek által jól Ismert eljárásokkal. A (11) általános képletü vegyületek előállítására előnyös eljárást közeinek az elbírálás alatt álló Dooket CY55 számú szabadalmi bejelentésben,

Ebben az eljárásban egy

általános képietö arii-éeztert — amelynek képletében R és Η^Λ a korábban megadott jelentésnek, ár jelentése hidrogénatom vagy nitrocsoport, és a feniicsoport o- vagy p~helyzetben szubszrituált lehet — egy kén-iiiddei, azaz egy, a

O CHg™ általános képleté funkciós csoportot tartalmazó vegyülettel egy

Rí .,R3 általános képletü keto~lilédé — a képletekben R és R^: jelentése a korábban megadott, R^J és R⁴ jelentése pedig alk.il-, szubsztituált alkil- vagy arlleeeport — reagálta tana k, majd a kapott keto-ílidet valamilyen kloridionforrásként szolgáló, előnyösen fcázlsos vegyülettel, különösen előnyösen litium-kloridőal és egy szerves savval, például metánszulfonsavvai tovább reagáltatva, a kívánt (11) általános képletü vegyülette alakítják át.

Az (1) általános képletü (2R, 3S)-l-balogén-'ü-nrörozi'· 3- (védett) am.ine-4~szabsztitaáit-batánok rr nennvma-u'se köztirermék ként has zneX X X X X * XX > * '* x ♦ >

» * * >

« X χ χ * X X *

X X χ· X ί«φ»

V * * X

XXX * χ χ * * * χχ x * sithatők olyan vegyületek szintézisénél, amelyek a gyógyászatban az ACE, a renin és HIV-proteázok Inhibitoraiként nyernek alkalmazást, Ezeket a HIV-proteázok ellen aktívnak bizonyult vegyö leteket az teszí nagyon értékessé, hogy retrovirusos fertőzések, például az AIDS kezelésére használhatók, Rátérve az (1) általános képletű (2R, 3S)-i-halogén-z-hidroxi-r- (védett) amíno-4-szubsztltuált-butánökra, ezeket megfelelő bázissal egy

általános képletű megfelelő epoxidda reagáitathatjuk.

A fenti általános képlettel ábrázolt epoxidok olyan köztitermékek, amelyekből a fontos AIDS-vegyület, a [3S-(3F?,8R?,SR*,izék)j-9-benzil-3,12-bisz (tero-bstii) -8-hidroxí-4,11-dioxo-ű- í4~ (2-piridil.) -benzilj-2, 3, 6,10,lu-pentaazs-tetradekándisav-dimetii-észter előái látható, amint azt az V.S. 5,849,911 számú szabadalmi iratban közlik,

A találmány szerint a (11) általános képleté (3S)-l-haiogén-2-hidroxi-3-(védett)amino-4-szubsztítuált bntánok redukálását (2R, 33) ~l~halogén-2-hidröx.i~3- ( védett) amino-4-szufcszt ituáit-butanokká egy oxidoreduktáz enzimmel vagy — előnyösen — egy, a (11) általános képletű ketonok enzimatlkus redukcióját katalizálni képes enzimet termelő mikroorganizmussal végeztetjük. A mikroorganizmus sejtjei lehetnek intakt nedves sejtek vagy száraz, például liofilizált, porlasztva szárított vagy melegen szárított sejtek, továbbá alkalmazhatjuk azokat kezelt, például elroncsolt sejtmassza vagy sejtestraktam, formájában. Ismeretes, hogy bár nagyon sok, a legváltozatosabb körből származó mikroorganizmus termel valamilyen formában oxidoreduktáz enzimet, találmányunkkal unra'.no.;'·<η:

φ φ φ φ φφφφ

Φ Φ X <

kapcsolatos vizsgálódásaink során azt találtuk, hogy csak a Rhodocooous és Srevibacterium fajok katalizál ják a (Ili általános képletű vegyületek redukcióját, tehát csak ezeket alkalmazva állíthatjuk elő a kívánt (22, 36)-l-halogén~2~hidroxi~3~ (védett! amino-4 -szubsztituált-butánokat jó, csaknem 100%-os kitermeléssel és enantiomer tisztasággal. A szóban forgó fajok a kővetkezők: Rhodococcus eryshropolis ATCC 4277; Ahodococcus erythropolls DSR

6971; Róodococeua sp, ATCC 21227; Ancdocoooas erythropolis ATCC 27854? és Srevibacterium sp. ATCC 19653. Az „ATCC betűjel az

American Type Cultare Collection (12301 karklaen Drlve, Rockvlile, Maryland 20852) intézménynél letétbe helyezett adott organizmusnak a letéti számára utal. Hasonló a rendeltetése a „DCM rövidítésnek, jelentése; Deutsche Sammlung far Ricroorganismen, Braunschweig, Germany,

A találmány szerinti enzímatikus redukciót végezhetjük az alkalmazott mikroorganizmus fermentációját követően, kér fázisban megvalósítva a fermentációt és a redukciót, vagy végezhetjük mindkét műveletet, tehát a fementáoiót és a redukciót egyetlen munkafázisban, egyidejűleg. Az utóbbi esetben ügy járunk ei, hogy a mikroorganizmust megfelelő közegben, közelebbről meghatározva nitrogén- és szénforrást tartalmazó közegben tenyésztjük, és amikor a szaporodást kielégítő mértékűnek, találjuk, a tenyészethez adjuk a (II) általános képletű vegyületet, Az enzimatikns redukciót ezután adóig folytatjuk, amig gyakorlatilag a (II) általános képletű vegyület teljes mennyisége átalakul.

A két. műveleti lépést magában foglaló eljárás során a mikroorganizmust először a fent leírtak szerint, megfelelő tápé lantban tenyésztjük, amíg el nem érjük az enzimaktívitás előre megΡ x fotPd határozott mértékét# amikor is a sejteket a szokásos technikai megoldások. valamelyikével ol különítjük, ét megfelelő pof térhatású anyagokat tartalmazó sejtszuszpsnziót készítünk. A szuszpsnzló készítéséhez puffét hatású anyagként foszfát-puffért, különösen kálium-foszfátot# TR'lS-hidrok'loridot, nátrium-acetátot és hasonlókat, közegként pedig vizet használhatunk. Szt követően a (11) általános képlete vegyületet hozzáadjuk a sejtszuszpenziöhoz# és a redukciót addig folytatjuk# amíg a konverzió gyakorlatilag teljessé válik. Mindkét esetben szükséges# hogy a tápközeg, amint fentebb már említettük# megfelelő nitrogén- és szénforrást és nyomelemeket tartalmazzon. Adhatunk a fermentléhez valamilyen indultőrt ís. A megfelelő képzettségű szakember számára nyilván nem igényel különösebb magyarázatot, hogy induktorként olyan vegyületeket használhatunk, ameiyek beindítják vagy fokozzák az enzim, ebben, az esetben egy oxídoreduktáz enzim aktivitását a sejtekben, hogy azok a kívánt terméket állítsák elő. Az (3S) -l“halogén~2-hídroxi-3- -védett; amino-4-szubsztítuá.Ít.-feutánck ilyen induktomak tekinthetők, ha kis mennyiségben a tápoldathoz adjuk, amelyben a mikroorganizmus szaporodik.

A tápközeghez adva megfelelő szénforrásként szolgálhatnak a cukrok, például maifőz, laktóz, glükóz, fruktóz, glicerin szóróit, szacharóz, keményítő, mannát, propilénglikol és hasonlók; a szerves savak és sóik# például nátrinm-aoetát, nátrium-extrát és hasonlók; az aminosavak és sóik, például nátrium-glatamát és hasonlók; és az alkoholok, például etanol, propanol és hasonlók. Megfelelő nitrogénforrásnak tekintjük a következőket; h-2 amin A, kukorieaszirnp, ssőjaliszt, húsextraktum, élssztöextraktnm, melasz, Baker-éiesztŐ, tripton, szőjatáp, pepton, élesztőamin,

7«n.;'m..uu:/Ras-Tk·;

nátrium-nitrát, ammóniám-szeltát ás hasonlók. Ά nyomelemek közül a foszfátokét, valamint a magnézium-, mangán-, kalcium-, kobalt-, nikkel-, vas-, nátrium- és káliumsókat említhetjük. A találmány

szerinti eljáráshoz	megfelelő tápoldat	a	fenti összetevők
csoportjaiból többet	is tartalmazhat.	A	következőkben me
néhány előnyös vize	s tápoldat tömegi-ban	kifejezett össz
lét, anélkül persze,	hogy ezzel bármilyen	módon korlátozni
dékoznánk ezek körét	. A pH-érték minden	esetben 7,0.
	összetevők		Tömeg#
Í-es aasáasö;	halátaextraktam		Iá
	Eiesztóextrsktum		li
	Pepton		li
	Glükóz		2%
2-es számú:	Ma1á ta ex traktum		li
	Elesztöextraktnm		1%
	Pepton		0, 3%
	Glükóz		4 %
3-as számú:	H a1á t ae xtr a ktum		1 %
	Elesztöextraktnm		ii
	Pepton		0,3%
	Glükóz		2i
á-ea számú:	'Malátaextraktum		X o.
	Elesztöextraktnm
	Pepton		·*} C V f s> Ü
	nátri um -szukcinát

Sö/mu-mm-váj ^φ φφφφ φφ**

A lent megadott pH-érték a sterilizálás utáni állapotra vonatkozik. Sterilizálás előtt a pH-t előnyösen 6 és 8 köze, mén előnyösebben 6,5~re állítjuk. Ezután a tápoldatot sterilizáljuk, például ügy, hegy hozzávetőleg 121 '^sC-on tartják 30 percig. A sterilizálást követően állítjuk ne a pK-t 6,5 és 7,5 közötti értékre, előnyösen a pH a sterilizálás után 7,0. A mikrobák tenyésztése es a redukció alatt a ρΗ-t hozzávetőleg 4,0 és 3,0 közötti, előnyösen 6,0 es 8,0 közötti értéken tartjuk. Az imént felsorolt bázisok vagy savanyú sók nagyon jól megfelelnek arra, hogy a tápoldat pH-ját a kívánt értékre állítsuk be.

A reakciőeiegy hőmérséklete biztosítja a redukciós lépéshez szükséges hőenergiát, ezért fontos, hogy olyan hőmérsékleten tartsuk az elegyet, ami elegendő energiát szolgáltat a reakció teljessé válásához. Általában megfelelő, ha a hőmérséklet hozzávetőleg a 25 °C és 50 *€ közötti tartományba esik előnyösen azonban 25 °C és 40 °C között hajtjuk végre a reakciót. A. nyomás nem tűnik meghatározó paraméternek a találmány szerinti eljárásban, ezért elsősorban kényelmi szempontból általában légköri nyomást alkalmazunk.

A találmány szerinti eljárás kivitelezése előnyösen aerob körülmények között történik. A reakoiőelegy keverése és levegőztetése szintén az eljárás fontos eleme, mivel ezek hatására válik a biotranszformációhoz szükséges oxigén hozzáférhetővé, Előnyösen az eljárás kivitelezéséhez rázópalackcs tenyészetet, vagy fermsntortartáiyt használunk a mikroorganizmus szaporításához mind. az egy munkafázisé, mind a két munkafázisé módszer, esetében, A keverést előnyösen 50 és 1000 közötti percenkénti foröu·?€. ’ ve me rne-oZz . . .... η ♦♦.· «♦♦♦

- A A « ** * * * * Ι** / ** > X * »*♦*** *

VAX A* * *« ** *♦ * * lapszámmal végezzük, még előnyösebb azonban ha az 50 és 500 közötti .fordu..lats2ám-tartozián.vban maradunk. A levegőztetést lile™ tőén előnyös, ha a tápoldat térfogatára számítva percenként 0,1™ -ΙΟ térfogategység (v/Vt) levegőt furatunk be, különösen előnyös azonban, ha a befúvatott levegő mennyisége a tápoldatra vonatkoztatva percenként 5 térfogategység.

A (TI) általános képletű vegyüiet teljes átalakításához szükséges idő hozzávetőleg 4-4 8 óra, tipikus esetben 4--24 őre, attól számítva, amikor a (TI) általános képletű vegyületet a fermontléhaz adjuk. Előnyösen a tápoldat vizes oldat, mindazonáltal szerves oldószerek, vízzel elegyedek és nem elegyedék egyaránt, szintén alkstlmasak lehetnek, vagyis használhatunk kétfázisú, szerves oldószeres-vizes rendszereket is.

A találmány szerinti sstereoszelektiv ensímatíkns redukció kivitelezéséhez, különösen olyan esetben, amikor izolált enzimmel dolgozunk, használhatnak kofaktorokat is, például redukált alkotinsavamid-adenin-dinuklootidőt (OADh). A. bAöh-t a folyamat vegén regenerálhatjuk és újból felhasználhatjuk, de eljárhatunk úgy is, hogy további enzimeket, például formiát-dehidrogenázt vagy glükóz-dehídrogenázt adunk a reakcióelegyhez, amikor is ín sün végbemegy az hADH regenerálódása. Megfelelő hidrogéndonor lehet a molekuláris hidrogén, valamilyen hangyasavas só, például egy alkálífém-formiát vagy ammónium-formiát, a glükóz vagy egy hipofőszéit, de valamilyen vioiogén, például metil-vioiogén elektrokémiai redukciójával ugyanazt a hatást érhetjük el. Lehetséges a EADH regenerálása további, enzimek hozzáadása nélkül is, például etanol vagy foraiátok alkalmazásával,

o. mooou

ΧΦΦΦ

X A ί ♦ ♦

Előnyös továbbá, ha a (II) általános képletü vegyületet olyan mennyiségbon adjak a közeghez, hogy a kiindulási vegyülök és a közeg együttes mennyiségére számítva annak mintegy Ö,2-5%át tegye ki. Ahhoz, hogy a mikroorganizmus a (II) általános képletü vegyületet a fent megadott időhatárokon beiül képes legyen redukálni, általában az szükséges, hogy a sejttömeg mennyisége a kiindulási, vegyüietre számítva hozzávetőleg 5 és 30 tömeg! között legyen. A fentebb előnyösnek nevezett reakciöparaméterek mellett igy a mikroorganizmus 70% feletti, előnyösen 99%—os kitermeléssel végzi el az átalakítást, és teljesen váratlanul, a diasztereomer tisztaság meghaladja a 93%-ot, sőt optimális esetben az (Σ) általános képletü vegyület kívánt enantiomere tekintetében a felesleg eléri a 99%-or. A találmány szerinti, redukciós lépes befejeztével a terméket, azaz az (I; általános képletü vegyületet a szokásos műveletekkel, például eatrakoiőval, deszkáiiádéval, kristályosítással, oszlopkromatográfiás eljárással vagy hasonló módon különíthetjük ei, illetve tisztíthatjuk.

1. példa:

drtereoer elekül v eur ima tikos redukció egésr sogfeek sXkslrísEgy 500 ml-es lombikba bekészitünk 100 ml l-es tápoldatót és 1 ml Rhoöococcus srythropolis ATCC 427? sejtinokuiumet, majd a tenyészetet 23 °C~on, 200 percenkénti fordulatszámmsi működő rázoberendezésben 22 órán át inkubáljuk. Ezt követően a. torment lé pH-ját 1 M káiiüm-toszfát-pufferoldattal 7,0···re állítjuk, azután 25 mg/mi glükózt és 50 mg szubsztrátot, íterc-butii)-[<3Ss-N-i1benzll~3-kiőr~2-oxo-propil>-karbarnát]-ot adunk az eiegyhez. A .· .-ve vo?v φφ * # φ * X * ♦ * * ΦΦ « > φ * φ φ * « * * φ φ *♦>

Φ χ. χ 9 *

ΧΦ ΦΦ X* biotranszformáciő (redukció) ideje alatt a reakcióelegyet 28 °C-on, 200 percenkénti fordulatssámmal működő rázőgepen rássfcjuk, és az előre megszabott idő leteltével a reakciót kétszeres térfogatú, 60; 40 arányú (tsrc-butíi)-metil-éter—toiuol oldószerelégy hozzáadásával leállítjuk. A szerves fázist elválasztjuk, 0,2 um porusméretu szúrón megszűrjük, majd 2 ml-t nitrogéngázáramban szárazra párolunk. A páriáéi maradékot feloldjuk 1 mi acetoni.trllben, megszűrjük, és a visszamaradó terméket, amely a várt {terc-buti1} - ((2R, 3$) -N- (l-benzii-2~hfdroxi“3-klór-propil) -karbamát], nagynyomású-folyadékkromatográfiás analízisnek vetjük alá. Az eredményeket as 1. táblázatban foglaltuk össze.

Azfcereoaael«aktív· enzim fciknv redukció e0ss vettek alkalssazáeával két műveleti lépcvőfeeu

A szubsztrát és a termék azonos sz 1. példában megadottakkal. Egy-egy 500 ml-es lombikba bekészitünk 100-100 mi. 1-es tápoldatot és 1 ml Rhodococcus erythropolis ATCC 4277, illetve 1 ml Rhodococcus erythropolis OSd 6971 sejtinokulumot, majd a tenyészeteket 25 ^eC“on., 280 percenkénti fordulatosammal működő résébe™ rendezésben 46 érán át inkuháljuk. Est kővetően mindkét tenyészetből 100 mi-t átvissünk egy-egy fermentorba, és ott la liter 1X *χφφ * Χ*Χ* «X Φ Φ * ’ * φ φ # * *** φ φ *χ * * * * .χφφ φχ ΦΦΦ XX ♦♦ es tápoldattal Összekeverjük. A fermencorban a tenyésztést 25 ®C~ on, 15 liter/perc levegőztetéssel, 500 percenkénti fordulatszámú keverés mellett 36 érán át folytatjuk, majd a sejteket elkülönítjük, és felhasználjuk a (terc-butil) (36) ~N~ (l~bonzil-3-kiér-2-ozo-propil) -kai'bamát] (szubsztrát) (terc-butil) - ((2R, 3S) -R- (.1 -becsi I.-2~-hidrozi~3~kl.ér~propiI) - ka rfoamát ] -tá (termék) történő enzimatikus átalakításához (biotranszformáciő). A sejtszuszpenziót ügy készítjük el, hogy 20 g sejtmasszát 100 ml. 7,0-es pH-jú 64 mM kál iuxa-foszfát-pof feroldatban szuszpendálunk tel. A biotranszformációt 28 '³C-en végezzük, és a mozgatáshoz 160 percenkénti fordulatszámon működé rázőgépet használunk. Az előre megszabott idő leteltével a reakciót az 1. példában megadott módon állítjuk le, és a kapott terméket egyenesek az ott közeiteknek megfelelő analizáljuk. Az eredményeket a 2, táblázatban foglaltuk Össze.

i Mikroorganizmus	Reá kelő idd' (őrsi	szubsztrát óagZml1	Szubsztrát img/sbü	(Termék f'mo/’sl	niasztereomer tisztaság dd
EhoöOCOCCUS	20	1,0	0	0, .3 8	>83
erythrapolis	32	-v	0, 02	4,8	>83
ATCC 4277	iá	10	0,05	3, 05	>83
Rhodococcus	20	1	0	0, 85	>38
erythropolis	24	8	0	4,83	>88 1
pSM 8571	4 6	10	0	8,2	>88 (

A 2.. és 3. táblázatban bemutatott eredmények bizonyítják, hogy a találmány szerinti eljárással a kívánt terméket nagyon jő kitermeléssel kapjuk, és a disztereomer tisztaság csaknem 1001-os>

Claims

tólönböaid míJkxafeafcdrxaajkfeal, ^gész sajfeek aááutlmszá .eével

Az 1. példában leírtak szerint eljárva egy sor mikroorganizmust megvizsgáltunk a találmány szerinti biotrsnszformáolö szempontjából. Az eredményeket a 3. táblázatban foglaltuk össze.

3. táblázat

Ϊ bikroorgasiszuir Aznaosito jel Stussztráfe iAg/nií Xitentóás Cl.) Olasztareumer tisztázás 68.3 Agrobaererinm. tusi faeiens ATCC 33970 1 25, 4 75, 6 Brevibacteríum sp. ATCC l$i€53 ·.<· 105 03,0 Hansenuia anucala ATCC 8170 1 31,8 76,2 Aansanuia anoaala ATCC 58044 1 33, 1 >08 Hansenula polymorpha ATCC 34438 1 37,6 •c n ··; ·· ,, <0 Hansenula polyampha ATCC 26012 1 6,1 >08 Osnsensla safcurnus ATCC 16762 1 35,1 >08 iFseuóomonas cepacia ATCC 20851 1 5,2 i i Pseuóomonas species ATCC 202027 1 5,1 i 54-ogococous erythropolis ATCC 4277 ·'> A. 74,2 > 0 : Pbodococoss ei'ythrgpolis ATCC 27864 7 7,7 >08 bhoOoeoccus erythropoiis ATCC 25544 2 61,1 >08 Phodococcas erytúránál is D5M 6071 9 100 >08 Ph<xk>coecu.s erythrnnol i s DSM 6077 ··> 72,5 >08 Phodoooccus maris ATCC 35015 9 16,6 >98 iRboöooooous rhoöocozous ATCC 11347 0 6 6,2 61,9 Rhodoeoueus rhouoooccus ACC 2 3.107 9 14,0 ξ

“U U-íO./SS/RAS-TÁ.?

Rhodococcus species ATCC 15592 9 91,2 >96 Rhodococcus species ATCC 29573 ··> 3 2,5 >98 Ϊ Rhodococcus species AT<X 21227 100 >98 Rhodococcus species RRX 21146 42,7 >98 Rhodo;;:occus species ATCC 13071 .·> 1.4, 3 - Rhodococcus species ATCC 21226 2 56, 6 >98 Trichodezma viriade ATCC 20536 1 e Ά· »?*,* f <·,· >98

Λ 3. táblázatban bemutatott adatok bizonyítják, hogy a taláimány szerinti mikroorganizmusokkal elfogadható, 70% feletti kitermeléssel állíthatjuk alá a terméket., és a dias ztereemer tisztaság is elfogadható, meghaladja a áut-ot,

Sej toxtraktus és kobalt.ex alkalsissása

A szubsztrát és a termék azonos az előző példákban megadottakkal, Rhodococcus erythropolis ATCC 4277 sejteket az előzőekben leírtak szerint 1-es tápoldatban tenyésztünk majd ISO g sejtmasszát 100 ab. 7,0~es pB-ju kalíum-foszfát-puíferoidatban szuszpendálunk fel. A sejteket ezután 4 ^öC-cn, egy mlkrofluldisátor segítségével, 908 bar nyomáson abroncsoljuk, és az elroncsolt sejteket tartalmazó szuszpenzíót 12000 percenkénti fordulatszámmal 20 percig centrifugáljuk, A tiszta felülűszőt (sejtextr.aktom) használjuk a szubsztrát bíotranszformációjához, hegy megkapjuk a kívánt terméket, mi sejtextraktumhoz 10 mg szubsztrátot, 35 egység glükóz-dehidrogenázt, 0,7 mb nikotinsavamid-adenin-dinukleotidot (RÁD*) <z .•«c/rs/íozOAz és 200 mg glükózt adunk. A reakció állandó, 6,0~os pK-ertéken, percenként 150 fordulatszámú keverés mellett, 30 ^fiC~on megy végbe. Meghatározott időszakonként az elegybői mintát veszünk, és azt analizáljuk. A terméket igy 95%~os kitermeléssel kapjuk, a diasztereemer tisztaság meghaladja a 98%-ot. Ebben a példában a NADH kofaktor regenerálását glükéz-dehidrogenáz, HADI és glükóz hozzáadásával valósitjuk meg, amint azt az alábbi ábra mutatja.

Rhodococéut törzs

Szubsztrát >* Termék

NAD

NADH

Glükóz

Glükonsav

(X) _s « fc fcfc# fcfcfcfc

XX fcfcfcfc

Sztereoszelektív eljárás ez

ÖH általános képletü (zE, 3S)-l-halcgén-2-hídroxi-3- (védett) ami no--4~

-azubsztituáit-británok — a képletben Hal jelentése halogénatom?

E jelentése alkil-, szubsztituált alkil-# aril- vagy szubsztituált arilcsoport? és

P? jelentése amino-védőcsoport — előállítására, aszal jellemezve, hogy egy

RlHN^xXV' általános képlete {33}-l~halogén-2-ezo~3~(védett;amino-4-szabsztituált bntánt — amelynek képletében Hal, E és E^; jelentése a fent megadott — egy, a (XT) általános képletü vegyületek sztereoszelektív redukcióját katalizálni képes, a Rhodococcus erythropolís ATCC 4277# .Rhodococcus erythropolís DSb 6971, Rhodococcus sp. ATCC 21227, Hhodococcos erythropolís ATCC 27354 és brevibacterium sp, ATCC .19533 közül választott mikroorganizmussal az adott redukcióhoz megfelelő reakciókörülmények között redukálunk, majd a keletkezett (1) általános képletü vegyületet kinyerjük.

7. Az 1, igénypont szerinti eljárás# azzai jellemezve# ·?δ. .· :0,00 00000:

hogy a képletben Hal jelentése kiér atom, R jelentése fen11csoport, es R^; jelentése terc-butoxi-karboníl-csoport,

3. Az 1. igénypont szerinti eijárás, azzal jellemezve, hogy az eljárást agy műveleti lépcsőből álló fermentációként hajtjuk végre.

4. Az '1. igénypont szerinti eijárás, azzal jellemezve, hogy az eljárást két műveleti lépcsőből alté fermentációként hajtjuk végre.

igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az eljárást agy indákkor jelenlétében hajtjuk végre.

6, Az 5. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az induktor egy (1; általános képletű vegyület, amelyet a mikroorganizmus tenyésztése közben adagolunk,

Ά Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az (1) általános képletű vegyüíetet legalább 70%-os kitermeléssel és legalább 93%~os diasztereomer tisztasággal kapjuk,

8. Az 5« igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az (I) általános képleté vegyületek legalább 95%-os kitermeléssel és legalább 99%~os diasztereomer tisztasággal kapjuk.

A meghatalmazott:

ö káhue-yí Zabáé zaba: áseüsgíVie? Oa-yvPOi Zevb;