KR100458811B1

KR100458811B1 - 광학 활성인 ｎ-벤질-3-피롤리디놀의 제조 방법

Info

Publication number: KR100458811B1
Application number: KR10-1999-7004570A
Authority: KR
Inventors: 야소하라요시히꼬; 하세가와준조
Original assignee: 가네가후치 가가쿠고교 가부시키가이샤
Priority date: 1996-11-26
Filing date: 1997-11-26
Publication date: 2004-12-03
Also published as: JP3703928B2; WO1998023768A1; HUP0000807A2; EP0942068B1; IL129881A0; DE69730444T2; EP0942068A4; US6214610B1; KR20000057221A; EP0942068A1; DE69730444D1; ES2227721T3; ATE274598T1; CN1238808A; CN1082093C; JPH10150997A; CZ186199A3; IL129881A; CZ289734B6; HUP0000807A3

Abstract

본 발명은 N-벤질-3-피롤리디논을 입체선택적으로 환원시키는 효소 반응에 의해 광학 활성인 N-벤질-3-피롤리디놀을 제조하는 효율적인 방법을 제공한다.

본 발명은 N-벤질-3-피롤리디논을 미생물의 세포 또는 배양물, 또는 그로부터 유도된 물질로 처리함으로써 반응 혼합물을 수득하는 단계, 및 상기 반응 혼합물로부터 광학 활성인 N-벤질-3-피롤리디놀을 회수하는 단계를 포함하는 광학 활성 N-벤질-3-피롤리디놀을 제조하는 방법으로 이루어지는데, 이 방법에서 상기 언급한 미생물은데포다스쿠스,데바리오마이세스,크립토코쿠스,피키아,로도스포리듐,트리코스포론,마이크로코쿠스,코마가타엘라,오가타에아또는자이고사카로마이세스속에 속하는 미생물이다.

Description

광학 활성인 Ｎ-벤질-3-피롤리디놀의 제조 방법 {PROCESS FOR THE PREPARATION OF OPTICALLY ACTIVE N-BENZYL-3-PYRROLIDINOL}

광학 활성인 N-벤질-3-피롤리디놀은 의약 화합물 합성용 중간물질로서 유용하다. 광학 활성인 N-벤질-3-피롤리디놀을 제조하는 방법으로, 그밖의 것 가운데 광학 활성 화합물로부터 동일 물질을 합성하는 것을 포함하는 기술 및 선구손대칭성 화합물로 출발하며 비대칭성 합성 또는 광학적 분해를 수행하는 기술이 공지되어 있다. 그러한 방법으로서, 일본 특허 공개 공보 평성-06-141876 에 개시되어 있는 방법은 N-벤질-3-피롤리디논의 입체선택적인 환원을 촉매할 수 있는 효소의 존재 하에서 N-벤질-3-피롤리디논을 입체선택적으로 환원시킴으로써 광학 활성인 N-벤질-3-피롤리디놀을 제조하는 것을 포함한다. 그러나, 이 방법은 실용적으로는 적당하지 않은데, 이는 부분적으로는 효소의 공급원으로 사용되는 진균류를 산업적인 규모로 배양하고 그 후의 과정을 수행하는 것이 어렵고, 부분적으로는 기질의 충전 농도 및 기질에서 생성물로의 전환율이 낮기 때문이다.

발명의 요약

앞서 말한 것을 고려할때, 본 발명의 목적은 N-벤질-3-피롤리디논의 입체특이적인 환원과 관련된 효소 반응에 의해 광학 활성인 N-벤질-3-피롤리디놀을 제조하는 효율적인 방법을 제공하는 것이다.

본 발명은 N-벤질-3-피롤리디논을 미생물의 세포 또는 배양물, 또는 그로부터 유도된 물질로 처리하여 반응 혼합물을 수득하는 단계, 및 상기 반응 혼합물로부터 광학 활성인 N-벤질-3-피롤리디놀을 회수하는 단계를 포함하는 광학 활성 N-벤질-3-피롤리디놀의 제조 방법으로 이루어지는데, 이 방법중의 상기 미생물은데포다스쿠스(Depodascus),데바리오마이세스(Debaryomyces),크립토코쿠스(Cryptococcus),피키아(Pichia),로도스포리듐(Rhodosporidium),트리코스포론(Trichosporon),마이크로코쿠스(Micrococcus),코마가타엘라(Komagataella),오가타에아(Ogataea) 또는자이고사카로마이세스(Zygosaccharomyces) 속에 속하는 미생물이다.

본 발명은 β-락탐 항생물질 및 디히드로피리딘 화합물과 같은 의약 화합물의 합성용 중간물질로서 유용하며, 광학 활성인 N-벤질-3-피롤리디놀을 제조하는 방법에 관한 것이다.

하기에서, 본 발명을 상세하게 기술한다.

본 발명에서, 먼저 기질 N-벤질-3-피롤리디논을 미생물의 세포 또는 배양물, 또는 그로부터 유도된 물질로 처리하여 반응 혼합물을 수득한다.

상기 N-벤질-3-피롤리디논은 일본 특허 공개 공보 소화-54-16466 에 개시된 방법으로 합성할 수 있다. 따라서, 벤질아민 및 에틸 아크릴레이트를 미카엘 (Michael) 첨가 반응에 적용하고 그렇게 수득한 β-알라닌 유도체를 염기 존재 하에서 에틸 클로로아세테이트와 반응시킨다. 수득한 화합물을 금속 나트륨 존재 하에서 고리화하여 N-벤질-4-카르보에톡시-3-피롤리돈을 수득하고, 이를 염산을 사용하여 탈카르복실화하여 N-벤질-3-피롤리디논을 수득할 수 있다.

본 발명에서는,데포다스쿠스,데바리오마이세스,크립토코쿠스,피키아,로도스포리듐,트리코스포론,마이크로코쿠스,코마가타엘라,오가타에아또는자이고사카로마이세스속에 속하는 미생물을 상기 미생물로 사용한다. 이러한 미생물은 상기의 N-벤질-3-피롤리디논의 3 위치의 카르보닐기를 입체선택적으로 환원시킨다.

상기 미생물의 구체적인 예에는 하기의 것들이 포함되지만, 이에 특별히 제한되지는 않는다:데포다스쿠스 테트라스퍼마(Depodascus tetrasperma) CBS 765.70,데바리오마이세스 한세니 변종. 한세니(Debaryomyces hansenii var.hansenii) IFO 0728,크립토코쿠스 알비두스 변종. 알비두스(Cryptococcus albidus var.albidus) IFO 0378,피키아 멤브레이나에파시엔스(Pichia membranaefaciens) IFO 0189,로도스포리듐 토룰로이데스(Rhodosporidium toruloides) IFO 0413,트리코스포론 퍼멘탄스(Trichosporon fermentans) ATCC 10675,마이크로코쿠스 루테우스(Micrococcus luteus) IFO 13867,코마가타엘라 파스토리스(Komagataella pastoris) IFO 0948,오가타에아 폴리모르파(Ogataea polymorpha) IFO 1476,자이고사카로마이세스 바일리(Zygosaccharomyces bailii) IFO 0519 등.

이들 미생물은 쉽게 입수할 수 있거나 살 수 있는 보존 배양물로부터 수득할수 있다. 이들은 또한 천연에서 분리할 수도 있다. 또한 이들 미생물에 돌연변이를 일으킴으로써 본 발명에 이로운 성질을 가지는 미생물 균주를 수득할 수도 있다. 또한, 재조합 DNA 및 세포 융합 등과 같은 유전공학 또는 생물공학 기술에 의해 이들 미생물로부터 유도된 것들을 사용할 수도 있다.

상기 미생물은 영양 성분을 포함하는 배지를 사용하여 배양할 수 있다. 상기 배지로서 통상 한천 배지와 같은 고체 배지 또는 액체 배지를 사용한다. 상기 미생물의 집단 배양에는, 액체 배지를 사용하는 것이 적합하다. 탄소 공급원, 예를 들어, 글루코오스, 수크로오스 및 말토오스와 같은 당류, 젖산, 아세트산 및 시트르산과 같은 유기산, 에탄올 및 글리세롤과 같은 알콜, 및 이들의 혼합물을 배지에 혼합할 수 있고, 질소 공급원, 예를 들어, 황산 암모늄, 인산 암모늄, 유레아, 효모 추출물, 육류 추출물, 펩톤 등을 혼합할 수 있다. 또한, 그밖의 무기염, 비타민 및 그외 영양 공급원 또한 경우에 따라서 혼합할 수 있다.

상기 미생물은 일반적으로 통상의 조건하, 예를 들면 pH 4.0 내지 9.5, 20 내지 45 ℃ 의 온도 내에서 10 내지 96 시간 동안 호기적으로 배양할 수 있다.

상기 N-벤질-3-피롤리디논을 상기의 미생물로 처리하는데 있어, 상기에서 수득한 미생물을 함유하는 배양액을 통상적으로 사용할 수 있다. 그러나, 이런 경우, 배양액의 성분이 반응을 저해하므로, 예를 들면 상기 배양액을 원심분리로 처리하여 수득한 현탁액을 사용하는 것이 바람직하다.

상기 미생물의 세포에서 유도된 물질은 건조된 세포, 계면활성제 또는 유기 용매로 처리하여 세포로부터 수득한 물질, 및 세포 용해 효소로 세포를 처리하여수득한 물질을 포함하지만, 이에 특별히 제한되는 것은 아니다. 또한, 세포 또는 배양물에서 추출하여 제조한 효소 제제도 사용할 수 있다.

배양물에서 유도된 물질은 농축 배양물, 건조 배양물, 계면활성제 또는 유기 용매로 처리된 배양물, 세포 용해 효소로 처리된 배양물 등을 포함하지만, 이에 특별히 제한되는 것은 아니다. 또한, 배양된 세포 또는 배양물로부터 정제된 효소 제제도 사용할 수 있다.

상기 N-벤질-3-피롤리디논을 상기의 미생물 세포, 배양물 또는 그로부터 유도된 물질로 처리하여 반응을 수행하는데 있어, 상기의 N-벤질-3-피롤리디논을 초기에 한꺼번에 모두 또는 부분적으로 첨가할 수 있다. 그러한 경우에 반응 온도는 통상 15 내지 50 ℃, 바람직하게는 20 내지 40 ℃ 이며, pH 는 2.5 내지 9.0 이다.

반응 혼합물내 세포량은 세포의 촉매 능력에 따라 적절하게 선택할 수 있다. 기질의 농도는 바람직하게는 0.01 내지 50 % (w/v), 더 바람직하게는 0.1 내지 20 % (w/v) 이다.

통상, 이 반응은 진동 또는 공기혼입 및 교반하여 수행한다. 반응 시간은 기질의 농도, 미생물의 양 및 그 외의 반응 조건에 따라서 적절하게 선택할 수 있다. 통상, 반응을 2 내지 168 시간에 완결할 수 있도록 각각의 조건을 선택하는 것이 바람직하다. 상기 반응을 촉진하기 위해, 글루코오스와 같은 에너지원을 반응 혼합물에 1 내지 5 % 의 양으로 첨가할 수 있으며, 이로 인해 좋은 결과를 얻을 수 있다.

또한, 이 반응은 통상 생물학적 작용에서 환원 반응에 필수적이라고 생각되는, 환원된 형태의 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 (NADH) 또는 환원된 형태의 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 포스페이트 (NADPH) 와 같은 조효소 성분을 첨가함으로써 촉진될 수 있다. 구체적으로, 이들을 반응계에 첨가할 수도 있고, 또는 NADH, NADPH 등을 형성할 수 있는 반응계를 상기의 반응계에 첨가할 수도 있다. 예를 들면, 포르메이트 탈수소효소의 존재하에서 포름산으로부터 이산화탄소 및 물을 형성할때 NAD 로부터 NADH 를 형성하는 반응, 또는 글루코오스 탈수소효소의 존재하에서 글루코오스로부터 글루코노락톤을 형성할때 NAD/NADP 로부터 NADH/NADPH 를 형성하는 반응을 사용할 수 있다. Triton (Nakalai Tesque 제), Span (Kanto Chemical 제) 또는 Tween (Nakalai Tesque 제) 와 같은 계면활성제 또한 첨가할 수 있다.

본 발명의 반응에서, 생성물, 즉 광학 활성인 N-벤질-3-피롤리디놀은 이후에 반응 혼합물로부터 회수된다.

반응 혼합물로부터 상기의 N-벤질-3-피롤리디놀을 회수하는 방법은 특별히 제한되지는 않으나 임의의 통상적인 분리 방법을 사용할 수 있다. 예를 들면, 광학 활성인 N-벤질-3-피롤리디놀은 반응 혼합물에 에틸 아세테이트와 같은 유기 용매를 첨가하여 추출을 수행하고, 수득한 추출물을 무수 황산 나트륨 등으로 탈수하고, 감압하에서 유기 용매를 제거하는 것을 포함하는 방법에 의해 수득할 수 있다. 이러한 경우, 탄산 수소 나트륨 또는 염화 나트륨과 같은 염을 첨가하여 추출 효율성을 개선시킬 수 있다. 필요한 경우, 이렇게 대충 정제한 생성물을증류, 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 등의 기술에 의해 더욱 정제된 형태의 광학 활성 N-벤질-3-피롤리디놀로 전환시킬 수 있다.

하기 실시예는 본 발명을 더 상세히 설명한다. 그러나, 이들이 본 발명의 범주를 제한하는 것은 아니다.

실시예 1

하기의 조성을 가지는 액체 배지를 제조하고 크기가 큰 시험용 튜브에 5 ml 분획씩 분포시키고 120 ℃ 에서 20 분 동안 증기 멸균시킨다.

배지의 조성:

글루코오스 4 %

효모 추출물 0.3 %

KH₂PO₄0.1 %

(NH₄)₂HPO₄0.65 %

NaCl 0.1 %

MgSO₄·7H₂O 0.8 %

ZnSO₄·7H₂O 0.06 %

FeSO₄·7H₂O 0.09 %

CuSO₄·5H₂O 0.005 %

MnSO₄·4∼6H₂O 0.01 %

수도물

pH 7.0

상기 배지 분획에 표 2 에 나타난 미생물중 하나를 한 루프씩 각각 접종한다. 그 후, 30 ℃ 에서 24 내지 72 시간 동안 진동 배양한다. 그 다음, 각 배양액으로부터 원심분리하여 세포를 채취하고, 물로 세척하고 100 mM 인산 완충액 (pH 6.5) 1 ml 에 현탁한다. 각 현탁액을 하기 반응 혼합물의 성분으로 사용한다.

반응 혼합물의 조성:

(1) 상기의 세포 현탁액 1 ml

(2) 글루코오스 20 mg

(3) N-벤질-3-피롤리디논 10 mg

각 시험용 튜브에 분포되어 있는 상기 성분 (1) 내지 (3) 을 혼합하고 20 시간 동안 진동시켜 이 반응이 30 ℃ 에서 진행하도록 한다. 반응 후, 3.5 ml 의 에틸 아세테이트를 각 반응 혼합물에 가하고 전체를 잘 교반한다. 유기층 분획을 가스 크로마토그래피에 적용하고 N-벤질-3-피롤리디놀 함량을 측정한다. 그의 광학 순도 또한 HPLC 로 측정한다.

가스 크로마토그래피의 조건: 칼럼: Uniport B, 10 % PEG-20M, 4.0 mm ID × 1.0 m; 칼럼 온도: 200 ℃; 캐리어 가스: 질소; 검출: FID.

HPLC 분석의 조건: 칼럼: Chiralcel OB (Daicel Chemical Industries 제);용리액: n-헥산/이소프로판올/디에틸아민 = 99/1/0.1; 검출: 254 nm; 유동 속도: 1 ml/min.; 용리 시간: (R) 형 6.1 분, (S) 형 7.9 분.

생성물로의 전환율 및 생성물의 광학 순도를 표 1 에 요약하였다.

미생물 균주	전환율 (%)	광학 순도 (%ee)
데포다스쿠스 테트라스퍼마CBS 765.70	10	(S) 97
데바리오마이세스 한세니 변종. 한세니IFO 0728	7	(S) 84
크립토코쿠스 알비두스 변종. 알비두스IFO 0378	34	(S) 100
피키아 멤브레이나에파시엔스IFO 0189	12	(S) 84
로도스포리듐 토룰로이데스IFO 0413	33	(S) 74
트리코스포론 퍼멘탄스ATCC 10675	75	(S) 96
코마가타엘라 파스토리스IFO 0948	14	(S) 61
오가타에아 폴리모르파IFO 1476	17	(S) 89
자이고사카로마이세스 바일리IFO 0519	12	(S) 62

실시예 2

하기의 조성을 가지는 액체 배지를 제조하고 크기가 큰 시험용 튜브에 10 ml 분획씩 분포시키고 120 ℃ 에서 20 분간 증기 멸균시킨다.

배지 조성물:

육류 추출물 1.0 %

펩톤 1.0 %

효모 추출물 0.5 %

NaCl 0.3 %

수도물

pH 7.0

이 액체 배지의 각 분획에 한 루프의마이크로코쿠스 루테우스IFO 13867 을 접종하고 30 ℃ 에서 24 시간 동안 진동 배양한다. 그 후, 이 배양액을 원심분리하여 세포를 채취하고, 물로 세척하고, 100 mM 인산 완충액 (pH 6.5) 2 ml 에 현탁하고 이 현탁액을 실시예 1 과 동일한 방법으로 반응 혼합물의 성분으로 사용한다. 이 반응을 20 시간 동안 진행하도록 한 후, 생성물로의 전환율 및 생성물의 광학 순도를 실시예 1 과 동일한 방법으로 측정한다. 전환율은 81 % 이고 광학 순도는 (S) 100 % ee 이다.

실시예 3

표 3 에 나타난 미생물을 실시예 1 과 동일한 방법으로 배양한다. 그 후, 각 배양액을 원심분리하여 세포를 채취하고, 이를 물로 세척하고 100 mM 인산 완충액 (pH 6.5) 1 ml 에 현탁한다. 이 현탁액을 하기 반응 혼합물의 성분으로 사용한다.

반응 혼합물의 조성:

(1) 상기의 세포 현탁액 0.5 ml

(2) 글루코오스 5.4 mg

(3) 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드

포스페이트 (산화된 형태) 0.275 mg

(4) 글루코오스 탈수소효소 (Amano

Pharmaceutical 제) 2.84 단위

(5) N-벤질-3-피롤리디논 1 mg

상기 성분 (1) 내지 (5) 를 시험용 튜브에 넣어 혼합하고, 20 시간 동안 진동시키면서 이 반응이 30 ℃ 에서 진행하도록 한다. 반응 후, 생성물로의 전환율 및 생성물의 광학 순도를 실시예 1 과 동일한 방법으로 측정한다. 그렇게 수득한 결과를 표 2 에 요약하였다.

미생물 균주	전환율 (%)	광학 순도 (%ee)
데포다스쿠스 테트라스퍼마CBS 765.70	15	(S) 96
데바리오마이세스 한세니 변종. 한세니IFO 0728	9	(S) 84
크립토코쿠스 알비두스 변종. 알비두스IFO 0378	47	(S) 91
피키아 멤브레이나에파시엔스IFO 0189	61	(S) 83
로도스포리듐 토룰로이데스IFO 0413	74	(S) 76
트리코스포론 퍼멘탄스ATCC 10675	74	(S) 96
코마가타엘라 파스토리스IFO 0948	18	(S) 58
오가타에아 폴리모르파IFO 1476	13	(S) 89
자이고사카로마이세스 바일리IFO 0519	15	(S) 58

실시예 4

반응 혼합물의 조성:

(1) 상기의 세포 현탁액 0.5 ml

(2) 글루코오스 5.4 mg

(3) 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드

(산화된 형태) 0.26 mg

(4) 글루코오스 탈수소효소 (Amano

Pharmaceutical 제) 2.84 단위

(5) N-벤질-3-피롤리디논 1 mg

상기 성분 (1) 내지 (5) 를 시험용 튜브에 넣어 혼합하고, 20 시간 동안 진동시키면서 이 반응이 30 ℃ 에서 진행하도록 한다. 반응 후, 생성물로의 전환율 및 생성물의 광학 순도를 실시예 1 과 동일한 방법으로 측정한다. 그렇게 수득한 결과를 표 3 에 요약하였다.

미생물 균주	전환율 (%)	광학 순도 (%ee)
데포다스쿠스 테트라스퍼마CBS 765.70	33	(S) 99
데바리오마이세스 한세니 변종. 한세니IFO 0728	6	(S) 83
피키아 멤브레이나에파시엔스IFO 0189	24	(S) 80
로도스포리듐 토룰로이데스IFO 0413	72	(S) 76
트리코스포론 퍼멘탄스ATCC 10675	74	(S) 96
코마가타엘라 파스토리스IFO 0948	19	(S) 59
오가타에아 폴리모르파IFO 1476	11	(S) 87
자이고사카로마이세스 바일리IFO 0519	13	(S) 63

실시예 5

마이크로코쿠스 루테우스IFO 13867 을 실시예 2 와 같은 방법으로 배양한다. 수득한 세포를 100 mM 인산 완충액 (pH 6.5) 2 ml 에 현탁하고, 이 현탁액을 실시예 3 의 반응 혼합물의 성분으로 사용한다. 반응이 20 시간 동안 진행되도록 한 후, 생성물로의 전환율 및 생성물의 광학 순도를 실시예 1 과 같은 방법으로 측정한다. 전환율은 78 % 이고 광학 순도는 (S) 100 % ee 이다.

실시예 6

마이크로코쿠스 루테우스IFO 13867 을 실시예 2 와 같은 방법으로 배양한다. 수득한 세포를 100 mM 인산 완충액 (pH 6.5) 2 ml 에 현탁하고, 이 현탁액을 실시예 4 의 반응 혼합물의 성분으로 사용한다. 반응이 20 시간 동안 진행되도록 한 후, 생성물로의 전환율 및 생성물의 광학 순도를 실시예 1 과 같은 방법으로 측정한다. 전환율은 78 % 이고 광학 순도는 (S) 100 % ee 이다.

실시예 7

실시예 2 의 조성을 가지는 액체 배지를 제조하고 25 개의 500 ml 사카구치 (Sakaguchi) 플라스크에 100 ml 분획씩 분포시키고 120 ℃ 에서 20 분간 증기 멸균한다. 각 플라스크의 내용물에 실시예 2 에서와 동일한 방법으로마이크로코쿠스 루테우스IFO 13867 을 배양하여 수득한 액체 배양물 2 ml 를 무균적으로 접종하고, 30 ℃ 에서 24 시간 동안 진동 배양한다. 수득한 배양액으로부터 원심분리하여 세포를 채취하고 100 mM 인산 완충액 (pH 6.5) 500 ml 에 현탁한다. 이 현탁액에 5 g 의 N-벤질-3-피롤리디논, 및 10 g 의 글루코오스를 가한다. 24시간 동안 교반하면서 반응이 30 ℃ 에서 진행하도록 하는 동안, 반응 혼합물은 6 N 의 수산화 나트륨 수용액으로 pH 를 6.5 로 유지한다. 그 후, 반응 혼합물을 2.5 L 의 에틸 아세테이트로 추출하고, 수층은 1 L 의 에틸 아세테이트로 더 추출한다. 유기층을 혼합하고 무수 황산 나트륨 상에서 탈수하고, 그 후 감압하에서 용매를 증류 제거한다. 잔류물을 증류하여 3 g 의 (S)-N-벤질-3-피롤리디놀을 수득한다. 수율은 60 % 이고, 광학 순도는 99.8 % ee 이며, 비등점은 132 내지 137 ℃/3 mm Hg 이고, 광회전 [α]_D ²⁰은 -3.77°이다 (CH₃OH, c = 5).¹H-NMR δ (CDCl₃): 1.63-1.76 (1H, m), 2.09-2.21 (1H, m), 2.26-2.37 (1H, m), 2.51-2.64 (2H, m), 2.75-2.85 (1H, m), 3.38 (1H, brs), 3.61 (2H, s), 4.24-4.33 (1H, m), 7.19-7.37 (5H, m).

실시예 8

실시예 1 의 조성을 가지는 액체 배지를 제조하고 50 개의 500 ml 사카구치 플라스크에 50 ml 분획씩 분포시키고 120 ℃ 에서 20 분간 증기 멸균시킨다. 각 플라스크의 내용물에 실시예 1 과 동일한 방법으로트리코스포론 퍼멘탄스ATCC 10675 를 배양하여 수득한 액체 배양물 1 ml 를 무균적으로 접종하고, 30 ℃ 에서 24 시간동안 진동 배양한다. 수득한 배양액으로부터 원심분리하여 세포를 채취하고 100 mM 인산 완충액 (pH 6.5) 500 ml 에 현탁한다. 이 현탁액에, 5 g 의 N-벤질-3-피롤리디논, 10 g 의 글루코오스, 275 mg 의 산화된 형태인 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 포스페이트 (Kohjin Co. 제) 및 1,420 단위의 글루코오스탈수소효소 (Amano Pharmaceutical Co. 제) 를 첨가하고, 48 시간 동안 교반하면서 이 반응이 30 ℃ 에서 진행되도록 하는 동안, 반응 혼합물은 6 N 수산화 나트륨 수용액으로 pH 6.5 를 유지한다. 이 후, 반응 혼합물을 2.5 L 의 에틸 아세테이트로 추출하고, 수층은 1 L 의 에틸 아세테이트로 더 추출한다. 유기층을 혼합하고 무수 황산 나트륨 상에서 탈수한 후, 감압하에서 용매를 증류 제거한다. 잔류물은 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 (용리액: 에틸 아세테이트/메탄올 = 2/1)에 적용함으로써 정제하여 2.5 g 의 (S)-N-벤질-3-피롤리디놀을 수득한다. 수율은 49 % 이고, 광학 순도는 96 % ee, 비등점은 132 내지 137 ℃/3 mm Hg 이며, 광회전 [α]_D ²⁰은 -3.73°이다 (CH₃OH, c = 5).¹H-NMR δ (CDCl₃): 1.63-1.76 (1H, m), 2.09-2.21 (1H, m), 2.26-2.37 (1H, m), 2.51-2.64 (2H, m), 2.75-2.85 (1H, m), 3.38 (1H, brs), 3.61 (2H, s), 4.24-4.33 (1H, m), 7.19-7.37 (5H, m).

실시예 9

실시예 1 의 조성을 가지는 액체 배지를 제조하고 50 개의 500 ml 사카구치 플라스크에 50 ml 분획씩 분포시키고 120 ℃ 에서 20 분간 증기 멸균한다. 각 플라스크의 내용물에 실시예 1 과 동일한 방법으로트리코스포론 퍼멘탄스ATCC 10675 를 배양하여 수득한 액체 배양물 1 ml 를 무균적으로 접종하고, 30 ℃ 에서 24 시간 동안 진동 배양한다. 수득한 배양액으로부터 원심분리하여 세포를 채취하고 100 mM 인산 완충액 (pH 6.5) 500 ml 에 현탁한다. 이 세포를 빙냉하에서 브라운(Brown) 세포 파열기로 파열시키고, 원심분리하여 수득한 상청액, 즉 세포가 없는 추출물을 하기 반응 혼합물의 성분으로 사용한다.

반응 혼합물의 조성:

(1) 상기의 세포 현탁액 0.5 ml

(2) 글루코오스 5.4 mg

(3) 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드

(산화된 형태) 0.26 mg

(4) 글루코오스 탈수소효소 (Amano

Pharmaceutical 제) 2.84 단위

(5) N-벤질-3-피롤리디논 1 mg

상기 성분 (1) 내지 (5) 를 시험용 튜브에 넣어 혼합하고, 20 시간 동안 진동시키면서 이 반응이 30 ℃ 에서 진행되도록 한다. 반응 후, 생성물로의 전환율 및 생성물의 광학 순도를 실시예 1 과 동일한 방법으로 측정한다. 전환율은 19 % 이고 광학 순도는 (S) 96 % ee 이다.

상기한 바와 같은 구성을 가지는, 본 발명에 따른 광학 활성 N-벤질-3-피롤리디놀의 제조 방법은 광학 활성인 N-벤질-3-피롤리디놀을 상업적인 규모에서 효율적으로 제조할 수 있다. 본 발명에 따라 수득한 광학 활성 N-벤질-3-피롤리디놀은 광학 순도가 높으며, β-락탐 항생물질 및 디히드로피리딘 화합물과 같은 의약 화합물을 제조하기 위한 중요한 중간물질이다.

Claims

광학 활성인 N-벤질-3-피롤리디놀을 제조하는 방법으로, N-벤질-3-피롤리디논을,데포다스쿠스,데바리오마이세스,크립토코쿠스,피키아,로도스포리듐,트리코스포론,마이크로코쿠스,코마가타엘라,오가타에아또는자이고사카로마이세스속에 속하는 미생물의 세포 또는 배양물, 또는 그로부터 유도된 물질로 처리하여 반응 혼합물을 수득하는 단계, 및 반응 혼합물로부터 광학 활성인 N-벤질-3-피롤리디놀을 회수하는 단계를 포함하는 방법.