CZ289734B6

CZ289734B6 - Způsob přípravy opticky aktivního N-benzyl-3-pyrrolidinolu

Info

Publication number: CZ289734B6
Application number: CZ19991861A
Authority: CZ
Inventors: Yoshihiko Yasohara; Junzo Hasegawa
Original assignee: Kaneka Corporation
Priority date: 1996-11-26
Filing date: 1997-11-26
Publication date: 2002-03-13
Also published as: IL129881A0; EP0942068A1; CZ186199A3; HUP0000807A2; ES2227721T3; JP3703928B2; IL129881A; KR20000057221A; EP0942068B1; CN1238808A; ATE274598T1; US6214610B1; DE69730444D1; JPH10150997A; WO1998023768A1; HUP0000807A3; CN1082093C; KR100458811B1; DE69730444T2; EP0942068A4

Abstract

Zp sob p° pravy opticky aktivn ho N-benzyl-3-pyrrolidinolu spo v v tom, e se na N-benzyl-3-pyrrolidinon p sob bu kami nebo kulturou mikroorganism , nebo z nich poch zej c m materi lem, p°i em mikroorganismy pou it v tomto zp sobu pat° do rod Depodascus, Debaryomyces, Cryptococcus, Pichia, Rhodosporidium, Trichosporon, Micrococcus, Komagataella, Ogataea nebo Zygosaccharomyces.\

Description

Způsob přípravy opticky aktivního N-benzyl-3-pyrroIidinolu

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká způsobu přípravy opticky aktivního N-benzyl-3-pyrrolidinolu, který je užitečný jako meziprodukt pro syntézu léčiv jako jsou např. β-laktamová antibiotika a dihydropyridinové sloučeniny.

Dosavadní stav techniky

Opticky aktivní N-benzyl-3-pyrrolidinol je užitečný jako meziprodukt pro syntézu léčiv. Známé metody pro přípravu opticky aktivního N-benzyl-3-pyrrolidinolu jsou, kromě jiných, např. postupy zahrnující jeho syntézu z opticky aktivní sloučeniny a postupy vycházející z prochirální sloučeniny a provádějící asymetrickou syntézu nebo optickou rezoluci. Jedna z takových metod, popsaná v japonské patentové publikaci (Kokai) Hei-06-141876, zahrnuje přípravu opticky aktivního N-benzyl-3-pyrrolidinolu stereoselektivní redukcí N-benzyl-3-pyrrolidinonu za přítomnosti enzymu schopného katalyzovat stereoselektivní redukci N-benzyl-3-pyrrolidinonu. Avšak tato metoda není vhodná k praktickému využití, částečně proto, že houby užívané jako zdroj enzymu se obtížně kultivují v průmyslovém měřítku, a tudíž se obtížně provádí celý navazující způsob, a zčásti proto, že navážková koncentrace substrátu a rychlost konverze substrátu na produkt jsou nízké.

Podstata vynálezu

Vzhledem k výše uvedenému, předmětem předkládaného vynálezu je poskytnout účinný způsob přípravy opticky aktivního N-benzyl-3-pyrrolidinolu, a sice enzymatickou reakcí zahrnující stereoselektivní redukci N-benzyl-3-pyrrolidinonu.

Předkládaný vynález spočívá ve způsobu přípravy opticky aktivního N-benzyl-3-pyrrolidinolu, kterýžto způsob obsahuje krok, kdy se získá reakční směs tak, že se na N-benzyl-3-pyrrolidinon působí buňkami nebo kulturou mikroorganismů, nebo z nich pocházejícím materiálem, a dále obsahuje krok, kdy se z této reakční směsi izoluje opticky aktivní N-benzyl-3-pyrrolidinol, přičemž mikroorganismy použité v tomto způsobu patří do rodů Depodascus, Debaryomyces, Cryptococcus, Pichia, Rhodosporidium, Trichosporon, Micrococcus, Komagataella, Ogataea nebo Zygosaccharomyces.

V následujícím textuje vynález podrobně popsán.

Nejdříve se ve způsobu podle předkládaného vynálezu působí na N-benzyl-3-pyrrolidinon buňkami nebo kulturou mikroorganismů, nebo z nich pocházejícím materiálem, aby vznikla reakční směs.

N-benzyl-3-pyrrolidinon se může syntetizovat způsobem popsaným v japonské patentové publikaci (Kokai) Sho-54-16466. Benzylamin a etylakrylát jsou podrobeny Michaelově adici a takto získaný alaninový derivát reaguje s etylchloracetátem v přítomnosti báze. Získaná sloučenina se cyklizuje v přítomnosti kovového sodíku a vzniká N-benzyl-4-carboetoxy-3pyrrolidon, který je dekarboxylován pomocí chlorovodíkové kyseliny, přičemž se získá N-benzyl-3-pyrrolidinon.

Ve způsobu podle předkládaného vynálezu se jako výše zmíněné mikroorganismy použijí mikroorganismy patřící do rodu Depodascus, Debaryomyces, Cryptococcus, Pichia, Rhodosporidium, trichosporon, Micrococcus, Komagataella, Ogataea nebo Zygosaccharomyces. Tyto mikro

-1 CZ 289734 B6 organismy stereoseiektivně redukují karbonylovou skupinu v poloze 3 ve výše uvedené N-benzyl-3-pyrrolidinonu.

K typickým příkladům těchto mikroorganismů patří, ale neomezuje se pouze na ně, Depodascus tetrasperma CBS 765.70, Debaryomyces hansenii var. hansenii IFO 0728, Cryptococcus albidus var. albidus IFO 0378, Pichia membranaefaciens IFO 0189, Rhodosporidium toruloides IFO 0413, Trichosporon fermentas ATCC 10675, Micrococcus luteus IFO 13867, Komagataella pastoris IFO 0948, Ogataea polymorpha IFO 1476, Zygosaccharomyces bailii IFO 0519 apod.

Tyto mikroorganismy je možné získat ze základních kmenových kultur, které jsou okamžitě dostupné z veřejných sbírek nebo za úplatu. Je také možné je izolovat přímo z přírody. Je také možné získat mikrobiální kmeny, které mají výhodné vlastnosti pro způsob podle předkládaného vynálezu, tak, že se vytvoří mutace v těchto mikroorganismech. Dále se mohou také užít mikroorganismy odvozené z těchto původních metodami genetického inženýrství nebo bioinženýrství, jako je např. metoda rekombinantní DNA, buněčné fuze apod.

Uvedené mikroorganismy se kultivují pomocí média obsahujícího živné složky. Obecně se užívá pevné médium jako je např. agarové médium nebo tekuté médium. Po kultivaci těchto mikroorganismů ve velkém měřítku se zpravidla výhodně užívá tekuté médium.. Součástí takového živného média je zdroj uhlíku, např. sacharidy jako glukóza, sacharóza nebo maltóza, organické kyseliny jako kyselina mléčná, kyselina octová nebo kyselina citrónová, alkoholy jako etanol nebo glycerol, anebo směsi těchto látek, a dále zdroj dusíku, např. síran amonný, fosforečnan amonný, močovina, extrakty z kvasinek, extrakty z masa, pepton apod. Dále se volitelně do média mohou přidat anorganické soli, vitaminy a další zdroje výživy.

Uvedené mikroorganismy se kultivují obecně v obvyklých podmínkách, což znamená např. aerobně při pH 4,0 až 9,5 při teplotě v rozmezí od 20 do 45 °C po dobu 10 až 96 hodin.

Při působení těchto mikroorganismů na výše uvedený N-benzyl-3-pyrrolidinon se obecně užije takto získané tekuté kultivační médium obsahující uvedené mikroorganismy. V případě, že nějaká složka tekutého kultivačního média interferuje s reakcí, je výhodné užít suspenzi, která se získá odstředěním uvedeného tekutého kultivačního média.

K materiálům, pocházejícím z buněk uvedených mikroorganismů patří, přičemž tento výčet není omezující, suché buňky, buněčný materiál získaný z buněk působením surfaktantu nebo organického rozpouštědla a materiál získaný z buněk působením lytického enzymu. Kromě toho sem patří také enzymové přípravky získané extrakcí z buněk nebo kultur.

K materiálům, pocházejícím z kultur patří, přičemž tento výčet není omezující, koncentrované kultury, suché kultury, kultury ošetřené působením surfaktantu nebo organického rozpouštědla, kultury ošetřené působením lytického enzymu apod. Kromě toho sem patří také enzymové přípravky získané purifikací z kultivovaných buněk nebo kultur.

Při provádění reakce, kdy se působí mikrobiálními buňkami nebo materiálem z nich získaným na N-benzyl-3-pyrrolidinon, se může N-benzyl-3-pyrrolidinon přidat všechen najednou na počátku nebo přidávat po částech. V takovém případě je teplota mezi 15 a 50 °C, výhodně 20 až 40 °C, a hodnota pH je 2,5 až 9,0.

Množství buněk v reakční směsi se dá vhodně zvolit v závislosti na katalytické schopnosti buněk. Koncentrace substrátu je výhodně mezi 0,01 až 50 % (hmotnost/objem), výhodněji 0,1 až 20 % (hmotnost/objem).

Obecně se reakce provádí tak, že se třese nebo provzdušňuje a míchá. Reakční doba se dá vhodně zvolit v závislosti na koncentraci substrátu, množství mikroorganismů a dalších reakčních podmínkách. Obecně je výhodné, když se podmínky zvolí tak, že reakce může být ukončena do

-2CZ 289734 B6 až 168 hodin. Pro uiychlení reakce je možné přidat zdroj energie, jako je např. glukóza, v množství 1 až 5 %, čímž se dosáhne dobrých výsledků.

Kromě toho se reakce může podpořit přidáním koenzymové složky jako je např. redukovaná forma nikotinamidadenindinukleotidu (NADH) nebo redukovaná forma nikotinamidadenindinukleotidfosfátu (NADPH), které se považují za nezbytné pro redukční reakce v biologických procesech. Konkrétně se tedy výše zmíněné sloučeniny buďto mohou přidat do reakce nebo se do reakce přidá reakční systém schopný vytvářet NADH, NADPH apod. Tak např. se může použít reakce, ve které se vytváří NADH z NAD, když se tvoří oxid uhličitý a voda z kyseliny mravenčí působením formiátdehydrogenázy, nebo reakce, kde se NADH/NADPH tvoří z NAD/NADP při příležitosti tvorby glukenolaktonu z glukózy v přítomnosti glukózadehydrogenázy. Surfaktant jako je Triton (produkt firmy Nakalai Tesque), Spán (produkt firmy Kanto Chemical) nebo Tween (produkt firmy Nakalai Tesque) se může také přidat.

V této reakci se pak získá z reakční směsi produkt, opticky aktivní N-benzyl-3-pyrrolidinol.

Způsob získání N-benzyl-3-pyrrolidinolu z reakční směsi není nijak zvlášť vymezen, lze užít jakýkoliv obecný způsob izolace. Tak např. opticky aktivní N-benzyl-3-pyrrolidinol lze získat způsobem, který spočívá v tom, že se k reakční směsi přidá organické rozpouštědlo jako je etylacetát, čímž se navodí extrakce, získaný extrakt se dehydratuje přes bezvodý síran sodný apod., a organické rozpouštědlo se odstraní za sníženého tlaku. V takovém případě se může přidat sůl jako je hydrogenuhličitan sodný nebo chlorid sodný, aby se zvýšila účinnost extrakce. Pokud je to nutné, tento hrubě purifikovaný produkt se může konvertovat na lépe purifikovaný opticky aktivní N-benzyl-3-pyrrolidinol destilací nebo chromatografií na silikagelové koloně nebo jiným obdobným způsobem.

Následující příklady dále podrobněji ilustrují předkládaný vynález. Avšak v žádném případě předmět vynálezu nij ak neomezuj í.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Bylo připraveno tekuté médium níže uvedeného složení a bylo rozděleno po 5 ml do velkých zkumavek a sterilizováno párou 20 minut při 120 °C.

Složení média:

Glukóza	4%
Kvasinkový extrakt	0,3 %
KH₂PO₄	0,1 %
(NH4)₂H₂PO₄	0,65 %
NaCl	0,1 %
MgSO₄.7H₂O	0,8 %
ZnSO₄.7H₂O	0,06 %
FeSO₄.7H₂O	0,09 %
CuSO₄.5H₂O	0,005 %
MnSO₄.4-6 H₂O	0,01 %
voda (z vodovodu)
pH7.0

Tyto dávky média byly inokulovány vždy jednou plnou kličkou jednoho z mikroorganismů uvedených v tabulce 2. Pak byly udržovány třepané kultury při 30 °C po 24 až 72 hodin. Poté

-3CZ 289734 B6 byly buňky z každé kultury sklizeny odstředěním, opláchnuty vodou a resuspendovány v 1 ml 100 mM fosfátového pufru (pH6,5). Každá taková suspenze pak byla užita jako složka následující reakční směsi.

Složení reakční směsi:

(1) Buněčná suspenze výše zmíněná 1 ml (2) Glukóza 20 mg (3) N-benzyl-3-pyrrolidinon 10 mg.

Složky (1) až (3) v každé zkumavce byly smíchány a reakce probíhala za třepání při 30 °C po 20 hodin. Pak byly přidány 3,5 ml etylacetátu ke každé reakční směsi a vše se dobře promíchalo. Část organické vrstvy se analyzovala plynovou chromatografií a testovala se na obsah N-benzyl-

3-pyrrolidinolu. Jeho optická čistota se stanovila pomocí HPLC.

Podmínky plynové chromatografie: kolona: Uniport B, 10% PEG-20M, 4,0 mm ID x 1,0 m; teplota kolony: 200 °C; nosný plyn: dusík; detekce: FID.

Podmínky HPLC: kolona: Chiralcel OB (od firmy Daicel Chemical Industries); eluent: n-hexan/isopropanol/dietylamin = 99/1/0,1; detekce: 254 nm; průtok: 1 ml/min; doba eluce: (R) forma 6,1 minuty, (S) forma 7,9 minuty.

Míra konverze na produkt a jeho optická čistota jsou souhrnně uvedeny v tabulce 1.

Tabulka 1

Kmen mikroorganismu	Míra konverze %	Optická čistota (% ee)
Depodascus tetrasperma CBS 765.70	10	(S) 97
Debaiyomyces hansenii var. hansenii ΠΌ 0728	7	(S) 84
Cryptococcus albidus var. albidus ΠΌ 0378	34	(S) 100
Pichia membranaefaciens ΠΌ 0189	12	(S) 84
Rhodosporidium toruloides ΠΌ 0413	33	(S)74
Trichosporon fermentans ATCC 10675	75	(S)96
Komagatealla pastoris IFO 0948	14	(S)61
Ogataea polymorpha IFO 1476	17	(S) 89
Zygosaccharomyces bailii IFO 0519	12	(S)62

Příklad 2

Bylo připraveno tekuté médium níže uvedeného složení a bylo rozděleno po 10 ml do velkých zkumavek a sterilizováno párou 20 minut při 120 °C.

Složení média:

Masový extrakt 1,0 %

Pepton 1,0%

Kvasinkový extrakt 0,5 %

NaCl 0,3 %

Voda (vodovodní) pH7,0

-4CZ 289734 B6

Dávky média byly inokulovány vždy jednou plnou kličkou Micrococcus luteus IFO 13867 a pak byly udržovány třepané kultury při 30 °C po 24 hodin. Poté byly buňky z každé kultury sklizeny odstředěním, opláchnuty vodou a resuspendovány ve 2 ml lOOmM fosfátového pufru (pH 0,5).

Každá taková suspenze pak byla užita jako složka reakční směsi stejným způsobem jako v příkladu 1. Poté, co reakce probíhala 20 hodin byla stanovena míra konverze a optická čistota produktu stejně jako v příkladu 1. Míra konverze byla v tomto případě 81 % a čistota byla 100 %ee.

Příklad 3

Mikroorganismy uvedené v tabulce 3 byly kultivovány stejným způsobem jako v příkladu 1. Poté byly buňky z každé kultury sklizeny odstředěním, opláchnuty vodou a resuspendovány v 1 ml lOOmM fosfátového pufru (pH6,5). Každá taková suspenze pak byla užita jako složka 15 následující reakční směsi.

Složení reakční směsi:

(1) Buněčná suspenze uvedená výše 0,5ml (2) Glukóza 5,4mg (3) Nikotinamidadenindinukleotidfosfát (oxidovaná forma) 0,275 mg (4) Glukózadehydrogenáza (od firmy Amano Pharmaceutical) 2,84jednotek (5) N-benzyl-3-pyrrolidinon 1,0mg.

Složky (1) až (5) byly vneseny do zkumavky a promíchány, reakce probíhala za třepání při 30 °C po 20 hodin. Pak byla stanovena míra konverze a optická čistota produktu stejně jako v příkladu 1. Takto získané výsledky jsou shrnuty v tabulce 2.

Tabulka 2

Kmen mikroorganismu	Míra konverze %	Optická čistota (% ee)
Depodascus tetrasperma CBS 765.70	15	(S)96
Debaryomyces hansenii var. hansenii IFO 0728	9	(S) 84
Ciyptococcus albidus var. albidus IFO 0378	47	(S)91
Pichia membranaefaciens IFO 0189	61	(S) 83
Rhodosporidium toruloides IFO 0413	74	(S)76
Trichosporon fermentans ATCC 10675	74	(S)96
Komagatealla pastoris IFO 0948	18	(S) 58
Ogataea polymorpha IFO 1476	13	(S) 89
Zygosaccharomyces bailii IFO 0519	15	(S) 58

Příklad 4

Mikroorganismy uvedené v tabulce 3 byly kultivovány stejným způsobem jako v příkladu 1. Poté byly buňky z každé kultury sklizeny odstředěním, opláchnuty vodou a resuspendovány v 1 ml lOOmM fosfátového pufru (pH6,5). Každá taková suspenze pak byla užita jako složka následující reakční směsi.

-5CZ 289734 B6 f

Složení reakční směsi:

(I)	Buněčná suspenze uvedená výše	0,5 ml
(2)	Glukóza	5,4 mg
(3)	Nikotinamidadenindinukleotid (oxidovaná forma)	0,26 mg
(4)	Glukózadehydrogenáza (od firmy Amano Pharmaceutical)	2,84 jednotek
(5)	N-benzyl-3-pyrrolidinon	1,0 mg.

Složky (1) až (5) byly vneseny do zkumavky a promíchány, reakce probíhala za třepání při 30 °C po 20 hodin. Pak byla stanovena míra konverze a optická čistota produktu stejně jako v příkladu 1. Takto získané výsledky jsou shrnuty v tabulce 3.

Tabulka 3

Kmen mikroorganismu	Míra konverze %	Optická čistota (% ee)
Depodascus tetrasperma CBS 765.70	33	(S)99
Debaiyomyces hansenii var. hansenii IFO 0728	6	(S) 83
Pichia membranaefaciens IFO 0189	24	(S) 80
Rhodosporidium toruloides IFO 0413	72	(S)76
Trichosporon fermentans ATCC 10675	74	(S)96
Komagatealla pastoris IFO 0948	19	(S)59
Ogataea polymorpha IFO 1476	11	(S) 87
Zygosaccharomyces bailii IFO 0519	13	(S)6j

Příklad 5

Micrococcus luteus IFO 13867 byl kultivován stejným způsobem jako v příkladu 2. Získané buňky byly resuspendovány ve 2 ml lOOmM fosfátového pufru (pH6,5) a suspenze pak byla užita jako složka reakční směsi uvedené v příkladu 3. Poté, co reakce probíhala 20 hodin byla stanovena míra konverze a optická čistota produktu stejně jako v příkladu 1. Míra konverze byla v tomto případě 78 % a čistota (S) byla 100 % ee.

Příklad 6

Micrococcus luteus IFO 13867 byl kultivován stejným způsobem jako v příkladu 2. Získané 30 buňky byly resuspendovány ve 2 ml lOOmM fosfátového pufru (pH6,5) a suspenze pak byla užita jako složka reakční směsi uvedené v příkladu 4. Poté, co reakce probíhala 20 hodin byla stanovena míra konverze a optická čistota produktu stejně jako v příkladu 1. Míra konverze byla v tomto případě 78 % a čistota (S) byla 100 % ee.

Příklad 7

Bylo připraveno tekuté médium stejného složení jako bylo uvedeno v příkladu 2 a bylo rozděleno po 100 ml do 25 Sakaguchiho lahví o objemu 500 ml a pak sterilizováno párou 20 minut při 40 120 °C. Obsah každé lahve byl asepticky inokulován 2 ml kultury získané kultivací Micrococcus luteus IFO 13867 stejným způsobem jako v příkladu 2 a byly udržovány třepané kultury při 30 °C po 24 hodin. Poté byly buňky z každé kultury sklizeny odstředěním a resuspendovány v 500 ml lOOmM fosfátového pufru (pH 6,5). K této suspenzi se přidalo 5 g N-benzyl-3pyrrolidinonu a 10 g glukózy. Reakce probíhala při 30 °C za míchání po 24 hodin, přičemž byla 45 udržována hodnota pH na 6,5 pomocí 6N vodného roztoku hydroxidu sodného. Poté byla reakční

-6CZ 289734 B6 směs extrahována 2,5 1 etylacetátu a vodná fáze pak dále extrahována 1 1 etylacetátu. Organické fáze pak byly sloučeny a dehydratovány přes bezvodý síran sodný, rozpouštědlo bylo odstraněno destilací za sníženého tlaku. Zbytek byl destilován a poskytl 3 g (S) N-benzyl-3-pyrrolidinolu. Výtěžek byl 60 %, optická čistota 99,8 % ee, bod varu 132 až 147 °C/0,399 kPa (3 mm Hg) a optická rotace [a]_D ²⁰ byla -3,77° (CH₃OH, c = 5). ’Η-NMR 5(CDC1₃): 1,63 - 1,76 (1H, m), 2,09 - 2,21 (1H, m), 2,26 - 2,37 (1H, m), 2,51-2,64 (2H, m), 2,75 - 2,85 (1H, m), 3,38 (1H, brs), 3,61 (2H, s), 4,24 - 4,33 (1H, m), 7,19 - 7,37 (5H, m).

Příklad 8

Bylo připraveno tekuté médium stejného složení jako bylo uvedeno v příkladu 1 a bylo rozděleno po 100 ml do 50 Sakaguchiho lahví o objemu 500 ml a pak sterilizováno párou 20 minut při 120 °C. Obsah každé lahve byl asepticky inokulován 1 ml kultury získané kultivací Trichosporon fermentans ATCC 10675 stejným způsobem jako v příkladu 1 a byly udržovány třepané kultury při 30 °C po 24. Poté byly buňky z každé kultury sklizeny odstředěním a resuspendovány v 500 ml lOOmM fosfátového pufru (pH6,5). K této suspenzi se přidalo 5g N-benzyl-3pyrrolidinonu, 10 g glukózy, 275 mg oxidované formy nikotinamidadenindinukleotidfosfátu (od firmy Kohjin Co.) a 1420 jednotek glukózadehydrogenázy (od firmy Amano Pharmaceuticals Co.) a reakce probíhala při 30 °C za míchání po 48 hodin, přičemž byla udržována hodnota pH na 6,5 pomocí 6N vodného roztoku hydroxidu sodného. Poté byla reakční směs extrahována 2,5 1 etylacetátu a vodná fáze pak dále extrahována 11 etylacetátu. Organické fáze pak byly sloučeny a dehydratovány přes bezvodý síran sodný, rozpouštědlo bylo odstraněno destilací za sníženého tlaku. Zbytek byl chromatograficky purifikován na koloně silikagelu (eluent etylacetát/metanol = 2/1) a poskytl 2,5 g (S) N-benzyl-3-pyrrolidinolu. Výtěžek byl 49 %, optická čistota 96 % ee, bod varu 132 až 137 °C/0,399 kPa (3 mm Hg) a optická rotace (a)_D ²⁰ - byla -3,73° (CH₃OH, c = 5). ’Η-NMR 5(CDC1₃): 1,63 - 1,76 (1H, m), 2,09 - 2,21 (1H, m), 2,26 - 2,37 (1H, m), 2,51 - 2,64 (2H, m), 2,75 - 2,85 (1H, m), 3,38 (1H, brs), 3,61 (2H, s), 4,24 - 4,33 (1H, m), 7,19 - 7,37 (5H, m).

Příklad 9

Bylo připraveno tekuté médium stejného složení jako bylo uvedeno v příkladu 1 a bylo rozděleno po 50 ml do 50 Sakaguchiho lahví o objemu 500 ml a pak sterilizováno párou 20 minut při 120 °C. Obsah každé lahve byl asepticky inokulován 1 ml kultury získané kultivací Trichosporon fermentans ATCC 10675 stejným způsobem jako v příkladu 1 a byly udržovány třepané kultury při 30 °C po 24. Poté byly buňky z každé kultury sklizeny odstředěním a resuspendovány v 500 ml lOOmM fosfátového pufru (pH 6,5). Buňky pak byly rozdrceny Brownovým drtičem buněk za současného chlazení a supematant získaný odstředěním, tedy bezbuněčný extrakt, byl použit jako složka v následující reakční směsi:

Složení reakční směsi:

(1) Buněčná suspenze uvedená výše 0,5 ml (2) Glukóza 5,4 mg (3) Nikotinamidadenindinukleotid (oxidovaná forma) 0,26 mg (4) Glukózadehydrogenáza (od firmy Amano Pharmaceutical) 2,84 jednotek (5) N-benzyl-3-pyrrolidinon 1,0 mg.

Výše uvedené složky (1) až (5) byly vneseny do zkumavky a promíchány, reakce probíhala za třepání při 30 °C po 20 hodin. Po proběhnutí reakce byla stanovena míra konverze a optická čistota produktu stejně jako v příkladu 1. Míra konverze byla v tomto případě 19 % a čistota (S) byla 96 % ee.

Průmyslová využitelnost

Způsob výroby opticky aktivního N-ben2yl-3-pyrroIidinolu podle předkládaného vynálezu, jehož podstata byla výše popsána, se může užít pro účinnou výrobu opticky aktivního N-benzyl3-pyrrolidinolu v průmyslovém měřítku. Opticky aktivní N-benzyl-3-pyrrolidinol připravený způsobem podle předkládaného vynálezu má vysokou optickou čistotu a je důležitým meziproduktem pro výrobu léčiv jako jsou (β-laktamová antibiotika a dihydropyridinové sloučeniny.

PATENTOVÉ NÁROKY

Claims

1. Způsob přípravy opticky aktivního N-benzyl-3-pyrrolidinolu, vyznačující se tím, že působením buňkami nebo kulturou mikroorganismů, nebo materiálem pocházejícím z buněk nebo kultury mikroorganismů na N-benzyl-3-pyrrolidinon se získá reakční směs, ze které se získá opticky aktivní N-benzyl-3-pyrrolidinol, přičemž použité mikroorganismy patří do rodů Depodascus, Debaryomyces, Cryptococcus, Pichia, Rhodosporidium, Trichosporon, Micrococcus, Komaagataella, Ogataea nebo Zygosaccharomyces.