ES2227721T3 - Procedimiento para la preparacion de n-bencil-3-pirrolidinol opticamente activo. - Google Patents

Procedimiento para la preparacion de n-bencil-3-pirrolidinol opticamente activo.

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ES2227721T3 ES97946058T ES97946058T ES2227721T3 ES 2227721 T3 ES2227721 T3 ES 2227721T3 ES 97946058 T ES97946058 T ES 97946058T ES 97946058 T ES97946058 T ES 97946058T ES 2227721 T3 ES2227721 T3 ES 2227721T3
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Yoshihiko Yasohara
Junzo Hasegawa
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Abstract

LA INVENCION PROPORCIONA UN PROCEDIMIENTO EFICIENTE PARA PRODUCIR N BENCIL - 3 - PIRROLIDINOL OPTICAMENTE ACTIVO, MEDIANTE UNA REACCION ENZIMATICA ESTEREOSELECTIVA DE REDUCCION DE N - BENCIL -3 PIRROLIDINONA. LA INVENCION CONSISTE EN UN PROCEDIMIENTO DE PRODUCCION DE N - BENCIL -3 PIRROLIDINOL OPTICAMENTE ACTIVO, QUE COMPRENDE UNA FASE DE OBTENCION DE UNA MEZCLA DE REACCION, MEDIANTE TRATAMIENTO DE N -BENCIL - 3 PIRROLIDINONA CON CELULAS O CON UN CULTIVO DE MICROORGANISMO, O CON UN MATERIAL DERIVADO DEL MISMO; Y UNA FASE DE RECUPERACION DE N BENCIL - 3 - PIRROLIDINOL OPTICAMENTE ACTIVO, A PARTIR DE DICHA MEZCLA DE REACCION. EN DICHO PROCEDIMIENTO, EL MICROORGANISMO CITADO ES UN MICROORGANISMO PERTENECIENTE A LOS SIGUIENTES GENEROS: DEPODASCUS, DEBARYOMYCES, CRYPTOCOCCUS, PICHIA, RHODOSPORIDIUM, TRICHOSPORON, MICROCOCCUS, KOMAGATAELLA, OGATAEA O ZYGOSACCHAROMYCES.

Description

Procedimiento para la preparación de N-bencil-3-pirrolidinol ópticamente activo.
Campo técnico
La presente invención se refiere a un método para producir N-bencil-3-pirrolidinol ópticamente activo, que es útil como producto intermedio para la síntesis de compuestos medicinales tales como los antibióticos \beta-lactámicos y los compuestos de dihidropiridina.
Antecedentes de la técnica
N-bencil-3-pirrolidinol ópticamente activo es útil como producto intermedio para la síntesis de compuestos medicinales. Para el método de producción de N-bencil-3-pirrolidinol ópticamente activo se conocen, entre otras, una tecnología que comprende la síntesis del mismo a partir de un compuesto ópticamente activo y una tecnología que comienza con un compuesto proquiral y lleva a cabo una síntesis asimétrica o una resolución óptica. Como un método tal, el método descrito en la publicación denominada "Kokai" de solicitud de patente japonesa Hei-06-141876 comprende la producción de N-bencil-3-pirrolidinol ópticamente activo reduciendo de manera estereoselectiva la N-bencil-3-pirrolidinona en presencia de una enzima que puede catalizar la reducción estereoselectiva de N-bencil-3-pirrolidinona. Sin embargo, este método no es adecuado para el uso práctico, en parte por la dificultad en el cultivo a escala industrial de los hongos utilizados como fuente de enzima y en el procedimiento que se lleva a cabo después de ello y, en parte, porque la concentración de la carga del sustrato y la tasa de conversión a partir del sustrato para dar el producto son bajas.
Sumario de la invención
En vista de lo anterior, un objeto de la presente invención es proporcionar un método eficaz para producir N-bencil-3-pirrolidinol ópticamente activo mediante una reacción enzimática que incluye la reducción estereoselectiva de N-bencil-3-pirrolidinona.
La presente invención consiste en un método para producir N-bencil-3-pirrolidinol ópticamente activo, que comprende una etapa de obtención de una mezcla de reacción mediante el tratamiento de N-bencil-3-pirrolidinona con células o un cultivo de un microorganismo, o un material derivado de los mismos, y una etapa de recuperación del N-bencil-3-pirrolidinol ópticamente activo a partir de dicha mezcla de reacción, método en el cual dicho microorganismo es un microorganismo que pertenece al género Depodascus, Debaryomyces, Cryptococcus, Pichia, Rhodosporidium, Trichosporon, Micrococcus, Komagataella, Ogataea o Zygosaccharomyces.
Descripción detallada de la invención
A continuación, la presente invención se describe en detalle.
En la presente invención, el sustrato N-bencil-3-pirrolidinona se trata primero con células o un cultivo del microorganismo, o un material derivado de los mismos, para dar una mezcla de reacción.
Dicha N-bencil-3-pirrolidinona puede sintetizarse mediante el procedimiento descrito en la publicación denominada "Kokai" de solicitud de patente japonesa Sho-54-16466. De este modo, bencilamina y acrilato de etilo se someten a la adición de Michael y el derivado de \beta-alanina obtenido de este modo se hace reaccionar con cloroacetato de etilo en presencia de una base. El compuesto obtenido se cicla en presencia de sodio metálico para dar N-bencil-4-carboetoxi-3-pirrolidona, que se descarboxila utilizando ácido clorhídrico, por medio de lo cual puede obtenerse N-bencil-3-pirrolidinona.
En la presente invención, como el microorganismo mencionado anteriormente se utiliza un microorganismo perteneciente al género Depodascus, Debaryomyces, Cryptococcus, Pichia, Rhodosporidium, Trichosporon, Micrococcus, Komagataella, Ogataea o Zygosaccharomyces. Un microorganismo tal reduce de manera estereoselectiva el grupo carbonilo en la posición 3 de la N-bencil-3-pirrolidinona mencionada anteriormente.
Los ejemplos específicos de dicho microorganismo incluyen, pero no se limitan particularmente a Depodascus tetrasperma CBS 765.70, Debaryomyces hansenii var. hansenii IFO 0728, Cryptococcus albdius var. albidus IFO 0378, Pichia membranaefaciens IFO 0189, Rhodosporidium toruloides IFO 0413, Trichosporon fermentans ATCC 10675, Micrococcus luteus IFO 13867, Komagataella pastoris IFO 0948, Ogataea polymorpha IFO 1476, Zygosaccharomyces bailii IFO 0519 y similares.
Estos microorganismos pueden obtenerse a partir de cultivos madre que pueden conseguirse o adquirirse fácilmente. También pueden aislarse a partir del mundo natural. También es posible obtener cepas microbianas que tengan propiedades ventajosas para la presente reacción produciendo mutaciones en estos microorganismos. Además, también pueden utilizarse aquellos derivados de estos microorganismos mediante técnicas de ingeniería genética o de bioingeniería, tales como ADN recombinante y fusión celular, etc.
Dichos microorganismos pueden cultivarse utilizando un medio que contiene componentes nutritivos. Generalmente, como dicho medio se utiliza un medio sólido, tal como un medio de agar, o un medio líquido. De manera adecuada, para el cultivo masivo de dicho microorganismo se utiliza un medio líquido. El medio puede incluir la fuente de carbono, por ejemplo, sacáridos, tales como glucosa, sacarosa y maltosa, ácidos orgánicos, tales como ácido láctico, ácido acético y ácido cítrico, alcoholes, tales como etano y glicerol, y mezclas de los mismos, y puede incluir la fuente de nitrógeno, por ejemplo, sulfato de amonio, fosfato de amonio, urea, extractos de levadura, extractos de carne, peptona y similares. Además, opcionalmente pueden incluirse también otras sales inorgánicas, vitaminas y otras fuentes de nutrientes.
Generalmente, dichos microorganismos pueden cultivarse en condiciones normales, por ejemplo, aeróbicamente a un pH de 4,0 a 9,5 dentro del intervalo de temperatura de 20 a 45ºC durante de 10 a 96 horas.
Generalmente, al tratar la N-bencil-3-pirrolidinona mencionada anteriormente con los microorganismos mencionados anteriormente puede utilizarse el fluido de cultivo que contiene dichos microorganismos, tal como se ha obtenido. Sin embargo, en algunos casos, un componente del fluido de cultivo interfiere en la reacción, entonces se prefiere el uso de una suspensión obtenida tratando dicho fluido de cultivo, por ejemplo, mediante centrifugación.
Los materiales derivados de las células de dichos microorganismos incluyen, pero no se limitan particularmente a células secas, materiales obtenidos a partir de las células mediante el tratamiento con un tensioactivo o un disolvente orgánico, y materiales obtenidos tratando las células con una enzima lítica. Además, también pueden utilizarse preparaciones enzimáticas preparadas mediante extracción de las células o los cultivos.
El material derivado del cultivo incluye, pero no se limita particularmente a cultivos concentrados, cultivos secos, cultivos tratados con tensioactivos o disolventes orgánicos, cultivos tratados con enzimas líticas y similares. Además, también pueden utilizarse preparaciones enzimáticas purificadas a partir de las células cultivadas o los cultivos.
Al llevar a cabo la reacción tratando la N-bencil-3-pirrolidinona mencionada anteriormente con las células microbianas, los cultivos o los materiales derivados de los mismos, mencionados anteriormente, dicha N-bencil-3-pirrolidinona puede añadirse toda de una vez al comienzo o en porciones. Generalmente, la temperatura de reacción es en este caso de 15 a 50ºC, preferiblemente de 20 a 40ºC, y el pH es de 2,5 a 9,0.
La cantidad de células en la mezcla de reacción puede seleccionarse de manera adecuada en función de la capacidad catalítica de las células. La concentración del sustrato es preferiblemente de 0,01 a 50% (p/v), más preferiblemente de 0,1 a 20% (p/v).
Generalmente, la reacción se lleva a cabo con agitación o con aireación y agitación. El tiempo de reacción puede seleccionarse de manera adecuada en función de la concentración del sustrato, la cantidad de microorganismos y de otras condiciones de la reacción. Generalmente se prefiere que las condiciones respectivas se seleccionen de manera que la reacción termine en de 2 a 168 horas. Para favorecer la reacción anterior puede añadirse a la mezcla de reacción una fuente de energía, tal como glucosa, en una cantidad del 1 al 5%, con lo que pueden obtenerse buenos resultados.
Además, la reacción puede favorecerse añadiendo un componente de coenzima, tal como la forma reducida de dinucleótido de nicotinamida y adenina (NADH) o la forma reducida de fosfato de dinucleótido de nicotinamida y adenina (NADPH), que generalmente se considera necesario para las reacciones de reducción en procesos biológicos. En el caso concreto, o bien pueden añadirse éstos al sistema de reacción o bien puede añadirse un sistema de reacción que puede formar NADH, NADPH o similares al sistema de reacción. Por ejemplo, puede hacerse uso de la reacción en la que se forma NADH a partir de NAD en el caso de la formación de dióxido de carbono y agua a partir de ácido fórmico en presencia de formiato deshidrogenasa, o de la reacción en la que se forma NADH/NADPH a partir de NAD/NADP, en el caso de la formación de gluconolactona a partir de glucosa en presencia de glucosa deshidrogenasa. También puede añadirse un tensioactivo, tal como Triton (producto de Nakalai Tesque), Span (producto de Kanto Chemical) o Tween (producto de Nakalai Tesque).
En la presente reacción, el producto, concretamente N-bencil-3-pirrolidinol ópticamente activo, se recupera entonces a partir de la mezcla de reacción.
El método de recuperación de dicho N-bencil-3-pirrolidinol a partir de la mezcla de reacción no está limitado particularmente sino que puede emplearse cualquier método general de aislamiento. Por ejemplo, N-bencil-3-pirrolidinol ópticamente activo puede obtenerse mediante un método que comprende añadir un disolvente orgánico, tal como acetato de etilo, a la mezcla de reacción para con ello llevar a cabo la extracción, deshidratar el extracto obtenido sobre sulfato de sodio anhidro o sustancia similar y eliminar el disolvente orgánico a presión reducida. En este caso puede añadirse una sal, tal como hidrógeno-carbonato de sodio o cloruro de sodio, para mejorar la eficacia de la extracción. Cuando sea necesario, este producto apenas purificado puede convertirse en una forma más purificada de N-bencil-3-pirrolidinol ópticamente activo mediante destilación, cromatografía en columna de gel de sílice o una técnica similar.
Mejores modos para llevar a cabo la invención
Los siguientes ejemplos ilustran la presente invención más detalladamente. Sin embargo, no son de ninguna manera limitantes para el alcance de la presente invención.
Ejemplo 1
Se preparó un medio líquido con la composición mostrada a continuación y se distribuyó en porciones de 5 ml en tubos de ensayo de gran tamaño y se esterilizó con vapor a 120ºC durante 20 minutos.
1
Estas porciones de medio se inocularon respectivamente con un asa completa de los microorganismos mostrados en la tabla 2. Después se realizó un cultivo con agitación a 30ºC durante de 24 a 72 horas. Después de esto, las células se recogieron de cada fluido de cultivo mediante centrifugación, se lavaron con agua y después se suspendieron en 1 ml de tampón fosfato 100 mM (pH 6,5). Cada suspensión se utilizó como un componente de la siguiente mezcla de reacción.
2
Los componentes (1) a (3) anteriores distribuidos en cada tubo de ensayo se mezclaron y se dejó que la reacción continuara a 30ºC con agitación, durante 20 horas. Después de la reacción, se añadieron 3,5 ml de acetato de etilo a cada mezcla de reacción y todo se agitó bien. Una porción de la fase orgánica se sometió a cromatografía de gases y se realizó un ensayo para determinar el contenido de N-bencil-3-pirrolidinol. También se determinó la pureza óptica del mismo mediante HPLC.
Condiciones de la cromatografía de gases: columna: Uniport B, 10% de PEG-20 M, 4,0 mm de DI (diámetro interno) x 1,0 m; temperatura de la columna: 200ºC; gas portador: nitrógeno; detección: FID (detector de ionización de llama).
Condiciones del análisis de HPLC: columna: Chiralcel OB (producto de Daicel Chemical Industries); eluyente: n-hexano/isopropanol/dietilamina = 99/1/0,1; detección: 254 nm; velocidad de flujo: 1 ml/min; tiempo de elución: (R) desde 6,1 minutos, (S) desde 7,9 minutos.
Las tasas de conversión en el producto y las purezas ópticas de los productos se resumen en la tabla 1.
TABLA 1
3
Ejemplo 2
Se preparó un medio líquido con la composición mostrada a continuación y se distribuyó en porciones de 10 ml en tubos de ensayo de gran tamaño y se esterilizó con vapor a 120ºC durante 20 minutos.
4
Cada porción de este medio líquido se inoculó con un asa completa de Micrococcus luteus IFO 13867 y se realizó un cultivo con agitación a 30ºC durante 24 horas. Después, este fluido de cultivo se sometió a centrifugación y de ese modo se recogieron las células, se lavaron con agua y después se suspendieron en 2 ml de tampón fosfato 100 mM (pH 6,5) y la suspensión se utilizó como un componente de la mezcla de reacción de la misma manera que en el ejemplo 1. Después de dejar que la reacción continuara durante 20 horas, se determinaron la tasa de conversión en el producto y la pureza óptica del producto, de la misma manera que en el ejemplo 1. La tasa de conversión fue del 81% y la pureza óptica fue de (S) 100% de ee (exceso enantiomérico)
Ejemplo 3
Los microorganismos indicados en la tabla 3 se cultivaron de la misma manera que en el ejemplo 1. Después, cada fluido de cultivo se sometió a centrifugación para recoger de este modo las células, que se lavaron con agua y se suspendieron en 1 ml de tampón fosfato 100 mM (pH 6,5). La suspensión se utilizó como un componente de la mezcla de reacción siguiente.
5
Los componentes (1) a (5) anteriores se colocaron en un tubo de ensayo y se mezclaron, y se dejó que continuara la reacción a 30ºC con agitación, durante 20 horas. Después de la reacción, se determinaron la tasa de conversión en el producto y la pureza óptica del producto, de la misma manera que en el ejemplo 1. Los resultados obtenidos de este modo se resumen en la tabla 2.
TABLA 2
6
Ejemplo 4
Los microorganismos indicados en la tabla 3 se cultivaron de la misma manera que en el ejemplo 1. Después, cada fluido de cultivo se sometió a centrifugación para recoger de este modo las células, que se lavaron con agua y se suspendieron en 1 ml de tampón fosfato 100 mM (pH 6,5). La suspensión se utilizó como un componente de la mezcla de reacción siguiente.
7
Los componentes (1) a (5) anteriores se colocaron en un tubo de ensayo y se mezclaron, y se dejó que continuara la reacción a 30ºC con agitación, durante 20 horas. Después de la reacción, se determinaron la tasa de conversión en el producto y la pureza óptica del producto, de la misma manera que en el ejemplo 1. Los resultados obtenidos de este modo se resumen en la tabla 3.
TABLA 3
8
Ejemplo 5
Micrococcus luteus IFO 13867 se cultivó de la misma manera que en el ejemplo 2. Las células obtenidas se suspendieron en 2 ml de tampón fosfato 100 mM (pH 6,5) y la suspensión se utilizó como un componente de la mezcla de reacción dada en el ejemplo 3. Después de dejar que la reacción continuara durante 20 horas, se determinaron la tasa de conversión en el producto y la pureza óptica del producto, de la misma manera que en el ejemplo 1. La tasa de conversión fue del 78% y la pureza óptica fue de (S) 100% de ee.
Ejemplo 6
Micrococcus luteus IFO 13867 se cultivó de la misma manera que en el ejemplo 2. Las células obtenidas se suspendieron en 2 ml de tampón fosfato 100 mM (pH 6,5) y la suspensión se utilizó como un componente de la mezcla de reacción dada en el ejemplo 4. Después de dejar que la reacción continuara durante 20 horas, se determinaron la tasa de conversión en el producto y la pureza óptica del producto, de la misma manera que en el ejemplo 1. La tasa de conversión fue del 78% y la pureza óptica fue de (S) 100% de ee.
Ejemplo 7
Se preparó un medio líquido con la composición dada en el ejemplo 2 y se distribuyó en porciones de 100 ml en veinticinco matraces Sakaguchi (matraz balón de fondo plano) de 500 ml y se esterilizó con vapor a 120ºC durante 20 minutos. El contenido de cada matraz se inoculó de manera aséptica con 2 ml de un fluido de cultivo obtenido cultivando Micrococcus luteus IFO 13867 de la misma manera que en el ejemplo 2, y se realizó un cultivo con agitación a 30ºC durante 24 horas. Se recogieron las células de los fluidos de cultivo resultantes mediante centrifugación y se suspendieron en 500 ml de tampón fosfato 100 mM (pH 6,5). A esta suspensión se añadieron 5 g de N-bencil-3-pirrolidinona y 10 g de glucosa. Se dejó que la reacción continuara a 30ºC con agitación, durante 24 horas, mientras que la mezcla de reacción se mantuvo a pH 6,5 con una disolución acuosa de hidróxido de sodio 6 N. Después de esto, la mezcla de reacción se extrajo con 2,5 l de acetato de etilo, y la fase acuosa se extrajo adicionalmente con 1 l de acetato de etilo. Las fases orgánicas se combinaron y deshidrataron sobre sulfato de sodio anhidro, y el disolvente se destiló entonces a presión reducida. El residuo se destiló para dar 3 g de (S)-N-bencil-3-pirrolidinol. El rendimiento fue del 60%, la pureza óptica fue del 99,8% de ee, el punto de ebullición fue de 132 a 137ºC / 3 mm de Hg, y la rotación óptica [\alpha]_{D}^{20} fue de -3,77º (CH_{3}OH, c = 5). ^{1}H-RMN \delta (CDCl_{3}): 1,63 - 1,76 (1H, m), 2,09 - 2,21 (1H, m), 2,26 - 2,37 (1H, m), 2,51 - 2,64 (2H, m), 2,75 - 2,85 (1H, m), 3,38 (1H, sa), 3,61 (2H, s), 4,24 - 4,33 (1H, m), 7,19 - 7,37 (5H, m).
Ejemplo 8
Se preparó un medio líquido con la composición dada en el ejemplo 1 y se distribuyó en porciones de 50 ml en cincuenta matraces Sakaguchi de 500 ml y se esterilizó con vapor a 120ºC durante 20 minutos. El contenido de cada matraz se inoculó de manera aséptica con 1 ml de un fluido de cultivo obtenido cultivando Trichosporon fermentans ATCC 10675 de la misma manera que en el ejemplo 1, y se realizó un cultivo con agitación a 30ºC durante 24 horas. Se recogieron las células de los fluidos de cultivo resultantes mediante centrifugación y se suspendieron en 500 ml de tampón fosfato 100 mM (pH 6,5). A esta suspensión se añadieron 5 g de N-bencil-3-pirrolidinona, 10 g de glucosa, 275 mg de la forma oxidada de fosfato de dinucleótido de nicotinamida y adenina (producto de Kohjin Co.) y 1,420 unidades de glucosa deshidrogenasa (producto de Amano Pharmaceutical Co.), y se dejó que la reacción continuara a 30ºC con agitación, durante 48 horas, mientras que la mezcla de reacción se mantuvo a pH 6,5 con una disolución acuosa de hidróxido de sodio 6 N. Después de esto, la mezcla de reacción se extrajo con 2,5 l de acetato de etilo, y la fase acuosa se extrajo adicionalmente con 1 l de acetato de etilo. Las fases orgánicas se combinaron y deshidrataron sobre sulfato de sodio anhidro, y el disolvente se destiló entonces a presión reducida. El residuo se purificó sometiendo al mismo a cromatografía en columna de gel de sílice (eluyente: acetato de etilo / metanol = 2/1) para dar 2,5 g de (S)-N-bencil-3-pirrolidinol. El rendimiento fue del 49%, la pureza óptica fue del 96% de ee, el punto de ebullición fue de 132 a 137ºC / 3 mm de Hg, y la rotación óptica [\alpha]_{D}^{20} fue de -3,73º (CH_{3}OH, c = 5). ^{1}H-RMN \delta (CDCl_{3}): 1,63 - 1,76 (1H, m), 2,09 - 2,21 (1H, m), 2,26 - 2,37 (1H, m), 2,51 - 2,64 (2H, m), 2,75 – 2,85 (1H, m), 3,38 (1H, sa), 3,61 (2H, s), 4,24 - 4,33 (1H, m), 7,19 - 7,37 (5H, m).
Ejemplo 9
Se preparó un medio líquido con la composición dada en el ejemplo 1 y se distribuyó en porciones de 50 ml en cincuenta matraces Sakaguchi de 500 ml y se esterilizó con vapor a 120ºC durante 20 minutos. El contenido de cada matraz se inoculó de manera aséptica con 1 ml de un fluido de cultivo obtenido cultivando Trichosporon fermentans ATCC 10675 de la misma manera que en el ejemplo 1, y se realizó un cultivo con agitación a 30ºC durante 24 horas. Se recogieron las células de los fluidos de cultivo resultantes mediante centrifugación y se suspendieron en 500 ml de tampón fosfato 100 mM (pH 6,5). Se rompieron las células por medio de un equipo Brown de ruptura celular enfriando con hielo, y el sobrenadante obtenido por centrifugación, concretamente el extracto sin células, se utilizó como un componente de la mezcla de reacción siguiente.
9
Los componentes (1) a (5) anteriores se colocaron en un tubo de ensayo y se mezclaron, y se dejó que continuara la reacción a 30ºC con agitación, durante 20 horas. Después de la reacción, se determinaron la tasa de conversión en el producto y la pureza óptica del producto, de la misma manera que en el ejemplo 1. La tasa de conversión fue del 19% y la pureza óptica fue de (S) 96% de ee.
Aplicabilidad industrial
EL método para producir N-bencil-3-pirrolidinol ópticamente activo según la presente invención, que tiene la constitución mencionada anteriormente, puede producir eficazmente N-bencil-3-pirrolidinol ópticamente activo a una escala comercial. El N-bencil-3-pirrolidinol ópticamente activo obtenido según la presente invención tiene elevada pureza óptica y es un producto intermedio importante para la producción de compuestos medicinales, tales como antibióticos \beta-lactámicos y compuestos de dihidropiridina.

Claims (1)

1. Método para producir N-bencil-3-pirrolidinol ópticamente activo, que comprende una etapa de obtención de una mezcla de reacción mediante el tratamiento de N-bencil-3-pirrolidinona con células o un cultivo de un microorganismo, o un material derivado de los mismos, y una etapa de recuperación del N-bencil-3-pirrolidinol ópticamente activo a partir de la mezcla de reacción, en el que dicho microorganismo es un microorganismo que pertenece al género Depodascus, Debaryomyces, Cryptococcus, Pichia, Rhodosporidium, Trichosporon, Micrococcus, Komagataella, Ogataea o Zygosaccharomyces.
ES97946058T 1996-11-26 1997-11-26 Procedimiento para la preparacion de n-bencil-3-pirrolidinol opticamente activo. Expired - Lifetime ES2227721T3 (es)

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