JPH089984A - ベンズアゼピンおよびベンゾチアゼピン誘導体の微生物による還元 - Google Patents

ベンズアゼピンおよびベンゾチアゼピン誘導体の微生物による還元

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JPH089984A
JPH089984A JP3081465A JP8146591A JPH089984A JP H089984 A JPH089984 A JP H089984A JP 3081465 A JP3081465 A JP 3081465A JP 8146591 A JP8146591 A JP 8146591A JP H089984 A JPH089984 A JP H089984A
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reductase
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hydrogen
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JP3081465A
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Ramesh N Patel
ラメッシュ・エヌ・パーテル
Laszlo J Szarka
ラシュロ・ジェイ・シャルカ
Richard H Mueller
リチャード・エイチ・ミューラー
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Bristol Myers Squibb Co
ER Squibb and Sons LLC
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Bristol Myers Squibb Co
ER Squibb and Sons LLC
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Abstract

(57)【要約】 【目的】 好ましいエナンシオマーと好ましくないエナ
ンシオマーとの混合物としてではなく、好ましいｄ−シ
スエナンシオマーを主として得る。 【構成】 式： 【化１】 で示される基質を式： 【化２】 で示される化合物に転換する方法であって、該基質をレ
ダクターゼまたはレダクターゼを供給する微生物で処理
することを特徴とする方法。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は心臓血管剤の化学的中間
体の製造方法、さらに詳しくはベンズアゼピンおよびベ
ンゾチアゼピン誘導体の中間体の製造方法に関する。
【０００２】
【発明の構成と効果】ベンズアゼピンおよびベンゾチア
ゼピン誘導体の多くが、血管拡張活性などを有している
(例えば、米国特許第４７７４２３９号、同第４７６７
７５６号、同第４７７１０４７号、同第４６９４００２
号、同第４７５２６４５号、同第４７４８２３９号、お
よび同第４５８４１３１号各明細書参照)。有用なベン
ズアゼピンおよびベンゾチアゼピン化合物を式：
【化９】 ［式中、および本明細書を通じて、Ｘ1は−ＣＨ2−また
は−Ｓ−; アセチル、アリール、アルケニル、アルキニル、アリー
ルアルキル、−ＳＲ9、−Ｎ3、−ＮＨ2、
【化１０】 Ｘ1が−ＣＨ2−であるとき、Ｒ2は水素、
【化１１】
【化１２】 Ｘ1が−Ｓ−であるとき、Ｒ2は水素、
【化１３】 Ｒ3,Ｒ4およびＲ5はそれぞれ独立して、水素、ハロゲ
ン、アルキル、アルコキシ、アリールオキシ、アリール
アルコキシ、ジアリールアルコキシ、アリールアルキ
ル、シアノ、ヒドロキシ、アルカノイルオキシ、ニト
ロ、 ロアルキル)アルコキシ、−ＮＯ2、−ＮＸ4Ｘ5、−Ｓ
(Ｏ)m・アリール、 Ｒ6は水素、アルキル、アセチル、アリール、アリール
アルキルまたは−ＮＲ7Ｒ8；Ｒ7およびＲ8はそれぞれ独
立して、水素、アルキル、シクロアルキルまたはアリー
ルアルキル、もしくはＲ7とＲ8はそれらが結合する窒素
原子と合してアゼチジニル、ピロリジニル、ピペリジニ
ルまたはモルホリニル;Ｒ9はアシル、アルキル、アリー
ルまたはアリールアルキル；Ｒ10およびＲ11は共に酸
素、あるいはＲ10が水素で、Ｒ11がヒドロキシ；Ｒ12は
水素、ヒドロキシ、アルキル、アリール、アリールアル
キル、−Ｏ−アルキル、−Ｏ−アリールまたは−Ｏ−ア
リールアルキル；Ｒ13は水素、アルキル、シクロアルキ
ルまたはアリールアルキル;Ｒ14はヘテロシクロまたは
ヘテロアリール；Ｘ2は酸素、イオウ、またはＲ6が−Ｎ
Ｒ7Ｒ8であるとき、単結合；Ｘ3は酸素またはイオウ；
Ｘ4およびＸ5はそれぞれ独立して、水素、アルキル、ア
ルカノイル、アリール Ｘ6はヒドロキシ、アルコキシ、アリールオキシ、アミ
ノ、アルキルアミノまたはジアルキルアミノ;Ｘ7はアル
キル、アルコキシまたはアリールオキシ；Ｙ1およびＹ2
はそれぞれ水素もしくはアルキル、またはＹ1は水素で
Ｙ2はアルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリ
ールもしくはシクロアルキル、またはＹ1とＹ2はそれら
が結合する炭素原子と合してシクロアルキル;Ｙ3は水
素、アルキル、アルカノイル、アルケニル、アリールカ
ルボニル、ヘテロアリールカルボニル、または−Ｃ−Ｎ
Ｒ7Ｒ8；Ｙ4およびＹ5はそれぞれ独立して、水素、アル
キル、アリールまたはアリールアルキル、ただし、Ｙ4
とＹ5が共に存在するときは、それらは共に水素ではな
く、さらにＹ4とＹ5が共に同一炭素原子に結合するとき
は、それらのいずれもが水素ではない；Ｙ6は水素、ヒ
ドロキシ、アルコキシ、アリールオキシまたはアラルコ
キシ；ｍは０，１または２；ｎまたはｎ’は０，１，２
または３；およびｑは１〜５の整数]で示すことができ
る。
【０００３】化合物（Ｉ）「化９」の具体例として、
式：
【化１４】 および式：
【化１５】 が挙げられる。上記の具体例の化合物もまた米国特許第
４９０２６８４号などに記載されている。
【０００４】化合物（Ｉ）におけるベンズアゼピン核の
３位および４位の炭素原子、およびベンゾチアゼピン核
の２位および３位の炭素原子は不斉炭素原子である。従
って、化合物（Ｉ）はエナンシオマーおよびジアステレ
オマー、およびそれらのラセミ混合物の形状で存在す
る。それらの全ては化合物（Ｉ）の範囲に含まれる。ｄ
−シス配列の化合物（Ｉ）が最も効力が強く、好まし
い。
【０００５】本明細書を通じて、語句の定義は、他の特
別な場合に限定されない限り、以下の通りである。「ア
ルキル」および「アルコキシ」とは、直鎖および分枝鎖
基の両方を指称する。炭素数１〜１０の基が好ましい。
「アルケニル」および「アルキニル」とは、直鎖および分
枝鎖基の両方を指称する。炭素数２〜１０の基が好まし
い。「アリール」とは、フェニルおよび置換フェニルを指
称する。置換フェニルの具体例は、アミノ(−ＮＨ2)、
アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ニトロ、ハロゲ
ン、ヒドロキシル、トリフルオロメチル、アルキル(炭
素数１〜４)、アルコキシ(炭素数１〜４)、アルカノイ
ルオキシ、カルバモイルまたはカルボキシルから選ばれ
る１、２または３個の置換基で置換されたフェニルであ
る。「ヘテロアリール」とは、環中に少なくとも１個のヘ
テロ原子を有する芳香族複素環基を指称する。好ましい
基は、ピリジニル、ピロリル、イミダゾリル、フラニ
ル、チエニルまたはチアゾリルである。
【０００６】「ヘテロシクロ」とは、環部分のヘテロ原
子の数が４個以下ならば、環原子に１または２個の酸素
原子あるいはイオウ原子、および／または１〜４個の窒
素原子を含有する、飽和ないし不飽和の５または６員環
基を指称する。このヘテロ環は結合可能な炭素原子で結
合する。「ヘテロシクロ」には、上記の酸素原子、イオ
ウ原子または窒素原子を含有する５または６員環がベン
ゼン環に縮合しているジ環式基も含まれ、該ジ環式基
は、ベンゼン環中の結合可能な炭素原子で結合する。さ
らに「ヘテロシクロ」には、結合可能な炭素原子が：炭
素数１〜４の低級アルキル、炭素数１〜４の低級アルキ
ルチオ、炭素数１〜４の低級アルコキシ、ハロ、ニト
ロ、ケト、シアノ、ヒドロキシ、アミノ、−ＮＨ−アル
キル［アルキルの炭素数は１〜４］、−Ｎ（アルキル）
2［アルキルの炭素数は１〜４］、−ＣＦ3、ＮＣＳまた
はＯＣＨＦ2、で置換されたモノ環式あるいはジ環式基
も含まれる。また「ヘテロシクロ」には、２〜３個の結
合可能な炭素原子が、メチル、メトキシ、メチルチオ、
ハロ、ＣＦ3、ニトロ、ヒドロキシ、アミノおよびＯＣ
ＨＦ2から選ばれる置換基を有するモノ環式あるいはジ
環式基も含まれる。
【０００７】「シクロアルキル」とは、炭素数３、４、
５、６または７の基を指称する。「ハロゲン」および「ハ
ロ」とは、弗素、塩素、臭素、ヨウ素およびトリフルオ
ロメチルを指称する。「フルオロ置換アルキル」および
「フルオロ置換アルコキシ」とは、１個以上の水素が弗素
原子で置換された上述のアルキルおよびアルコキシを指
称する。かかる基の具体例は、トリフルオロメチル、
２,２,２−トリフルオロエチル、ペンタフルオロエチ
ル、フルオロメトキシ、ジフルオロメトキシ等である。
「アルカノイル」とは、式:
【０００８】式(Ｉ)で示される化合物は、下記のように
して調製することができる。すなわち、まず式(ＩＩ)：
【化１６】 で示される２−ニトロトルエン化合物を式(ＩＩＩ)：
【化１７】 [式中、Ｙはアルキルである]で示されるマロン酸ベンジ
リジン化合物と反応させる。この反応は、強塩基(たと
えば、水素化ナトリウムなど)の存在下、極性非プロト
ン溶媒(たとえば、ジメチルホルムアミドなど)中で行
い、式(ＩＶ)：
【化１８】 で示される化合物を得る。
【０００９】化合物(ＩＶ)を還元して式(Ｖ)：
【化１９】 で示される対応化合物を得る。この還元反応は、接触水
素化(たとえば、触媒としてパラジウム／炭素を用い
て)、または化学的還元剤(たとえば、硫酸第一鉄や塩化
第一錫など)を用いて行うことができる。
【００１０】式(Ｖ)のアミン化合物を、アルカリ金属ア
ルコキシド(たとえば、ナトリウムメトキシドなど)およ
びアルコール(たとえば、メタノールなど)で処理する
か、またはテトラヒドロフランやトルエンなどの溶媒中
のヘキサメチルジシルアジドで処理して式(ＶＩ)：
【化２０】 で示される対応ベンズアゼピン化合物を得る。
【００１１】式(ＶＩ)の化合物をテトラヒドロフランな
どの溶媒中、低温にて水素化リチウムアルミニウムなど
の還元剤と反応させて式(ＶＩＩ)：
【化２１】 で示される対応化合物を得る。
【００１２】ついで、化合物(ＶＩＩ)を塩基(たとえ
ば、ピリジンなど)の存在下、ｐ−トルエンスルホニル
クロライドまたはメタンスルホニルクロライドと反応さ
せて式(ＶＩＩＩ)：
【化２２】 で示される化合物を得る。
【００１３】化合物(ＶＩＩＩ)を室温にて溶媒(たとえ
ば、ジクロロメタンやジメチルホルムアミドなど)の存
在下、塩基と反応させて式(ＩＸ)：
【化２３】 で示される対応化合物を得る。
【００１４】ついで、化合物(ＩＸ)を不活性溶媒(たと
えば、ジメチルスルホキシドなど)中、水素化アルカリ
金属(たとえば、水素化ナトリウムなど)で処理した後、
式(ＩＸ')： Ｒ2−ハロゲン (ＩＸ') で示される化合物と反応させて式(Ｘ)：
【化２４】 で示される化合物を得る。
【００１５】化合物(Ｘ)を３位で有効に還元できれば、
式(ＸＩ)：
【化２５】 で示される有用な中間体を得ることができる。
【００１６】従来は、化合物(ＸＩ)は、式(ＸＩＩ)：
【化２６】 で示される化合物の脱カルボキシル化により、たとえば
化合物(ＸＩＩ)を熱ピリジン中、過剰のヨウ化リチウム
で処理することにより得ることができた(米国特許第４,
７４８,２３９号参照)。この方法では、化合物(ＸＩ)と
その異性体である式(ＸＩ')：
【化２７】 で示される化合物との混合物が得られる。
【００１７】式(Ｉ)の化合物は、化合物(ＸＩ)および
(ＸＩ')から米国特許第４,５８４,１３１号、同第４,７
４８,２３９号、同第４,７５２,６４５号、同第４,６９
４,００２号、同第４,７７１,０４７号、同第４,７６
７,７５６号および同第４,７７４,２３９号各明細書に
記載されているようにして調製することができる。式
(Ｉ)の化合物の別の調製法が、米国特許出願第２０８,
５２１号(１９８８年６月２０日出願)、同第３５３,８
０６号(１９８９年５月２２日出願)(米国特許第４,９０
２,６８４号)および同第３３４,０２５号(１９８９年４
月６日出願)各明細書に記載されている。Ｘ1が−Ｓ−で
ある化合物については、米国特許第４,５８４,１３１号
および同第４,６９４,００２号各明細書参照。
【００１８】化合物(ＸＩ)は一層強いｄ−シス配置にあ
るので、化合物(ＸＩ')よりも好ましい。それゆえ、化
合物(ＸＩ)を主として調製する方法は、有用な技術を提
供するものである。
【００１９】本発明に従い、化合物(ＸＩ)の新規な製造
方法が開示される。本質において、化合物(Ｘ)をレダク
ターゼを含む微生物または微生物から単離したレダクタ
ーゼで処理して対応する化合物(ＸＩ)を得る。本発明の
好ましい態様においては化合物(Ｘ)においてＲ2は水素
であり、該化合物(Ｘ)をまず本発明に従って微生物また
は酵素で処理し、ついで、さらに反応させてＲ2が化合
物(ＩＡ)および(ＩＢ)中に示される基である化合物を得
る。
【００２０】本発明の方法は、立体特異的な生成物が得
られるという利点を有する。従来技術とは異なり、本発
明の方法では、好ましいエナンシオマーと好ましくない
エナンシオマーとの混合物ではなく、好ましいｄ−シス
エナンシオマー(化合物(ＸＩ))が主として得られる。本
発明の他の利点は、多工程化学合成と比較して化合物
(Ｘ)を１工程で化合物(ＸＩ)に立体特異的に還元すると
いうことである。転換反応を周囲温度および圧力で触媒
すれば、高変換(９８％)および所望のエナンシオマーが
９９％を越える高エナンシオマー純度が得られる。
【００２１】以下、本発明をさらに詳しく説明する。本
発明の方法は、単一段階または２段階の発酵および転換
により行うことができる。単一段階法においては、使用
する微生物を炭素および窒素源を含有する適当な培地中
で増殖させる。この微生物培養液に化合物を加え、完全
な変換が得られるまで化合物(Ｘ)の化合物(ＸＩ)への転
換を続ける。２段階法では、第一段階において微生物を
発酵により適当な培地中で増殖させて所望のレダクター
ゼ活性を示すようにする。細胞を適当な緩衝溶液中に懸
濁して細胞懸濁液を調製する。化合物(Ｘ)を上記微生物
細胞懸濁液と混合し、化合物(Ｘ)の化合物(ＸＩ)への転
換を微生物細胞懸濁液により触媒させる。この反応は、
ほぼすべての化合物(Ｘ)が化合物(ＸＩ)に転換されるま
で続ける。
【００２２】転換中に炭素源を加えてもよい。微生物の
増殖の間に化合物(Ｘ)を誘導物質として加えてもよい。
微生物または微生物に由来するレダクターゼは、遊離の
形態または支持体上に固定化して用いることができる。
【００２３】本発明の方法に使用する代表的な微生物に
は、細菌、酵母および真菌からの属が含まれる。微生物
の代表的な属としては、アクロモバクター(Achromobact
er)、アシネトバクター(Acinetobacter)、アクチノマイ
セス(Actinomyces)、アルカリゲネス(Alcaligenes)、ア
ースロバクター(Arthrobacter)、アゾトバクター(Azoto
bacter)、バシラス(Bacillus)、ブレビバクテリウム(Br
evibacterium)、コリネバクテリウム(Corynebacteriu
m)、フラボバクテリウム(Flavobacterium)、メチロモナ
ス(Methylomonas)、マイコバクテリウム(Mycobacteriu
m)、ノカルジア(Nocardia)、シュードモナス(Pseudomon
as)、ロドコッカス(Rhodococcus)、ストレプトマイセス
(Streptomyces)、キサントモナス(Xanthomonas)、アス
ペルギルス(Aspergillus)、カンジダ(Candida)、フザリ
ウム(Fusarium)、ゲオトリクム(Geotrichum)、ハンゼヌ
ラ(Hansenula)、クロエクケラ(Kloeckera)、ペニシリウ
ム(Penicillium)、ピシア(Pichia)、リゾプス(Rhizopu
s)、ロドトルラ(Rhodotorula)、サッカロミセス(Saccha
romyces)、トリコデルマ(Trichoderma)およびロドシュ
ードモナス(Rhodopseudomonas)などが挙げられる。
【００２４】好ましい微生物の例としては、アースロバ
クター・シンプレックス(A.simplex)、ノカルジア・グ
ロベルラ(N.globerula)、ノカルジア・レストリクタ(N.
restricta)、ノカルジア・サルモニカラー(N.salmonico
lor)、ロドコッカス・ファシアンス(R.fascians)、ロド
コッカス・ロドクロウス(R.rhodochrous)、マイコバク
テリウム・バッカ(M.vacca)、ノカルジア・メディテラ
ネイ(N.meditteranei)、ノカルジア・アウトトロフィカ
(N.autotrophica)、ロドコッカス・エクイ(R.equi)、ア
ースロバクター・パラフィネウス(A.paraffineus)、ハ
ンゼヌラ・ポリモルファ(H.polymorpha)およびカンジダ
・アルビカンス(C.albicans)などが挙げられる。
【００２５】本発明者らはまた、微生物を生細胞、凍結
乾燥細胞または熱乾燥細胞として遊離の状態で使用し得
ることを見いだした。物理的吸着または包括により支持
体上に固定化した細胞もまた、本発明の目的に用いるこ
とができる。
【００２６】培地は微生物細胞の増殖に必要な栄養分を
供給する。増殖用の代表的培地は、必要な炭素源、窒素
源、および微量元素を含んでいる。炭素源の例として
は、マルトース、乳糖、ブドウ糖、果糖、グリセロー
ル、ソルビトール、ショ糖、デンプン、マンニトールな
どの糖類；酢酸ナトリウム、クエン酸ナトリウムなどの
有機酸；グルタミン酸ナトリウムなどのアミノ酸；エタ
ノール、プロパノールなどのアルコールなどが挙げられ
る。
【００２７】窒素源としては、Ｎ−ＺアミンＡ、トウモ
ロコシ浸漬液(corn steep liquor)、ダイズ粉、牛肉
エキス、糖密、パン酵母、トリプトン、ニュートリソイ
(nutrisoy)、亜硝酸ナトリウム、硫酸アンモニウムなど
が挙げられる。微量元素としては、リン酸塩およびマグ
ネシウム塩、マンガン塩、カルシウム塩、コバルト塩、
ニッケル塩、鉄塩、ナトリウム塩、およびカリウム塩な
どが挙げられる。
【００２８】代表的な好ましい培地を下記に挙げる。培地１ ： 塩Ａ溶液： Ｋ2ＨＰＯ4 １０ｇ ＫＨ2ＰＯ4 １０ｇ 蒸留水 １００ｍｌ 塩Ｂ溶液： ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ４ｇ ＮａＣｌ ０.２ｇ ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０.２ｇ ＭｎＳＯ4・５Ｈ2Ｏ ０.２ｇ 蒸留水 １００ｍｌ 組成： ブドウ糖 １５ｇ (ＮＨ4)2ＳＯ4 １０ｇ 酵母エキス １０ｇ Ｎ−ＺアミンＡ １０ｇ ＣａＣＯ3 ５ｇ 塩Ａ溶液 ５ｍｌ 塩Ｂ溶液 ５ｍｌ 水道水 １ｌ容量
【００２９】培地２ ： 組成： ブドウ糖 ２０ｇ 酵母エキス １０ｇ マルトースエキス １０ｇ ペプトン １ｇ 水道水 １ｌ
【００３０】本発明の方法の効率は、使用する基質の初
期量および本発明の方法の間に基質を加えるタイミング
および量の両方により影響される。基質の添加は、１段
階発酵法における増殖細胞または２段階発酵／転換法に
おける微生物の細胞懸濁液による転換過程の間に、バッ
チ様式で１〜１２時間毎に、または連続的に行うことが
できる。
【００３１】培地のｐＨは、微生物の増殖の間、および
転換過程中に４.０〜９.０、好ましくは６.０〜８.０に
維持する。転換過程を行うための微生物細胞の懸濁液を
調製するため、トリス−ＨＣｌ、リン酸塩、酢酸ナトリ
ウムなどの緩衝液を用いることができる。
【００３２】反応混合物の温度は、転換過程に利用でき
る熱エネルギーを評価する。反応温度の維持により、転
換過程に充分なエネルギーを利用できることが保証され
る。約１５〜６０℃、好ましくは約３５〜５０℃の温度
が転換反応に最も適している。
【００３３】反応混合物の撹拌および通気は、１段階法
および２段階法における微生物の増殖の間の震盪フラス
コ培養液または発酵タンク中での転換反応の間に利用で
きる酸素の量に影響を与える。撹拌は、５０〜１０００
ｒｐｍが好ましいが、５０〜５００ｒｐｍが最も好まし
い。１分間当たり、培地１容量当たり、約１〜５容量の
空気の通気(すなわち、１〜５ｖ/ｖｔ)が好ましい。
【００３４】最適反応時間は、最初に基質(化合物(Ｘ))
を微生物で処理してから化合物(Ｘ)を化合物(ＸＩ)に完
全に変換するまでの時間として、１２〜１６８時間、好
ましくは４８〜９６時間である。
【００３５】化合物(Ｘ)から化合物(ＸＩ)への転換はま
た、微生物から単離したレダクターゼによっても行うこ
とができる。微生物からレダクターゼを単離する方法の
例は、実施例１の方法ＩＩＩおよびＩＶに記載してあ
る。
【００３６】化合物(Ｘ)および(ＸＩ)においてＸ1が−
ＣＨ2−である場合は、化合物(ＸＩ)を式(ＸＩＩＩ)：
【化２８】 (式中、Ｌはハロゲンまたはトシルオキシ(トシルオキシ
が好ましい)などの脱離基である)で示される化合物と反
応させて化合物(Ｉ)においてＲ2が式：
【化２９】 で示される化合物(たとえば、化合物(ＩＢ))を得ること
ができる。化合物(Ｉ)または(ＸＩ)はまた常法によって
アシル化して、化合物(Ｉ)においてＲ1が式：
【化３０】 で示される化合物(たとえば、化合物(ＩＡ))を得ること
もできる。
【００３７】つぎに、本発明の方法を下記実施例に基づ
いてさらに詳しく説明する。これら実施例は、本発明の
方法の実施および支持データを提供するものである。こ
れら実施例は本発明を限定することを意図するものでは
ない。特に断らない限り、温度はすべて℃である。
【００３８】実施例１ (３Ｒ−シス)−１,３,４,５−テトラヒドロ−３−ヒド
ロキシ−４−(４−メトキシフェニル)−６−(トリフル
オロメチル)−２Ｈ−１−ベンズアゼピン−２−オン：
本方法における基質は、４,５−ジヒドロ−４−(４−メ
トキシフェニル)−６−(トリフルオロメチル)−１Ｈ−
１−ベンズアゼピン−２,３−ジオンである。この基質
の構造は下記の通りである。
【化３１】
【００３９】所望の生成物の構造は下記の通りである。
【化３２】
【００４０】方法Ｉ 細菌培養液として、シュードモナス・アエルギノーサ
(S.aeruginosa)ＡＴＣＣ２５６１９、シュードモナス・
プチダ(S.putida)ＡＴＣＣ２３９７３、アシネトバクタ
ー・カルコアセチクス(A.calcoaceticus)ＡＴＣＣ３３
３０５、アルカリゲネス・エウントロフス(A.euntrophu
s)ＡＴＣＣ１７６９７、マイコバクテリウム・バッカＡ
ＴＣＣ２９６７８、ロドコッカス・ファシアンスＡＴＣ
Ｃ１２９７５(ノカルジア・サルモニカラーＳＣ６３１
０)、ロドコッカス・ロドクロウスＡＴＣＣ２９６７
０、１５９０６、１４３４９、１３８０８、１２９７
５、９９９、１５５９２、２９６７５、２１２４３およ
び１９１５０を用いた。酵母培養液として、ハンゼヌラ
・ポリモルファＡＴＣＣ２６０１２、サッカロミセス・
セレビシエ(S.cerevisiae)ＡＴＣＣ１２３４１、ピシア
・パストリス(P.pastoris)ＡＴＣＣ２８４８５、カンジ
ダ・ルゴサ(C.rugosa)ＡＴＣＣ１０５７１およびカンジ
ダ・ユーチリス(C.utilis)ＡＴＣＣ２６３８７を用い、
所望の生成物への基質の転換を行った。
【００４１】微生物を液体窒素中のバイアル中に保持し
た。接種物の通常の生育のため、一つのバイアルを５０
０ｍｌ容フラスコ中の培地１または培地２(１００ｍｌ)
中に接種し、２８〜３０℃、シェーカー上の２５０〜３
００ｒｐｍにて２４〜４８時間インキュベートした。微
生物の増殖後、培地(１００ｍｌ)を入れた５００ｍｌ容
フラスコ中に培養液(１０ｍｌ)を接種し、２８〜３０
℃、シェーカー上の２５０〜３００ｒｐｍにてインキュ
ベートした。
【００４２】種々の微生物(第１表)を培地１中、２８〜
３０℃、シェーカー上の２５０〜３００ｒｐｍ(１分間
当たりの回転数)にて４８〜７２時間インキュベートし
た。細胞を回収し、トリス−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ６.８
中に懸濁した。１０％(ｗ／ｖ)生細胞懸濁液を調製し
た。細胞懸濁液に基質(２００μｇ／ｍｌ)を加え、３０
℃、２５０ｒｐｍにて２４時間転換を行った。試料を取
り出し、酢酸エチルで５回抽出した。遠心分離後に酢酸
エチル層を回収し、窒素下に蒸発させた。得られた乾燥
残渣をメタノール中に溶解し、高圧液体クロマトグラフ
ィー(ＨＰＬＣ)により分析して基質および生成物の同定
を行った。クロマトグラフィーの条件は下記のようであ
った。
【００４３】カラム：ホワットマンパーチシル(Partisi
l)５−ＯＤＳ−３ 移動相：０.３ｍＭ Ｎａ2ＥＤＴＡ・２Ｈ2Ｏ、３５％
アセトニトリル、２０％メタノールを含有する０.０５
Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液の４５％(酢酸でｐＨ５.０に調
節) 流速：１ｍｌ／分 検出器：ダイオードアレイ(ヒューレット・パッカード
(Hewlett Packard))２４０ｎｍ
【００４４】２つのエナンシオマーをＨＰＬＣによりベ
イカーボンドキラルフェース(Bakerbond Chiral phas
e)ＤＮＢＰＧ(ベイカー・ケミカル(Baker Chemical C
o.,)、フィリップスバーグ、ＮＪ)上で分離した。条件
は下記の通りであった。
【００４５】移動相：１０／９０、２−プロパノール／
ヘキサン 流速：２ｍｌ／分 圧力：３０気圧 検出：２５４ｎｍ 注入容量：１０μｌ 上記キラルＨＰＬＣにより、所望の生成物(構造式ＸＩ
Ａ)が同定された。
【００４６】２つのエナンシオマーをＨＰＬＣ分析によ
りベイカーボンドキラルセル(Bakerbond Chiralcel)Ｏ
Ｄカラム(ベイカー・ケミカル、フィリップスバーグ、
ＮＪ)上でも分離した。条件は下記の通りであった。移
動相：１０／９０、２−プロパノール／ヘキサン 流速：１ｍｌ／分 圧力：３０気圧 検出：２３０ｎｍ 注入容量：１０μｌ クロマトグラフィーの間、移動相を絶えず撹拌した。
【００４７】本発明者らの分析結果によれば、すべての
微生物が基質を所望の生成物に変換することが示され
た。ロドコッカス・ファシアンスＡＴＣＣ１２９７５
(ノカルジア・サルモニカラーＳＣ６３１０)が、基質か
ら所望の生成物への変換が最良であった(９７％；第１
表)。
【００４８】第１表 a 微生物 生成物 (化合物ＸＩＡ、μg/ml) 変換率(％) シュードモナス・アエルギノーサ ４ ２ ＡＴＣＣ２５６１９ シュードモナス・プチダ ５ ２.５ ＡＴＣＣ２３９７３ シュードモナス・オレオボランス ４.５ ２.２５ (S.oleovolans)ＡＴＣＣ２９３４７ アシネトバクター・カルコアセチクス ６ ３ ＡＴＣＣ３３３０５ アースロバクター・シンプレックス １５６ ７８ ＡＴＣＣ６９４９ ロドコッカス・ファシアンスＡＴＣＣ １９４ ９７ １２９７５(ノカルジア・サルモニカラー ＳＣ６３１０) アルカリゲネス・エウントロフス ８０ ４０ ＡＴＣＣ１７６９７ マイコバクテリウム・バッカ １７６ ８８ ＡＴＣＣ２９６７８ ロドコッカス・ロドクロウス １３４ ６７ ＡＴＣＣ２９６７０ ロドコッカス・ロドクロウス １２８ ６４ ＡＴＣＣ１５５９２ ロドコッカス・ロドクロウス ２２ １１ ＡＴＣＣ１５９０６ ロドコッカス・ロドクロウス ３０ １５ ＡＴＣＣ１４３４９ ロドコッカス・ロドクロウス ８９ ４４.５ ＡＴＣＣ１３８０８ ロドコッカス・ロドクロウス ６９ ３４.５ ＡＴＣＣ９９９ ロドコッカス・ロドクロウス ４９ ２４.５ ＡＴＣＣ２９６７５ ロドコッカス・ロドクロウス ５８ ２９ ＡＴＣＣ２１２４３ ロドコッカス・ロドクロウス １７ ８.５ ＡＴＣＣ１９１５０ ハンゼヌラ・ポリモルファ ６５ ３２.５ ＡＴＣＣ２６０１２ サッカロミセス・セレビシエ ５５ ２７.５ ＡＴＣＣ１２３４１ ピシア・パストリスＡＴＣＣ２８４８５ ４０ ２０ カンジダ・ルゴサＡＴＣＣ１０５７１ ２５ １２.５ カンジダ・ユーチリスＡＴＣＣ ６７ ３３.５ ２６３８７ (注)ａ：「ＡＴＣＣ」はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションを、「Ｓ Ｃ」はイー・アール・スクイブ・アンド・サンズ・インコーポレイテッドの培養 コレクションを表す。
【００４９】方法ＩＩ 方法ＩＩの基質および生成物は方法Ｉと同じであった。３８０Ｌ発酵器中でのロドコッカス・ファシアンスＡＴ
ＣＣ１２９７５(ノカルジア・サルモニカラーＳＣ６３
１０)の増殖 ：培地１または培地２を含有する３８０Ｌ
発酵器中、２８℃、２５０ｒｐｍにてロドコッカス・フ
ァシアンスＡＴＣＣ１２９７５(ノカルジア・サルモニ
カラーＳＣ６３１０)の増殖を行った。増殖期中の２２
時間後に実施例１からの基質(ジメチルホルムアミド(１
１０ｍｌ)中に５.０ｇ)を加え、増殖を続けた。基質添
加後の培地のｐＨは６.８〜７.０に維持した。対数４４
時間後に細胞を回収し、遠心分離後、細胞ペーストを種
々のバッチから回収した。使用するときまで細胞を４℃
または−２０℃で貯蔵した。細胞試料の一部を真空下、
３５℃で熱乾燥させた。
【００５０】基質の生成物への転換 シェークフラスコ培養転換 上記バッチからの細胞を、５〜２０％(ｗ／ｖ)生細胞濃
度にて０.２Ｍトリス−塩酸(トリスＨＣｌ)緩衝液、ｐ
Ｈ７.２中に懸濁した。シェーカー上、２５０ｒｐｍに
て、２８℃、３７℃および４５℃で転換を行った。リア
クターの容量は、５００ｍｌ容フラスコ中で１００ｍ
ｌ、または２５０ｍｌ容フラスコ中で５０ｍｌであっ
た。定期的に試料を２〜５容量の酢酸エチルで抽出し、
ＨＰＬＣアッセイにより所望の生成物への転換について
分析した(第２表)。温度上昇は、変換効率を高めた。
【００５１】３８０Ｌ容発酵器中での転換 上記バッチからの細胞はまた、１０〜２０％(ｗ／ｖ)の
細胞濃度で３８０Ｌ発酵器中で転換するのにも用いた。
転換は、０.１Ｍトリス−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ７.２中、
１２５〜２５０ｒｐｍで２５℃にて行った。絶えず撹拌
および通気を行いながら、基質(ジメチルホルムアミド
(３０ｍｌ)中に６.２５ｇ)を細胞懸濁液(２５Ｌ)に加え
た。転換中のｐＨは６.５〜７.５に維持した。定期的に
試料を酢酸エチルで抽出し、ＨＰＬＣシステムにより分
析した。その結果を第３表に示す。
【００５２】第２表 (細胞懸濁液による転換；ロドコッカス・ファシアンスＡＴＣＣ１２９７ ５(ノカルジア・サルモニカラーＳＣ６３１０))(a) 温度(℃) 生成物(化合物ＸＩＡ；μｇ/ｍｌ) 転換％ ２８ ６９４ ５３ ３７ １１８１ ９１ ４５ １２６６ ９７
【００５３】(注)(ａ)細胞を培地１または培地２上で２
４時間増殖させた。基質(化合物ＸＡ、１００μｇ／ｍ
ｌ)を対数２４時間にて加え、対数４８時間にて細胞を
回収した。細胞ペーストを０.１Ｍトリス−ＨＣｌ(ｐＨ
７.２；６００ｍｌ)中に懸濁させた。１０％(ｗ／ｖ)の
生重量細胞濃度を調製し、５００ｍｌ容フラスコ中に入
れた１００ｍｌリアクター容量中、シェーカー上の２５
０ｒｐｍにて転換を行うのに用いた。初期基質濃度は１
３００μｇ／ｍｌであった。
【００５４】第３表 (ロドコッカス・ファシアンスＡＴＣＣ１２９７５(ノカルジア・サルモニ カラーＳＣ６３１０)の２５Ｌ細胞懸濁液中での基質の生成物への転換)(a) 反応時間(時) 基質(化合物XA； 生成物(化合物XIA； 転換％ μｇ／ｍｌ) μｇ／ｍｌ) ０(細胞懸濁液) ２２ ４０ ０(細胞懸濁液＋基質) ２００ ４１ １５ ２２５ １２５ ３９ １２０ １９０ ６３ ８４ ２２６ ９９ ９１ １５ ３１０ １１５ ５ ３０１ (注)(ａ)０.１Ｍトリス−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ７.２中に細胞懸濁液(２５Ｌ；１ ７％(ｗ／ｖ)、生重量細胞)を含有する３８０Ｌ容発酵器中、２５℃で転換を行 った。基質(化合物ＸＡ、ジメチルホルムアミド(３０ｍｌ)中に６.２５ｇ)は、 ２５０μｇ／ｍｌの濃度にて供給した。
【００５５】回収に際して、細胞懸濁液(約２１Ｌ)を５
容量の酢酸エチルで抽出した。代表的なバッチ中の酢酸
エチル濃縮物には生成物(５.９９ｇ)が含まれており(第
４表)、これをさらに精製し、ＭＳ、ＣＤおよびＨＰＬ
Ｃシステムで特徴付けて化合物のエナンシオマー純度を
決定した。単離した生成物および標準生成物試料を質量
分光分析により分析した。ＭＳ分析によれば、単離した
生成物は標準化合物と同じであることが確認された。
【００５６】第４表 (所望生成物の回収)(a) バッチ 回収 酢酸エチル濃縮物 光学純度(％) 反応時間(時) 容量(Ｌ) 化合物ＸＩＡ(ｇ) ＸＰ０２２１ １１５ ２１ ５.９９ ９９.７ (注)(ａ)３８０Ｌ容発酵器中で第２表に記載したようにして転換を行った。回収 に際して、細胞懸濁液(２１Ｌ)を５容量の酢酸エチルで抽出し、酢酸エチル濃縮 物を所望の生成物の回収について分析した。
【００５７】単離生成物の絶対配置をキラルカラム上の
ＣＤ分析およびＨＰＬＣ分析(２つのエナンシオマーを
分離した)により割り当てた。２つのエナンシオマーの
ＣＤスペクトルは、お互いに鏡像にあることを示した。
生物学的に単離した生成物は、所望のエナンシオマー生
成物と同じＣＤスペクトルを示した。２５８ｎｍにおけ
る正のＣＤ値は炭素−３原子が(Ｒ)−配置にあることを
意味し、２５８ｎｍにおける負のＣＤ値は炭素−３原子
が(Ｓ)−配置にあることを意味した。対照的に、２７５
／２８０ｎｍ系における正のＣＤ値は炭素−４原子が
(Ｓ)−配置にあることを意味し、２７５／２８０ｎｍ系
における負のＣＤ値は炭素−４原子が(Ｒ)−配置にある
ことを意味した。
【００５８】最後に、標準生成物および単離生成物をキ
ラルカラム上のＨＰＬＣ分析にかけ、微生物により製造
された生成物が確かに９９％を越える光学純度の所望の
エナンシオマーであることが確認された。酵素転換反応
から回収した生成物は、所望の標準生成物と同様の２２
３℃の融点、[α]D＋１２８.２〜１３２°を示した。
【００５９】種々のバッチからの細胞の評価 種々のバッチから回収したロドコッカス・ファシアンス
ＡＴＣＣ１２９７５(ノカルジア・サルモニカラーＳＣ
６３１０)の細胞の評価を、１００ｍｌ容の反応器中、
３７℃、シェーカー上、２５０ｒｐｍで行った。細胞の
増殖を３８０Ｌ容の発酵器中、培地１中で４０〜６０時
間行い、シャープレス(Sharples)遠心管により回収し、
細胞ペーストを回収した。細胞を０.２Ｍトリス−ＨＣ
ｌ緩衝液(ｐＨ６.８)中に懸濁し、この細胞懸濁液に基
質(１６００μｇ／ｍｌ)を加えた。上記のようにして５
００ｍｌ容フラスコ中で転換を行った。定期的に試料を
取り出し、酢酸エチルで抽出し、ＨＰＬＣ分析により評
価した。その結果を第５表に示す。
【００６０】種々の炭素源の評価 ロドコッカス・ファシアンスＡＴＣＣ１２９７５(ノカ
ルジア・サルモニカラーＳＣ６３１０)におけるレダク
ターゼ酵素の合成に対する種々の炭素源の影響を評価す
るため、培地１を用いた。
【００６１】ブドウ糖の代わりに種々の炭素源(ブドウ
糖、マルトース、乳糖、グリセロール、酢酸ナトリウ
ム、エタノール、果糖、ショ糖、ソルビール)を加えた
培地１を用い、ロドコッカス・ファシアンスＡＴＣＣ１
２９７５(ノカルジア・サルモニカラーＳＣ６３１０)を
増殖させた。培地(１００ｍｌ)を含有する５００ｍｌ容
フラスコ中で細胞を増殖させた。培地２中で２６時間増
殖させた培養液を接種物として用いた。０.５％接種物
を用い、培養液を２８℃、２８０ｒｐｍにて増殖させ
た。数時間後に遠心分離により細胞を回収し、０.２Ｍ
トリス−ＨＣｌ緩衝液(ｐＨ７.２)中に２０％ｗ／ｖの
細胞濃度にて懸濁した。基質(２５０μｇ／ｍｌ)を細胞
懸濁液に加え、転換を４５℃、２８０ｒｐｍにて２時間
行った。
【００６２】分析結果の示すところによると、ロドコッ
カス・ファシアンスＡＴＣＣ１２９７５(ノカルジア・
サルモニカラーＳＣ６３１０)の細胞懸濁液による基質
の生成物への転換は、炭素およびエネルギー源としてマ
ルトース、果糖、ソルビールおよびショ糖を用いたとき
に高い活性が得られた(第６表)。
【００６３】第５表 (所望の生成物への転換についての種々のバッチからのロドコッカス・フ ァシアンスＡＴＣＣ１２９７５(ノカルジア・サルモニカラーＳＣ６３１０)の評 価)(a) バッチ 生成物分析(化合物ＸＡ、μｇ／ｍｌ) 変換率(％) ２４時間 ４８時間 ６６時間 １１５時間 ＨＮＰＦ０４０５１ ４１１ １２８４ １５００ − ９４ ＸＰ０４０２７１ ２０１ ４００ ７５６ １５５５ ９７ ＸＰ０５２５１ − ９１５ １５００ − ９４ ＸＰ０５２５２ ４７３ ７８１ １３１６ − ８２ (注)(ａ)培地１(２５０Ｌ)を入れた３８０Ｌ容発酵器中で細胞を増殖させ、４４ 時間後に細胞を回収した。トリス−ＨＣｌ緩衝液(ｐＨ６.８)中の細胞懸濁液(２ ０％ｗ／ｖ生細胞)を、５００ｍｌ容フラスコ中、１００ｍｌリアクター容量で 評価した。基質(化合物ＩＸＡ；１６００μｇ／ｍｌ)を加えた後、３７℃、シェ ーカー上、２８０ｒｐｍにて転換を行った。
【００６４】第６表 (ロドコッカス・ファシアンスＡＴＣＣ１２９７５(ノカルジア・サルモニ カラーＳＣ６３１０)のレダクターゼ合成に対する種々の炭素源の評価)(a) 炭素源 生成物合成(化合物ＸＡ；μｇ/時/ｇ乾燥細胞重量) １.５％ブトウ糖 ７８０ １.５％マルトース ７７５ １.５％乳糖 ５３５ １.５％グリセロール ３００ １.５％クエン酸ナトリウム ４３５ １.５％エタノール ４７５ １.５％果糖 ５１９ １.５％ショ糖 ２４３ １.５％ソルビトール ４９４ (注)(ａ)対数４０時間で表示した種々の炭素源を含有する培地１中、２８℃、２ ８０ｒｐｍにて細胞を増殖させた。細胞を回収し、０.２Ｍトリス−ＨＣｌ(ｐＨ ７.０)中に２０％ｗ／ｖの細胞濃度にて懸濁した。基質(化合物ＩＸＡ、２５０ μｇ／ｍｌ)を加え、４５℃、２８０ｒｐｍにて２時間転換を行った。比活性を 、合成された生成物(化合物ＸＡ)のμｇ／時／ｇ乾燥細胞重量として表した。
【００６５】方法ＩＩＩ 方法ＩＩＩでは、方法Ｉと同じ基質を用い、同じ生成物
を製造した。発酵器中でのロドコッカス・ファシアンスＡＴＣＣ１２
９７５の増殖 培地１(２５０Ｌ)を入れた３８０Ｌ容発酵器中でロドコ
ッカス・ファシアンスＡＴＣＣ１２９７５培養液を増殖
させた。増殖は、接種物の成育および発酵の各段階から
なっていた。
【００６６】接種物の成育 接種物の成育はＦ１段階およびＦ２段階からなってい
た。Ｆ１段階では、ロドコッカス・ファシアンスＡＴＣ
Ｃ１２９７５培養液の凍結バイアルを培地２(２％ブド
ウ糖、１％酵母エキス、１％マルトースエキス、および
０.１％ペプトン含有)中に接種した。増殖は、５００ｍ
ｌ容フラスコ中、２８℃、２８０ｒｐｍにて４８時間行
った。Ｆ２段階では、Ｆ１段階の培養液(１００ｍｌ)を
４Ｌ容フラスコ中の培地２(１.５Ｌ)中に接種し、２８
℃、１８０ｒｐｍにて２４時間インキュベートした。培
地Ａ(２５０Ｌ)を入れた発芽器にＦ２段階の接種物(１.
５Ｌ)を接種し、２８℃、１５０ｒｐｍ、２００ＬＰＭ
(Ｌ／分)の通気にて２４時間増殖させた。
【００６７】発酵 培地１(２５０Ｌ)を入れた発酵器に発芽器増殖させた接
種物(１３Ｌ)を接種した。発酵を、２８℃、２５０ｒｐ
ｍ、および２００ＬＰＭ通気およびｐＨ６.８〜７.０に
て４０時間行った。発酵器中での増殖２２時間後に誘導
物質として化合物ＸＡ(ジメチルホルムアミド(３０ｍ
ｌ)中に５ｇ)を加えた。発酵の間の細胞の比活性を決定
するため、培養ブロース(２００ｍｌ)から遠心分離によ
り細胞を定期的に回収した。０.１Ｍリン酸緩衝液(ｐＨ
６.８)中で細胞懸濁液を調製し、化合物ＸＡ(２５０μ
ｇ／ｍｌ、ジメチルホルムアミド中)を加えた。１２５
ｍｌ容フラスコ中、２５ｍｌの反応容量、３７℃、２８
０ｒｐｍにて２時間生物転換を行った。定期的に、化合
物ＸＡの化合物ＸＩＡへの転換についてＨＰＬＣにより
試料を分析した。比活性は、生成した化合物ＸＩＡのμ
ｇ／時／ｇ乾燥細胞として表した。発酵４０時間後、シ
ャープレス遠心管の助けを借りて細胞を回収し、生細胞
ペーストを回収し、使用するときまで−６０℃にて貯蔵
した。各発酵から生細胞ペースト(約８ｋｇ)を回収し
た。
【００６８】細胞抽出物の調製 ０.１Ｍリン酸緩衝液(ｐＨ６.８)中のロドコッカス・フ
ァシアンスＡＴＣＣ１２９７５の細胞懸濁液(２０％ｗ
／ｖ、生細胞)を４℃にて超音波処理にて粉砕した。粉
砕した細胞懸濁液を１５,０００×ｇにて１５分間遠心
分離にかけて細胞の破片を除いた。ここでは上澄み液を
細胞抽出物と称する。
【００６９】硫酸アンモニウム分画 ４℃にて絶えず撹拌しながら、上記細胞抽出物に硫酸プ
ロタミン溶液(２０ｍｌ、０.１Ｍトリス−ＨＣｌ中の２
％溶液)を滴下した。３０分間放置した後、抽出物を１
５,０００×ｇにて１５分間遠心分離にかけた。酵素活
性を有する上澄み液を４℃にて段階的に固体硫酸アンモ
ニウムで分画して３０％、５０％、７０％および９０％
飽和を得た。各分画後に得られた沈殿(たとえば、０〜
３０％、３０〜５０％、５０〜７０％、および７０〜９
０％飽和)を１５,０００×ｇにて１５分間遠心分離にか
けて回収し、５０ｍＭリン酸緩衝液(ｐＨ６.８)に溶解
し、４℃にて同緩衝液中で１６時間透析して硫酸アンモ
ニウムを除いた。
【００７０】細胞抽出物による化合物ＸＡの転換 粗製の細胞抽出物、硫酸プロタミン上澄み液および硫酸
アンモニウム画分を用い、化合物ＸＡ(４００μｇ／ｍ
ｌ)添加後、２５℃、９０ｒｐｍにて化合物ＸＡの化合
物ＸＩＡへの転換を触媒させた。定期的に試料を取り出
し、２容量の酢酸エチルで抽出した。遠心分離後、酢酸
エチル層を回収し、窒素下で乾燥させた。得られた油状
残渣をメタノール中に溶解し、０.２μｍＬＩＤ／Ｘフ
ィルターで濾過し、ＨＰＬＣにより分析した。細胞画分
中のタンパク質をバイオラドアッセイにより測定した。
比活性を、１時間当たり、タンパク質１ｇ当たりに化合
物ＸＡから得られた化合物ＸＩＡのμモルとして定義し
た。
【００７１】方法ＩＶ ロドコッカス・ファシアンスＡＴＣＣ１２９７５の増殖
および化合物ＸＡの転換：方法ＩＶでは、方法Ｉと同じ
基質を用い、同じ生成物を生成させた。ロドコッカス・
ファシアンスＡＴＣＣ１２９７５培養液を、方法ＩＩＩ
に記載と同様にして３８０Ｌ容発酵器中で増殖させた。
種々のバッチから回収した細胞を、化合物ＸＡから化合
物ＸＩＡへの転換について評価した。化合物ＸＡ(１６
００μｇ／ｍｌ)を添加後、２０％ｗ／ｖ細胞懸濁液(１
００ｍｌ)を入れた５００ｍｌ容フラスコ中、３７℃、
２８０ｒｐｍにて反応を行った。転換６６〜１１５時間
後、化合物ＸＡから化合物ＸＩＡへの９４〜９８％の変
換率が得られた。キラルＨＰＬＣによると、化合物ＸＩ
Ａの光学純度は９８〜９９％であった。
【００７２】上記バッチからの細胞を用い、上記と同様
にして細胞抽出物を調製し、ついで硫酸プロタミンで処
理した。種々の画分を用いて化合物ＸＡから化合物ＸＩ
Ａへの転換を行った。その結果を第７表に示す。化合物
ＸＩＡの転換を触媒する酵素の約８倍の精製が得られ
た。
【００７３】第７表 (ロドコッカス・ファシアンスＡＴＣＣ１２９７５からのレダクターゼ酵 素の精製および化合物ＸＡの化合物ＸＩＡへの変換)画分 活性 容量 全活性 タンハ゜ク質 全タンハ゜ク 比活性 回収 化合物XIA (ml) 化合物XIA (mg/ml) 質(mg) (μモル/時/ (％) (μモル/ml) (μモル) mg) 細胞抽出物 66.4 670 44500 3.75 2512 4.380 100 硫酸フ゜ロタミン 88.3 500 44159 3.0 1500 7.356 99 処理 硫酸アンモニウム 416 72 29948 3.2 230 32.52 67.3 処理 (0■30%飽和) 種々の画分による化合物ＸＡの化合物ＸＩＡへの転換は、化合物ＸＡ(４００ μｇ／ｍｌ)添加後、２５℃、９０ｒｐｍにて１時間行った。
【００７４】実施例２ [３Ｒ−[１(Ｓ＊),３α,４α]]−３−(アセチルオキシ)
−１,３,４,５−テトラヒドロ−４−(４−メトキシフェ
ニル)−１−(２−ピロリジニルメチル)−６−(トリフル
オロメチル)−２Ｈ−１−ベンズアゼピン−２−オン、
一塩酸塩：方法Ｉ Ａ．[３Ｒ−[１(Ｓ＊),３α,４α)]−１−(ベンジルオ
キシカルボニル−２−ピロリジニル)メチル]−３−ヒド
ロキシ−１,３,４,５−テトラヒドロ−４−(４−メトキ
シフェニル)−６−(トリフルオロメチル)−２Ｈ−１−
ベンズアゼピン−２−オン：
【００７５】(３Ｒ−シス)−３−ヒドロキシ−４−(４
−メトキシフェニル)−６−(トリフルオロメチル)−１,
３,４,５−テトラヒドロ−２Ｈ−１−ベンズアゼピン−
２−オン(０.８ｇ、２.３ミリモル)をジメチルホルムア
ミド(２３ｍｌ)中の水素化ナトリウム(０.０６６ｇ、
２.７ミリモル)の懸濁液に加えた。室温にて１時間後、
Ｓ−１−(ベンジルオキシカルボニル)−２−(ブロモエ
チル)ピロリジン(０.９７ｇ、３.４ミリモル)を加え
た。この反応混合物を６５℃にて２.５時間加熱し、つ
いで、水素化ナトリウム(０.０２８ｇ、１.１４ミリモ
ル)およびＳ−１−(ベンジルオキシカルボニル)−２−
(ブロモメチル)ピロール(０.３３ｇ、１.１４ミリモル)
をさらに加えた。６５℃でさらに１時間後、混合物を冷
却し、ついで水で希釈し、酢酸エチルで３回抽出した。
酢酸エチル抽出物を集め、１０％塩化リチウム水溶液
(硫酸マグネシウムで乾燥)で洗浄し、濃縮した。得られ
た粗製の残渣をシリカゲルカラム上のクロマトグラフィ
ーにかけ、ヘキサン中の２０〜４０％酢酸エチルで溶離
して標記化合物(０.８ｇ)を得た。
【００７６】Ｂ．[３Ｒ−[１(Ｓ＊),３α,４α]]−３−
アセトキシ−１−(１−ベンジルオキシカルボニル−２
−ピロリジニル)メチル]−１,３,４,５−テトラヒドロ
−４−(４−メトキシフェニル)−６−(トリフルオロメ
チル)−２Ｈ−１−ベンズアゼピン−２−オン：ジクロ
ロメタン(２０ｍｌ)中の[３Ｒ−[１(Ｓ＊),３α,４α)]
−１−(ベンジルオキシカルボニル−２−ピロリジニル)
メチル]−３−ヒドロキシ−１,３,４,５−テトラヒドロ
−４−(４−メトキシフェニル)−６−(トリフルオロメ
チル)−２Ｈ−１−ベンズアゼピン−２−オン(１.１４
ｇ、１.８５ミリモル)および無水酢酸(０.８７ｍｌ、
０.２４ミリモル)の溶液に、Ｎ,Ｎ−ジメチルアミノピ
リジン(０.４５ｇ／３.７ミリモル)を加えた。この混合
物を室温にて４日間撹拌し、シリカゲル(６０メッシュ)
中に吸収させ、シリカゲルカラム上のフラッシュクロマ
トグラフィーにかけた。ヘキサン中の１０〜４０％酢酸
エチルで溶離して標記化合物(０.６８ｇ)を粘性油状物
として得た。
【００７７】Ｃ．[３Ｒ−[１(Ｓ＊),３α,４α])−３−
(アセチルオキシ)−１,３,４,５−テトラヒドロ−４−
(４−メトキシフェニル)−１−(２−ピロリジニルメチ
ル)−６−(トリフルオロメチル)−２Ｈ−１−ベンズア
ゼピン−２−オン、一塩酸塩：メタノール(１０ｍｌ)中
の１０％パラジウム／炭素(０.０５ｇ)および[３Ｒ−
[１(Ｓ＊),３α,４α]]−３−アセトキシ−１−(１−ベ
ンジルオキシカルボニル−２−ピロリジニル)メチル]−
１,３,４,５−テトラヒドロ−４−(４−メトキシフェニ
ル)−６−(トリフルオロメチル)−２Ｈ−１−ベンズア
ゼピン−２−オン(０.４８ｇ、０.７３ミリモル)の懸濁
液にギ酸アンモニウム(０.２３ｇ、３.６４ミリモル)を
一度に加えた。この混合物を還流下に３０分間加熱し、
ついで冷却し、セライトで濾過した。残留した固体を酢
酸エチルで洗浄した。濾液を濃縮して白色の泡を得、こ
れをエーテル中に溶解し過剰のエーテル塩酸溶液で処理
した。この溶液を濃縮し、トルエン／ヘキサンから結晶
化させて標記化合物(０.３２５ｇ)をオフホワイトの固
体として得た。融点：２１７〜２１９℃。[α]D＝＋７
８.７°(ｃ＝１.０、メタノール)。 元素分析値(Ｃ25Ｈ27Ｆ3Ｎ2Ｏ4ＨＣｌ．０.２９Ｈ2Ｏと
して)： 計算値(％)：Ｃ５８.０６、Ｈ５.３７、Ｎ５.４２、Ｃ
ｌ６.９６、Ｆ１１.０２ 実測値(％)：Ｃ５８.３７、Ｈ５.５７、Ｎ５.５４、Ｃ
ｌ７.０５、Ｆ１０.５８
【００７８】方法ＩＩ Ａ．１−[(フェニルメトキシ)カルボニル]−Ｌ−プロリ
ン：反応温度を１〜３℃に保つような速度にて、ＣＢＺ
Ｃｌ(１３００ｍｌ)およびＨ2Ｏ(１７００ｍｌ)中のＮ
ａＯＨ(３４６.５ｇ)の溶液を、Ｈ2Ｏ(３５００ｍｌ)中
のＬ−プロリン(１０００ｇ)およびＮａＯＨ(３４６.５
ｇ)の０℃溶液に滴下した。Ｌ−プロリン／ＮａＯＨ溶
液の初期ｐＨは１１.５であった。ｐＨが９まで下がる
までＣＢＺＣｌを加えた。ついで、ｐＨを９〜１０に保
ちながらＣＢＺＣｌおよびＮａＯＨ溶液の両方を同時に
加えた。ついで、ＮａＯＨ溶液の残りを加えて最終ｐＨ
を１１.５とした。
【００７９】１℃にて１時間撹拌した後、濃ＨＣｌで溶
液のｐＨを２に調節した。この間に反応温度を１１.５
℃まで上げ、油状物を分離した。上記混合物を酢酸エチ
ル(２×４０００ｍｌ)で抽出した。有機抽出物を集め、
食塩水(２×１０００ｍｌ)で抽出し、乾燥し(Ｎａ2ＳＯ
4)、濾過し、真空濃縮してシロップを得た。
【００８０】Ｚ−プロリンをシロップ(約２５００ｍｌ)
まで濃縮した後、等容量のトルエン(２５００ｍｌ)およ
び種晶を加えた。撹拌しながら少量のヘキサンを２時間
かけて加えた(全部で５０００ｍｌ)。ついで、この混合
物を３時間撹拌し、濾過した。収量：２１０８ｇ(９８
％)。融点：７２〜７３℃。添加を余り速く行うと、生
成物は結晶化するまえにガム状となる。ＴＬＣ：ＣＨ2
Ｃｌ2−ＭｅＯＨ(９：１)
【００８１】Ｂ．１−[(フェニルメトキシ)カルボニル]
−Ｌ−プロリンメチルエステル： ＨＣ(ＯＣＨ3)3(２１０８ｍｌ)を含有するメタノール
(１５Ｌ)中の上記工程Ａで得た化合物(２１０８ｇ)の溶
液にトリメチルシリルクロライド(２１１ｍｌ)を加え
た。２４時間撹拌した後、トルエン(４０００ｍｌ)を加
え、溶液を真空濃縮してシロップとした。酢酸エチル
(８０００ｍｌ)で希釈した後、溶液をＨ2Ｏ(１×３００
０ｍｌ、抽出後の水相のｐＨ５)および食塩水(１×２０
００ｍｌ)で抽出し、ついで乾燥し(ＭｇＳＯ4)、濾過
し、濃縮してシロップ(２２６９ｇ、１０２％)とし、こ
れを次の反応にそのまま使用した。 ＴＬＣ：ＣＨ2Ｃｌ2−ＭｅＯＨ(９５：５)Ｒｆ＝０.９
(硫酸セリウム／モリブデン酸アンモニウム)ＥｔＯＡｃ
−ヘキサン(１：１)Ｒｆ＝０.９
【００８２】Ｃ．(Ｓ)−２−(ヒドロキシメチル)−１−
ピロリジンカルボン酸フェニルメチルエステル：ｔ−ブ
タノール(４７００ｍｌ)中の化合物Ｂ(１１３４.５ｇ)
の溶液にＮａＢＨ4(４１８.５ｇ)を周囲温度にて加え
た。４５℃に加熱した後(浴温５０℃)、メタノール(１
１４５ｍｌ)を２時間かけて滴下した。メタノールの滴
下は４５℃で開始した。２０分後(６００ｍｌ添加)、温
度を５０℃に上昇させた。浴を除き、ついでメタノール
添加を停止した。内部温度を５５℃に上昇させた。温度
が下がり始めたとき、メタノール添加を再開し、必要な
ときに外部から熱を加えて内部温度を約５２℃に維持し
た。メタノール添加の全時間は２時間であった。
【００８３】メタノール添加の間に激しい水素ガスの発
生が増加した。添加完了後、水素ガスの発生は約１時間
強く続き、その後、弱まり始めてゆっくりとした発生と
なった。ついで、反応混合物を５０℃にてさらに９０分
間撹拌した。
【００８４】反応混合物を２５℃に冷却し、水(９５０
０ｍｌ)をゆっくりと加えた。この混合物を３０分間撹
拌した(固体を溶解させた)。約６０００ｍｌに真空濃縮
した後、食塩水(２０００ｍｌ)を加え、混合物を酢酸エ
チル(２×４０００ｍｌ)で抽出した。有機抽出物を集
め、酸性食塩水(食塩水中に０.５％ＨＣｌ、１×２００
０ｍｌ)、食塩水(３×１０００ｍｌ)で抽出し、乾燥し
(ＭｇＳＯ4)、濾過し、濃縮して濁ったシロップとし、
ついでトルエン(３×１０００ｍｌ)とともに蒸発させ
た。得られたシロップを高真空下で１８時間乾燥させて
化合物Ｃ(９１０ｇ、収率９０％)を得た。
【００８５】ＴＬＣ：酢酸エチル−ヘキサン(１：１)Ｒ
ｆ＝０.３５(硫酸セリウム／モリブデン酸アンモニウ
ム)、出発物質のエステル(５％以下と推定される)とと
もにアルコール(主要)を示す。
【００８６】Ｄ．(Ｓ)−２−[[[(４−メチルフェニル)
スルホニル]オキシ]メチル]−１−ピロリジンカルボン
酸フェニルメチルエステル：ピリジン(９５００ｍｌ)中
の上記工程Ｃで得たＺ−プロリノール(１８２０ｇ)およ
びジメチルアミノピリジン(４７.５ｇ)の冷(１０℃)溶
液に、トシルクロライド(１９２０ｇ)を加えた。室温で
１８時間撹拌した後、水(３０ｍｌ)を加え、溶液をさら
に４時間撹拌し、ついで真空濃縮してシロップとした。
酢酸エチル(８０００ｍｌ)を加え、水相が酸性となるま
で５％ＨＣｌで抽出した(２×２０００ｍｌ、２回目の
抽出のときに水相は酸性となった)。ついで、有機相を
飽和ＮａＨＣＯ3(２×２０００ｍｌ)、水(１×２０００
ｍｌ)、最後に食塩水(１×２０００ｍｌ)で抽出した。
有機相を乾燥し(ＭｇＳＯ4)、濾過し、真空濃縮してシ
ロップとした。このシロップを種晶し、ヘキサン(８０
００ｍｌ)を加え、オーバーヘッドスターラーを用いて
混合物を中位のスピードで撹拌した。２時間後、シロッ
プは半固体を形成し始めた。３時間後、混合物は「チー
ズカード」のように硬くなり、ついで細かい固体となっ
た。撹拌を増加させ、混合物を一夜撹拌した。固体を１
８”ＬＡＰＰフィルター上の濾過により回収し、つい
で、さらにヘキサン(３×２０００ｍｌ)で洗浄して化合
物Ｄ(２７２５ｇ)を得た。融点：５１〜５２℃。ＴＬ
Ｃ：酢酸エチル−ヘキサン(１：１)Ｒｆ＝０.７(硫酸セ
リウム／モリブデン酸アンモニウム)
【００８７】Ｅ．[３Ｒ−[１(Ｓ＊),３α,４α]]−１,
３,４,５−テトラヒドロ−３−ヒドロキシ−４−(４−
メトキシフェニル)−１−[[１−[(フェニルメトキシ)カ
ルボニル]−２−ピロリジニル]メチル−６−(トリフル
オロメチル)−２Ｈ−１−ベンズアゼピン−２−オン：
【００８８】窒素下、ジメチルホルムアミド(２０３０
ｍｌ、ふるい乾燥)中の(３Ｒ−シス)−１,３,４,５−テ
トラヒドロ−３−ヒドロキシ−４−(４−メトキシフェ
ニル)−６−(トリフルオロメチル)−２Ｈ−１−ベンズ
アゼピン−２−オンおよび化合物Ｄ(３４７.９ｇ)の溶
液に、炭酸セシウム(３４７.５ｇ)を加えた。ついで、
この混合物を５０℃にて２４時間加熱した。この反応混
合物を室温に冷却し、酢酸エチル(２０３０ｍｌ)で希釈
し、セライトで濾過した。セライトベッドをさらに酢酸
エチル(３×５００ｍｌ)で洗浄した。濾液を真空濃縮し
て濃厚な油状物とした。この油状物を酢酸エチル(４Ｌ)
中に溶解し、ついで１０％塩酸(２×５００ｍｌ)、蒸留
水(２×５００ｍｌ)、および食塩水(２×７５０ｍｌ)で
順番に洗浄した。有機相を無水硫酸マグネシウムで乾燥
し、濾過し、ついで真空濃縮して半固体とした。残渣を
ジエチルエーテル(４００ｍｌ)でトリチュレートして流
動性の固体を得、ついで４℃にて一夜貯蔵した。この固
体を濾過により回収し、さらに冷(４℃)ジエチルエーテ
ル(２×２００ｍｌ)で洗浄した。得られた白色粉末を真
空下で一夜乾燥させて化合物Ｅ(３７４ｇ)を得た。融
点：１８１℃；[α]D＝＋１４５°(ｃ＝１、メタノー
ル)。ＴＬＣ：ＥｔＯＡｃ／ヘキサン(１：１)Ｒｆ＝０.
５５；硫酸セリウム
【００８９】Ｆ．[３Ｒ−[１(Ｓ＊),３α,４α]]−３−
(アセチルオキシ)−１,３,４,５−テトラヒドロ−４−
(４−メトキシフェニル)−１−(２−ピロリジニルメチ
ル)−６−(トリフルオロメチル)−２Ｈ−１−ベンズア
ゼピン−２−オン、一塩酸塩：
【００９０】化合物Ｅ(２４０ｇ)を窒素下、ピリジン
(４００ｍｌ)中にスラリー化し、ついで無水酢酸(１１
５ｍｌ)で処理した。この混合物を７０℃で４時間加熱
した。反応混合物を０℃に冷却し、ついで温度を３０℃
未満に維持するような速度にてメタノール(１５０ｍｌ)
で滴下処理した。ついで、反応混合物を約３０℃にて３
０分間撹拌した。トルエン(２００ｍｌ)を加え、混合物
を真空濃縮して薄いシロップとした。このシロップをト
ルエン／メタノール(１：１、４×５００ｍｌ)とともに
４回蒸発させた。
【００９１】得られたシロップを酢酸エチル(１５００
ｍｌ)中に溶解し、ついで１０％塩酸(２×２００ｍ
ｌ)、蒸留水(２×２００ｍｌ)、飽和重炭酸ナトリウム
(３×２００ｍｌ)、蒸留水(２×２００ｍｌ)、および食
塩水(２×２００ｍｌ)で順番に洗浄した。有機層を無水
硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過し、ついで真空濃縮し
て薄いシロップとし、これをそのまま次の反応に用い
た。このシロップを酢酸エチル(１２００ｍｌ)中に溶解
し、酸性酸(９６ｍｌ)で処理し、ついでガス分散チュー
ブにより窒素ガスを１０分間通した。Ｐｄ(ＯＨ)2／Ｃ
(１２ｇ)を加え、混合物を激しく撹拌しながら大気圧下
にて２時間水素化した。窒素ガスを通した後、懸濁液を
セライトで濾過し、セライトベッドをさらに酢酸エチル
(３×３００ｍｌ)で洗浄した。濾液を真空濃縮し、つい
でトルエン(３×５００ｍｌ)とともに蒸発させた。残渣
のシロップを酢酸エチル(１５００ｍｌ)中に溶解した。
ｐＨ７.２にて飽和重炭酸ナトリウム溶液を加えてｐＨ
を８.９に上昇させた。酢酸エチル層を分離し、水相を
酢酸エチル(２×１０００ｍｌ)で再抽出した。酢酸エチ
ル層を集めて飽和重炭酸ナトリウム(２×５００ｍｌ)、
蒸留水(２×５００ｍｌ)、および食塩水(２×５００ｍ
ｌ)で順番に洗浄した。酢酸エチル溶液を無水硫酸マグ
ネシウムで乾燥させ、濾過した。酢酸エチル中の１Ｍ
ＨＣｌ(５７０ｍｌ)を撹拌しながら上記濾液に加え、こ
の溶液を真空濃縮して薄いシロップとした。このシロッ
プを酢酸エチルで全容量約７５０ｍｌに希釈し、種晶
し、ついで室温にて一夜放置した。固体の沈殿を濾過に
より回収し、ついで冷(４℃)酢酸エチル(２×１００ｍ
ｌ)およびジエチルエーテル(２×２００ｍｌ)で洗浄し
た。得られた白色の結晶性固体真空下で一夜乾燥させて
生成物(２０１ｇ)を得た。この物質を、６０ｇの投入量
の化合物Ｅから得られた第二のバッチと混合した。ＨＩ
＝９９.６；融点２２３〜２２５℃。ＴＬＣ：ＣＨ2Ｃｌ
2／ＭｅＯＨ(９：１)、Ｒｆ＝０.３、硫酸セリウム；
[α]D＝＋８０.７°(ｃ＝１、ＭｅＯＨ)
【００９２】実施例３ [３Ｒ−[１(Ｓ＊),３α,４α]]−１,３,４,５−テトラ
ヒドロ−３−ヒドロキシ−４−(４−メトキシフェニル)
−１−(２−ピロリジニルメチル)ー６−(トリフルオロ
メチル)−２Ｈ−１−ベンズアゼピン−２−オン、一塩
酸塩：
【００９３】実施例２、方法ＩＩからの化合物Ａ(２０
０ｇ)を含有する酢酸エチル(１８００ｍｌ)／酢酸(６０
０ｍｌ)中の２０％Ｐｄ(ＯＨ)2／Ｃ(１０ｇ)の懸濁液
に、ガス分散チューブにより窒素ガスを１０分間通し、
ついで大気圧下で３時間水素化した。このスラリーに窒
素ガスを１０分間通し、ついでセライトで濾過した。セ
ライトベッドをさらに酢酸エチル(３×２００ｍｌ)で洗
浄した。濾液を真空濃縮し、ついでトルエン(４×５０
０ｍｌ)とともに蒸発させた。得られた残渣を酢酸エチ
ル(２００ｍｌ)中に溶解し、ついで飽和重炭酸ナトリウ
ム溶液(１０００ｍｌ)でゆっくりと処理した。この混合
物を飽和重炭酸ナトリウム溶液で処理してｐＨ９とし
た。
【００９４】飽和食塩水(４００ｍｌ)を加えた後、有機
層を分離し、水相を酢酸エチル(２×４００ｍｌ)で再抽
出した。有機相を集めて水相が中性となるまで飽和食塩
水(５×１０００ｍｌ)で洗浄した。有機相を無水硫酸マ
グネシウムで１５分間乾燥させた。無水硫酸マグネシウ
ムの添加により有意の発熱(約３５℃)となり、このこと
は溶液が過剰量の水を含有していることを示していた。
この乾燥過程の間、生成物が溶液から沈殿することもま
た明らかとなった。この混合物を濾過した。得られたケ
ーキをジクロロメタンで充分に洗浄して沈殿生成物を溶
解させた。濾液を集めて真空濃縮した。得られた固体残
渣を酢酸エチル(３０００ｍｌ)中にスラリー化し、つい
で酢酸エチル中の１.５Ｍ ＨＣｌ(２８０ｍｌ)で５分
間かけて処理した。この混合物を６０分間撹拌し、つい
で濾過した。得られた固体をさらに酢酸エチル(２×２
００ｍｌ)およびジエチルエーテル(２×３００ｍｌ)で
洗浄した。この固体を真空下で５日間乾燥させた。この
操作は、残留するＨＣｌを除去するために必要であっ
た。ＨＣｌ蒸気の除去を容易にするため、ときどき真空
を中断した。全部で１３８ｇの生成物が得られた。ＨＩ
＝９９.５；融点１６３〜１６７℃；[α]D＝＋７５.１
°(ｃ＝１、ＭｅＯＨ)。ＴＬＣ：ＣＨ2Ｃｌ2／ＭｅＯＨ
(９：１)；Ｒｆ＝０.２。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｐ 17/14 Ｃ１２Ｒ 1:01） (72)発明者 ラシュロ・ジェイ・シャルカ アメリカ合衆国ニュージャージー州イース ト・ブランズウィック、ウエリントン・ロ ード５番 (72)発明者 リチャード・エイチ・ミューラー アメリカ合衆国ニュージャージー州リンゴ ーズ、リンドバーグ・ロード66番

Claims (24)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 式： 【化１】 で示される基質を式： 【化２】 ［式中、Ｘ1は−ＣＨ2−または−Ｓ−;Ｘ1が−ＣＨ2−
    であるとき、Ｒ2は水素、 【化３】 【化４】 Ｘ1が−Ｓ−であるとき、Ｒ2は水素、 【化５】 Ｒ3,Ｒ4およびＲ5はそれぞれ独立して、水素、ハロゲ
    ン、アルキル、アルコキシ、アリールオキシ、アリール
    アルコキシ、ジアリールアルコキシ、アリールアルキ
    ル、シアノ、ヒドロキシ、アルカノイルオキシ、ニト
    ロ、 ロアルキル)アルコキシ、−ＮＯ2、−ＮＸ4Ｘ5、−Ｓ
    (Ｏ)m・アリール、 Ｒ7およびＲ8はそれぞれ独立して、水素、アルキル、シ
    クロアルキルまたはアリールアルキル、もしくはＲ7と
    Ｒ8はそれらが結合する窒素原子と合してアゼチジニ
    ル、ピロリジニル、ピペリジニルまたはモルホリニル;
    Ｒ12は水素、ヒドロキシ、アルキル、アリール、アリー
    ルアルキル、−Ｏ−アルキル、−Ｏ−アリールまたは−
    Ｏ−アリールアルキル；Ｒ13は水素、アルキル、シクロ
    アルキルまたはアリールアルキル;Ｒ14はヘテロシクロ
    またはヘテロアリール；Ｘ4およびＸ5はそれぞれ独立し
    て、水素、アルキル、アルカノイル、アリール Ｘ6はヒドロキシ、アルコキシ、アリールオキシ、アミ
    ノ、アルキルアミノまたはジアルキルアミノ;Ｘ7はアル
    キル、アルコキシまたはアリールオキシ；Ｙ4およびＹ5
    はそれぞれ独立して、水素、アルキル、アリールまたは
    アリールアルキル、ただし、Ｙ4とＹ5が共に存在すると
    きは、それらは共に水素ではなく、さらにＹ4とＹ5が共
    に同一炭素原子に結合するときは、それらのいずれもが
    水素ではない；Ｙ6は水素、ヒドロキシ、アルコキシ、
    アリールオキシまたはアラルコキシ；ｍは０，１または
    ２；およびｎまたはｎ’は０，１，２または３]で示さ
    れる化合物に転換する方法であって、該基質をレダクタ
    ーゼまたはレダクターゼを供給する微生物で処理するこ
    とを特徴とする転換方法。
  2. 【請求項２】 （ａ）レダクターゼ供給微生物を培養
    し、次いで、（ｂ）該培養ステップにおいて、レダクタ
    ーゼ供給微生物に基質を加えて基質を処理するをことを
    さらに特徴とする請求項１に記載の転換方法。
  3. 【請求項３】 （ａ）基質を処理する前に該レダクター
    ゼ供給微生物を培養し、次いで、（ｂ）培養したレダク
    ターゼ供給微生物を緩衝液に懸濁し、次いで基質を微生
    物細胞懸濁液に加えて基質を処理することをさらに特徴
    とする請求項１に記載の転換方法。
  4. 【請求項４】 レダクターゼ供給微生物をアクロモバク
    ター、アシネトバクター、アクチノマイセス、アルカリ
    ゲネス、アースロバクター、アゾトバクター、バシラ
    ス、ブレビバクテリウム、コリネバクテリウム、フラボ
    バクテリウム、メチロモナス、マイコバクテリウム、ノ
    カルジア、シュードモナス、ロドコッカス、ストレプト
    マイセス、キサントモナス、アスペルギルス、カンジ
    ダ、フザリウム、ゲオトリクム、ハンゼヌラ、クロエク
    ケラ、ペニシリウム、ピシア、リゾプス、ロドトルラ、
    サッカロミセス、トリコデルマおよびロドシュードモナ
    スからなる群から選択する請求項１に記載の転換方法。
  5. 【請求項５】 レダクターゼ供給微生物をアースロバク
    ター・シンプレックス、ノカルジア・グロベルラ、ノカ
    ルジア・レストリクタ、ノカルジア・サルモニカラー、
    ロドコッカス・ロドクロウス、ロドコッカス・ファシア
    ンス、マイコバクテリウム・バッカ、ノカルジア・メデ
    ィテラネイ、ノカルジア・アウトトロフィカ、ロドコッ
    カス・エクイ、アースロバクター・パラフィネウス、ハ
    ンゼヌラ・ポリモルファおよびカンジダ・アルビカンス
    からなる群から選択する請求項１に記載の転換方法。
  6. 【請求項６】 レダクターゼ供給微生物がロドコッカス
    ・ファシアンスである請求項１に記載の転換方法。
  7. 【請求項７】 レダクターゼ供給微生物がロドコッカス
    ・ファシアンスＡＴＣＣ１２９７５である請求項１に記
    載の転換方法。
  8. 【請求項８】 Ｒ2が水素である請求項１に記載の転換
    方法。
  9. 【請求項９】 Ｒ3がトリフルオロメチルである請求項
    １に記載の転換方法。
  10. 【請求項１０】 Ｒ4およびＲ5の一方がアルコキシ、他
    方が水素である請求項１に記載の転換方法。
  11. 【請求項１１】 炭素源、窒素源および鉱物塩からなる
    培地に微生物を植えて培養ステップを行うことを特徴と
    する請求項２に記載の転換方法。
  12. 【請求項１２】 炭素源、窒素源および鉱物塩からなる
    培地に微生物を植えて培養ステップを行うことを特徴と
    する請求項３に記載の転換方法。
  13. 【請求項１３】 基質の濃度が０.１〜５.０％である請
    求項１に記載の転換方法。
  14. 【請求項１４】 基質をレダクターゼまたはレダクター
    ゼ供給微生物で処理した後、続いてまた供給を加えるこ
    とをさらに特徴とする請求項１に記載の転換方法。
  15. 【請求項１５】 反応時のｐＨを約４〜９に維持するこ
    とをさらに特徴とする請求項１に記載の転換方法。
  16. 【請求項１６】 緩衝液のｐＨが約６.８〜７.０である
    請求項３に記載の転換方法。
  17. 【請求項１７】 反応時の温度を約２０〜６０℃に維持
    することをさらに特徴とする請求項１に記載の転換方
    法。
  18. 【請求項１８】 基質とレダクターゼ供給微生物を発酵
    器に入れ、該発酵器を撹拌し、通気することをさらに特
    徴とする請求項１に記載の転換方法。
  19. 【請求項１９】 約５０〜１０００ｒ.ｐ.ｍ.の速度で
    発酵器を撹拌または回転させる請求項１８に記載の転換
    方法。
  20. 【請求項２０】 １分間に培地量の約１〜５倍量の空気
    を発酵器に通気することを特徴とする請求項１８に記載
    の転換方法。
  21. 【請求項２１】 （ａ）基質のＲ2が水素であり、
    （ｂ）基質のＸ1が−ＣＨ2−であり、（ｃ）さらに基質
    を式： 【化６】 ［式中、Ｌは脱離基］で示される化合物と反応させ、
    式： 【化７】 で示される生成物を得ることを特徴とする請求項１〜７
    および請求項９〜２０に記載の転換方法。
  22. 【請求項２２】 基質または請求項２１の生成物のいず
    れか一方をさらにアシル化し、式： 【化８】 で示される新規化合物を得ることを特徴とする請求項２
    １に記載の転換方法。
  23. 【請求項２３】 Ｒ3がトリフルオロメチルであり、Ｒ4
    またはＲ5のいずれかを一方がメトキシであり、他方が
    水素である請求項２１に記載の転換方法。
  24. 【請求項２４】 Ｒ3がトリフルオロメチルであり、Ｒ4
    またはＲ5のいずれかを一方がメトキシであり、他方が
    水素である請求項２２に記載の転換方法。
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