CZ303884B6 - Stereoselektivní zpusob prípravy (3S,2R)-1-halogen-2-hydroxy-3-(chránených)amino-4-substituovaných butanu - Google Patents

Abstract

Stereoselektivní zpusob prípravy (3S,2R)-1-halogen-2-hydroxy-3-(chránených)amino-4-substituovaných butanu vzorce I, kde Hal je halogen, R je vybrán ze skupiny sestávající z alkylu, substituovaného alkylu, arylu a substituovaného arylu a R.sub.1.n. je chránicí skupina aminové funkcní skupiny, pri nemz se (3S)-1-halogen-2-oxo-3-(chránený)amino-4-substituovaný butan vzorce II, kde Hal, R a R.sub.1.n. mají výse uvedený význam, uvádí do styku s mikroorganismem schopným katalyzovat stereoselektivní redukci slouceniny vzorce II, vybraným ze skupiny sestávající z Rhodococcus erythropolis ATCC 4277, Rhodococcus erythropolis DSM 6971 a Rhodococcus sp. ATCC 21227, Rhodococcus erythropolis ATCC 27854 a Brevi-bacterium sp. ATCC 19653 za takových podmínek, ze se uskutecní redukce a získá se uvedená sloucenina vzorce I.

Description

Vynález se týká způsobu příprava (3S,2R)-l-haIogen-2-hydroxy-3-(chráněných)amino-4substituovaných butanů stereoselektivní redukcí odpovídajících oxo sloučenin. Substituované butany, produkované způsobem podle vynálezu, jsou prekursory hydroxyethylaminových izomemích podjednotek, přítomných v mnoha molekulách, které jsou terapeuticky vhodné jako inhibitory enzymů konvertujících angiotensin (ACV), reninu a HlV-proteázy.

Dosavadní stav techniky

Bing-nan Zhou et al., J. Am. Chem. Soc., 105, 5926 až 5928, 1983 popisuje chemomikrobiologickou syntézu L-kamitinu, který hraje významnou úlohu v lidském metabolismu a transportu mastných kyselin s dlouhým řetězcem. Konkrétně, tato práce uvádí redukci pomocí droždí, tj. Saccharomyces cerevisiae, ethyl K-chloracetoacetátu na ethyl(S)-4-chlor-3-hydroxybutanoát.

Kazutoshi Ushio et al., Tetrahedron Letters, Vol. 27, No. 23, 2657 až 2660, 1986 popisuje redukci beta-keto esterů pomocí kvasinek rostoucích na methanolu. Tato práce uvádí, že předmětná reakce způsobuje dramatický enantiomemí posun v přebytku D-izomeru ve výsledném produktu. Tento fenomén byl získán, jestliže byla reakce prováděna s použitím kvasinek rostoucích na methanolu, díky enzymům charakteristickým pro kvasinky pěstované v takových médiích.

Markus Christen et al., J. Chem. Soc., Chem., Commun., 264 až 266, 1988, uvádí syntézu čtyř stereoizomerů methyl-6-(p-chlorfenylthio)-3,4-dihydrohexanoátu, ve které bylo nejdůležitější zavedení chirality uskutečněno vhodnou redukcí kvasinkami. Předpokládá se, že ačkoliv redukce beta-keto esterů kvasinkami byla intenzivně studována, zůstává nadále obtížným předpovědět buď absolutní konfiguraci produktu (produktů), nebo zejména pravděpodobnost získání enantiomemího nadbytku.

Antonio Trincone et al., (Biotechnology and Bioengineering, Vol. 35, 559 až 564, 1990 popisuje asymetrickou redukci ketonu buňkami, které se nedělí, Sulfolobus solfataricus. Uvádí se, že redukční schopnost nedělících se buněk tohoto organismu silně závisí na fázi buněčného růstu.

Ramesh Patel et al., Enzyme Microb. Technol., Vol., 13, 906 až 912, 1991 popisuje stereospecifickou mikrobiální redukci 4,5-dihydro-4-(4-methoxyfenyl)-6-(trifluormethyl-lH-l)benzazepin-2-onu. Konkrétně se uvádí, že klíčový meziprodukt (3R-cis)-l,3,4,5-tetrahydro-3hydroxy-4-(4-methoxyfenyl)-6-(trifluormethyl)-2I-I-l-benzazepÍne-2-on byl připraven stereoselektivní mikrobiální redukcí odpovídajícího ketonu. Předpokládá se, že výběrem specifických podmínek je možné získat jeden izomer ze čtyř známých možností.

Ramesh Patel et al., Enzyme Microb. Technol., Vol. 15, 1014 až 1021, 1993, popisuje stereoselektivní redukci di-keto sloučeniny, methyl esteru kyseliny 3,5-dioxo-6-(benzyloxy)hexanové na jediný enantiomer výsledné dihydroxy sloučeniny.

Ramesh Patel et al., Enzyme Microb. Technol., Vol 14, 731 až 738, 1992, popisuje postup tepelného ošetření Geotrichum candidum ke zvýšení optické čistoty hydroxy produktu, získaného redukcí odpovídajících beta-keto esterů.

Kometani et al., Journal of Fermentation and Bioengineering, Vol. 80, No. 2, 208 až 210, 1995, popisuje kvasinkami zprostředkovanou bioredukci s použitím ethanolu jako zdroje energie. Byl

I sledován vztah mezi rychlostí spotřeby ethanolu a rychlostí redukce prochirálního ketonu pekařskými kvasinkami se závěrem, že ethanol by mohl být použitelný k produkci chirálních alkoholů z prochirálních ketonů ve velkém měřítku.

Ramesh Patel et al., patent US 5 391 495, vydaný 21.2.1995, popisuje stereoselektivní redukci určitých sulfonamidových sloučenin obsahujících ketoskupiny pro tvorbu odpovídajících sloučenin obsahujících hydroxylovou skupinu s použitím mikroorganismů nebo enzymů schopných katalyzovat redukci. Jmenovanými enzymy jsou oxidoreduktáza nebo dehydrogenáza a mikroorganismy jsou přednostně vybrány z druhů Hansenula, Rhodococcus a Nocardia.

Podstata vynálezu

Předkládaný vynález je zaměřen na nový stereoselektivní způsob přípravy (3S,2R)-l-halo-2hydroxy-3-(chráněných)amino-4-substituovaných butanů redukcí odpovídajících sloučenin obsahujících ketoskupinu určitými druhy Rhodococcus a Brevibacterium. Produkty jsou získány ve vysokém výtěžku a o vynikající diastereomemí čistotě.

Následuje podrobnější popis vynálezu.

Konkrétně je předmětem vynálezu stereoselektivní způsob přípravy (3S,2R)-l-halogen-2hydroxy-3-(chráněných)amino-4-substituovaných butanů vzorce I

kde Hal je halogen, R je vybrán ze skupiny sestávající z alkylu, substituovaného alkylu, arylu a substituovaného arylu a R, je chránící skupina aminové funkční skupiny, jehož podstata spočívá v tom, že se (3S)-l-halogen-2-oxo-3-{chráněný)-amino-4-substituovaný butan vzorce II

kde Hal, R a Ri mají výše uvedený význam, uvádí do styku s mikroorganismem schopným katalyzovat stereoselektivní redukci sloučeniny vzorce II, vybraným ze skupiny sestávající z Rhodococcus erythropolis ATCC 4277, Rhodococcus erythropolis DSM 6971 a Rhodococcus sp. ATCC 21227, Rhodococcus erythropolis ATCC 27854 a Brevibacterium sp. ATCC 19653 za takových podmínek, že se uskuteční redukce a získá se uvedená sloučenina vzorce I.

Přednostní provedení způsobu zahrnují zejména způsob podle výše uvedeného hlavního provedení vynálezu, kde

Hal je chlor, R je fenyl a R, je t-butoxykarbonyl; mikroorganismem je Rhodococcus erythropolis ATCC 4277; mikroorganismem je Rhodococcus erythropolis DSM 6971;

- mikroorganismem je Rhodococcus sp. ATCC 21227;

- mikroorganismem je Rhodococcus erythropolis ATCC 27854; nebo

- mikroorganismem je Brevibacterium sp. ATCC 19653;

Způsob podle výše uvedeného hlavního provedení vynálezu se může provádět jako jednostupňová fermentace nebo jako dvoustupňová fermentace.

Přednostně se také fermentace provádí v přítomnosti induktoru, kteiým je výhodně sloučenina vzorce I, která je přidána během růstu mikroorganismu.

Sloučenina vzorce I se přednostně získává v alespoň 70% výtěžku a o alespoň 93% diastereomemí čistotě, zvláště výhodně v alespoň 95% výtěžku a o alespoň 99% diastereomemí čistotě.

Substituované butany vzorce I jsou užitečné jako meziprodukty v syntéze molekul, které jsou inhibitory ACE, reninu a HIV proteáz. Aktivita takových molekul proti HIV proteázám je činí hodnotnými a ošetření retrovirálních infekcí, jako je AIDS. Takové sloučeniny a jejich například popsány v patentu US 5 849 911, jehož popis je zde uveden jako odkaz. Zvláště významnou AIDS sloučeninou popsanou v patentu US 5 849 911 je dimethyl ester [3S— (3R*,8R*,9R*,12R*)]-3,12-bis(l,l-dimethylethyl)-8-hydroxy-4,l-dioxo-9-(fenylmethyl)6{[4-(2-pyridyl)fenyl]methyl}-2,3,6,10,13-pentaazatetradekandiové kyseliny. Tato sloučenina může být přímo syntetizována s (3S,2R)-l-halo-2-hydroxy-3-(chráněných)amino-4-substituovaných butanů znázorněných vzorcem I. Skutečnost, že způsob podle předkládaného vynálezu produkuje velmi vysoký výtěžek trans (1 S,2S) enantíomeru substituovaných butanů vzorce I, činí vynález významným pro konečnou účinnost syntézy výše popsané terapeutické sloučeniny.

Následně jsou uvedeny definice používaných termínů. Výraz „alkyl“ znamená případně substituovaný přímý nebo rozvětvený nasycený uhlovodíkový řetězec mající od 1 do 7 uhlíkových atomů, přednostně 1 až 4 uhlíkové atomy. Výraz „nižší alkyl“ znamená případně substituované alkylové skupiny mající 1 až 4 uhlíkové atomy.

Výraz „substituovaný alkyl“, znamená alkylovou skupinu substituovanou například jedním nebo čtyřmi substituenty, jako je halogen a skupiny trifluormethyl, trifluormethoxy, hydroxy, alkoxy, cykloalkoxy, heterocyklyloxy, oxo, alkanoyl, aryl, aryloxy, aralkyl, alkanoyloxy, amino, alkylamino, alkylamino, arylamino, aralkylamino, cykloalkylamino, heterocykloamino a distubstituovaná amino skupina. Zde uvedené definice pro alkyl a substituovaný alkyl jsou rovněž platné pro alkylové podíly alkoxy skupin.

Výraz „aryl“ znamená monocyklické nebo bicyklické aromatické uhlovodíkové skupiny mající od 6 do 12 atomů uhlíku v kruhu, jako je například fenylová, naftylová, bifenylová a difenylová skupina, z nichž může být substituována.

Výraz „substituovaný aryl“ znamená arylovou skupinu substituovanou například jedním nebo čtyřmi substituenty, jako je alkyl, substituovaný alkyl, halogen a skupiny trifluormethyl, trifluromethoxy, hydroxy, alkoxy, cykloalkoxy, heterocyklyloxy, alkanoyl, alkanoyloxy, amino, alkylamino, dialkylamino, aralkylamino, cykloalkylamino, heterocyklylthio, ureido, nitro, kyano, karboxy, karboxyalkyl, karbamyl, alkoxykarbonyl alkylthio, arylthio, alkylsulfonyl, sulfonamido, aryloxy a podobně.

Výraz „halogen“ nebo „Hal“ znamená chlor, brom, fluor a jod, přednostně chlor.

Výraz „chránící skupina aminofunkce“ znamená v oboru známou skupinu sloučenin, které mohou být připojeny k aminoskupině tak, aby bylo zabráněno zahrnutí aminokyselin do reakce probíhající kdekoliv v molekule sloučeniny, k níž je připojena. Preferovanou skupinou je

-3CZ 303884 B6 t-butoxykarbonyl (BOC), nicméně v oboru známé funkční chránící skupiny, obecně alkoxykarbonylové skupiny, jako je benzyloxykarbonyl, mohou být rovněž použity.

Výchozími sloučeninami pro předmětný způsob přípravy (3S,2R)-l-halo-2-hydroxy~3-(chráněných)amino-4-substituovaných butanů znázorněných vzorcem I jsou odpovídající sloučeniny obsahující keto-skupinu znázorněné vzorcem 11

kde Hal, R a R, jsou definovány výše. Sloučeniny znázorněné vzorcem II mohou být připraveny technikami popsanými v literatuře a běžně známými odborníkům v oboru. Výhodný způsob pro přípravu sloučenin vzorce lije popsán v US patentu 6 399 793.

Podle této metody je aryl ester znázorněný vzorcem

ve kterém R a R, byly definovány výše, R₂ je vodík nebo nitroskupina a může být substituován v ortho nebo para pozici na fenylovém kruhu, reaguje se simým ylidem, tj. sloučeninou obsahující funkci znázorněnou vzorcem

k získání intermediámí keto-ylidové sloučeniny vzorce

kde R a R| byly definovány výše, R₃ a R4 jsou vybrány ze skupiny sestávající z alkylu, substituovaného alkylu a arylu. Keto-ylidová sloučenina znázorněná vzorcem výše je pak přeměněna na keto-skupinu obsahující sloučeniny znázorněné vzorcem II reakcí se zdrojem chloru, přednostně s bazickým zdrojem chloru, nejvýhodněji chloridem litným a organickou kyselinou, např. kyselinou methansulfonovou.

(3S,2R)-l-halo-2-hydroxy-3-(chráněné)amino-4-substituované butany znázorněné vzorcem I jsou významnými meziprodukty syntézy molekul, které jsou inhibitory ACE, reninu a HIV proteáz. Aktivita takových molekul proti HIV proteázám je činí hodnotnými v ošetření retrovirálních infekcí, jako je AIDS. Konkrétně, na (3S,2R)-l-halo-2-hydroxy-3-(chráněné)amino4-substituované butany vzorce I se působí vhodnou bází kjejich přeměně na odpovídající epoxidy znázorněné vzorcem uvedeným níže

Epoxidové sloučeniny výše uvedeného vzorce jsou meziprodukty, které mohou být přeměněny na významnou AIDS sloučeninu dimethyl ester [3S-(3R*,8R*,9R*]-3,12-bis(l,l_dimethylethyl)8-hydroxy-4,l l-dioxo-9-(fenylmethyl)-6-{[4-(2-pyridyl)fenyl]methyl}2,3,6,10,13-pentózatetradekandiové kyseliny, popsanou v patentu US 5 489 911.

Stereoselektivní redukce (lS)-l-halo-2-oxo-3-(chráněných)amino-4-substituovaných butanů vzorce II uvedeného výše pro tvorbu (3S,2R)-l-halo-2-hydroxy-3-(diráněných)amino-4substituovaných butanů znázorněných vzorcem I je podle předkládaného vynálezu prováděno reakcí s oxidoreduktázovým enzymem schopným katalyzovat enzymatickou reakci ketonů vzorce II. Buňky mikroorganismů mohou být ve formě inaktivních vlhkých nebo sušených buněk, jako jsou buňky lyolizované, sprejově sušené nebo tepelně sušené, nebo mohou být ve formě upraveného buněčného materiálu, jako rozrušené buňky, nebo buněčné extrakty. Zatímco je znám velký počet mikroorganismů, které poskytují některé z forem oxidoreduktáz, bylo podle předkládaného vynálezu nalezeno, že pouze vybrané druhy Rhodococcus a Brevibacterium katalyzují redukci sloučeniny vzorce II za tvorby požadovaných (3S,2R)-l-halo-2-hydroxy-3-(chráněných)amino-4-substituovaných butanů ve vysokém kvantitativním a enanciomemím výtěžku. Těmito druhy jsou Rhodococcus erythropolis ATCC 4277, Rhodococcus erythropolis DSM 6971 a Rhodococcus sp. ATCC 21227, Rhodococcus erythropolis ATCC 27854 a Brevibacterium sp. ATCC 19653. Zde použitý termín ATCC znamená přírůstkové číslo uložení konkrétního mikroorganismu v American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Merylant 20852. Výraz DMS znamená German Collection of Microorganisms and Cell Cultures, Braunschweig, Germany.

Metoda enzymatické redukce podle předkládaného vynálezu může být prováděna následně po fermentací zúčastněného mikroorganismu, tj. jako dvoustupňová sestávající z fermentace a redukce, nebo jako souběžná, tj. jako jednostupňová nebo in šitu fermentace a redukce. Ve druhém případě může být mikroorganismus pěstován ve vhodném médiu, zejména obsahujícím zdroj dusíku a uhlíku, dokud není dosaženo postačujícího růstu, a pak je přidána sloučenina vybraná ze sloučenin vzorce II. Enzymatická redukce pak pokračuje, dokud není dosaženo skutečné kompletní přeměny sloučeniny vzorce II.

Ve dvoustupňovém postupu je mikroorganismus nejprve pěstován ve vhodné médiu popsaném výše, dokud nevykazuje předem stanovenou hladinu enzymatické aktivity, v tomto bodě jsou buňky sklizeny běžnou separační technikou a jsou připraveny suspenze mikrobiálních buněk obsahujících vhodné pufrační činidla apod. Vhodná pufrační činidla zahrnují fosfátové pufry, zejména draselný fosfátový pufr, tris-HCl, octan sodný apod. Rovněž voda může být použita pro přípravu suspenze mikrobiálních buněk. Sloučenina vzorce II je pak přidána a enzymatická redukce pokračuje, dokud není dosaženo kompletní přeměny. V jiném provedení zahrnuje vhodné růstové médium, jak bylo dříve uvedeno, zdroje uhlíku a dusíku a stopové prvky. Rovněž mohou být přidány induktory. Jak je odborníkům v oboru známo, výraz induktor znamená jakoukoliv sloučeninu iniciující nebo zvyšující požadovanou enzymatickou, tj. oxidoreduktázovou, aktivitu uvnitř buňky pro produkci požadovaného produktu. (lS)-l-halo-2-oxo-3-(chráněné)- 5 CZ 303884 B6 amino-4-substituované butany vzorce 11 mohou být požadovány za induktor, zejména, jsou-li přidány v malých množstvích během růstu mikroorganismů.

Vhodné zdroje uhlíku pro médium zahrnují cukry, jako je maltóza, laktóza, glukóza, fruktóza, glycerol, sorbitol, sacharóza, škrob, mannitol, propylenglykol apod., organické kyseliny a jejich soli, jako je octan sodný, citronan sodný, apod., aminokyseliny a jejich soli, jako je glutamát sodný apod., alkoholy, jako je ethanol, propanol apod. Vhodné zdroje dusíku mohou zahrnovat N-Z amin A, kukuřičný výluh, sójovou mouku, hovězí extrakty, kvasničné extrakty, melasu, pekařské kvasnice, trypton, nutrisoy, pepton, yeastamin, dusičnan sodný, síran amonný apod. Vhodné stopové prvky mohou zahrnovat fosfáty a soli s hořčíkem, manganem, vápníkem, kobaltem, niklem, železem, sodíkem a draslíkem. Vhodníř-použitá média podle vynálezu mohou zahrnoval množství složek vybraných z jakékoliv těchto kategorií. Reprezentativní výhodná média zahrnují bez omezení vodná média obsahující v hmotnostních procentech následující složky:

Složka	Hmotnostní procenta
č. 1	sladový extrakt	1 %
pH 7,0	kvasničný extrakt	1 %
	pepton	1 %
	glukóza	2%
č. 2	sladový extrakt	1 %
pH 7,0	kvasničný extrakt	1 %
	pepton	0,3 %
	glukóza	4%
č. 3	sladový extrakt	1 %
pH 7,0	kvasničný extrakt	1 %
	pepton	0,3 %
	glukóza	2%
č. 4	sladový extrakt	1 %
pH 7,0	kvasničný extrakt	1 %
	pepton	0,3 %
	sukcinát sodný	2%

Hodnota pH uvedený výše platí pro média po sterilizaci. Před sterilizací je pH přednostně upravováno na od přibližně 6 do 8, výhodně přibližně na hodnotu pH 6,5. Pak jsou média sterilizována, například zahříváním při teplotě přibližně 121 °C po dobu 30 minut. Po sterilizaci je pH médií upraveno na pH 6,5 až 7,5, Výhodně přibližně 7,0. Během mikrobiálního růstu a procesu redukce je pH udržováno mezi přibližně 4,0 až 9,0, výhodně mezi přibližně pH 6,0 a 8,0. Pro úpravu pH mohou být s výhodou použity vhodné zásady nebo kyselé soli z výše uvedených složek.

Teplota reakční směsi je mírou tepelné energie dostupné pro proces redukce, a proto by měla být vhodná teplota procesu udržována k zajištění dostupnosti jejího dostatku už k ukončení reakce. Vhodné teplotní rozmezí způsobu podle vynálezu je rozmezí od přibližně 15 do přibližně 60 °C, výhodně od přibližně 25 do přibližně 40 °C. Není známo, že by tlak byl kritickým pro provedení způsobu podle vynálezu a běžně je udržován přibližně atmosférický tlak.

Způsob podle předkládaného vynálezu je přednostně prováděn za aerobních podmínek. Pro předmětný způsob jsou míchání a aerace reakční směsi rovněž prospěšné proto, že ovlivňují dostupnost kyslíku pro biotransformaci. Způsob je výhodně prováděn například v třepaných lahvových kulturách nebo fermentačních tancích během růstu mikroorganismů v jednostupňovém nebo dvoustupňovém procesu popsaném výše. Je preferováno míchání v rozsahu přibližně 50 až 1000 otáček za minutu, nejvýhodněji pak přibližně 50 až 500 otáček za minutu. Výhodné provedení aerace je od přibližně 0,1 do 10 objemů vzduchu na objem média za minutu, s nejvýhodnějším provedením přibližně 5 objemů na objem média za minutu.

Kompletní konverze sloučeniny vzorce II může požadovat například od přibližně 4 do 48 hodin, běžně od přibližně 4 do 24 hodin, měřeno do doby přidání sloučeniny vzorce II k médiu. Je upřednostňováno, aby média byla na bázi vody, ačkoliv i organické kapaliny nebo mísitelné či nemísitelné, tj. dvojfázové směsi organická fáze/vodná fáze, mohou být stejně dobře použity.

Způsob stereoselektivní enzymatické redukce podle předkládaného vynálezu může být prováděn s použitím kofaktoru, jako je nikotinamid adenin dinukleotid (NADH), zejména tehdy, jestliže je použit izolovaný enzym. NADH může být například následně regenerován a opětovně použit. Může být použit další enzym, který regeneruje NADH in šitu, jako je formiat dehydrogenáza nebo glukóza dehydrogenáza. Vhodné donory vodíku zahrnují, molekulární vodík, formiát (tj. formiát alkalického kovu nebo ammonium formiát), glukóza, fosfoman nebo elektrochemická redukce v přítomnosti viologenu, např. methyl viologenu. Rovněž je možné regenerovat NADH bez použití dalších enzymů s použitím například ethanolu nebo formiátu.

Dalším výhodným provedením je přidání sloučeniny vzorce II do reakčního média v množství od přibližně 0,2 do přibližně 5 % hmotnostních, vztaženo na celkovou hmotnost výchozí sloučeniny a média. Inokulum mikroorganismu je vzhledem k množství výchozího materiálu dostačující k poskytnutí enzymatické redukce sloučeniny vzorce II v časech výše uvedených, obecně od přibližně 5 % hmotnostních do přibližně 30 % hmotnostních koncentrace buněk. Použití preferovaných reakčních parametrů popsaných výše s danými mikroorganismy poskytuje reakční výtěžek vyšší než 70 %, optimálně až 99 %, a o neočekávané diastereomemí Čistotě vyšší než 93 %, optimálně až 99 % požadovaného enantiomeru sloučeniny vzorce I. Produkt redukčního způsobu podle předkládaného vynálezu, tj. sloučeniny vzorce I, mohou být získány jakoukoliv vhodnou metodou izolace a/nebo purifikace, tj. metodou, jako je extrakce, destilace, krystalizace, sloupcová chromatografie a podobně.

Je pochopitelné, že další provedení nebo modifikace v provedení vynálezu jsou zřejmé a mohou být snadno proveditelné odborníkem v oboru bez odchýlení se od rozsahu a ducha výše popsaného vynálezu. Proto není zamýšleno, aby rozsah zde připojených nároků byl limitován exaktním popisem uvedeným výše, nároky jsou spíše konstruovány tak, aby obsahovaly všechny znaky patentovatelné novosti předkládaného vynálezu, včetně všech znaků a provedeni, které odborník v příslušném oboru považuje za ekvivalentní vynálezu. Vynález je dále popsán odkazy na následující experimentální provedení.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Stereoselektivní enzymatická redukce: Použití celých buněk-jednostupňový způsob

Buňky Rhodococcus erythropolis ATCC 4277 (1 ml) byly inokulovány do 100 ml Média 1, jak bylo popsáno výše, v 500ml lahvích a inkubovány při 28 °C a 200 RPM (otáčkách za minutu) na třepačce po dobu 22 hodin. Bylo upraveno pH 50 buněčné živné půdy na hodnotu 7,0 pomocí 1M draselného fosfátového pufru. K buněčnému médiu byla přidána glukóza v množství 25 mg/ml a 50 mg (lS)-[N-(l-benzyl-2-oxo-3-chlor)propyl]t-butyl esteru kyseliny karbamové jako substrátu. Biotransformace (redukce) byly prováděny při 28 °C a 200 RPM na třepačce. V předem stanovených časech byly reakce ve směsi zastaveny dvěma objemy t-butyl-methyl etheru a toluenu v poměru 60:40, a oddělená organická fáze byla filtrována přes 0,2 mikronový filtr a shromážděna. Dva ml organické fáze byly odpařeny k usušení pod proudem dusíku a zbytek byl rozpuštěn v acetonitrilu, filtrován a analyzován pomocí HPCL na t—butyl ester (3S,2R)-[N-(1-7 CZ 303884 B6 benzyl-2-hydroxy-3-chlor)propyl]kyseliny karbamové (produkt). Výsledky jsou shrnuty v Tabulce 1.

Tabulka 1

Mikroorganismus	Reakční doba {hodiny)	Substrát (mg/ml)	Produkt < mg/ml)	Diastereamerni čistota (%)
Rhodococcus erythropolis ATCC 4277	21	0.45	0.48	>98
93	0.05	0.95	>98

Příklad 2 ío Substrát a produkt byly shodné jako v Příkladu 1. Buňky Rhodococcus erythropolis ATCC 4277 a Rhodococcus erythropolis DSM 6971 (1 ml) byl jednotlivě inokulovány do lOOml podílů Média 1, jak bylo uvedeno výše, do 500ml lahví a inkubovány při 25 °C při 280 RPM na třepačce po dobu 48 hodin. Jedno sto ml každé kultury bylo inokulováno do 15 ml Média 1 ve fermentorů. Růst ve fermentorů probíhal při 25 °C, aeraci 15 LPM (litrů za minutu) a míchání 500 RPM po dobu 36 hodin. Buňky byly z fermentorů sklizeny a použity pro enzymatickou konverzi (biotransformaci) t-butyl esteru (lS)-[N-(l-benzyl-2-oxo—3—chlor)propyl] kyseliny karbamové (substrát) na t-butyl ester (3S,2R)-[N-(l-benzyl-2-hydroxy-3-chlor)propyl]kyseliny karbamové (produkt). Buněčné suspenze byly připraveny suspendováním buněk, 200 gramů ve 100 ml draselného fosfátového pufru, pH 7,0. Ke každé suspenzi bylo přidáno 25 mg/ml glukózy a předem byla stanovena koncentrace substrátu. Biotransformace substrátu na produkt byla prováděna při 28 °C na třepačce při 160 RPM. V předem stanovených časech byly reakce ve směsi zastaveny a získaný produkt byl analyzován, jak je popsáno u Příkladu 1. Výsledky jsou shrnuty v Tabulce 2.

Tabulka 2

Mikroorganismus	Reakční doba < hodiny)	Použitý substrát (mg/ml)	Substrát (mg/ml)	Produkt (rog/ml)	Diastereo- merní čistota (%)
Rhodococciw erythropolis ATCC 4277	20	1,0	0	0,86	>98
32	5	0,02	4,9	>98
49	10	0,05	9,65	>98
Rhoáococcus erythropvlis DSM 6971	20	1	0	0,95	>98
24	5	0	4,83	>98
46	10	0	9 2	>98

Výsledky v Tabulce 1 a 2 demonstrují, že požadovaný produkt je získán způsobem podle vyná5 lezu ve vysokém výtěžku a o velmi vysoké diastereomemí čistotě.

Příklad 3 ío Použití různých mikrobiálních kmenů pro biotransformaci: celé buňky

Pro biotransformaci byla použita řada mikroorganismů způsobem podle Příkladu 1. Výsledky jsou uvedeny v Tabulce 3.

-9CZ 303884 B6

Tabulka 3

Mikroorganismus	Kultura ID	Substrát vstup ng/ml	Výtěžek (%)	Diastereamerní čistota (%>
Ágrfíbacterium tumifaciens	ATCC 33970	1	25,4	75,8
Brevibacfárium xp.	ATCC 19653	2	100	93,9
Han&enula anomcda	ATCC 8170	i	31,8	76,2
Jlansenuia anomala	ATCC 58044	í	33,1	>98
fícmsenuta poiytnorpka	ATCC 34438	1	37,6	79,2
Hansenula poiymorpha	ATCC 26012	1	6,1	>98
Hansemtla saturnns	ATCC 16762	1	35,1	>98
Pseudomonas cepacia	ATCC 29351	1	5,2	--
Pseudomanas species	ATCC 202027	1	5,1	—
Rhodococcus erythropfdis	ATCC 4277	2	74,2	>98
Rhodococcus erythropolis	ATCC 27854	2	77,7	>98
Rhodococcus erythropolis	ATCC 25544	2	61,1	>98
Rhodococcus erythropolis	DSM6971	O z.	i5o	>98
Rhodococcus erythropolis	DSM6977	2
Rhodococcus mcrris	ATCC 35013	2	16,6	>98
Rhodococcus rhodococcus	ATCC 14347	2	66,2	61,9
Rhodococcus rhodococcus	ATCC 21197	2	14,0	-*
Rhodococcus species	ATCC 15592	2	91,2	>98
Rhodococcus species	ATČČ 29673	2	32,5	>98
Rhodococcus species	ATCC 21227	2	100	>98
Rhodococcas species	ATCC 21146	2	42,7	>98
Rhodococcus species	ATCC 19071	2	14,3	—
Rhodococcus species	ATCC 21226	2	56,6	>98
Trichoderma viridae	ATCC 20536	1	12.2	>98

Výsledky v Tabulce 3 prokazují, že podle vynálezu mikroorganismy jasně způsobují produkci produktu v přijatelných výtěžcích, tj. více než 70 %, a o přijatelné diastemomemí čistotě, tj. více než 90 %.

Příklad 4 ío Použití buněčného extraktu a kofaktoru

Substrát a produkt pro tento postup byl shodný jako v předchozích příkladech. Buňky Rhodococcus erythropolis ATCC 4277 rostly na médiu 1, jak bylo popsáno výše. Buňky (150 gramů) byly suspendovány ve 100 ml draselného fosfátového pufru, pH 7,0. Suspenze buněk byly dezinte1 Λ grovány při 4 °C s použitím mikrofluidizéru při tlaku 13 000 psi. Dezintegrovaná buněčná suspenze byla centrifugována při 12 000 RPM po dobu 30 minut. Čistý supematant („buněčný extrakt“) byl použit pro biotransformaci substrátu na produkt.

Podíly (10 ml) buněčných extraktů byly doplněny 10 mg substrátu, glukóza dehydrogenázou (35 jednotek), 0,7 mM NAD+ (nikotinamid adenin dinukleotid) a 200 mg glukózy. Reakce byla prováděna v pH stavu při pH 6,0, míchání 150 RPM a teplotě 30 °C. Vzorky byly periodicky odebírány z reakčního média a analyzovány. Produkt byl získán ve výtěžku 95% a o diastereomemí čistotě vyšší než 98 %. V tomto příkladu byl NADH kofaktor regenerován s použitím glukóza dehydrogenázy, NAD+ a glukózy, jak je uvedeno níže.

Substrát

Kmen Rhodococcus

Produkt

NAD

NADH

Glukóza

Glukóza dehydrogenáza

Kyselina glukonová

Claims (1)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Stereoselektivní způsob přípravy (3S,2R)-l-halogen-2-hydroxy-3-(chráněných)amino-4substituovaných butanů vzorce I

   R(HN

   Hal

   OH (I) kde Hal je halogen, R je vybrán ze skupiny sestávající z alkylu, substituovaného alkylu, arylu a substituovaného arylu a Ri je chránící skupina aminové funkční skupiny, vyznačující se tím, že se (3S)-l-halogen-2-oxo-3-(chráněný)-amino-4-substituovaný butan vzorce II

   RlHN

   Hal

   Q kde Hal, R a R, mají výše uvedený význam, uvádí do styku s mikroorganismem schopným katalyzovat stereoselektivní redukci sloučeniny vzorce II, vybraným ze skupiny sestávající z Rhodococcus erythropolis ATCC 4277, Rhodococcus erythropolis DSM 6971 a Rhodococcus sp. ATCC 21227, Rhodococcus erythropolis ATCC 27854 a Brevibacterium sp. ATCC 19653 za takových podmínek, že se uskuteční redukce a získá se uvedená sloučenina vzorce L

   2. Způsob podle nároku 1, butoxykarbonyl. vyznačující s e tím, 3, Způsob podle nároku 1, cms erythropolis ATCC 4277. vyznačující s e tím, 4. Způsob podle nároku 1, cus erythropolis DSM 6971. vyznačující s e tím, 5, Způsob podle nároku 1, cms sp. ATCC 21227. vyznačující s e tím, 6. Způsob podle nároku 1, vyznačující cms erythropolis ATCC 27854. s e tím, 7. Způsob podle nároku 1, rium sp. ATCC 19653. vyznačující s e tím, 8. Způsob podle nároku 1, fermentace. vyznačující s e tím, 9. Způsob podle nároku 1, vyznačující s e tí ni,

   mentace.

   že Hal je chlor, Rje fenyl a R, jet— že mikroorganismem je Rhodococže mikroorganismem je Rhodococie mikroorganismem je Rhodococže mikroorganismem je Rhodocucže mikroorganismem je Brevibacteže se provádí jako jednostupňová že provádí jako dvoustupňová fer10. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že se provádí v přítomnosti induktoru.

   11. Způsob podle nároku 10, vyznačující se tím, že induktorem je sloučenina vzorce I, která je přidána během růstu mikroorganismu.

   12. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že sloučenina vzorce I je získána v alespoň 70 % výtěžku a o alespoň 93 % diastereomemí čistotě.

   13. Způsob podle nároku 10, vyznačující se tím, že sloučenina vzorce I je získána v alespoň 95 % výtěžku a o alespoň 99 % diastereomemí čistotě.