JP2010523095A

JP2010523095A - 対応しているケトン類の酵素還元による２−アミノ−［５−（１（ｓ），２−ジヒドロキシエチル）又は−（ｋｓ）−ヒドロキシ−２−ハロエチル）］−ピラジン誘導体を製造するための方法

Info

Publication number: JP2010523095A
Application number: JP2010501479A
Authority: JP
Inventors: ハンロン，スティーブン・ポール; イディンク，ハンス; クップファー，エルンスト; ラディノフ，ルーメン・ニコラエフ; シュ，リャンホ; ワン，ピン
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2007-04-04
Filing date: 2008-03-26
Publication date: 2010-07-15
Also published as: EP2145012A2; US20080248537A1; CA2682304A1; WO2008122511A2; WO2008122511A3; CN101641447A; US7727750B2

Abstract

本発明は、（式Ｉ）［式中、Ｒは、低級アルキルカルボニル又はアミノ保護基であり、そしてＲ^１は、ヒドロキシ又はハロゲンである］で示される、式：２−アミノ−［５−（１−ヒドロキシ−２−ヒドロキシ又はハロゲン−エチル）］−ピラジン誘導体を製造するための生体触媒不斉還元に関する。該化合物は、グルコキナーゼアクチベーターの生産において重要な中間体である。

Description

本発明は、式（Ｉ）：

［式中、Ｒは、低級アルキルカルボニル又はアミノ保護基であり、そしてＲ^１は、ヒドロキシ又はハロゲンである］で示される２−アミノ−［５−（１−ヒドロキシ−２−ヒドロキシ又はハロゲン−エチル）］−ピラジン誘導体の製造方法であって、
式（II）：

［式中、Ｒ^２は、低級アルキルカルボニルオキシ又はハロゲンである］で示されるケトンの酵素加水分解及び／又は酵素不斉還元による方法に関する。

当該方法は、特に、鏡像異性的に純粋な（Ｓ）−Ｎ−［５−（１，２−ジヒドロキシ−エチル）−ピラジニル］−２，２−ジメチル−プロピオンアミドの調製において有用である。当該化合物は、グルコキナーゼアクチベーターの中間体であり、そしてグルコキナーゼアクチベーターである、
式（III）：

で示される、２−（３−クロロ−４−メタンスルホニル−フェニル）−３−シクロペンチル−Ｎ−［５−（１，２−ジヒドロキシ−エチル）−ピラジン−２−イル］−プロピオンアミドは、II型糖尿病の治療及び／又は予防に有用である。

式（III）の化合物は、ＰＣＴ国際特許出願第ＷＯ２００４／０５２８６９Ａ１号に開示されている。

式（III）の化合物の合成において使用される重要な構成要素の１つは、
式（Ia）：

［式中、Ｒは、低級アルキルカルボニル又はアミノ保護基である］で示される鏡像異性的に純粋な２−アミノ−［５−（１，２−ジヒドロキシ−エチル）］−ピラジン誘導体である。医薬品有効成分（ＡＰＩ）の製造に関して、異性体的に純粋な構成要素及び／又は高立体選択的な手順を使用することは不可欠であり、なぜなら、ＡＰＩ中の副成分が、疾患の処置において副作用を有し得るからである。したがって、すべてのＡＰＩに対して高純度が要求される。

光学的に活性な１，２−ジオールは、多用途な合成中間体であり、そして鏡像異性的に純粋な形態で得ることが困難である。（Ｓ）−Ｎ−［５−（１，２−ジヒドロキシ−エチル）−ピラジニル］−２，２−ジメチル−プロピオンアミドの調製に関してＷＯ２００４／０５２８６９Ａ１に記載されている方法には、四酸化オスミウムを含む反応において対応するビニルピラジン前駆体のシャープレス酸化を含んでいた（スキーム１参照）。四酸化オスミウム触媒の毒性のせいで、当該反応はキログラム規模で行うことは不可能である。したがって解決すべき課題は、毒性試薬が不要で、そして技術的大規模で実施することができる適切な代替方法を見つけることであった。

単一工程においてアルコキシケトン類の対応するジオールへの微生物加水分解／還元を報告している文献例は、ほとんどない。G. Egri et al., Tetrahedron Asymmetry 1998, 9, 271-283は、パン酵母による１−アセトキシ−３−アリールオキシプロパン−２−オンの一連の生体内変換について記載している。試験された１３ケトン類のうち２つだけが、中間体モノアセタートの形成を伴わずにジオールに直接変換された。ほとんどの場合、モノアセタートとジオールの混合物には、式（Ｉ）の化合物の製造方法に望ましくないものが見られた。加えて、これらの反応は、基質濃度０．２５％w/wにおいてほんの０．５ｇ規模で実施しただけであり、式（Ｉ）の化合物の製造用に使用すべきものよりはるかに下回る。

T. Kometani et al, J. Bioscience. Bioeng. 2001, 91, 525-527は、パン酵母を使用して１−アセトキシ−２−プロパノンの還元による、（Ｓ）−１，２−プロパンジオールの調製について記載している。ジオールへの変換は、基質濃度１％ w/vで完了したが、ｅｅ（鏡像体過剰率）は８８％であった。この値は、アセトキシケトンの加水分解を抑制することでしか改善することはできなかった。

Z-L Wei et al, Bioorganic and Medicinal Chemistry 2000, 8, 1129-1137は、対応する２−アセトキシ−１−アリールエタノン類からのＳ−ジオールの調製について記載しているが、これもまた選択性が比較的低く、そしてモノアセタートがほとんどの場合存在していた。

微生物の還元／加水分解反応により形成される（Ｓ）−ジオールのｅｅは、それがＡＰＩの最終収量に影響を及ぼすので極めて重要な値である。本発明にしたがって製造されたＡＰＩの場合、それに続くケタール化及び結晶化工程は、鏡像体過剰率の増加を＞９９％までもたらした。

アルコキシケトンの加水分解／還元について記載された微生物生体内変換と並んで、必要な単離された生体触媒−酵素（例えば、ヒドロラーゼ、ケトレダクターゼ、グルコースデヒドロゲナーゼ）だけを、ワンポットアプローチで適用してもよい。グルコースデヒドロゲナーゼ及びエステル部分の酵素加水分解を使用する酵素コファクターのリサイクルと組み合わせた、単離されたケトレダクターゼによる不斉還元は、最新技術である。S. Kambourakis et al., Tetrahedron Asymmetry 2005, 16, 3682-3689は、異なるケトレダクターゼを使用する２−ヒドロキシ−１−フェニル−エタノンの還元について記載している。２種以上の酵素タイプを用いる酵素変換反応は、V. Kren et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1995, 34 (8), 893に記載のとおり高い頻度で成功する。したがって、ヒドロキシルケトンへのアセトキシケトンのアップストリーム酵素加水分解及びこのインサイツで生成されたヒドロキシルケトンのダウンストリーム還元は、潜在的な微生物−加水分解／還元−生体内変換を模倣する。単離された酵素を使用するマルチ酵素反応は、ｉ）標準機器を使用し得る；ii）高い反応率、iii）全細胞系と比較すると副活性が全くない、iv）簡単な反応制御、及びｖ）生成された（Ｓ）−ジオールのより高いｅｅに起因して、続くケタール化反応におけるより高い収率など、いくつかの利点を示す。

２−アミノ−［５−（アセチル）］−ピラジン誘導体の末端位置は、異なる置換基を有してもよく、それらはケトン部分の不斉還元後にヒドロキシル官能基に変換可能である。ハロゲン置換基、すなわちより具体的には、１つの有力な候補であるクロロ置換基に関して、異なるアリールケトンのいくつかの生体触媒による不斉還元については、文献、L. Hua et al., Organic & Biomolecular Chemistry 2006, 4, 2690-2695 and L. Hua et al. Tetrahedron Asymmetry 2005, 16, 3275-3278に記載されている。芳香族塩素化アルコールから出発する鏡像異性的に純粋な１，２−ジオールの合成については、T. Ikaraiya et al., Tetrahedron 2004, 60, 7411-7417に記載のように、対応する鏡像異性的に純粋なエポキシドを介して行われ、そして続くエポキシド加水分解については、Z. Li et al., Tetrahedron Asymmetry 2006, 17, 47-52に記載のように生体触媒加水分解を介するか、又はG-J. Kim et al., Tetrahedron Letters 2005, 46, 2263-2266に記載のように金属触媒を使用する加水分解を介するかのいずれかである。

本発明による生体内変換方法を用いて、鏡像異性的に純粋な２−アミノ−［５−（１，２−ジヒドロキシ−エチル）］−ピラジン誘導体の調製に有効な手順が見出された。

特記のない限り、下記の定義は、本明細書の発明を記載するために使用される種々の用語の意味及び範囲を説明し、明確にするために記載される。

本明細書において、用語「低級」は、１〜６個、好ましくは１〜４個の炭素原子からなる基を意味するために使用される。

用語「ハロゲン」は、フルオロ及びクロロを指し、クロロが好ましい。

用語「アルキル」は、単独で又は他の基と組み合わせで、１〜２０個の炭素原子、好ましくは１〜１６個の炭素原子、さらに好ましくは１〜１０個の炭素原子の分岐又は直鎖の一価飽和脂肪族炭化水素基を指す。

用語「低級アルキル」又は「Ｃ_１−Ｃ_６−アルキル」は、単独で又は他の基と組み合わせで、１〜６個の炭素原子、好ましくは１〜４個の炭素原子の分岐又は直鎖の一価アルキル基を指す。この用語は、さらに、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｓ−ブチル、イソブチル、tert−ブチル、ｎ−ペンチル、３−メチルブチル、ｎ−ヘキシル、２−エチルブチル等などの基により例示される。好ましい低級アルキル残基は、メチル、エチル及びtert−ブチルであり、tert−ブチルが特に好ましい。

用語「低級アルキルカルボニル」は、基−Ｃ（Ｏ）−Ｒ’を指し、ここで、Ｒ’は、１〜６個の炭素原子、好ましくは、１〜４個の炭素原子で示される分岐又は直鎖の一価アルキル基である。好ましい「低級アルキルカルボニル」又は「Ｃ_１−Ｃ_６−アルキルカルボニル」基は、アセチル、プロピオニル、ブチリル、ピバロイル、ペンタノイル及びヘキサノイルである。より好ましくは、アセチル及びピバロイル（tert−ブチルカルボニル）であり、tert−ブチルカルボニルが最も好ましい。

本明細書において使用される用語「アミノ保護基」は、化合物上の他の官能基を反応させている間、アミノ官能性を遮断又は保護するために一般に用いられる置換基を指す。適切なアミノ保護基は、ホルミル基、ベンジル基、ベンジルオキシカルボニル（「Ｃｂｚ」）、９−フルオレニルメトキシカルボニル（「ＦＭＯＣ」）、tert−ブトキシカルボニル（「ＢＯＣ」）及びアリルオキシカルボニルなどのエステル基、ならびにパラ−トルエンスルホニル、ベンゼンスルホニル及びフェニルスルホニルなどのアリールスルホニル誘導体からなる群より選択される。アミノ保護基の選択及び使用（付加及び続く除去）は、当業者に周知である。上記用語により引用される基の更なる例は、T. W. Greene and P. G. M. Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 3^rd edition, John Wiley and Sons, New York, NY, 1999に記載されている。好ましいアミノ保護基は、ＢＯＣである。

用語「低級アルキルカルボニルオキシ」は、基−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｒ”を指し、ここで、Ｒ”は、１〜６個の炭素原子、好ましくは１〜４個の炭素原子の直鎖の一価アルキル基である。好ましい「低級アルキルカルボニルオキシ」又は「Ｃ_１−Ｃ_６−アルキルカルボニルオキシ」基は、アセチルオキシ、プロピオニルオキシ、ブチリルオキシ、ペンタノイルオキシ及びヘキサノイルオキシである。特に好ましい「低級アルキルカルボニルオキシ」は、アセチルオキシである。

用語「鏡像異性的に純粋な」は、その組成の単一鏡像異性体を少なくとも９０％、好ましくは約９５％〜１００％、より好ましくは９８％〜１００％、そして最も好ましくは９９％〜１００％を含む組成を指す。

本明細書において使用される、用語「鏡像体過剰率」（略して「ｅｅ」）は、［Ｆ（＋）−Ｆ（−）］として定義され、ここで、Ｆ（＋）は、（＋）−鏡像異性体のモル分率又は重量分率を指し、そしてＦ（−）は、（−）−鏡像異性体のモル分率又は重量分率を指す。それに相応して、用語「パーセント鏡像体過剰率」又は「％ｅｅ」は、１００×［Ｆ（＋）−Ｆ（−）］として定義される。あるいは、パーセント鏡像体過剰率は、１００×（［Ｒ］−［Ｓ］／［Ｒ］＋［Ｓ］）として計算することができる。

本発明は、
式（Ｉ）：

［式中、Ｒは、低級アルキルカルボニル又はアミノ保護基であり、そしてＲ^１は、ヒドロキシ又はハロゲンである］で示される化合物の製造方法であって、

式（II）：

本発明の好ましい実施態様では、方法は、Ｒ^１が、ヒドロキシであり、そしてＲ^２が、アセチルオキシであることを特徴とし、
式（Ia）：

［式中、Ｒは、低級アルキルカルボニル又はアミノ保護基である］で示される化合物を得ることを意味する。

本発明の一つの実施態様では、方法は、酵素加水分解及び酵素不斉還元を、種カンジダ・パラプシローシス（Candida parapsilosis）の酵母と共に実施することを特徴とする。したがって、本発明は、
式（Ia）：

［式中、Ｒは、低級アルキルカルボニル又はアミノ保護基である］で示される２−アミノ−［５−（１，２−ジヒドロキシ−エチル）］−ピラジンの製造方法であって、
式（IIa）：

で示されるケト化合物を、種カンジダ・パラプシローシスの酵母を用いて酵素加水分解及び酵素不斉還元をすることによる、製造方法に言及する。

酵母カンジダ・パラプシローシスの株を使用することにより、所望の生成物（Ia）は、技術的に適切な基質濃度で対応するアセトキシケトン（IIa）の加水分解及び不斉還元により生成される。方法は、株が加水分解及び不斉還元の両方に触媒作用を及ぼすことができるため、リパーゼなどのヒドロラーゼの添加なしで実施することができる。

詳しくは、本発明は、式（IIa）の化合物の加水分解及び不斉微生物還元を、酵母カンジダ・パラプシローシスを使用して行い、式（Ia）の鏡像異性的に純粋な（Ｓ）−ジオールを得ることを含む、大規模で実現可能な生体触媒方法であって、
ａ）酵母抽出物（１％ w/v）、ソイトン（１％w/v）、酵母ニトロゲンベース（０．６７％w/v）及びグルコース（２％ w/v）を含むリッチ培地を含有するフラスコ又は発酵槽中で、２７〜３０℃にて、１〜２日間、カンジダ・パラプシローシスの培養物を培養する工程；
ｂ）ｐＨを６．５〜７．０の範囲で維持するために、播種後１６〜２０時間にＮＨ_４ＯＨを添加する工程、並びに培養及び不斉還元用に還元当量を提供するために２４時間毎に３〜５％（v/v）に相当するエタノールを供給する工程；
ｃ）さらに２〜４時間後、式（IIa）のアセトキシケトン基質１７５ｇを、水８７５ml中の懸濁液として発酵ブロスに添加して、最終濃度１〜５％（w/v）を得る工程；
ｄ）２〜５日以内に、式（IIa）のアセトキシケトンを加水分解及び還元して対応する（Ｓ）−ジオールにする工程；
ｅ）バイオマスの分離（遠心分離）により（Ｓ）−ジオールを単離し、続いて（Ｓ）−ジオールを酢酸エチル（２体積当量で３回）で抽出し、そして濃縮する工程
を含む、方法に関する。

反応はまた、完了するまで進められなければならず、すなわち基質濃度５％（w/v）で全ての基質が変換されなければならず、これは、文献例において引用されている濃度よりはるかに高い。

Ｃ．パラプシローシスを用いる式（IIa）のアセトキシケトンの生体内変換により、９１．４％〜９５．６％の範囲のｅｅを有する鏡像異性的に純粋な（Ｓ）−ジオールが得られる。

本明細書において使用されるように、カンジダ・パラプシローシスは、Rocheにて単離され、ブダベスト条約の下で２００７年３月９日、ＤＳＭＺ（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Inhoffenstrasse 7B, 38124 Braunschweig, Germany）に、アクセッション番号ＤＳＭ１９１５５で寄託されている株である。Ｃ．パラプシローシスのいくつかの他の株もまた、記載した生体内変換に触媒作用を及ぼして、９２〜９５％ｅｅを有する（Ｓ）−ジオールが得られ、それはどんなＣ．パラプシローシス株も使用できる可能性を示す。加えて、酵母カンジダ・ケフィア（Candida kefyr）、クルイベロマイセス・マルシアヌス（Kluyveromyces marxianus）及び真菌カロネクトリア・リジディウスクラ（Calonectria rigidiuscula）の株は、使用することができる。

好ましい実施態様では、本発明は、酵母カンジダ・パラプシローシスを使用する酢酸２−［５−（２，２−ジメチル−プロピオニルアミノ）−ピラジン−２−イル］−２−オキソ−エチルエステル（Ｒが、tert−ブチルカルボニルである、式（IIa）の化合物）の不斉微生物還元及び加水分解を行って、鏡像異性的に純粋な（Ｓ）−Ｎ−［５−（１，２−ジヒドロキシ−エチル）−ピラジニル］−２，２−ジメチル−プロピオンアミドを得ることを含む、大規模で実現可能な生体触媒法に関する。

本発明のさらなる実施態様では、方法は、酵素加水分解が、エステラーゼ、プロテアーゼ又はリパーゼからなる群より選択されるヒドロラーゼ（ＥＣ３．１．１）を用いて実施され、後続の酵素不斉還元が、１個以上のオキシドレダクターゼ（ＥＣ１．１．１）を用いて実施されることを特徴とする。したがって、本発明はまた、
式（Ia）：

で示されるケト化合物を、ヒドロラーゼ、エステラーゼ、プロテアーゼ又はリパーゼからなる群より選択される酵素を用いて酵素加水分解をすること、及び１個以上のオキシドレダクターゼを用いて酵素不斉還元をすることによる製造方法に言及する。

好ましくは、酵素加水分解は、リパーゼを用いて実施される。より好ましくは、リパーゼが、カンジダ・アンタークティカ（Candida Antarctica）、アルカリゲネス（Alcaligenes）種又はバークホルデリア・セパシア（Burkholderia cepacia）から得られる。

好ましい実施態様では、ケトレダクターゼ又はアルコールデヒドロゲナーゼが、酵素不斉還元においてオキシドレダクターゼとして使用される。

マルチ酵素生体内変換を、ワンポット反応として変換する。加水分解−脱アセチル化を、ヒドロラーゼと二相反応培地中に懸濁した式（IIa）のアセトキシケトンとを接触させることにより実施する。還元を、オキシドレダクターゼとインサイツで形成されたα−ヒドロキシケトンとを接触させることにより実施する。インサイツで形成されたα−ヒドロキシケトンの低い安定性のため、レダクターゼの適用反応性は、ヒドロラーゼの適用反応性を超えなければならない。所要の還元当量は、触媒量として用いられ、そしてインサイツでリサイクルされる。式（Ia）の所望の生成物は、技術的反応条件で生成される。

好ましい実施態様では、本発明は、大規模で実現可能な生体触媒方法であって、ヒドロラーゼ、エステラーゼ、プロテアーゼ又はリパーゼからなる群より選択される酵素を用いて、酢酸２−［５−（２，２−ジメチル−プロピオニルアミノ）−ピラジン−２−イル］−２−オキソ−エチルエステル（Ｒが、tert−ブチルカルボニルである、式（IIa）の化合物）を加水分解すること、及び１個以上のオキシドレダクターゼを用いて酵素不斉還元を行って、鏡像異性的に純粋な（Ｓ）−Ｎ−［５−（１，２−ジヒドロキシ−エチル）−ピラジニル］−２，２−ジメチル−プロピオンアミドを得ることを含む、方法に関する。

第一の工程、つまりアセトキシケトン（５）の脱アセチル化によるヒドロキシルケトン（６）のインサイツ生成を、ヒドロラーゼ、エステラーゼ、プロテアーゼ又はリパーゼにより、好ましくはリパーゼにより；さらにより好ましいのは、カンジダ・アンタークティカ（Candida Antarctica）からのリパーゼ［例えば、ＣＡＬＢＬ（Novozyme）］により、アルカリゲネス（Alcaligenes）種からのリパーゼ［例えば、ＱＬＭ（Meito Sangyo）］により、バークホルデリア・セパシア（Burkholderia cepacia）からのリパーゼ（リパーゼＰＳ）により、及びその突然変異リパーゼＡＨにより実施する。続く不斉還元を、オキシドレダクターゼにより、好ましくはケトレダクターゼ又はアルコールデヒドロゲナーゼにより、より好ましくはケトレダクターゼＫＲＥＤ１０１、１０７、１１１、１１２、１１３及び１１４、Ａ１Ｆ、Ｂ１Ｄ及びＢ１Ｅ［BioCatalytics］により実施する。所要の還元当量は、最先端の方法によりインサイツでリサイクルし得る；好ましくは酵素により；より好ましくは、グルコースデヒドロゲナーゼＧＤＨ１０２［BioCatalytics］によりリサイクルし得る。

適切な緩衝液は、ｐＨ５〜８、好ましくはｐＨ６〜７の範囲で生化学において一般に使用される従来の緩衝液である。反応の過程において、反応混合物のｐＨを、塩基、好ましくはＮａＯＨ又はＫＯＨの溶液を加えることにより選択された値で一定に保持する。形成された酢酸を中和するために相当量が必要であり、そして形成されたグルコン酸を中和するためにさらなる相当量が必要である。

酵素の組合わせＫＲＥＤ１０１、リパーゼＡＨ及びＧＤＭ１０２の場合、ｎ−ヘプタン又はtert−ブチルメチルエーテル（ＴＢＭＥ）（例えば２０％ v/v）及びＤ−グルコース（例えば０．５M）などの無極性の有機溶媒の存在下、２−（４−モルホリノ）−エタンスルホン酸緩衝液（例えばｐＨ６．２５）の使用は、反応性全体に積極的に影響を及ぼす。

反応温度は、２５〜４５℃、好ましくは３０〜４０℃の範囲であり得る。基質濃度は、１〜２０％（w/w）、好ましくは５％（w/w）に及び得る。

インサイツで形成されたヒドロキシケトン（６）の低い安定性は、脱アセチル化活性を超える触媒還元活性を必要とする。ヒドロキシケトン（６）のインサイツでの濃度は、その不斉還元についての高いターンオーバー率を可能にするために、十分に高くなければならない。生成されたアセトキシアルコール（ジオール（７）になる可能性のある中間体）にとっての著しくより低い鏡像異性的純度と相まって、ケトレダクターゼは、アセトキシケトン（５）の直接還元に対して著しくより低い活性を示す。処理条件は、鏡像異性的に純粋な（Ｓ）−ジオール（７）を保持するために、アセトキシケトン（５）の直接還元を抑制するか、又はそのインサイツでの濃縮を誘発することによりインサイツで形成されたヒドロキシケトン（６）の不斉還元の高いターンオーバー率を向上させなければならない。

別の実施態様では、本発明は、
式（Ib）：

［式中、Ｒは、低級アルキルカルボニル又はアミノ保護基であり、そしてＲ^１は、ハロゲンである］で示される２−アミド−［５−（１−ヒドロキシ−２−ハロ−エチル）］−ピラジンの製造方法であって、
式（IIb）：

［式中、Ｒ^２は、ハロゲンである］で示されるケトンの酵素不斉還元による製造方法に言及する。

好ましくは、Ｒ^１及びＲ^２は、塩素である。

好ましくは、酵素不斉還元を、１個以上のオキシドレダクターゼを用いて実施する。より好ましくは、ケトレダクターゼ又はアルコールデヒドロゲナーゼを、オキシドレダクターゼとして使用する。

好ましい実施態様では、本発明は、Ｎ−［５−（２−クロロ−アセチル）−ピラジニル］−２，２−ジメチル−プロピオンアミド（４）を酵素還元して（Ｓ）−Ｎ−［５−（２−クロロ−１−ヒドロキシ−エチル）−ピラジン−２−イル］−２，２−ジメチル−プロピオンアミド（５）にすることに関する。

不斉還元を、オキシドレダクターゼとクロロケトン（８）とを接触させることにより実施する。必要な還元当量は、触媒量として用いられ、そしてインサイツでリサイクルされる。

好ましいオキシドレダクターゼは、ケトレダクターゼ又はアルコールデヒドロゲナーゼであり、より好ましいものは、ケトレダクターゼＫＲＥＤ１０１、ＫＲＥＤ１１１、ＫＲＥＤ１１２、ＫＲＥＤ１１３及びＫＲＥＤ１１４［BioCatalytics］である。必要な還元当量は、従来の方法により；好ましくは酵素により；より好ましくは、グルコースデヒドロゲナーゼＧＤＨ１０２［BioCatalytics］により、インサイツでリサイクルし得る。

適切な緩衝液は、ｐＨ５〜８の範囲で、好ましくはｐＨ６〜７の範囲で生化学において一般に使用される従来の緩衝液である。反応の過程において、反応混合物のｐＨを、塩基、好ましくはＮａＯＨ又はＫＯＨの溶液を加えることにより選択された値で一定に保持する。形成されたグルコン酸を中和するために相当量が必要である。

酵素の組合わせＫＲＥＤ１０１及びＧＤＭ１０２の場合、Ｄ−グルコース（例えば０．０６M）の存在下、高基質濃度でのリン酸カリウム緩衝液（例えば、ｐＨ６．５）の使用及びより高い濃度のＤ−グルコースの添加は、反応性全体に積極的に影響を及ぼす。

反応温度は、２５〜４５℃の範囲、好ましくは３０〜３５℃の範囲であり得る。基質濃度は、０．１〜１０％（w/w）、好ましくは５％（w/w）、より好ましくは０．５％（w/w）で変動し得る。

好都合に、鏡像異性的に純粋な（Ｓ）−Ｎ−［５−（２−クロロ−１−ヒドロキシ−エチル）−ピラジン−２−イル］−２，２−ジメチル−プロピオンアミド（Ic）となるクロロケトン（８）の不斉還元は、第三の加水分解酵素（例えば、リパーゼ）を必要とせず、また潜在的に不安定な中間体をインサイツで生成しなかった。絶対配置を、結晶構造により決定した。続いて、鏡像異性的塩素化アルコール（Ic）を、ヒドロキシル基に対してクロロの求核置換によって所望の鏡像異性的に純粋な（Ｓ）−ジオール（７）に変換しなければならない。

既に先に記載のように、Ｒは、好ましくはtert−ブチルカルボニルである、すなわち、本明細書中の先に定義した方法を、好ましくは、式（II）［式中、Ｒは、tert−ブチルカルボニルである］の化合物から出発して実施する。

したがって、別の実施態様では、本発明は、
式（IIc）：

［式中、Ｒ^２は、低級アルキルカルボニルオキシ又はハロゲンである］で示される新しい化合物に関する。

式（IIc）の化合物の調製を、下記のスキーム４及び５にしたがって実施することができる。

工程１において、２−アミノ−５−ブロモピラジン（１）のアミノ基を、ジクロロメタン中の塩化トリメチルアセチル（ピバロイルクロリド；ＰｉｖＣｌ）で保護して、アミド７を収率９０％で得た。アミド２のパラジウム触媒されたカルボメトキシル化（工程２）を、Parr反応器中でジメチルホルムアミド：メタノールの４：１の混合溶媒中、一酸化炭素５００psi下、実施して、メチルエステル９を収率８４％で得た。工程３において、メチルエステル９のクライゼン縮合を、酢酸tert−ブチルから生成されたエノラートを用い、リチウムビス（トリメチルシリル）アミド（ＬＨＭＤＳ）で処理することにより行って、ケトエステル１０を得た。抽出処理及び溶媒交換後、得られたエタノール溶液１０を、触媒量の臭化リチウムの存在下、Ｎ−ブロモスクシンイミド（ＮＢＳ）で処理して、９からブロミド１１を総収率９５％で得た。１１をジクロロメタン中のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）で処理して、α−ブロモケトン(IId）を収率９７％で得て（工程５）、室温で４０時間撹拌後、脱カルボキシル化を完了した。α−ブロモケトン（IId）を、ＤＭＦ中の酢酸ナトリウムで室温にて置換反応により、アセトキシケトン（IIe）に変換した（工程６）。酢酸エチル／ヘプタンからの結晶化の後、アセトキシケトン（IIe）を、収率９０％で得た。続いて、（IIe）を、水を加えることにより反応混合物から直接沈殿させることが可能であることを見出した。

Ｎ−［５−（２−クロロ−アセチル）−ピラジン−２−イル］−２，２−ジメチル−プロピオンアミド（IIf）を、ブロモクロロメタンと反応させ、そしてブチルリチウムで活性化させることにより、メチルエステル９から直接得ることができる（スキーム５参照）。

別の実施態様では、本発明は、
式（Ic）：

で示される新しい化合物に関する。

さらなる実施態様では、本発明は、
式（III）：

で示される化合物の製造方法であって、
請求項１〜１１記載の方法を含み、続いて、
ａ）式（Ia）：

［式中、Ｒは、低級アルキルカルボニル又はアミノ保護基である］で示されるジオールを、２，２−ジメトキシプロパンと反応させて、アセタールを形成し、塩基性条件下でアミンを脱保護して、
式（IV）：

で示される化合物を得ること；
ｂ）式（IV）のアミンと、
式（Ｖ）：

で示されるカルボン酸又はその活性化誘導体との縮合により、アミドを得ること；そして
ｃ）酸性条件下でアセタールを加水分解すること
を含む方法を提供する。

２Ｒ−（３−クロロ−４−メタンスルホニル−フェニル）−３−シクロペンチル−Ｎ−［５−（１Ｓ，２−ジヒドロキシ−エチル）−ピラジン−２−イル］−プロピオンアミド（式（III）の化合物）は、強力なグルコキナーゼアクチベーターであることが分かった。ＧＫを活性化して、それによってＧＫセンサーシステムの感度を増加させる化合物は、全てのII型糖尿病における高血糖特性の処置に有用である。グルコキナーゼアクチベーターは、β−細胞及び肝細胞中のグルコース代謝の流動を増加させ、それが増加したインスリン分泌と共役する。したがって、そのような薬剤は、II型糖尿病及びその他の代謝性障害を処置するために有用である。

工程ａ）において、１，２−ジオール基は、環状アセタールの形態で保護される。１，２−ジオールとジメトキシプロパンとの反応は、１，３−ジオキソランを提供する。好ましくは、反応を、例えば、ｐ−トルエンスルホン酸（ＰＴＳＡ）又はカンファースルホン酸（ＣＳＡ）などの酸触媒の存在下で実施する。アセタールは、例えば、含水酢酸、含水トリフルオロ酢酸及び塩酸、ならびにルイス酸などのプロトン酸を除いて、ほとんどの反応条件に対して安定である。したがって、アセタールは、後続のアミンの脱保護に使用される炭酸カリウムなどの塩基によって攻撃されない。

工程ｂ）における縮合に関して、式（Ｖ）のカルボン酸の活性化誘導体は、当業者に既知の方法により調製し得る、例えば、保護エステル又はその酸クロリドにより使用し得る。好ましくは、式（Ｖ）の酸の酸クロリドを使用し得、カップリングを、例えばピリジン又はアミノピラジンなどの塩基の存在下で実施する。酸クロリドは、式（Ｖ）の化合物を、ジクロロメタンなどの適切な溶媒中の塩化オキサリル又はチオニルクロリドと反応させて調製することができる。

工程ｃ）において、アセタール保護基は、酸条件下、例えば、塩酸を使用することにより開裂させて、式（III）の１，２−ジオールを得る。

下記のスキーム６において、本明細書中の先に定義したように酵素的方法により調製した式（Ia）の化合物から出発する、式（III）の化合物の製造方法を図示する。

以下の実施例は、非限定的に本発明を例示するものとする。

実施例
実施例１
酢酸２−［５−（２，２−ジメチルプロピオニルアミノ）−ピラジン−２−イル］−２−オキソ−エチルエステルの調製
工程１：Ｎ−（５−ブロモ−ピラジン−２−イル）−２，２−ジメチルプロピオンアミド（２）の調製
電磁撹拌機、温度計、冷却器及び窒素入口／出口を装備した１Ｌの三つ口丸底フラスコに、２−アミノ−５−ブロモピラジン（１）５０．００ｇ（２８７．４mmol）、ジクロロメタン２１８mL及びピリジン３０．５０mL（３７７．１mmol）を入れた。次に、塩化トリメチルアセチル（ＰｉｖＣｌ）３９．３０mL（３１９．１mmol）を、５分間かけて滴下した。発熱のせいで、混合物の温度が２２℃から４４℃に上昇した。約４０℃で２時間撹拌した後、ＨＰＬＣ分析は完全な反応を示した。反応混合物をエタノール２００mLで希釈し、次に大気圧で、蒸留により濃縮した。蒸留液２４０mLを回収した後、混合物の温度が６８℃に達し、混合物の温度を約６８℃で維持しながら、水１００mLをゆっくりと加えた。添加が完了した後、得られた懸濁液を室温に放冷し、一晩撹拌した。固体を濾過により回収し、エタノール：水１：１の１００mLで洗浄し、吸引により乾燥させて、標記化合物６７．０８ｇ（収率９０．４％）を明ベージュ色の固体として得た；ＨＰＬＣ分析により測定した純度９８．２１％（ＨＰＬＣカラム Zorbax Eclipse XDB-C8、４．６×５０mm、１．８μm、溶離剤５〜１００％アセトニトリル／水＋０１．％ＴＦＡ１mL／分で５分間かけて、ＵＶ２５０nmで検出、保持時間４．２２分）。

工程２：５−（２，２−ジメチル−プロピオニルアミノ）−ピラジン−２カルボン酸メチルエステル（９）の調製
３００mLParr反応器に、工程１で調製した化合物１５．００ｇ（５８．１１mmol）、メタノール１６．８０mL（４１４．８mmol）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）６７．２０mL、ビス（トリフェニルホスフィン）パラジウムジクロリド６１．２０mg（０．０８７２mmol）及びトリエチルアミン８．９００mL（６３．９２mmol）を入れた。反応器を、窒素で２回（それを加圧して、続いてそれを大気圧に排気することにより）パージし、次に一酸化炭素で２回パージした。混合物を、５００rpmで撹拌しながら９２℃に加熱し、次にＣＯで、１８時間、５００psiに加圧した。ＨＰＬＣ分析は完全な反応を示した。６５℃に冷却した後、反応器を減圧して、内容物を５００mL丸底フラスコに移した。反応器をＤＭＦ３０mLですすぎ、すすぎ液もまたフラスコに移した。次に、水８０mLを加えた。室温に冷ました後、得られた固体を濾過により回収し、ＤＭＦ：水１：１の５０mL及び水５０mLで洗浄して、吸引により乾燥させて、標記化合物１１．５６ｇ（収率８３．８％）を明ベージュ色の固体として得た；ＨＰＬＣ分析により測定した純度１００％（工程１と同じ条件、保持時間３．４６分）。

工程３：３−［５−（２，２−ジメチル−プロピオニルアミノ）−ピラジン−２−イル］−３−オキソ−プロピオン酸−tert−ブチルエステル（１０）の調製
電磁撹拌機、添加漏斗、熱電対プローブ及び窒素入口／出口を装備した１Ｌの三つ口丸底フラスコに、酢酸tert−ブチル２５．００mL（１８５．５mmol）、工程２で調製した化合物２０．００ｇ（８４．３０mmol）及びＴＨＦ２０mLを入れた。−２０℃に冷却した後、ＴＨＦ中の１．０M リチウムビス（トリメチルシリル）アミド（ＬＨＭＤＳ）の溶液２６１．４mL（２６１．４mmol）を、反応混合物の温度を−２０℃〜０℃に維持しながら滴下した。得られた赤色の溶液を、−２０℃で４０分間撹拌した。ＨＰＬＣ分析は完全な反応を示した。混合物を０℃に温まるにまかせ、次に予冷した２５wt％クエン酸溶液２００mL（２６０．３mmol）を加えることによりクエンチした。有機層を分離し、飽和塩化ナトリウム溶液２×２００mLで洗浄し、３０℃／６０mmHgで濃縮し、約５０mLの容量にした。濃縮した溶液をブタノン２００mLで希釈し、再度３０℃／６０mmHgで濃縮し、約５０mLにした。濃縮物を再度ブタノン２００mLで希釈し、３０℃／６０mmHgで濃縮し、約１００mLの容量にした。ＮＭＲ分析は、ＴＨＦの非存在を示した。標記化合物である得られたブタノン溶液を、次の工程で直接使用した。

工程４：２−ブロモ−３−［５−（２，２−ジメチル−プロピオニルアミノ）−ピラジン−２−イル］−３−オキソ−プロピオン酸tert−ブチルエステル（１１）の調製
電磁撹拌機を装備した１Ｌの丸底フラスコに、臭化リチウム７３．００mg（０．８４１mmol）及び工程３で得られたブタノン溶液（約１００mL）を入れたが、それは、理論上、３−［５−（２，２−ジメチル−プロピオニルアミノ）−ピラジン−２−イル］−３−オキソ−プロピオン酸−tert−ブチルエステル２７．０９ｇ（８４．３０mmol）及びブタノンおよそ７３mLを含有していた。得られた混合物に、Ｎ−ブロモスクシンイミド１５．１６ｇ（８５．１７mmol）の全量を、ＨＰＬＣにより反応を注意深くモニタリングしながら少しずつ加えた。室温で１時間撹拌した後、ＨＰＬＣ分析は完全な反応を示した。反応混合物を２５℃／２５mmHgで濃縮し、約７０mLの容量にし、次に酢酸エチル１３０mLで希釈し、水３×１００mLで洗浄した。３５℃／６０mmHgで濃縮した後、約９０mLの容量にし、得られた懸濁液をヘプタン２００mLで希釈し、再濃縮し、約９０mLの容量にした。次にヘプタン２００mLを加え、懸濁液を再度濃縮し、約１５０mLの容量にした。次に固体を濾過により回収し、ヘプタン２×５０mLで洗浄し、吸引により乾燥させて、標記化合物３２．１６ｇを明黄色の固体として得た；ＨＰＬＣ分析により測定した純度９８．７％（ＨＰＬＣカラム Zorbax XDB-C8、３×１００mm、３．５μm、溶離剤２０〜１００％アセトニトリル／水＋０１．％ＴＦＡ０．５mL／分で１０分間かけて、ＵＶ２５４nmで検出、保持時間９．５２分）。

工程５：Ｎ−［５−（２−ブロモ−アセチル）−ピラジン−２−イル］−２，２−ジメチル−プロピオンアミド（IId）の調製
電磁撹拌機及び窒素入口／出口を装備した５００mL丸底フラスコに、工程４で調製した化合物３２．１０ｇ（８０．１９mmol）、ジクロロメタン９０mL及びトリフルオロ酢酸５６．２０mL（７５６．６mmol）を入れ、反応混合物を室温で４０時間撹拌した。ＨＰＬＣ分析は完全な反応を示した。反応混合物を３０℃／３０mmHgで濃縮し、約４０mLの容量にし、トルエン２００mLで希釈し、濃縮し、約５０mLの容量にした。得られたスラリーをトルエン１００mLで希釈し、再度濃縮し、約５０mLの容量にした。ヘプタン１００mLで希釈した後、固体を濾過により回収し、吸引により乾燥させて、標記化合物２３．３０ｇ（収率９６．８％）を黄色の固体として得た；ＨＰＬＣ分析により測定した純度９９．１５％（工程４と同じ条件、保持時間７．７６分）。

工程６：酢酸２−［５−（２，２−ジメチルプロピオニルアミノ）−ピラジン−２−イル］−２−オキソ−エチルエステル（IIe）の調製
電磁撹拌機、添加漏斗、熱電対プローブ及び窒素入口／出口を装備した５００mLの丸底フラスコに、酢酸４．４０mL（７６．８６mmol）、ＤＭＦ１４０mL及び酢酸ナトリウム７．０００ｇ（８５．３３mmol）を入れた。次に、工程５で得られた化合物２３．３０ｇ（７７．６２mmol）を４５分間かけて少しずつ加えた。室温でさらに１時間撹拌した後、ＨＰＬＣは完全な反応を示した。反応混合物を酢酸エチル３５０mLで希釈し、飽和重炭酸ナトリウム１００mLを撹拌しながら加えた。有機層を分離し、水３×１００mLで洗浄し、３０℃／６０mmHgで濃縮し、約６０mLの容量にした。得られたスラリーをヘプタン２００mLで希釈し、３０℃／６０mmHgで濃縮し、約１５０mLの容量にし、５０℃で３０分間撹拌した。室温に冷ました後、固体を濾過により回収し、ヘプタン中の１０％酢酸エチル４０mLで洗浄し、吸引により乾燥させ、次に減圧下（室内圧）で２４時間乾燥させて、標記化合物１９．５２ｇ（収率９０．０％）をオフホワイトの固体として得た；ＨＰＬＣ分析により測定した純度９８．８１％（工程４と同じ条件、保持時間６．７８分）。
¹H-NMR (DMSO-d₆): 10.71 (s, 1H), 9.37 (d, 1H), 8.89 (d, 1H), 5.48 (s, 2H), 2.14 (s, 3H), 1.25 ppm (s, 9H)。

実施例２
Ｎ−［５−（２−クロロ−アセチル）−ピラジン−２−イル］−２，２−ジメチル−プロピオンアミド（IIf）の調製
機械式撹拌機、添加漏斗、熱電対プローブ及び窒素入口／出口を装備した１Ｌの三つ口丸底フラスコに、実施例１、工程２で調製した５−（２，２−ジメチル−プロピオニルアミノ）−ピラジン−２−カルボン酸メチルエステル（９）２４．１０ｇ（１０２mmol）、ＴＨＦ３００mLを入れ、ブロモクロロメタン２４．０mL（３６９mmol）を加えた。−９０℃のヘプタン−液体窒素の冷却浴を使用して−７８℃に冷却後、ヘキサン類中の２．６Mブチルリチウム１００．０mL（２６０mmol）の溶液を、反応混合物の温度を−７７±２℃で維持しながら、滴下した。次に、ブロモクロロメタン１５．０mL（２３１mmol）をさらに加え、続いて、反応混合物の温度を−７７±２℃で維持しながら、ヘキサン類中の２．６Mブチルリチウム５５．０mL（１４３mmol）をさらに滴下した。ＨＰＬＣ分析は完全な反応を示した。コールド混合物を、１N塩酸３００mL（３００mmol）にゆっくりと注ぎ、撹拌して周囲温度まで温めた。混合物を部分的に減圧下で濃縮し、沈殿した固体を濾過により単離し、水で洗浄し、吸引により乾燥させて、粗生成物１９．４２ｇを明橙色の固体として、ＨＰＬＣ分析により測定した純度９１．５％を得た。この粗生成物、１９．０ｇを、酢酸エチル１００mL中でスラリー化し、得られた懸濁液をヘプタン５０mLで希釈した。次に、固体を濾過により回収し、ヘプタン：酢酸エチル１：１の２×５０mLで洗浄し、吸引により乾燥させて、クロロケトン１３．５ｇ（収率５３％）をオフホワイトの固体として、ＨＰＬＣ分析により測定した純度＞９９％を得た。
¹H-NMR (DMSO-d₆): 10.71 (s, 1H), 9.35 (d, 1H), 8.94 (d, 1H), 5.20 (s, 2H), 1.25 ppm (s, 9H)。

実施例３
発酵及び生体内変換
脱イオン水１Ｌ当たりグルコース２０ｇ、酵母抽出物１０ｇ及びソイトン１０ｇを含む５０８Ｓ培地１００mlを入れた２×５００mlバッフルフラスコに、Ｃ．パラプシローシスＲ２５９９の冷凍貯蔵品１mlを播種した。次にフラスコを、２２０rpmに設定したオービタルシェーカー上で２７℃にて７２時間インキュベートした。次にフラスコの内容物を、適切な播種フラスコ中にプールして、脱イオン水１Ｌ当たりグルコース２０ｇ、酵母抽出物１０ｇ、ソイトン１０ｇ及びアミノ酸不含酵母ニトロゲンベース６．７ｇを含むＹＳＤ培地５Ｌ及びShell Aseol消泡剤０．３mlを入れた７．５Ｌ発酵槽に播種した。発酵パラメーターを、次の通りに設定した：温度２７℃；溶解した酸素を、曝気及び撹拌速度の自動調節により５０％以上に保持し；２５％w/v水酸化アンモニウムの自動添加によりｐＨを６．５で保持し；エタノール（１００％）を４〜５％v/v／日の速度で線量計を使用して供給した。２０時間培養後、ブロス１．５Ｌを除去し、エタノール供給を開始した。さらに２時間後、酢酸２−［５−（２，２−ジメチルプロピオニルアミノ）−ピラジン−２−イル］−２−オキソ−エチルエステル（実施例１）１７５．５ｇを、水８７５mL中の懸濁液として加えて、最終濃度５％（w/v）を得た。周期的に試料を除去し、ＨＰＬＣにより分析して、（Ｓ）−Ｎ−［５−（１，２−ジヒドロキシ−エチル）−ピラジン−イル］−２，２−ジメチル−プロピオンアミド（７）の滴定量及びこの生成物の鏡像異性体純度もまた測定した。６８時間後に反応が完了したと判断された時、ブロスをインサイツで７０℃に３０分間加熱することにより、Ｃ．パラプシローシスを不活性化した。

単離
上記で得られた加熱不活性化ブロスを、生成物単離に使用した。ブロス４．２３Ｌを、スイングアウトローター（３５００rpm、１５分間）を有する理化学用遠心機上で遠心分離した。乳白色の上清（３．６０Ｌ）を除去した。沈殿物を水０．８Ｌ中に再懸濁し、遠心分離して、不透明な上清０．７６Ｌを得た。合わせた水溶液を酢酸エチルで３回抽出した（各９Ｌ）。最初の抽出で、自然な相分離が生じた。第二の抽出で、エマルションを得た。エマルションを、dicalite speed plus(Acros Organics 123380010)２５０ｇ中で混合し、そして混合物を減圧下で濾過（Filtrox filter plate AF 50/8427）することにより分解した。第三の抽出で、急速相分離が得られた。得られた有機抽出物をプールし、実験用ロータリーエバポレーターで、減圧下で濃縮した。濃縮物を、スプーン２杯のdicalite speed plusと混合し、濾過し、酢酸エチルで１．００Ｌの濃縮物にした。濃縮物は、（ｓ）−ジオール（７）１１４．４ｇを含有した。

濃縮物の試料を乾燥させ、そして以下の分析データを示した：（ＨＰＬＣ）：ＨＰＬＣによるエリア純度により９９．４％（カラムSupelcoSil ABZ+、４．６×２５０mm、５μm、溶離剤２０〜９０％アセトニトリル／水＋０．１％ＴＦＡ１ml／分で１０分間かけて、ＵＶ３００nmで検出、保持時間４．２６分）、キラルＨＰＬＣにより９２．０％ｅｅ（カラムChiralpak AD-H、溶離剤２０％エタノール／８０％アセトニトリル１ml／分で、４０℃、ＵＶ２３７nmで検出、保持時間：１８．１４分（Ｒ−ジオール）及び２０．８６分（Ｓ−ジオール））。
¹H-NMR (DMSO-d₆): 10.15 (s, 1H), 9.18 (s, 1H), 8.44 (s, 1H), 5.54 (d, 1H), 4.72 (t, 1H), 4.63 (dd, 1H), 3.69 (m, 1H), 3.53 (m, 1H), 1.25 ppm (s, 9H)。
ＭＳ（イオンスプレー）：ｍ／ｚ２４０．１（Ｍ２３９．１に対してＭ＋Ｈ）。

実施例４
大規模な複数の酵素による反応
酢酸２−［５−（２，２−ジメチルプロピオニルアミノ）−ピラジン−２−イル］−２−オキソ−エチルエステル（１７８mmol）５０ｇを、tert−ブチルメチルエーテル（ＴＢＭＥ）１５０ml中で撹拌した。次いで、反応緩衝液、２０mM ２−（４−モルホリノ）−エタンスルホン酸６７４mL、及びＤ−グルコース（６５８mmol）１００．１ｇを加えた。温度を２９℃に調整し、ｐＨを６．２５にした。反応−脱アセチル化−を、リパーゼＡＨ２．０１ｇを加えて開始した。直後に、グルコースデヒドロゲナーゼＧＤＨ１０２４０mg、ケトレダクターゼＫＲＥＤ１０１２０１mg及びコファクターＮＡＤＰ２０２mgを、不斉還元を開始するために加えた。反応温度を３７℃まで上昇させた。撹拌した懸濁液を、１．０N水酸化ナトリウム溶液の制御添加（ｐＨスタット）によりｐＨ６．２５（及び３７℃）で保持した。１１．２時間後、１．０N水酸化ナトリウム３５４．１mLをすべて消費した後、そして完全に変換した後、反応混合物をさらに１０．５時間撹拌した。生成物を抽出するために、塩化ナトリウム３００ｇを反応混合物に加え、ｐＨを７．５に調整した。次いで、反応混合物を酢酸エチル１Ｌで５回抽出した。相分離が自然に生じた。合わせた有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、蒸発させ、高真空下で一晩乾燥させた。（Ｓ）−Ｎ−［５−（１，２−ジヒドロキシ−エチル）−ピラジン−イル］−２，２−ジメチル−プロピオンアミド（４）４４．７６ｇ（ＨＰＬＣ純度９６．４％、［SupelcoSil ABZ+、２５０×４．６mm、溶離剤２０〜９０％アセトニトリル／水＋０．１％ＴＦＡ１mL／分で１０分間かけて、ＵＶ３００nmで検出、保持時間５．３分］、ｅｅ＞９９．９％［Chiralpak IA、２５０×４．６mm、５μm、溶離剤５０％ヘプタン５０％エタノール／メタノール１：１１mL／分で２０分間かけて、ＵＶ２４０nmで検出、保持時間鏡像異性体９．３分及び１０．９分］）を、明橙色の、高粘性油状物として単離した。

実施例５
酢酸２−［５−（２，２−ジメチルプロピオニルアミノ）−ピラジン−２−イル］−２−オキソ−エチルエステルの小規模還元
酢酸２−［５−（２，２−ジメチルプロピオニルアミノ）−ピラジン−２−イル］−２−オキソ−エチルエステル２mgを、ＤＭＳＯ２０μlに溶解し、２−プロパノール２０μl、１００mM ２−（４−モルホリノ）−エタンスルホン酸１．５ml、ｐＨ６．０、ＮＡＤＰＨ３mg及びケトレダクターゼ３mgを含有する反応バイアルに加えた（表１参照）。２時間後、反応物を酢酸エチル０．５mlで抽出し、キラルＨＰＬＣを介して分析した（［キラルセルOD-H、２５０×４．６mm、Nr.146、溶離剤６５％ヘプタン２０％ヘプタン＋０．１％ＴＦＡ１５％イソ−プロパノール、１mL／分で１５分間かけて４０℃、ＵＶ２１０nmで検出、保持時間鏡像異性体６．２分及び７．２分］、結果は表２参照）。

表２：対応するアセトキシアルコール（酢酸２−［５−（２，２−ジメチルプロピオニルアミノ）−ピラジン−２−イル］−２−ヒドロキシ−エチルエステル）の形成について選択された分析結果

実施例６
小規模な複数の酵素による反応
酢酸２−［５−（２，２−ジメチルプロピオニルアミノ）−ピラジン−２−イル］−２−オキソ−エチルエステル（IIe）１mgを、ＤＭＳＯ２０μlに溶解し、２−プロパノール２０μl、１００mMリン酸カリウム１．５ml、ｐＨ７．２、ＮＡＤＰＨ３mg、Lipozyme CALB L［Novozyme］３０μl及びケトレダクターゼ２mgを含有する反応バイアルに加えた（表２参照）。１６時間後、反応物を酢酸エチル０．５mlで抽出し、キラルＨＰＬＣを介して分析した（［キラルセルAD-H、Nr.417、溶離剤９０％エタノール１０％メタノール、１mL／分で３０分間かけて４０℃、ＵＶ２１０nmで検出、保持時間鏡像異性体９．２分及び１０．２分］、結果は表３参照）。

表３：対応する（Ｓ）−ジオール（４）の形成について選択された分析結果

実施例７
Ｎ−［５−（２−クロロ−アセチル）−ピラジン−２−イル］−２，２−ジメチル−プロピオンアミド（IIf）の酵素還元
Ｎ−［５−（２−クロロ−アセチル）−ピラジン−２−イル］−２，２−ジメチル−プロピオンアミド（実施例２、５．８mmol）１．５ｇを、ｐＨ電極、ｐＨ制御注入ポンプ及び撹拌機を装備した反応器に入れた。次いで、反応緩衝液、１００mMリン酸カリウム緩衝液３００ml及びＤ−グルコース（１７．７mmol）３．５ｇを加えた。温度を３０℃に調整し、ｐＨを６．５にした。不斉還元を、グルコースデヒドロゲナーゼＧＤＨ１０２２５mg、ケトレダクターゼＫＲＥＤ１０１１００mg及びコファクターＮＡＤＰ２５０mgを加えて開始した。１．０N水酸化ナトリウム溶液の制御添加（ｐＨスタット）によりｐＨをｐＨ６．５（及び３０℃）で保持した。４６時間後、１．０N水酸化ナトリウム５．７９mLのすべてを消費した後、反応物を濾過により浄化した。次いで、生成物を酢酸エチル０．４Ｌで抽出した。相分離が自然に生じた。有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、蒸発させ、高真空下で一晩乾燥させた。（Ｓ）−クロロアルコール１．４２ｇ（ＨＰＬＣ純度９７．７％、［Suplecosil Abz+、２５０×４．６mm、溶離剤３５〜９０％アセトニトリル／水＋０．１％ＴＦＡ、１mL／分で１０．９分間かけて２５℃、ＵＶ３００nmで検出、保持時間５．６分］、ｅｅ＞９９．９％［キラルセルOD-H、２５０×４．６mm、溶離剤８５％ヘプタン１５％エタノール＋０．０１M酢酸アンモニウム、０．８mL／分で２５分間かけて２５℃、ＵＶ３０２nmで検出、保持時間鏡像異性体６．６分及び７．５分］）を、明黄色の結晶として単離した。
¹H-NMR (DMSO-d₆): 10.21 (s, 1H), 9.2 (d, 1H), 8.50 (d, 1H), 6.10 (d, 2H), 4.94 ppm (d/tr, 1H), 3.92 (d/d, 2H), 1.25 ppm (s, 9H)。
ＭＳ（イオンスプレー）：ｍ／ｚ２５７．８（Ｍ２５７．１に対してＭ＋Ｈ）。

実施例８
２（Ｒ）−（３−クロロ−４−メタンスルホニル−フェニル）−３−シクロペンチル−Ｎ−［５−（１（Ｓ），２−ジヒドロキシ−エチル）−ピラジン−２−イル］−プロピオンアミド（III）の調製
工程１：Ｎ−［５−（（Ｓ）−２，２−ジメチル−［１，３］ジオキソラン−４−イル）−ピラジン−２−イル］−２，２−ジメチル−プロピオンアミド（１２）の調製
テトラヒドロフラン（２７５mL）中のＮ−［５−（１（Ｓ），２−ジヒドロキシ−エチル）−ピラジン−２−イル］−２，２−ジメチル−プロピオンアミド（４６ｇ（溶媒で僅かに湿潤した）、約１７０mmol）の溶液を、２，２−ジメトキシプロパン（２２５mL、１．８８mol）及びｐ−トルエンスルホン酸一水和物（３．４ｇ、１７．９mmol）で処理した。反応混合物を２５℃で１６．５時間撹拌した。薄層クロマトグラフィーは、反応が完了してより小さい極性の生成物を形成したことを示した。反応混合物を減圧下で濃縮し、残留物を塩化メチレン（６００mL）に溶解した。有機層を飽和塩化ナトリウム水溶液（２５０mL）及び飽和重炭酸ナトリウム水溶液（２５０mL）で洗浄した。各々の水層を塩化メチレン（２５０mL）で逆抽出した。合わせた有機層を硫酸ナトリウム（３５mg）及びNorit A Charcoal（８ｇ）で撹拌し、次にセライトパッドを通して濾過した。濾液を減圧下で濃縮して約２５０ｇの重量になった。物質をジエチルエーテル（３００mL）で処理し、混合物を再度減圧下で濃縮して約３５０ｇの重量になり、その時点で、結晶化が始まった。混合物を冷蔵庫（４℃）で４時間貯蔵し、濾過した。固体を減圧オーブン中で３０℃にて１６時間乾燥させて、白色の結晶（３２．３ｇ、６８％）、融点１４４〜１４４．５℃を得た。母液からさらなる生成物を回収して、白色の結晶（９．５ｇ、２０％）を得て、それは純度が第一生成物と同程度であった。キラルカラムを用いる高速液体クロマトグラフィー分析は、いずれの生成物も標準ラセミ化合物試料と比較して１００％ｅｅであることを示した。２つの生成物を合わせて、所望のＮ−［５−（（Ｓ）−２，２−ジメチル−［１，３］ジオキソラン−４−イル）−ピラジン−２−イル］−２，２−ジメチル−プロピオンアミドを得た。

工程２：５−（（Ｓ）−２，２−ジメチル−［１，３］ジオキソラン−４−イル）−ピラジン−２−イルアミン（１３）の調製
メタノール（１５０mL）中のＮ−［５−（（Ｓ）−２，２−ジメチル−［１，３］ジオキソラン−４−イル）−ピラジン−２−イル］−２，２−ジメチル−プロピオンアミド（８．４ｇ、３０．７mmol）及び炭酸カリウム（４．３２ｇ、３１．２mmol）の混合物を、２５℃で１６．５時間撹拌し、その時点で、薄層クロマトグラフィーは、より大きい極性生成物への部分変換を示唆した。不斉中心でエピマー化を回避する目的で、反応を完了前に中止した。したがって、溶媒を減圧下、２５℃で除去した。得られた残留物を酢酸エチル（５０mL）から減圧下で再度濃縮した。物質を、Biotage クロマトグラフィー（FLASH 40L、シリカ、酢酸エチル）を使用して精製した。回収した早期の画分から未反応の出発物質ピバロイルアミドを白色の固体（２．０ｇ、２４％）として回収することができた。後から得た画分を減圧下で濃縮して、５−（（Ｓ）−２，２−ジメチル−［１，３］ジオキソラン−４−イル）−ピラジン−２−イルアミン（３．７ｇ、６３％）を淡黄色の油状物として得た。キラルカラムを用いた高速液体クロマトグラフィー分析は、１００％ｅｅを示した。

工程３：２（Ｒ）−（３−クロロ−４−メタンスルホニル−フェニル）−３−シクロペンチル−Ｎ−［５−（（Ｓ）−２，２−ジメチル−［１，３］ジオキソラン−４−イル）−ピラジン−２−イル］−プロピオンアミド（１４）の調製
塩化メチレン（７０ml）中の２（Ｒ）−（３−クロロ−４−メタンスルホニル−フェニル）−３−シクロペンチル−プロピオン酸（実施例１において調製した、６．２９ｇ、１９．０１mmol）及びＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（２滴）の溶液を２℃で撹拌し、次に塩化オキサリル（４．１５mL、４５．７mmol）で処理した。混合物を２℃で５分間、そして２５℃で１５分間撹拌した。次に反応混合物を減圧下で濃縮した。残留物をベンゼン（２５ml）に溶解し、蒸発を繰り返した。得られた酸クロリドを塩化メチレン（４０mL）に溶解し、０℃に冷却し、次に５−（（Ｓ）−２，２−ジメチル−［１，３］ジオキソラン−４−イル）−ピラジン−２−イルアミン（３．６５ｇ、１８．９５mmol）、ピリジン（４．６mL、５６．９mmol）及び塩化メチレン（４０mL）からなる溶液で処理した。混合物を、冷却浴を継ぎ足さずに１６時間撹拌した。次に反応混合物を１N塩酸水溶液（１００ml）で処理した。層を分離して、水層を塩化メチレン（７５mL）で抽出した。有機層を飽和重炭酸ナトリウム水溶液（１００mL）及び飽和塩化ナトリウム水溶液で洗浄した。合わせた有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮した。Biotageクロマトグラフィー（FLASH 40L、シリカ、１／１酢酸エチル／ヘキサン）により、２（Ｒ）−（３−クロロ−４−メタンスルホニル−フェニル）−３−シクロペンチル−Ｎ−［５−（（Ｓ）−２，２−ジメチル−［１，３］ジオキソラン−４−イル）−ピラジン−２−イル］−プロピオンアミド（８．９ｇ、９２％）を、白色の泡状物として得た：（ＥＳ）^＋−ＨＲＭＳｍ／ｅ、Ｃ_２４Ｈ_３０ＣｌＮ_３Ｏ_５Ｓ（Ｍ＋Ｈ）^＋の計算値５０８．１６６８、実測値５０８．１６７１。

工程４：２（Ｒ）−（３−クロロ−４−メタンスルホニル−フェニル）−３−シクロペンチル−Ｎ−［５−（１（Ｓ），２−ジヒドロキシ−エチル）−ピラジン−２−イル］−プロピオンアミド（III）の調製
テトラヒドロフラン（５０mL）中の２（Ｒ）−（３−クロロ−４−メタンスルホニル−フェニル）−３−シクロペンチル−Ｎ−［５−（（Ｓ）−２，２−ジメチル−［１，３］ジオキソラン−４−イル）−ピラジン−２−イル］−プロピオンアミド（８．８５ｇ、１７．４mmol）の溶液を、１N塩酸水溶液（５０mL）で処理した。得られた乳白色の反応混合物を２５℃で１５分以内に撹拌し、乳白色の反応混合物が清澄になった。撹拌を２５℃で１６時間続けた。反応物を減圧下で濃縮し、残留物を塩化メチレン（１×１００mL、次に２×５０mL）で抽出した。各々の有機抽出物を飽和重炭酸ナトリウム水溶液（５０mL）及び飽和塩化ナトリウム水溶液（５０mL）で洗浄した。合わせた有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮した。Biotageクロマトグラフィー（FLASH 40L、シリカ、１／１酢酸エチル／ヘキサン、次に１００％酢酸エチル）により、２（Ｒ）−（３−クロロ−４−メタンスルホニル−フェニル）−３−シクロペンチル−Ｎ−［５−（１（Ｓ），２−ジヒドロキシ−エチル）−ピラジン−２−イル］−プロピオンアミド（７．１５ｇ、８８％）を、無色の泡状物として得た：（ＥＳ）^＋−ＨＲＭＳｍ／ｅ、Ｃ_２１Ｈ_２６ＣｌＮ_３Ｏ_５Ｓ（Ｍ＋Ｈ）^＋の計算値４６８．１３５５、実測値４６８．１３６０。

Claims

式（Ｉ）：

［式中、Ｒは、低級アルキルカルボニル又はアミノ保護基であり、そしてＲ^１は、ヒドロキシ又はハロゲンである］で示される化合物の製造方法であって、
式（II）：

［式中、Ｒ^２は、低級アルキルカルボニルオキシ又はハロゲンである」］で示されるケトンの酵素加水分解及び／又は酵素不斉還元による方法。
Ｒ^１がヒドロキシであり、そしてＲ^２がアセチルオキシである、請求項１記載の方法。
酵素加水分解及び酵素不斉還元が、種カンジダ・パラプシローシス（Candida parapsilosis）の酵母を用いて実施されることを特徴とする、請求項２記載の方法。
酵素加水分解が、エステラーゼ、プロテアーゼ及びリパーゼからなる群より選択されるヒドロラーゼを用いて実施され、そして後続の酵素不斉還元が１個以上のオキシドレダクターゼを用いて実施されることを特徴とする、請求項３記載の方法。
酵素加水分解が、リパーゼを用いて実施されることを特徴とする、請求項４記載の方法。
リパーゼが、カンジダ・アンタークティカ（Candida Antarctica）、アルカリゲネス（Alcaligenes）種又はバークホルデリア・セパシア（Burkholderia cepacia）から得られることを特徴とする、請求項５記載の方法。
ケトレダクターゼ又はアルコールデヒドロゲナーゼが、オキシドレダクターゼとして使用されることを特徴とする、請求項４記載の方法。
ＫＲＥＤ１０１、ＫＲＥＤ１０７、ＫＲＥＤ１１１、ＫＲＥＤ１１２、ＫＲＥＤ１１３、ＫＲＥＤ１１４、Ａ１Ｆ、Ｂ１Ｄ及びＢ１Ｅからなる群より選択されるケトレダクターゼの１個が、グルコースデヒドロゲナーゼＧＤＨ１０２と組み合わされて、オキシドレダクターゼとして使用されることを特徴とする、請求項４又は請求項７記載の方法。
Ｒ^１及びＲ^２が、塩素であることを特徴とする、請求項１記載の方法。
酵素不斉還元が、１個以上のオキシドレダクターゼを用いて実施されることを特徴とする、請求項９記載の方法。
ケトレダクターゼ又はアルコールデヒドロゲナーゼが、オキシドレダクターゼとして使用されることを特徴とする、請求項１０記載の方法。
Ｒが低級アルキルカルボニルであることを特徴とする、請求項１〜１１のいずれか一項記載の方法。
Ｒがtert−ブチルカルボニルであることを特徴とする、請求項１〜１２のいずれか一項記載の方法。
式（IIc）：

［式中、Ｒ^２は、低級アルキルカルボニルオキシ又はハロゲンである］
で示される化合物。
Ｒ^２が、アセチルオキシ又はハロゲンである、請求項１４記載の式（IIc）の化合物。
式（Ic）：

で示される化合物。
式（III）：

で示される化合物の製造方法であって、
請求項１〜１２記載の方法を含み、続いて、
ａ）式（Ia）：

［式中、Ｒは、低級アルキルカルボニル又はアミノ保護基である］で示されるジオールを、２，２−ジメトキシプロパンと反応させてアセタールを形成して、塩基性条件下でアミンを脱保護して、
式（IV）：

で示される化合物を得ること；
ｂ）式（IV）のアミンと
式（Ｖ）：

で示されるカルボン酸又はその活性化誘導体との縮合により、アミドを得ること；そして
ｃ）酸性条件下でアセタールを加水分解すること
を含む、方法。
本明細書に前記の新規な方法及び化合物。