JP2703768B2 - 光学活性３−ヒドロキシピロリジン誘導体の製造法 - Google Patents
光学活性３−ヒドロキシピロリジン誘導体の製造法Info
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Description
【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野）
本発明は、一般式〔Ｉ〕
（式中、Ｘは水素あるいは炭素数１〜17の置換又は未
置換アルキル基、アルケニル基を示す。）で示される
（Ｒ）および（Ｓ）−Ｎ−ベンジル−３−アシロキシピ
ロリジン混合物を立体選択的に加水分解して、一般式
〔II〕 で示される光学活性な（Ｒ）−Ｎ−ベンジル−３−ヒド
ロキシピロリジンを生成させる立体選択的エステラーゼ
活性を有し、シュードモナス属、ムコール属またはアル
カリゲネス属に属する微生物を、あるいは該微生物由来
の立体選択的エステラーゼ活性を有するリパーゼを一般
式〔Ｉ〕で示される（Ｒ）および（Ｓ）−Ｎ−ベンジル
−３−アシロキシピロリジン混合物に作用させ、光学活
性な（Ｒ）−Ｎ−ベンジル−３−ヒドロキシピロリジン
〔II〕と、これと立体的に対掌な一般式〔Ｉ′〕 （式中、Ｘは前記と同じ）で示される光学活性な（Ｓ）
−Ｎ−ベンジル−３−アシロキシピロリジンとに光学分
割し、夫々の光学活性化合物を分離採取することを特徴
とする光学活性な（Ｒ）−Ｎ−ベンジル−３−ヒドロキ
シピロリジン及びその対掌体の光学活性（Ｓ）−Ｎ−ベ
ンジル−３−アシロキシピロリジンの製造法に関する。 本発明によつて製造される光学活性な（Ｒ）−Ｎ−ベ
ンジル−３−ヒドロキシピロリジン及び（Ｓ）−Ｎ−ベ
ンジル−３−アシロキシピロリジンは医薬、農薬等の有
用な合成中間体である。 （従来の技術と問題点） 光学活性な（Ｒ）−Ｎ−ベンジル−３−ヒドロキシピ
ロリジンの製法に関しては、トランス−４−ヒドロキシ
−Ｌ−プロリンを脱炭酸して得る方法（特開昭60-2332
8）が知られており、これらをベンジル化して合成する
ことも可能である。しかし、経済的な工業的製法とは考
え難い。 本発明は、医薬品等の合成原料として有用な式〔II〕
で示される光学活性（Ｒ）−Ｎ−ベンジル−３−ヒドロ
キシピロリジン及び一般式〔Ｉ′〕で示される光学活性
（Ｓ）−Ｎ−ベンジル−３−アシロキシピロリジンを化
学的に容易に合成しうる（Ｒ）および（Ｓ）−Ｎ−ベン
ジル−３−アシロキシピロリジン混合物を微生物あるい
は酵素により立体選択的に加水分解することにより光学
分割することで経済的に生産することを目的としたもの
である。 （問題点を解決するための手段と作用） 先に本発明者らは、（Ｒ）体と（Ｓ）体の等量混合物
であるラセミ体の（RS）−Ｎ−ベンジル−３−アシロキ
シピロリジン〔Ｉ〕は、これまでに報告されたことのな
い新規化合物であるが、このものは安価なDL−リンゴ酸
等から容易に合成しうる（RS）−Ｎ−ベンジル−３−ヒ
ドロキシピロリジンと脂肪酸ハライド等と反応させるこ
とで容易に合成しうる事を見い出し、特許出願した。次
に本発明者らは、この新規化合物である（Ｒ）および
（Ｓ）−Ｎ−ベンジル−３−アシロキシピロリジン混合
物〔Ｉ〕を微生物あるいは酵素により不斉加水分解をし
て光学分割することを考え検討を行った。その結果、化
合物〔Ｉ〕の（Ｒ）体を立体選択的に加水分解し、光学
活性な化合物〔II〕を生成させうる微生物および酵素の
存在を見い出し、該反応後、簡単な分離操作により光学
活性な（Ｒ）−Ｎ−ベンジル−３−ヒドロキシピロリジ
ン〔II〕と立体的に対掌な光学活性（Ｓ）−Ｎ−ベンジ
ル−３−アシロキシピロリジン〔Ｉ′〕とを採取しうる
事を見い出した。また光学活性の（Ｓ）−Ｎ−ベンジル
−３−アシロキシピロリジン〔Ｉ′〕は、更にアルカリ
加水分解あるいは（Ｓ）体に立体特異的に作用する微生
物や酵素あるいは立体選択性のないリパーゼ等を用いて
加水分解することにより立体配置を保持した光学活性
（Ｓ）−Ｎ−ベンジル−３−アシロキシピロリジンとす
ることができ、いずれの立体特異性をもつ微生物あるい
は酵素を用いても（Ｒ）体と（Ｓ）体のＮ−ベンジル−
３−ヒドロキシピロリジン両対掌体を同時に得ることが
できる。 本製造法の発明により、従来法と比べ経済的に光学活
性な（Ｒ）−Ｎ−ベンジル−３−ヒドロキシピロリジン
および光学活性な（Ｓ）−Ｎ−ベンジル−３−アシロキ
シピロリジンの各々の両対掌体の生産が可能となった。 本発明の基質として用いられる一般式〔Ｉ〕 で表わされる（Ｒ）および（Ｓ）−Ｎ−ベンジル−３−
アシロキシピロリジンは、（Ｒ）体と（Ｓ）体の等量混
合物であるラセミ体でも、（Ｒ）体か（Ｓ）体のいずれ
かがより多く含まれた混合物でも使用しうる。また置換
基Ｘとしては、水素あるいは炭素数１〜17個の直鎖ある
いは分岐アルキル基、アルケニル基で無置換のもの、あ
るいはハロゲン等で置換されたものも用いることができ
る。例えば、メチル基，エチル基，エチレン基,n−プロ
ピル基，イソプロピル基,1−プロピレン基,n−ブチル
基，イソブチル基,1−ブチレン基,n−ペンチル基,n−ヘ
キシル基,n−ヘプチル基、ｎ−オクチル基,n−ノナシル
基,n−デシル基,n−ウンデシル基,n−ドデシル基,n−ト
リデシル基,n−テトラデシル基,n−ペンタデシル基,n−
ヘキサデシル基,n−ヘプタデシル基,n−オクタデシル基
等の直鎖あるいは分岐状の未置換アルキル基，アルケニ
ル基等、例えばクロロメチル基，ジクロロメチル基，ト
リフロロメチル基,2−クロロエチル基,3−クロロプロピ
ル基,4−クロロブチル基等のハロゲン置換された置換ア
ルキル基等が挙げられる。 化合物〔Ｉ〕を立体選択的に加水分解し、光学活性な
〔II〕を生成させる立体選択的エステラーゼ活性を有す
る微生物あるいは酵素は、次の様なスクリーニングを行
なえば容易に見い出すことができる。例えばその具体的
な一例として示すと、微生物の生育可能な栄養培地10ml
を大型試験管に入れ、被試験菌を植菌後、25〜35℃に１
〜３日間振とう培養する。次に、この培養液に（RS）−
Ｎ−ベンジル−３−ブチリルオキシピロリジンを２％
（w/v）添加し、更に20〜35℃、pHをNaOHでpH5〜７に調
整しながら１〜３日間反応させる。加水分解の進行は、
反応液を硫酸でpH2.0とし２倍量の酢酸エチルで生成す
る酪酸を抽出し、これをガスクロマトグラフイー（充填
剤、島津FAL-M6％／シマライト、φ0.3×10cmカラム、
温度140℃）にて定量することで分析できる。各反応液
の経時変化をとり、添加基質に対して、生成する酪酸が
約２分の１当量生成したところで反応が極端に遅くなる
菌株を１次選択する。次に反応スケールを500mlにか
え、前記と同様の培養及び加水分解を行ない、終了後、
ジクロロメタン500mlで４回抽出し、減圧下で脱溶剤す
る。これをシリカゲルカラム（ワコーゲルＣ−200、250
g）に負荷し、ヘキサン／酢酸エチル（10/2）で未反応
のＮ−ベンジル−３−ブチリルオキシピロリジンを溶出
する。更に、酢酸エチルで生成したＮ−ベンジル−３−
ヒドロキシピロリジンを溶出する。各画分を濃縮すれば
油状の光学活性Ｎ−ベンジル−３−ブチリルオキシピロ
リジンと光学活性Ｎ−ベンジル−３−ヒドロキシピロリ
ジンが得られる。 そして、光学活性Ｎ−ベンジル−３−ブチリルオキシ
ピロリジンはNaOHで加水分解すれば、光学活性を損う事
なく光学活性のＮ−ベンジル−３−ヒドロキシピロリジ
ンとなり、これらを蒸留により精製し、比旋光度を測定
すれば、立体選択的エステラーゼ活性を有する微生物か
否か容易に判断できる。各種起源の酵素のスクリーニン
グにおいても微生物培養液の代りに、酵素0.5gを10mlの
0.1Mリン酸緩衝液に溶解し、同様な方法で行なう事がで
きる。この様にＮ−ベンジル−３−ブチリルオキシピロ
リジンを立体選択的に加水分解しうる微生物あるいは酵
素は前記の様な各種のＮ−ベンジル−３−アシロキシピ
ロリジンに対しても同様な立体選択的加水分解活性を示
す。 （Ｒ）および（Ｓ）−Ｎ−ベンジル−３−アシロキシ
ピロリジン混合物を立体選択的に加水分解し、〔II〕と
〔Ｉ′〕を与える立体選択的エステラーゼ活性を有する
微生物としては、例えばシユードモナス属、ムコール
属、アルカリゲネス属等に属する微生物があり、更に詳
しくはシユードモナス・フルオレツセンス（Pseudomona
s fluorescens）IFO 3081、シユードモナス・アエルギ
ナーサ（Pseudomonas aeruginosa）IFO 3080、ムコール
・ジヤバニクス（Mucor javanicus）IFO 4569、アルカ
リゲネス・ユートロフス（Alcaligens eutrophus）ATCC
17697などが利用できる。 これらの微生物は培養液そのものを用いる事ができる
が、培養液あるいは菌体から酵素を抽出精製して用いる
こともできる。また市販酵素を直接用いることもでき
る。例えばリポプロテインリパーゼ（LPLアマノ３、シ
ユードモナス属由来、天野製薬（株）製）、リパーゼＭ
−AP10（ムコール属由来、天野製薬（株）製）、リパー
ゼPL（アルカリゲネス属、名糖産業（株）製）などがこ
の目的に適している。 加水分解反応は、微生物培養液あるいは酵素抽出物又
は酵素の水溶液に基質〔Ｉ〕を0.5〜75％（w/v）濃度の
範囲で添加し、温度10〜55℃の範囲で撹拌しながら行な
う。酵素量は酵素活性に依存するが、通常〔Ｉ〕に対し
て等量から1000分の１の範囲で行なう。反応のpHは5.0
〜8.5の範囲で行なうが、加水分解反応中にpHが変化す
る場合は適当な酸やアルカリ水溶液で最適のpHに保持す
るのが望ましい。 反応において微生物あるいは酵素を水不溶性の担体等
で固定化して、くり返し用いる事もできる。微生物の固
定化は、例えばアクリルアミドポリマー、ウレタンポリ
マー、エチレングリコール誘導体ポリマー、カラギーナ
ン、アルギン酸カルシウム等による方法が挙げられる。
また酵素の固定化にはアンバーライトXAD−７、アンバ
ーライトXAD−２、ダイヤイオンHP20、ダイヤイオンHP2
MG、オクチル・セファロースCL−4B等の合成吸着剤等に
よる方法等が挙げられる。基質の〔Ｉ〕は水に対する溶
解度は一般に低いが、撹拌を充分すれば本反応にとつて
支障とならない。しかし、反応をすみやかに進行させる
目的でアセトン，エタノール等の親水性溶媒や界面活性
剤等を反応に支障を与えない程度加えても良い。 反応の追跡は、加水分解によつて生成する有機酸をガ
スクロマトグラフイーで分析し、添加した〔II〕の0.5
当量の有機酸が生成した時点で反応を終了させれば良
い。 加水分解物〔II〕と残存する〔Ｉ′〕を分離する方法
としては、疎水性の有機溶剤、例えばヘキサン，シクロ
ヘキサン，石油エーテル，塩化メチレン，クロロホル
ム，四塩化炭素等を用い、pH4.0〜8.5の範囲に調整した
反応液より、〔Ｉ′〕のみあるいは若干〔II〕を含む
〔Ｉ′〕を抽出分離し、必要あればシリカゲルクロマト
グラフイー（ヘキサン−アセトン溶剤で分離）にて
〔Ｉ′〕と〔II〕を分離し、各々純粋なものを得ること
ができる。更に反応液中に残存する〔II〕は反応液のpH
をNaOH等で９〜14に調整した後、前記の溶剤で抽出すれ
ば完全に回収することができる。ここで注意すべき事
は、〔Ｉ′〕はアルカリ条件で加水分解を受けるため、
最小からアルカリ性条件で〔II〕と〔Ｉ′〕を抽出する
ことは、〔II〕の光学純度低下をもたらすため良くない
点である。 〔Ｉ′〕と〔II〕との分離は、前記のシリカゲルクロ
マトグラフイーでも、他の無機吸着剤、例えばフロリジ
ル，アルミナ、ゼオライト等、あるいは合成吸着剤、例
えばアンバーライトXAD−７、アンバーライトXAD−２、
ダイヤイオンHP20、ダイヤイオンHP2MG、オクチル−セ
フアロースCL−4B等を用いて分離することもできる。炭
素鎖の長い〔Ｉ′〕と〔II〕であれば蒸留によつても分
離することができる。 光学活性な〔Ｉ′〕は、そのまま合成原料として用い
ることもできるが、NaOH,KOH,Ca（OH）2等のアルカリに
より化学的に、あるいは立体選択性の異なるエステラー
ゼや微生物を用いて加水分解することで容易に光学活性
を保持したまま〔II〕に導くこともできる。 〔II〕および〔Ｉ′〕の光学純度の測定は次の方法で
行なう事ができる。〔Ｉ′〕は前記の方法で加水分解
後，〔II〕となし、〔II〕を塩化メチレン中、等モルの
ｐ−トルエンスルホニルクロライドと反応させてトシル
化後、これを高速液体クロマトグラフイー（HPLC）（カ
ラム：キラルセルOB（日本分光製）φ0.46×25cm、溶出
後、ヘキサン：イソプロパノール（20:1）、流速1.5ml/
min、検出221nm、保持時間（Ｒ）体:36.7分、（Ｓ）体5
1.3分）により測定することができる。 （実施例） 以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本
発明はこれら実施例のみに限定されるものではない。 実施例１ 100mlの0.1Mリン酸緩衝液（pH7.0）にリポプロテイン
リパーゼ（LPLアマノ３、シユードモナス属由来、天野
製薬（株）製）を0.1g及びラセミ体の（RS）−Ｎ−ベン
ジル−３−ブチリルオキシピロリジン10gを添加し、塩
酸でpH7.0に調整後、撹拌下40℃で28時間反応を行つ
た。反応液を100mlのヘキサンで３回抽出し、減圧下で
脱溶剤後、油状の（Ｓ）−Ｎ−ベンジル−３−ブチルオ
キシピロリジン 4.95gを得た。次に抽出残液をNaOH溶
液でpH13となし、各100mlのヘキサンで３回抽出し、減
圧にて脱溶剤後、油状の（Ｒ）−Ｎ−ベンジル−３−ヒ
ドロキシピロリジン 3.42gを得た。（Ｓ）−Ｎ−ベン
ジル−３−ブチリルオキシピロリジンを減圧下蒸留（13
2〜137℃/3mmHg）し、4.5gの無色透明な精製品を得た。
このものの比旋光度は▲〔α〕20 D▼−19.2°（ｃ＝
５、MeOH）を示すと共に、NMRおよびIRスペクトルは標
品と一致し、元素分析値は計算値と一致した。 次に、本品は1N-NaOH 50mlを加え、加熱下、加水分解
を行ない、塩化メチレン50mlにて３回抽出した。これを
減圧下脱溶剤を行ない、3.31gの（Ｓ）−Ｎ−ベンジル
−３−ヒドロキシピロリジンを得た。これを減圧下蒸留
し（111℃/2mmHg）、無色油状物を3.00g得た。このもの
のNMRおよびIRスペクトルは標品と一致し、元素分析値
は計算値とよく一致した。比旋光度は▲〔α〕20 D▼−
3.79°（ｃ＝５、MeOH）を示した。高速液体クロマトグ
ラフイーでの測定による光学純度は100％e.e.であつ
た。一方、（Ｒ）−Ｎ−ベンジル−３−ヒドロキシピロ
リジンの蒸留後の比旋光度は▲〔α〕20 D▼＋3.73°
（ｃ＝５、MeOH）、光学純度は99％e.e.であつた。 実施例２〜14 100mlの0.1M−リン酸緩衝液（pH7.0）にラセミ体の
（RS）−Ｎ−ベンジル−３−アシロキシピロリジンを各
45.5ミリモル添加し、更にリポプロテインリパーゼ（LP
L アマノ３）を0.1〜1.0g添加し、塩酸でpHを7.0に調
整後、撹拌下40℃で24〜72時間反応を行つた。添加基質
の50％が加水分解された時点で反応を止め、塩化メチレ
ン100mlで５回抽出を行ない、未反応の（Ｓ）−Ｎ−ベ
ンジル−３−アシロキシピロリジンと、加水分解された
（Ｒ）−Ｎ−ベンジル−３−ヒドロキシピロリジンとの
混合物を得た。減圧下脱溶剤を行なつたのち、シリカゲ
ルカラム（ワコーC200、200g）に負荷し、ヘキサン−酢
酸エチル（10:2〜5:10）で溶出分離し、（Ｓ）−Ｎ−ベ
ンジル−３−アシロキシピロリジンと（Ｒ）−Ｎ−ベン
ジル−３−ヒドロキシピロリジン各々を得た。（Ｓ）−
Ｎ−ベンジル−３−アシロキシピロリジンは実施例１と
同様に加水分解した後、光学純度を測定した。これらの
結果を表１に示す。 実施例15 リポプロテインリパーゼ（LPLアマノ３）2gを0.05M−
リン酸緩衝液（pH7.0）40mlに懸濁し、これにアンバー
ライトXAD−７を40g添加し、一夜撹拌し、酵素を樹脂に
吸着させた。次に樹脂を過後、約500mlの0.05M−リン
酸緩衝液（pH7.0）で洗浄し、未吸着の酵素を除去し
た。この酵素吸着樹脂をカラム（φ2.2×15cm）につ
め、33℃に保温しながら（RS）−Ｎ−ベンジル−３−ヘ
キサノイルオキシピロリジン5gを負荷した。次に0.05M
−リン酸緩衝液（pH7.0）を500ml流し、（Ｒ）−Ｎ−ベ
ンジル−３−ヒドロキシピロリジンを溶出した。次にヘ
キサンを500ml流し、未反応の（Ｓ）−Ｎ−ベンジル−
３−ヘキサノイルオキシピロリジンを溶出した。 （Ｒ）−Ｎ−ベンジル−３−ヒドロキシピロリジンを
含む溶液を減圧濃縮して50mlとし、NaOHでpH13とした
後、100mlの塩化メチレンで３回抽出した。減圧下脱溶
剤後、減圧蒸留して無色油状の（Ｒ）−Ｎ−ベンジル−
３−ヒドロキシピロリジン1.32gを得た。このものの比
旋光度は▲〔α〕20 d▼＋3.75°（ｃ＝５、MeOH）を示
し、HPLC分析による光学純度は99％e.e.であつた。 一方、（Ｓ）−Ｎ−ベンジル−３−ヘキサノイルオキ
シプロリジンは、ヘキサンを減圧下脱溶剤した後、減圧
蒸留（bp.160℃/3mmHg）にて精製し、無色油状で2.21g
得た。このものの比旋光度は▲〔α〕20 d▼−15.3°
（ｃ＝５、MeOH）を示した。更にアルカリ条件で加水分
解をし、（Ｓ）−Ｎ−ベンジル−３−ヒドロキシピロリ
ジンとなし、これをトシル化後、HPLCで光学純度を測定
したところ100％e.e.であつた。 実施例16〜19 グルコース２％、イーストエキス0.5％、肉エキス0.3
％、ペプトン0.3％、オリーブ油１％（pH7.0）の組成か
らなる栄養液体倍地1500mlを3l容ミニジヤーに入れ、12
0℃、20分間殺菌後、表２に示す微生物を植菌し、30
℃、40時間通気1vvm、撹拌500rpmで培養した。その後pH
を7.0に調整し、（RS）−Ｎ−ベンジル−３−ヘキサノ
イルオキシピロリジン5gを添加し、30℃で48時間反応さ
せた。反応後、遠心分離して菌体を除去し、上清を等量
のヘキサンで３回抽出し、未反応のＮ−ベンジル−３−
ヘキサノイルオキシピロリジンを回収した。 次に抽出残液をNaOH溶液でpH134とし、等量の塩化メ
チレンで３回抽出し、加水分解されたＮ−ベンジル−３
−ヒドロキシピロリジンを得た。減圧下脱溶剤の後、蒸
留により無色透明のＮ−ベンジル−３−ヒドロキシピロ
リジンを得、これをトシル化後、HPLCによる光学純度を
測定した結果表２の如くであつた。 実施例20〜22 100mlの0.1Mリン酸緩衝液（pH7.0）に（RS）−Ｎ−ベ
ンジル−３−ヘキサノイルオキシピロリジン10gを添加
し、更に表３に示す市販酵素を添加し、40℃、撹拌下22
〜120時間反応を行つた。反応液を等量のヘキサンで３
回抽出し、未反応のＮ−ベンジル−３−ヘキサノイルオ
キシピロリジンを回収した。その後NaOH溶液でpHを13と
し、等量の塩化メチレンで３回抽出し、加水分解された
Ｎ−ベンジル−３−ヒドロキシピロリジンを抽出分離
し、減圧下脱溶剤を行ない、次に蒸留により精製して無
色透明油状のＮ−ベンジル−３−ヒドロキシピロリジン
を得た。これをトシル化後、HPLCにより光学純度を測定
した結果を表３に示す。
置換アルキル基、アルケニル基を示す。）で示される
（Ｒ）および（Ｓ）−Ｎ−ベンジル−３−アシロキシピ
ロリジン混合物を立体選択的に加水分解して、一般式
〔II〕 で示される光学活性な（Ｒ）−Ｎ−ベンジル−３−ヒド
ロキシピロリジンを生成させる立体選択的エステラーゼ
活性を有し、シュードモナス属、ムコール属またはアル
カリゲネス属に属する微生物を、あるいは該微生物由来
の立体選択的エステラーゼ活性を有するリパーゼを一般
式〔Ｉ〕で示される（Ｒ）および（Ｓ）−Ｎ−ベンジル
−３−アシロキシピロリジン混合物に作用させ、光学活
性な（Ｒ）−Ｎ−ベンジル−３−ヒドロキシピロリジン
〔II〕と、これと立体的に対掌な一般式〔Ｉ′〕 （式中、Ｘは前記と同じ）で示される光学活性な（Ｓ）
−Ｎ−ベンジル−３−アシロキシピロリジンとに光学分
割し、夫々の光学活性化合物を分離採取することを特徴
とする光学活性な（Ｒ）−Ｎ−ベンジル−３−ヒドロキ
シピロリジン及びその対掌体の光学活性（Ｓ）−Ｎ−ベ
ンジル−３−アシロキシピロリジンの製造法に関する。 本発明によつて製造される光学活性な（Ｒ）−Ｎ−ベ
ンジル−３−ヒドロキシピロリジン及び（Ｓ）−Ｎ−ベ
ンジル−３−アシロキシピロリジンは医薬、農薬等の有
用な合成中間体である。 （従来の技術と問題点） 光学活性な（Ｒ）−Ｎ−ベンジル−３−ヒドロキシピ
ロリジンの製法に関しては、トランス−４−ヒドロキシ
−Ｌ−プロリンを脱炭酸して得る方法（特開昭60-2332
8）が知られており、これらをベンジル化して合成する
ことも可能である。しかし、経済的な工業的製法とは考
え難い。 本発明は、医薬品等の合成原料として有用な式〔II〕
で示される光学活性（Ｒ）−Ｎ−ベンジル−３−ヒドロ
キシピロリジン及び一般式〔Ｉ′〕で示される光学活性
（Ｓ）−Ｎ−ベンジル−３−アシロキシピロリジンを化
学的に容易に合成しうる（Ｒ）および（Ｓ）−Ｎ−ベン
ジル−３−アシロキシピロリジン混合物を微生物あるい
は酵素により立体選択的に加水分解することにより光学
分割することで経済的に生産することを目的としたもの
である。 （問題点を解決するための手段と作用） 先に本発明者らは、（Ｒ）体と（Ｓ）体の等量混合物
であるラセミ体の（RS）−Ｎ−ベンジル−３−アシロキ
シピロリジン〔Ｉ〕は、これまでに報告されたことのな
い新規化合物であるが、このものは安価なDL−リンゴ酸
等から容易に合成しうる（RS）−Ｎ−ベンジル−３−ヒ
ドロキシピロリジンと脂肪酸ハライド等と反応させるこ
とで容易に合成しうる事を見い出し、特許出願した。次
に本発明者らは、この新規化合物である（Ｒ）および
（Ｓ）−Ｎ−ベンジル−３−アシロキシピロリジン混合
物〔Ｉ〕を微生物あるいは酵素により不斉加水分解をし
て光学分割することを考え検討を行った。その結果、化
合物〔Ｉ〕の（Ｒ）体を立体選択的に加水分解し、光学
活性な化合物〔II〕を生成させうる微生物および酵素の
存在を見い出し、該反応後、簡単な分離操作により光学
活性な（Ｒ）−Ｎ−ベンジル−３−ヒドロキシピロリジ
ン〔II〕と立体的に対掌な光学活性（Ｓ）−Ｎ−ベンジ
ル−３−アシロキシピロリジン〔Ｉ′〕とを採取しうる
事を見い出した。また光学活性の（Ｓ）−Ｎ−ベンジル
−３−アシロキシピロリジン〔Ｉ′〕は、更にアルカリ
加水分解あるいは（Ｓ）体に立体特異的に作用する微生
物や酵素あるいは立体選択性のないリパーゼ等を用いて
加水分解することにより立体配置を保持した光学活性
（Ｓ）−Ｎ−ベンジル−３−アシロキシピロリジンとす
ることができ、いずれの立体特異性をもつ微生物あるい
は酵素を用いても（Ｒ）体と（Ｓ）体のＮ−ベンジル−
３−ヒドロキシピロリジン両対掌体を同時に得ることが
できる。 本製造法の発明により、従来法と比べ経済的に光学活
性な（Ｒ）−Ｎ−ベンジル−３−ヒドロキシピロリジン
および光学活性な（Ｓ）−Ｎ−ベンジル−３−アシロキ
シピロリジンの各々の両対掌体の生産が可能となった。 本発明の基質として用いられる一般式〔Ｉ〕 で表わされる（Ｒ）および（Ｓ）−Ｎ−ベンジル−３−
アシロキシピロリジンは、（Ｒ）体と（Ｓ）体の等量混
合物であるラセミ体でも、（Ｒ）体か（Ｓ）体のいずれ
かがより多く含まれた混合物でも使用しうる。また置換
基Ｘとしては、水素あるいは炭素数１〜17個の直鎖ある
いは分岐アルキル基、アルケニル基で無置換のもの、あ
るいはハロゲン等で置換されたものも用いることができ
る。例えば、メチル基，エチル基，エチレン基,n−プロ
ピル基，イソプロピル基,1−プロピレン基,n−ブチル
基，イソブチル基,1−ブチレン基,n−ペンチル基,n−ヘ
キシル基,n−ヘプチル基、ｎ−オクチル基,n−ノナシル
基,n−デシル基,n−ウンデシル基,n−ドデシル基,n−ト
リデシル基,n−テトラデシル基,n−ペンタデシル基,n−
ヘキサデシル基,n−ヘプタデシル基,n−オクタデシル基
等の直鎖あるいは分岐状の未置換アルキル基，アルケニ
ル基等、例えばクロロメチル基，ジクロロメチル基，ト
リフロロメチル基,2−クロロエチル基,3−クロロプロピ
ル基,4−クロロブチル基等のハロゲン置換された置換ア
ルキル基等が挙げられる。 化合物〔Ｉ〕を立体選択的に加水分解し、光学活性な
〔II〕を生成させる立体選択的エステラーゼ活性を有す
る微生物あるいは酵素は、次の様なスクリーニングを行
なえば容易に見い出すことができる。例えばその具体的
な一例として示すと、微生物の生育可能な栄養培地10ml
を大型試験管に入れ、被試験菌を植菌後、25〜35℃に１
〜３日間振とう培養する。次に、この培養液に（RS）−
Ｎ−ベンジル−３−ブチリルオキシピロリジンを２％
（w/v）添加し、更に20〜35℃、pHをNaOHでpH5〜７に調
整しながら１〜３日間反応させる。加水分解の進行は、
反応液を硫酸でpH2.0とし２倍量の酢酸エチルで生成す
る酪酸を抽出し、これをガスクロマトグラフイー（充填
剤、島津FAL-M6％／シマライト、φ0.3×10cmカラム、
温度140℃）にて定量することで分析できる。各反応液
の経時変化をとり、添加基質に対して、生成する酪酸が
約２分の１当量生成したところで反応が極端に遅くなる
菌株を１次選択する。次に反応スケールを500mlにか
え、前記と同様の培養及び加水分解を行ない、終了後、
ジクロロメタン500mlで４回抽出し、減圧下で脱溶剤す
る。これをシリカゲルカラム（ワコーゲルＣ−200、250
g）に負荷し、ヘキサン／酢酸エチル（10/2）で未反応
のＮ−ベンジル−３−ブチリルオキシピロリジンを溶出
する。更に、酢酸エチルで生成したＮ−ベンジル−３−
ヒドロキシピロリジンを溶出する。各画分を濃縮すれば
油状の光学活性Ｎ−ベンジル−３−ブチリルオキシピロ
リジンと光学活性Ｎ−ベンジル−３−ヒドロキシピロリ
ジンが得られる。 そして、光学活性Ｎ−ベンジル−３−ブチリルオキシ
ピロリジンはNaOHで加水分解すれば、光学活性を損う事
なく光学活性のＮ−ベンジル−３−ヒドロキシピロリジ
ンとなり、これらを蒸留により精製し、比旋光度を測定
すれば、立体選択的エステラーゼ活性を有する微生物か
否か容易に判断できる。各種起源の酵素のスクリーニン
グにおいても微生物培養液の代りに、酵素0.5gを10mlの
0.1Mリン酸緩衝液に溶解し、同様な方法で行なう事がで
きる。この様にＮ−ベンジル−３−ブチリルオキシピロ
リジンを立体選択的に加水分解しうる微生物あるいは酵
素は前記の様な各種のＮ−ベンジル−３−アシロキシピ
ロリジンに対しても同様な立体選択的加水分解活性を示
す。 （Ｒ）および（Ｓ）−Ｎ−ベンジル−３−アシロキシ
ピロリジン混合物を立体選択的に加水分解し、〔II〕と
〔Ｉ′〕を与える立体選択的エステラーゼ活性を有する
微生物としては、例えばシユードモナス属、ムコール
属、アルカリゲネス属等に属する微生物があり、更に詳
しくはシユードモナス・フルオレツセンス（Pseudomona
s fluorescens）IFO 3081、シユードモナス・アエルギ
ナーサ（Pseudomonas aeruginosa）IFO 3080、ムコール
・ジヤバニクス（Mucor javanicus）IFO 4569、アルカ
リゲネス・ユートロフス（Alcaligens eutrophus）ATCC
17697などが利用できる。 これらの微生物は培養液そのものを用いる事ができる
が、培養液あるいは菌体から酵素を抽出精製して用いる
こともできる。また市販酵素を直接用いることもでき
る。例えばリポプロテインリパーゼ（LPLアマノ３、シ
ユードモナス属由来、天野製薬（株）製）、リパーゼＭ
−AP10（ムコール属由来、天野製薬（株）製）、リパー
ゼPL（アルカリゲネス属、名糖産業（株）製）などがこ
の目的に適している。 加水分解反応は、微生物培養液あるいは酵素抽出物又
は酵素の水溶液に基質〔Ｉ〕を0.5〜75％（w/v）濃度の
範囲で添加し、温度10〜55℃の範囲で撹拌しながら行な
う。酵素量は酵素活性に依存するが、通常〔Ｉ〕に対し
て等量から1000分の１の範囲で行なう。反応のpHは5.0
〜8.5の範囲で行なうが、加水分解反応中にpHが変化す
る場合は適当な酸やアルカリ水溶液で最適のpHに保持す
るのが望ましい。 反応において微生物あるいは酵素を水不溶性の担体等
で固定化して、くり返し用いる事もできる。微生物の固
定化は、例えばアクリルアミドポリマー、ウレタンポリ
マー、エチレングリコール誘導体ポリマー、カラギーナ
ン、アルギン酸カルシウム等による方法が挙げられる。
また酵素の固定化にはアンバーライトXAD−７、アンバ
ーライトXAD−２、ダイヤイオンHP20、ダイヤイオンHP2
MG、オクチル・セファロースCL−4B等の合成吸着剤等に
よる方法等が挙げられる。基質の〔Ｉ〕は水に対する溶
解度は一般に低いが、撹拌を充分すれば本反応にとつて
支障とならない。しかし、反応をすみやかに進行させる
目的でアセトン，エタノール等の親水性溶媒や界面活性
剤等を反応に支障を与えない程度加えても良い。 反応の追跡は、加水分解によつて生成する有機酸をガ
スクロマトグラフイーで分析し、添加した〔II〕の0.5
当量の有機酸が生成した時点で反応を終了させれば良
い。 加水分解物〔II〕と残存する〔Ｉ′〕を分離する方法
としては、疎水性の有機溶剤、例えばヘキサン，シクロ
ヘキサン，石油エーテル，塩化メチレン，クロロホル
ム，四塩化炭素等を用い、pH4.0〜8.5の範囲に調整した
反応液より、〔Ｉ′〕のみあるいは若干〔II〕を含む
〔Ｉ′〕を抽出分離し、必要あればシリカゲルクロマト
グラフイー（ヘキサン−アセトン溶剤で分離）にて
〔Ｉ′〕と〔II〕を分離し、各々純粋なものを得ること
ができる。更に反応液中に残存する〔II〕は反応液のpH
をNaOH等で９〜14に調整した後、前記の溶剤で抽出すれ
ば完全に回収することができる。ここで注意すべき事
は、〔Ｉ′〕はアルカリ条件で加水分解を受けるため、
最小からアルカリ性条件で〔II〕と〔Ｉ′〕を抽出する
ことは、〔II〕の光学純度低下をもたらすため良くない
点である。 〔Ｉ′〕と〔II〕との分離は、前記のシリカゲルクロ
マトグラフイーでも、他の無機吸着剤、例えばフロリジ
ル，アルミナ、ゼオライト等、あるいは合成吸着剤、例
えばアンバーライトXAD−７、アンバーライトXAD−２、
ダイヤイオンHP20、ダイヤイオンHP2MG、オクチル−セ
フアロースCL−4B等を用いて分離することもできる。炭
素鎖の長い〔Ｉ′〕と〔II〕であれば蒸留によつても分
離することができる。 光学活性な〔Ｉ′〕は、そのまま合成原料として用い
ることもできるが、NaOH,KOH,Ca（OH）2等のアルカリに
より化学的に、あるいは立体選択性の異なるエステラー
ゼや微生物を用いて加水分解することで容易に光学活性
を保持したまま〔II〕に導くこともできる。 〔II〕および〔Ｉ′〕の光学純度の測定は次の方法で
行なう事ができる。〔Ｉ′〕は前記の方法で加水分解
後，〔II〕となし、〔II〕を塩化メチレン中、等モルの
ｐ−トルエンスルホニルクロライドと反応させてトシル
化後、これを高速液体クロマトグラフイー（HPLC）（カ
ラム：キラルセルOB（日本分光製）φ0.46×25cm、溶出
後、ヘキサン：イソプロパノール（20:1）、流速1.5ml/
min、検出221nm、保持時間（Ｒ）体:36.7分、（Ｓ）体5
1.3分）により測定することができる。 （実施例） 以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本
発明はこれら実施例のみに限定されるものではない。 実施例１ 100mlの0.1Mリン酸緩衝液（pH7.0）にリポプロテイン
リパーゼ（LPLアマノ３、シユードモナス属由来、天野
製薬（株）製）を0.1g及びラセミ体の（RS）−Ｎ−ベン
ジル−３−ブチリルオキシピロリジン10gを添加し、塩
酸でpH7.0に調整後、撹拌下40℃で28時間反応を行つ
た。反応液を100mlのヘキサンで３回抽出し、減圧下で
脱溶剤後、油状の（Ｓ）−Ｎ−ベンジル−３−ブチルオ
キシピロリジン 4.95gを得た。次に抽出残液をNaOH溶
液でpH13となし、各100mlのヘキサンで３回抽出し、減
圧にて脱溶剤後、油状の（Ｒ）−Ｎ−ベンジル−３−ヒ
ドロキシピロリジン 3.42gを得た。（Ｓ）−Ｎ−ベン
ジル−３−ブチリルオキシピロリジンを減圧下蒸留（13
2〜137℃/3mmHg）し、4.5gの無色透明な精製品を得た。
このものの比旋光度は▲〔α〕20 D▼−19.2°（ｃ＝
５、MeOH）を示すと共に、NMRおよびIRスペクトルは標
品と一致し、元素分析値は計算値と一致した。 次に、本品は1N-NaOH 50mlを加え、加熱下、加水分解
を行ない、塩化メチレン50mlにて３回抽出した。これを
減圧下脱溶剤を行ない、3.31gの（Ｓ）−Ｎ−ベンジル
−３−ヒドロキシピロリジンを得た。これを減圧下蒸留
し（111℃/2mmHg）、無色油状物を3.00g得た。このもの
のNMRおよびIRスペクトルは標品と一致し、元素分析値
は計算値とよく一致した。比旋光度は▲〔α〕20 D▼−
3.79°（ｃ＝５、MeOH）を示した。高速液体クロマトグ
ラフイーでの測定による光学純度は100％e.e.であつ
た。一方、（Ｒ）−Ｎ−ベンジル−３−ヒドロキシピロ
リジンの蒸留後の比旋光度は▲〔α〕20 D▼＋3.73°
（ｃ＝５、MeOH）、光学純度は99％e.e.であつた。 実施例２〜14 100mlの0.1M−リン酸緩衝液（pH7.0）にラセミ体の
（RS）−Ｎ−ベンジル−３−アシロキシピロリジンを各
45.5ミリモル添加し、更にリポプロテインリパーゼ（LP
L アマノ３）を0.1〜1.0g添加し、塩酸でpHを7.0に調
整後、撹拌下40℃で24〜72時間反応を行つた。添加基質
の50％が加水分解された時点で反応を止め、塩化メチレ
ン100mlで５回抽出を行ない、未反応の（Ｓ）−Ｎ−ベ
ンジル−３−アシロキシピロリジンと、加水分解された
（Ｒ）−Ｎ−ベンジル−３−ヒドロキシピロリジンとの
混合物を得た。減圧下脱溶剤を行なつたのち、シリカゲ
ルカラム（ワコーC200、200g）に負荷し、ヘキサン−酢
酸エチル（10:2〜5:10）で溶出分離し、（Ｓ）−Ｎ−ベ
ンジル−３−アシロキシピロリジンと（Ｒ）−Ｎ−ベン
ジル−３−ヒドロキシピロリジン各々を得た。（Ｓ）−
Ｎ−ベンジル−３−アシロキシピロリジンは実施例１と
同様に加水分解した後、光学純度を測定した。これらの
結果を表１に示す。 実施例15 リポプロテインリパーゼ（LPLアマノ３）2gを0.05M−
リン酸緩衝液（pH7.0）40mlに懸濁し、これにアンバー
ライトXAD−７を40g添加し、一夜撹拌し、酵素を樹脂に
吸着させた。次に樹脂を過後、約500mlの0.05M−リン
酸緩衝液（pH7.0）で洗浄し、未吸着の酵素を除去し
た。この酵素吸着樹脂をカラム（φ2.2×15cm）につ
め、33℃に保温しながら（RS）−Ｎ−ベンジル−３−ヘ
キサノイルオキシピロリジン5gを負荷した。次に0.05M
−リン酸緩衝液（pH7.0）を500ml流し、（Ｒ）−Ｎ−ベ
ンジル−３−ヒドロキシピロリジンを溶出した。次にヘ
キサンを500ml流し、未反応の（Ｓ）−Ｎ−ベンジル−
３−ヘキサノイルオキシピロリジンを溶出した。 （Ｒ）−Ｎ−ベンジル−３−ヒドロキシピロリジンを
含む溶液を減圧濃縮して50mlとし、NaOHでpH13とした
後、100mlの塩化メチレンで３回抽出した。減圧下脱溶
剤後、減圧蒸留して無色油状の（Ｒ）−Ｎ−ベンジル−
３−ヒドロキシピロリジン1.32gを得た。このものの比
旋光度は▲〔α〕20 d▼＋3.75°（ｃ＝５、MeOH）を示
し、HPLC分析による光学純度は99％e.e.であつた。 一方、（Ｓ）−Ｎ−ベンジル−３−ヘキサノイルオキ
シプロリジンは、ヘキサンを減圧下脱溶剤した後、減圧
蒸留（bp.160℃/3mmHg）にて精製し、無色油状で2.21g
得た。このものの比旋光度は▲〔α〕20 d▼−15.3°
（ｃ＝５、MeOH）を示した。更にアルカリ条件で加水分
解をし、（Ｓ）−Ｎ−ベンジル−３−ヒドロキシピロリ
ジンとなし、これをトシル化後、HPLCで光学純度を測定
したところ100％e.e.であつた。 実施例16〜19 グルコース２％、イーストエキス0.5％、肉エキス0.3
％、ペプトン0.3％、オリーブ油１％（pH7.0）の組成か
らなる栄養液体倍地1500mlを3l容ミニジヤーに入れ、12
0℃、20分間殺菌後、表２に示す微生物を植菌し、30
℃、40時間通気1vvm、撹拌500rpmで培養した。その後pH
を7.0に調整し、（RS）−Ｎ−ベンジル−３−ヘキサノ
イルオキシピロリジン5gを添加し、30℃で48時間反応さ
せた。反応後、遠心分離して菌体を除去し、上清を等量
のヘキサンで３回抽出し、未反応のＮ−ベンジル−３−
ヘキサノイルオキシピロリジンを回収した。 次に抽出残液をNaOH溶液でpH134とし、等量の塩化メ
チレンで３回抽出し、加水分解されたＮ−ベンジル−３
−ヒドロキシピロリジンを得た。減圧下脱溶剤の後、蒸
留により無色透明のＮ−ベンジル−３−ヒドロキシピロ
リジンを得、これをトシル化後、HPLCによる光学純度を
測定した結果表２の如くであつた。 実施例20〜22 100mlの0.1Mリン酸緩衝液（pH7.0）に（RS）−Ｎ−ベ
ンジル−３−ヘキサノイルオキシピロリジン10gを添加
し、更に表３に示す市販酵素を添加し、40℃、撹拌下22
〜120時間反応を行つた。反応液を等量のヘキサンで３
回抽出し、未反応のＮ−ベンジル−３−ヘキサノイルオ
キシピロリジンを回収した。その後NaOH溶液でpHを13と
し、等量の塩化メチレンで３回抽出し、加水分解された
Ｎ−ベンジル−３−ヒドロキシピロリジンを抽出分離
し、減圧下脱溶剤を行ない、次に蒸留により精製して無
色透明油状のＮ−ベンジル−３−ヒドロキシピロリジン
を得た。これをトシル化後、HPLCにより光学純度を測定
した結果を表３に示す。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所
(Ｃ１２Ｐ 41/00
Ｃ１２Ｒ 1:785）
(Ｃ１２Ｐ 41/00
Ｃ１２Ｒ 1:05）
Claims (1)
- (57)【特許請求の範囲】 １．一般式〔Ｉ〕 ［式中、Ｘは水素あるいは炭素数１〜17の置換又は未置
換アルキル基、アルケニル基を示す。］で示される
（Ｒ）および（Ｓ）−Ｎ−ベンジル−３−アシロキシピ
ロリジン混合物を立体選択的に加水分解して、一般式
〔II〕 で示される光学活性な（Ｒ）−Ｎ−ベンジル−３−ヒド
ロキシピロリジンを生成させる立体選択的エステラーゼ
活性を有するシュードモナス属、ムコール属またはアル
カリゲネス属に属する微生物あるいは該微生物由来の立
体選択的エステラーゼ活性を有するリパーゼを一般式
〔Ｉ〕で示される（Ｒ）および（Ｓ）−Ｎ−ベンジル−
３−アシロキシピロリジン混合物に作用させ、式〔II〕で表わされる光学活性な（Ｒ）−Ｎ−ベンジル−３−ヒ
ドロキシピロリジン〔II〕と、これと立体的に対掌な一
般式〔Ｉ′〕 （式中、Ｘは前記と同じ）で示される光学活性な（Ｓ）
−Ｎ−ベンジル−３−アシロキシピロリジンとに光学分
割し、夫々の光学活性化合物を分離採取することを特徴
とする光学活性な（Ｒ）−Ｎ−ベンジル−３−ヒドロキ
シピロリジン及び／またはその対掌体の光学活性（Ｓ）
−Ｎ−ベンジル−３−アシロキシピロリジンの製造法。 ２．立体選択的エステラーゼ活性を有する微生物あるい
はリパーゼを水不溶性担体に固定化して用いる特許請求
の範囲第１項記載の製造法。 ３．一般式〔Ｉ〕で示される（Ｒ）および（Ｓ）−Ｎ−
ベンジル−３−アシロキシピロリジン混合物を微生物あ
るいはリパーゼにより立体選択的に加水分解をして得ら
れる光学活性な（Ｒ）−Ｎ−ベンジル−３−ヒドロキシ
ピロリジン〔II〕と光学活性な（Ｓ）−Ｎ−ベンジル−
３−アシロキシピロリジン〔Ｉ′〕との混合物から〔I
I〕と〔Ｉ′〕とを分離採取する際に、無機吸着剤ある
いは合成吸着剤を担体とするカラムクロマトグラフィー
により分離し、夫々を採取することを特徴とする特許請
求の範囲第１項ないし第２項いずれかの項記載の製造
法。 ４．一般式〔Ｉ〕で示される（Ｒ）および（Ｓ）−Ｎ−
ベンジル−３−アシロキシピロリジン混合物を微生物あ
るいはリパーゼにより立体選択的に加水分解をして得ら
れる光学活性な（Ｒ）−Ｎ−ベンジル−３−ヒドロキシ
ピロリジン〔II〕と光学活性な（Ｓ）−Ｎ−ベンジル−
３−アシロキシピロリジン〔Ｉ′〕との混合物から〔I
I〕と〔Ｉ′〕とを分離採取する際に、疎水性溶剤を用
いて（Ｓ）−〔Ｉ′〕を抽出して（Ｒ）−〔II〕と分離
し、夫々を採取することを特徴とする特許請求の範囲第
１項ないし第２項いずれかの項記載の製造法。
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| JP30105287A JP2703768B2 (ja) | 1987-11-28 | 1987-11-28 | 光学活性３−ヒドロキシピロリジン誘導体の製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
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|---|---|---|---|
| JP30105287A JP2703768B2 (ja) | 1987-11-28 | 1987-11-28 | 光学活性３−ヒドロキシピロリジン誘導体の製造法 |
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| JP13110097A Division JP2813342B2 (ja) | 1997-05-21 | 1997-05-21 | 光学活性３−ヒドロキシピロリジン誘導体の製造法 |
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|---|---|
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ID=17892282
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP30105287A Expired - Lifetime JP2703768B2 (ja) | 1987-11-28 | 1987-11-28 | 光学活性３−ヒドロキシピロリジン誘導体の製造法 |
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-
1987
- 1987-11-28 JP JP30105287A patent/JP2703768B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
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