CN110198726A

CN110198726A - 用于治疗皮炎的包含花生地上部提取物和分馏物的组合物及其用途

Info

Publication number: CN110198726A
Application number: CN201780083951.1A
Authority: CN
Inventors: 金水男; 金亨子; 金真徹; 李雪林; 奉庚泰; 朴鲁濬; 郑裕贞; 李多惠; 尹景老; 诸葛铉
Original assignee: Korea Advanced Institute of Science and Technology KAIST
Current assignee: Korea Advanced Institute of Science and Technology KAIST; Korea Institute of Science and Technology KIST
Priority date: 2016-11-28
Filing date: 2017-11-28
Publication date: 2019-09-03
Also published as: KR20180060201A; WO2018097681A1

Abstract

本发明涉及一种用于改善皮炎或由皮炎引起的继发性疾病的包含花生(Arachis hypogaea L.)地上部的提取物或其分馏物作为有效成分的组合物及其制备方法。

Description

用于治疗皮炎的包含花生地上部提取物和分馏物的组合物及其用途

技术领域

本发明涉及一种用于改善皮炎的包含花生(Arachis hypogaea L.)地上部提取物或其分馏物的组合物及其用途。

背景技术

免疫反应对保护身体是必须的，但当免疫反应出现为过敏反应时，便作为对我们身体无害的物质的异常免疫反应，其更成为一种破坏组织的免疫疾病(immune disorder)。

免疫疾病是由免疫系统的功能异常而引起的，其包括自身免疫性疾病、免疫缺陷症、过敏症等，其中过敏症由遗传因素、环境因素等的综合作用引起。特应性是指对外部刺激异常反应的超敏反应(hypersensitivity)之一，其含义与过敏症基本相同。

特应性疾病是指由于特应性引起的临床症状，其包括特应性皮炎、哮喘、过敏性鼻炎、过敏性结膜炎等。虽然“特应性皮炎”有时被称为“特应性”，但这两个术语的定义在医学上显然不同，由于特应性疾病倾向在进行相互作用的同时或具有时差下表达，因此往往被描述为“过敏进程(allergic march)”的特性(American Academy of Allergy Asthma&Immunology)。过敏进程是指婴儿在成长过程中以特应性皮炎、食物过敏、哮喘和过敏性鼻炎顺序出现过敏性疾病的现象，其与对过敏原致敏的进展有关。特应性皮炎的病因主要分为与皮肤屏障相关的病因(outside-in model)和与异常免疫反应相关的病因(inside-outmodel)，并需要综合考虑遗传因素和环境因素。

目前使用的特应性疾病治疗剂主要偏重于使用具有抑制组胺分泌或抑制过敏症状之一的炎症反应的效果的类固醇剂及抗组胺剂，还使用一些免疫调节剂和光疗法。现有治疗剂在缓和过敏症状方面有效，但不是根本的治疗方法，当长期使用时，存在药物功效降低和发生各种副作用的风险。类固醇剂的副作用包括肥胖、糖尿病、高血压和抑郁症等，抗组胺剂的副作用包括抑郁症、注意力不集中、嗜睡症、无气力、倦睡、性功能障碍等，免疫抑制剂的副作用包括局部刺激、高血压、肾毒性等。因此，越来越需要开发可替代现有药物或在长期使用中具有较少副作用的新概念治疗物质。

花生的学名为Arachis hypogaea L.，其为一种属于豆科(leguminosae)植物的一年生草本植物，高达50至60厘米。叶互生，为一回偶数羽状复叶，叶柄长，小叶四片，其为倒卵形或卵形，有圆形先端及短突起且基部渐狭，托叶大，先端长而尖锐。花冠黄色，花期为7至9月，每个叶腋处生一朵花，没有花梗，花萼管像蝶形花的茎，先端处有萼片、花瓣和雄蕊。在花萼管中有一个子房，从此顶出线状的花柱，当受精时，子房基部变长，子房进入地面。果实为椭圆形的荚果，果熟期为10月。果壳厚，质地坚硬，黄白色，外面具网状脉纹，在其中具1至3粒种子，种子为椭圆形或长椭圆形，种子壳为红棕色。由于主枝从基部分支并向侧面倾斜生长，因此遍布四方并有毛，且在沙地中栽培(韩国生物多样性信息系统，KoreaBiodiversity Information System)。

花生作为植物性油和蛋白质的资源，是一种非常重要的油脂植物，其可以以多种方式使用，如直接食用、黄油、人造黄油、食用油等(Lee et al.，2004)。据报道，花生含有大量作为天然多酚化合物的白藜芦醇，花生芽富含功能性营养成分，含水量高，味道好，被作为食材广泛使用。这些花生芽以其在癌症、糖尿病和心脏病的预防、抗氧化作用、炎症抑制、抗衰老、动脉硬化和血胆固醇的降低及记忆力增强等方面的效能和效果而闻名，据报道，特别是白藜芦醇包含在红葡萄、花生、桑葚等中，并具有多种药理作用。

然而，对花生地上部的研究很少。

发明内容

技术问题

本发明一方面提供一种用于改善皮炎或由皮炎引起的继发性疾病的包含花生(Arachis hypogaea L.)地上部的提取物或其分馏物作为有效成分的组合物。

本发明另一方面提供一种包括在超声波照射下使花生地上部与水、C1-C6的醇或其混合物接触的步骤的花生地上部提取物的制备方法。

本发明另一方面还提供一种包括将所述组合物以有效改善皮炎或由皮炎引起的继发性疾病的量施用于个体的步骤的用于改善个体的皮炎或由皮炎引起的继发性疾病的方法。

技术方案

所述花生地上部可以是叶、花、茎、芽或其组合，并且可以是干燥的。

特应性皮炎被认为是在过敏进程的第一个疾病，因此被用作预测特应性疾病发生的指标。如果在特应性皮炎期间不控制免疫反应，则估计过敏进程加速，所以为了预防哮喘、鼻炎等，需要控制特应性皮炎。因此，所述继发性疾病可以是哮喘或鼻炎。

在一实施例中，所述提取物可以用亲水性溶剂(hydrophilic solvent)提取，所述亲水性溶剂可以是水、C1-C6的醇或其混合物。所述醇可以是C1-C6或C1-C4的具有至少一个-OH基的化合物。所述醇可以是甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、仲丁醇、异丁醇、叔丁醇或其混合物。

所述花生地上部提取物可以是粗提物、分馏物或其组合。所述粗提物是通过将所述花生地上部与提取溶剂接触而获得的，并是指含有特定成分且未分离的提取物。所述分馏物是指从所述粗提物中分离含有特定成分的馏分的。所述分离可以是指使用有机溶剂的分离、色谱或过滤。所述色谱可以是离子交换色谱、亲和色谱、尺寸排阻色谱、高效液相色谱(HPLC)或其组合。

所述提取可以是指将所述花生地上部添加到所述提取溶剂中并进行孵育的。所述花生地上部可以具有通过细切或粉碎来微粉化的颗粒形态。所述花生地上部可以被干燥或洗涤。所述孵育可以是指在室温至回流温度下搅拌或不搅拌进行的。孵育温度可以根据所选溶剂而适当选择。例如，可以是室温至回流温度、30℃至回流温度、40℃至回流温度、50℃至回流温度、60℃至回流温度或65℃至回流温度。所述提取时间可以根据提取条件而适当选择。所述提取时间可以是2小时至4小时，例如2.5小时至3.5小时。所述提取溶剂可以是花生地上部的5至15倍，例如5至13倍、5至11倍、8至15倍、8至13倍、8至11倍或9至11倍。所述提取可以是指一次或多次的提取，例如1次至5次、1次至4次、1次至3次、2次至5次或2次至4次。获得的粗提物可以被过滤、浓缩及干燥。所述干燥可以是指减压干燥。

在一实施例中，所述提取物可以在超声波照射下提取。所述超声波照射可以在室温、10℃至25℃、10℃至30℃、10℃至40℃、10℃至45℃、10℃至50℃、10℃至55℃、10℃至60℃、10℃至65℃或10℃至70℃下进行。所述超声波照射时间可以为10分钟至30分钟、10分钟至1小时、10分钟至2小时、10分钟至3小时、10分钟至4小时、10分钟至5小时、10分钟至6小时、10分钟至9小时、10分钟至12小时、10分钟到24小时。所述超声波照射可以在密封容器中进行。

在一实施例中，所述提取物可以使用有机溶剂来进一步提取。所述进一步的提取可以用于分馏。所述有机溶剂可以是乙酸乙酯(EtOAc)、己烷、二氯甲烷(CH₂Cl₂)、丁醇、丙酮、乙腈或其组合。使用所述有机溶剂的提取可以包括将所述提取物添加到所述有机溶剂中以进行孵育的步骤。所述提取条件可以根据所选溶剂而适当选择，所述孵育可以在室温至回流温度下搅拌或不搅拌进行。所述孵育温度可以根据所选溶剂而适当选择，例如可以是室温至回流温度、30℃至回流温度、40℃至回流温度、50℃至回流温度、60℃至回流温度或65℃至回流温度。所述提取时间可以根据提取条件而适当选择。所述提取时间可以是2小时至4小时，例如2.5小时至3.5小时。所述提取溶剂可以是花生地上部的5倍至15倍，例如5倍至13倍、5倍至11倍、8倍至15倍、8倍至13倍、8倍至11倍、或9倍至11倍。所述提取可以是指一次或多次的提取，例如1次至5次、1次至4次、1次至3次、2次至5次、或2次至4次。获得的提取物可以被过滤、浓缩及干燥。所述干燥可以是指减压干燥。

所述提取可以进一步包括对粗提物或其分馏物进行HPLC检测的步骤。所述HPLC可以是半制备(semi-preparative)HPLC。

在一实施例中，所述组合物可以包括通过将花生地上部提取物分馏为有效成分而获得的馏分。所述分馏物通过将花生地上部提取物悬浮于水后用二氯甲烷(CH₂Cl₂)、乙酸乙酯(EtOAc)或丁醇(n-BuOH)作为分馏溶剂来提取而获得，所述分馏物可以根据分馏溶剂分别为二氯甲烷分馏物、乙酸乙酯分馏物、丁醇分馏物或水分馏物。优选地，所述分馏物可以是二氯甲烷分馏物、乙酸乙酯分馏物或水分馏物。由于二氯甲烷可能引起细胞毒性，因此更优选地，可以是乙酸乙酯分馏物或水分馏物。

在一实施例中，所述花生地上部提取物或其分馏物可以通过抑制免疫细胞的过度活化来稳定或恢复免疫功能，或通过抑制白细胞介素-4(Interleukin-4,IL-4)的表达来预防、改善或治疗皮炎或由皮炎引起的继发性疾病。

所述皮炎可以选自皮肤瘙痒症、脂溢性皮炎、接触性皮炎、特应性皮炎、糖尿病性皮炎、毛囊炎、痤疮、过敏性皮炎和神经性皮炎。

因此，所述花生地上部提取物或其分馏物可以以有效抑制细胞中IL-4的表达、改善皮炎、尤其改善特应性皮炎或改善由其引起的继发性疾病的量包含在所述组合物中。所述有效量可以根据本领域技术人员选择的细胞或个体而适当选择。所述有效量可以为所述每一种组合物的0.1mg至1000mg，例如0.1mg至500mg、0.1mg至100mg、0.1mg至50mg、0.1mg至25mg、1mg至1000mg、1mg至500mg、1mg至100mg、1mg至50mg、1mg至25mg、5mg至1000mg、5mg至500mg、5mg至100mg、5mg至50mg、5mg至25mg、10mg至1000mg、10mg至500mg、10mg至100mg、10mg至50mg或10mg至25mg。所述组合物可以用于在体外或个体中的细胞来抑制IL-4的表达。个体中的细胞可以位于例如因IL-4的表达增加而导致皮炎的部位，或者因IL-4的沉积而导致过度发炎的在外部表现出皮炎症状的部位。所述皮炎可以是特应性皮炎，所述继发性疾病可以是由皮肤屏障功能减弱引起的皮肤感染症。

所述组合物可以进一步包含化妆品学上、药学上或食物学上可接受的赋形剂或载体。所述组合物可以是药物、食物或化妆品组合物，或者可以是以有效成分添加到药物、食物或化妆品中的组合物。

所述食物组合物可以单独使用花生地上部提取物或其分馏物或与其他食物或食物成分组合一起使用花生地上部提取物或其分馏物，并可以根据常规方法合适地使用。有效成分的混合量可以根据使用目的(预防、健康或治疗处理)而适当地决定。通常，当制备食物或饮料时，本发明的药物组合物可以以基于原料的15重量份以下，优选10重量份以下的量添加。然而，当以健康和卫生的目的或健康控制的目的来长期摄入时，所述量可以小于上述范围，并且由于在安全性方面没有问题，因此有效成分可以以超过上述范围的量使用。

所述食物的种类没有特别限制。可以添加所述物质的食物例如为肉类、香肠、面包、巧克力、糖果类、点心类、饼干类、披萨、方便面、其他面类、口香糖类、包括冰淇淋的乳制品、各种汤、饮料、茶、保健饮料、酒精饮料及维生素复合制剂等，并包括所有通常含义的食物。

本发明的饮料组合物与通常的饮料一样，可以含有各种香味剂或天然碳水化合物等作为追加成分。上述天然碳水化合物为如葡萄糖、果糖等的单糖；如麦芽糖、蔗糖等的二糖；如糊精、环糊精等的多糖；木糖醇、山梨醇、赤藓醇等的糖醇。甜味剂可以使用如奇异果甜蛋白、甜叶菊提取物等的天然甜味剂；糖精、阿斯巴甜等的合成甜味剂等。

所述食物组合物可以含有各种营养剂、维生素、电解质、调味剂、着色剂、果胶酸及其盐、藻酸及其盐、有机酸、保护性胶体增稠剂、pH调节剂、稳定剂、防腐剂、甘油、醇、用于碳酸饮料的碳酸化剂，或其组合。此外，所述食物组合物可以含有用于制造天然果汁、果汁饮料或蔬菜饮料的果肉，或其组合。这些添加剂的选择范围为每100重量份组合物0.01至0.1重量份。

所述组合物的剂型可以制成口服或非口服施用的剂型。口服施用剂型可以是颗粒剂、粉剂、溶液剂、片剂、胶囊剂、干糖浆剂或其组合。非口服施用剂型可以是注射剂或皮肤外用剂。皮肤外用剂可以是乳膏、凝胶、软膏、皮肤乳化剂、皮肤悬浮液、经皮传递性贴片、含药绷带、乳液或其组合。

所述皮肤外用剂可以根据需要适当混合通常用于化妆品或药物等的皮肤外用剂的成分，例如，水性成分、油性成分、粉末成分、醇类、保湿剂、增稠剂、紫外线吸收剂、美白剂、防腐剂、抗氧化剂、表面活性剂、香料、着色剂以及各种皮肤营养剂等。

所述皮肤外用剂可以适当混合乙二胺四乙酸二钠、乙二胺四乙酸三钠、柠檬酸钠、多聚磷酸钠、偏磷酸钠、葡萄糖酸等的金属螯合剂、咖啡因、单宁、戊脉安、甘草提取物、光甘草定、大蓟果实的热水提取物、各种生药、生育酚乙酸酯、甘草酸、氨甲环酸及其衍生物或其盐等药剂、维生素C、抗坏血酸磷酸酯镁、抗坏血酸葡糖苷、熊果苷、曲酸、葡萄糖、果糖及海藻糖等的糖类。

所述组合物可以包括药学上可接受的稀释剂或载体。所述载体可以是赋形剂、崩解剂、结合剂、润滑剂或其组合。所述赋形剂可以是微晶纤维素、乳糖、低取代羟基纤维素或其组合。所述崩解剂可以是淀粉乙醇酸钠、无水磷酸氢钙或其组合。所述结合剂可以是聚乙烯吡咯烷酮、低取代羟丙基纤维素、羟丙基纤维素或其组合。所述润滑剂可以是硬脂酸镁、二氧化硅、滑石或其组合。

所述组合物可以是用于预防或治疗皮炎或由皮炎引起的继发性疾病的化妆品组合物。

所述组合物可以是用于预防或治疗皮炎或由皮炎引起的继发性疾病的食物组合物。

本发明另一方面提供一种花生地上部提取物的制备方法，其包括在超声波照射下将花生地上部与水、C1-C6的醇或其混合物接触的步骤。

另外，所述方法进一步包括在将所述提取物悬浮于水后，用二氯甲烷、乙酸乙酯、丁醇或其组合进行分馏的步骤。

本发明另一方面还提供一种改善所述个体的皮炎或由皮炎引起的继发性疾病的方法，其包括将所述组合物施用于个体的步骤。

施用是可通过本领域已知的任何方法来执行。施用可以通过例如静脉内、肌肉内、口服、经皮(transdermal)、粘膜、鼻内(intranasal)、气管内或皮下施用的途径，以任何方式直接向个体执行。所述施用可以全身或局部执行。所述施用可以是对伤口所在部位的局部施用。

所述组合物可以与诸如类固醇、抗炎剂、抗组胺剂、抗生素和抗真菌剂的药物联合施用，以有效地改善个体的皮炎或由皮炎引起的继发性疾病，所述联合施用可以依次、同时或分别施用于个体。

所述个体可以是哺乳动物，例如：人、牛、马、猪、狗、绵羊、山羊或猫。所述个体可以是需要改善特应性皮炎的个体。

所述施用可以是每天将花生地上部提取物或其分馏物按照以下量施用于个体：0.1mg至1000mg，例如0.1mg至500mg、0.1mg至100mg、0.1mg至50mg、0.1mg至25mg、1mg至1000mg、1mg至500mg、1mg至100mg、1mg至50mg、1mg至25mg、5mg至1000mg、5mg至500mg、5mg至100mg、5mg至50mg、5mg至25mg、10mg至1000mg、10mg至500mg、10mg至100mg、10mg至50mg或10mg至25mg。

有益效果

根据本发明一方面的一种包含花生(Arachis hypogaea L.)地上部的提取物或其分馏物作为有效成分的用于改善个体的皮炎或由皮炎引起的继发性疾病的组合物，其可用于通过抑制IL-4的表达来改善特应性皮炎或由皮炎引起的继发性疾病。

根据本发明另一方面的一种花生地上部提取物的制备方法，其包括在超声波照射下将花生地上部与水、C1-C6的醇或其混合物接触的步骤，可以有效地制备花生地上部的提取物或其分馏物。

根据本发明另一方面的一种用于改善个体的皮炎或由皮炎引起的继发性疾病的方法，其包括将所述组合物以有效改善皮炎或由皮炎引起的继发性疾病的量施用于个体的步骤，可以通过施用于患有皮炎或由皮炎引起的继发性疾病的个体来有效地改善个体的所述疾病。

附图说明

图1为用花生地上部提取物(MeOH)和分馏物处理RBL-H23细胞后的IL-4表达量的测量结果。

图2为花生地上部的HPLC分析结果。

图3为在无毛小鼠中用花生地上部提取物处理后根据时间的经皮水分丢失(TEWL)的测量结果。

图4为在无毛小鼠中用花生地上部提取物处理后皮肤水分含量(hydration)的测量结果。

图5为在无毛小鼠中用花生地上部提取物处理后皮肤表型的比较照片。

图6中的A为在无毛小鼠中用花生地上部提取物处理后血清中IgE量的测量结果，图6中的B为IL-4量的测量结果。

图7中的A为在无毛小鼠中用花生地上部提取物处理后的H&E组织染色照片，图7中的B为表皮厚度的测量结果。

图8中的A为在无毛小鼠中用花生地上部提取物处理后的甲苯胺蓝组织染色照片，图8中的B为肥大细胞数的测量结果。

图9为在无毛小鼠中用花生地上部提取物处理后激肽释放酶5(Kallikrein 5)、桥粒芯胶黏蛋白1(Desmocollin 1)和聚丝蛋白(Filaggrin)的表达照片。

图10中的A为在Balb/c小鼠中用花生地上部提取物处理后的耳朵表型照片，图10中的B为耳朵厚度的测量结果，图10中的C为皮肤厚度的测量结果。

图11中的A为在Balb/c小鼠中用花生地上部提取物处理后血清中TSLP表达量的测量结果，图11中的B为IgE表达量的测量结果，图11中的C为IL-4表达量的测量结果。

图12中的A为在Balb/c小鼠中用花生地上部提取物处理后的甲苯胺蓝组织染色照片，图12中的B为肥大细胞数的测量结果。

具体实施方式

在下文中，将通过实施例更详细地描述本发明。然而，这些实施例是为了描述本发明，本发明的范围不限于这些实施例。

实施例1：花生地上部提取物及其分馏物的制备及其效果的确认

在本实施例中制备了花生地上部提取物及其分馏物，并证实了所述提取物及其分馏物对特应性皮炎改善的效果。

1、花生地上部提取物及其分馏物的制备

(1)花生地上部提取物的制备

本实施例的花生地上部是在生长和收获花生之后所剩余的地上部，使用了从韩国庆尚北道荣州市直接收集并干燥的花生地上部。

(1-1)花生地上部-甲醇提取物的制备

将1.2kg花生地上部的全草细切并浸入于其中装有6.1L 99％甲醇水溶液的由BANDELIN electronic GmbH&Co.KG制造的超声波装置BANDELIN SONOREX Ultrasonicbaths的浴锅(bath)中，并超声波照射3小时。通过将其重复三次而得到的提取物减压干燥并浓缩来得到67.0g浓缩物(下文称为“花生地上部-甲醇提取物”)。

(1-2)花生地上部-乙醇提取物的制备

通过相同的过程获得20.4g花生地上部-乙醇提取物，不同之处在于使用480g花生地上部全草和12L 95％乙醇水溶液。

(1-3)花生地上部提取物之分馏物的制备

将实施例(1-1)中制备的67.0g花生地上部-甲醇提取物悬浮于670mL蒸馏水中，根据系统分馏方法分别用相同量的二氯甲烷(CH₂Cl₂)、乙酸乙酯(EtOAc)和丁醇(n-BuOH)来提取三次并分馏后，通过减压浓缩得到19.4g二氯甲烷层、1.44g乙酸乙酯层、1.44g丁醇层和23.7g水层，其分别为CH2Cl2馏分、EtOAc馏分、n-BuOH馏分和水馏分。

2、花生地上部提取物及其分馏物对IL-4表达的影响

在本实验中使用的大鼠嗜碱性白血病细胞(rat basophilic leukemia cell)RBL-2H3细胞购自韩国细胞株银行(Korean Cell Line Bank；Seoul，Korea)

将RBL-2H3细胞以5×105个细胞/孔的浓度接种于6孔板培养器(6-well plate)的每个孔，并在含有10％胎牛血清(fetal bovine serum:FBS)和1％青霉素/链霉素的DMEM(Dulecco'Modified Eagle Medium)培养基中于37℃和5％CO2条件下的培养箱中培养，16小时后添加1μM环孢菌素(cyclosporine)A和10μg/mL试料，再培养1小时并进行预处理。试料是实施例(1)中制备的花生地上部提取物或其分馏物。接下来，添加50ng/mL佛波醇-12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯(phorbol 12-myristate 13-acetate:PMA)和1μM离子霉素(ionomycin)，并在相同条件下培养9小时。PMA和离子霉素用于刺激诸如干扰素、穿孔素、IL-2和IL-4的细胞因子的细胞内产生。

通过使用RNeasy mini kit(Qiagen)将细胞固定在QIAsymphony或QIAQube(Qiagen)仪器上来提取RNA。使用Agilent 2100BioAnalyzer(Agilent Technologies，Santa Clara，CA，USA)确认了所提取的RNA的完整性(integrity)。使用ImProm-II ReverseTranscription System(Promega,Madison,WI,USA)将1μgRNA合成为cDNA。使用GeneAmpPCR System 9700(Applied Biosystems，Foster City，CA，USA)进行PCR。

PCR反应在将0.02μL Ex taq polymerase(TAKARA,Otsu,Shiga,Japan)、2μLExtaq polymerase buffer、1.6μLdNTP(10mM)、2μL正向引物(20uM)、2μL反向引物、11.38μLnuclease free water和1μL合成的第一链(first-strand)cDNA良好混合的总体积为20μL的反应混合物上进行。

IL-4的PCR条件为在94℃下4分钟(1个循环(cycle))、在94℃下30秒、在60℃下30秒和在72℃下30秒(25个循环)、在72℃下5分钟(1个循环)，β-肌动蛋白的条件为在94℃下4分钟(1个循环)、在94℃下30秒、在55℃下30秒和在72℃下30秒(20个循环)、在72℃下5分钟(1个循环)。在RT-PCR结果中，使用QIAxcel advanced(Qiagen)仪器测量条带的强度。通过与百分比设定为100％的[PMA+离子霉素(ionomycin)](PI)处理组比较来决定功效分析。用于RT-PCR的引物如表1所示。

[表1]

表2在花生地上部提取物及其分馏物对IL-4表达的影响用百分比设定为100％的PI处理组显示IL-4的抑制程度。

[表2]

试料	IL-4表达(％)
		无处理组	35.4
PI	100.0
		PI+CsA	24.4
PI+花生地上部提取物	15.7
		PI+花生地上部CHCl<sub>2</sub>分馏物	6.8
PI+花生地上部EtOAc分馏物	0.0
		PI+花生地上部n-BuOH分馏物	54.2
PI+花生地上部H<sub>2</sub>O分馏物	13.3

在表2中，CsAs代表作为阳性对照组的环孢菌素A。

如表2和图1所示，花生地上部提取物和分馏物抑制了RBL-2H3细胞中IL-4的表达。这表明花生地上部提取物和分馏物可以帮助缓和特应性症状。

此外，每个馏分具有CHCl₂<EtOAc<n-BuOH<水的顺序的高极性。参考表2，显示每个馏分的IL-4表达抑制程度存在显着差异，特别是CHCl₂馏分、EtOAc馏分和水馏分具有显著的效果，其程度优于阳性对照组。

3、花生地上部的HPLC成分模式分析

进行花生地上部分馏物的HPLC分析以分析花生地上部的具体成分。具体地，注入10μL试料并使用Agilent 1200Series HPLC system/DAD和反相柱(YMC triart C18(4.6×150mm，5μm)。柱的温度保持在40℃，使用洗脱溶剂A为水及洗脱溶剂B为乙腈的梯度溶剂系统，从5％的A及95％的B以1mL/min的流速开始，将洗脱溶剂B以90％(3分钟)、10％(23分钟)和10％(25分钟)的体积逐渐流下。此时，使用紫外检测器在280nm处检测与柱分离的各成分。

在上述条件下，检测时间越早，被检测的成分越接近非极性；检测时间越晚，被检测的成分越接近极性。参考图2，检测到多个强烈的峰，并观察到密集检测到峰的时间以各种区域存在。

4、花生地上部-甲醇提取物对由DNCB诱导特应性皮炎的无毛小鼠(hairlessmouse)的影响

(1)确定对皮肤屏障的影响

在无毛小鼠中，使用2,4-二硝基氯苯(2,4-dinitrochlorobenzen，DNCB)和丙酮刺激背部皮肤可能会诱导对受刺激局部区域的延迟型过敏反应，导致免疫功能异常并损害皮肤屏障。因此，可以使用DNCB创建类似于特应性皮炎的模型，以创建与其个体的皮肤屏障功能和免疫功能相关的体内模型。在由DNCB诱导特应性皮炎的小鼠中，经皮水分丢失(TEWL)和pH增加，并且水合作用(hydration)减少。

在Balb/c小鼠中，当将恶唑酮(4-ethoxymethylene-2-phenyloxazolone)和丙酮施用于小鼠的耳朵时，其具有与特应性相似的病变。恶唑酮-特应性皮炎诱导的耳朵引起发红和异常免疫反应，与对照组相比耳朵增厚。所述恶唑酮模型可用于进行与其个体的皮肤屏障功能和免疫功能相关的体内实验。

在使用DNCB、恶唑酮等来诱导诸如特应性皮炎的病变后，如果存在一种使皮肤屏障功能、耳朵厚度和免疫学功能恢复正常的物质，其可以是治疗或预防特应性皮炎的非常优选的候选物。

将6周龄(雌性，23-27g)无毛小鼠(hairless mouse，购自OrientBio)分成三组：未处理组(n＝2)；2,4-二硝基氯苯(2,4-dinitrochlorobenzene:DNCB)诱导后的载体处理组(n＝4)；DNCB诱导后的花生地上部提取物处理组(n＝4)。在DNCB中，使用将99％丙酮和橄榄油以体积比为3:1混合在水中的溶液作为溶剂。载体是丙二醇和乙醇的体积比为7:3的混合物。在分组后连续7天将1(v/v)％DNCB溶液以200μL每天一次涂敷于小鼠背部。最后涂敷后不处理一周，在一周后每两天总7次以与上述相同的方法涂敷0.1(v/v)％DNCB溶液。涂敷0.1(v/v)％DNCB溶液并连续14天每天上午和下午两次用作为载体溶剂的花生地上部提取物1(v/v)％溶液和载体以200μL涂敷于小鼠背部。

对于涂敷试料的小鼠皮肤，使用AquaFlux(Biox，London，UK)测量经皮水分丢失(TEWL，Trans Epidermal Water Loss)，并使用Skin-O-Mat(COSMOMEP，Berlin，Germany)测量皮肤水分含量(hydration)。在首次用DNCB诱导特应性皮炎之前、诱导7天后、14天后及21天后测量。

其结果是，如显示在无毛小鼠中用花生地上部提取物处理后根据时间的经皮水分丢失(TEWL)差异的图3所示，与对照组的载体相比，花生地上部提取物在无毛小鼠中显示出以与未处理组相似的程度降低的经皮水分丢失。因此可以看出，花生地上部提取物在无毛小鼠中与对照组的载体相比显着增强皮肤屏障功能。

另外，如图4所示，可以确认花生地上部提取物在无毛小鼠中与对照组的载体相比增加水分含量(hydration)，因此花生地上部提取物在无毛小鼠中与载体相比增强皮肤屏障功能。

图5为在无毛小鼠中用花生地上部提取物处理后根据时间的皮肤表型的比较照片。从图5中可以看出，花生地上部提取物在无毛小鼠中从诱导DNCB特应性皮炎后第7天开始提供比对照组的载体更好的皮肤状况。当诱导DNCB-特应性皮炎时，可以看出角质严重剥离并皮肤角化，而当用1％花生地上部提取物处理时，可以确认皮肤角化和角质量的减少。因此，可以看出花生地上部提取物显着增强皮肤屏障功能。

(2)鉴定对免疫系统的影响

通过ELISA试验测量免疫球蛋白E(IgE)和白细胞介素-4(IL-4)的量，其中所述免疫球蛋白E用作所述血液的血浆中特应性皮炎的标志物，是特应性皮炎中最重要的因素之一；所述免白细胞介素-4是免疫细胞的细胞因子之一。

诱导T细胞过度活化的IL-4、IL-5和IL-13由Th2细胞分泌，并通过控制IgE的合成来在特应性皮炎的发病中起很重要的作用。

郎格罕(Langerhans)细胞和炎性树突状表皮细胞(inflammatory dendriticepidermal cell:IDEC)通过将幼稚(naive)T细胞转化为Th2型来在过敏性免疫反应的起始中起很重要的作用，并且在其过程中IL-4发挥很重要的作用。郎格罕细胞表面存在IgE受体，其通过与食物、空气中的过敏原(allergen)和微生物的超抗原(superantigen)结合来分泌炎性信号并引发过敏性免疫反应。Th2细胞因子(IL-4、IL-5和IL-13)介导用于产生IgE的同种型转换(isotype switching)并增强内皮细胞中粘附分子(adhesion molecule)的表达。

已经表明在皮肤中IL-4诱导T细胞类型中特别是特应性皮炎的特征性病理现象的Th2细胞活性的不平衡增加，同时通过刺激B细胞来增加IgE的产生，从而促进肥大细胞分泌组胺，其是一种诱导如红斑、发红、瘙痒等特应性反应的关键细胞因子。因此，本发明人期望能够同时抑制IL-4的产生以及作为所述反应的最终产物的T细胞的过度增殖的物质可以提供比常规免疫抑制物质更适合治疗特应性皮炎的效果。

此外，在皮肤中IL-4显着降低将细丝聚集素(filaggrin)转化为天然保湿因子(NMF)所需的蛋白水解酶caspase-14的表达(Hvid et al.,Exp.Dermatol.20,633-636(2011))，促进降解如桥粒芯糖蛋白1(desmoglein 1)的胶原蛋白的klk7肽酶的表达，从而诱导表皮剥离并增加表皮的水分丢失。

因此，本发明人通过观察这些因子的变化来确认花生地上部提取物的效果。

具体地，在小鼠麻醉后，使用含有0.18M EDTA 30μL的注射器从腹主动脉抽取血液。使用离心分离机将所述抽取的血液在4℃、8000rpm下离心15分钟来分离血浆和血细胞。使用mouse IgE ELISA定量试剂盒(Bethy Laboratories,Montgomery,TX,USA)和mouseIL-4 ELISA定量试剂盒(Bethy Laboratories,Montgomery,TX,USA)在所述血浆中检测血浆中IgE和IL-4。

结果，如图6中的A和B所示，花生地上部提取物与对照组的载体相比在无毛小鼠中显着降低了血浆中IgE和IL-4的量。

图7中的A为在无毛小鼠中用花生地上部提取物处理后的H&E组织染色照片，图7中的B为表皮层厚度的测量结果。从图7中的A和B所示，用花生地上部提取物处理的实验组与对照组的载体相比显示出表皮厚度的减少。

图8中的A为在无毛小鼠中用花生地上部提取物处理后的甲苯胺蓝组织染色照片，图8中的B为肥大细胞数的测量结果。从图8中的A和B所示，用花生地上部提取物处理的实验组与对照组的载体相比显示出肥大细胞的减少。

图9为在无毛小鼠中用花生地上部提取物处理后的免疫组化照片。从图9所示，用花生地上部提取物处理的实验组与对照组的载体相比显示出降低的激肽释放酶(Kallikrein)5表达和增加的桥粒芯胶蛋白(Desmocollin)1和Filaggrin的表达。

5、花生地上部乙醇提取物在由恶唑酮(4-乙氧基亚甲基-2-苯基恶唑酮)引起特应性皮炎的Balb/c小鼠中对异常免疫功能的影响

(5-1)在Balb/c小鼠中特应性皮炎诱导和表型测量

将6周龄(雌性，17-20g)无毛小鼠(hairless mouse，购自OrientBio)分成三组：未处理组(n＝2)；恶唑酮-特应性皮炎诱导后的载体处理组(n＝4)；恶唑酮-特应性皮炎诱导后的花生地上部提取物乙醇处理组(n＝4)。恶唑酮使用水中99％丙酮作为溶剂。载体是丙二醇和乙醇的体积比为7:3的混合物。

在分组后的第一天，将1(v/v)恶唑酮溶液一次以15μL涂敷于小鼠的两只耳朵。通过在驯育一周后每两天总11次以与上述相同的方法涂敷0.1％恶唑酮溶液来诱导如特应性皮炎的病变。涂敷0.1％恶唑酮溶液，并连续21天每天上午和下午用作为载体溶剂的1％花生地上部提取物溶液和载体分别以15μL涂敷于小鼠的两只耳朵。使用数字标尺在诱导之前第一次测量后每周一次测量了耳朵厚度。在首次用1％恶唑酮溶液开始诱导后第28天，解剖小鼠而收集耳组织、血液和脾脏并拍照。

其结果是，如显示在无毛小鼠中用花生地上部提取物处理后第21天的耳朵表型和耳朵厚度的差异的图10中的A、B和C所示，与对照组的载体相比，花生地上部提取物处理的BALB/c小鼠显示出红斑减少并且角质也被除去。当恶唑酮施用于小鼠的耳朵时，由于异常的免疫反应，因此耳朵厚度和表皮层变厚并角质剥离，然而花生地上部提取物处理的实验组与对照组的载体相比耳朵厚度减小。因此，从此可以看出花生地上部提取物可以增强特应性皮肤屏障功能。

(5-2)特应性皮炎动物模型的血浆中IgE和IL-4的变化

通过ELISA试验测量免疫球蛋白E(IgE)和白细胞介素-4(IL-4)的蛋白质量，其中所述免疫球蛋白E用作所述血液的血浆中特应性皮炎的标志物，是特应性皮炎中最重要的因素之一；所述免白细胞介素-4是免疫细胞的细胞因子之一。

具体地，在小鼠麻醉后，使用含有0.18M EDTA30μL的注射器从腹主动脉抽取血液。使用离心分离机将所述抽取的血液在4℃、8000rpm下离心15分钟来分离血浆和血细胞。使用mouse IgE ELISA定量试剂盒(Bethy Laboratories,Montgomery,TX,USA)和mouse IL-4ELISA定量试剂盒(Bethy Laboratories,Montgomery,TX,USA)在所述血浆中检测血浆中IgE和IL-4。

其结果是，如图11中的A、B和C所示，花生地上部提取物在BALB/c小鼠中与对照组的载体相比显示出血浆中IgE的量没有变化，但IL-4和TSLP的量趋于显着降低。

图12中的A为在Balb/c小鼠中花生地上部提取物处理后的甲苯胺蓝染色组织照片，图12中的B为肥大细胞数的测量结果。从图12中的A和B所示，用花生地上部提取物处理的实验组与对照组的载体相比显示出肥大细胞的减少。

Claims

1.一种用于改善皮炎或由皮炎引起的继发性疾病的组合物，所述组合物包含花生地上部的提取物或其分馏物作为有效成分。

2.如权利要求1所述的组合物，其中，

所述花生地上部是干燥的。

3.如权利要求1所述的组合物，其中，

所述提取物用亲水性溶剂提取。

4.如权利要求3所述的组合物，其中，

所述亲水性溶剂是水、C1-C6的醇或其混合物。

5.如权利要求4所述的组合物，其中，

所述醇是甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、仲丁醇、异丁醇、叔丁醇或其混合物。

6.如权利要求1所述的组合物，其中，

所述提取物在超声波照射下提取。

7.如权利要求1所述的组合物，其中，

所述分馏物是通过将所述提取物悬浮于水后用二氯甲烷(CH₂Cl₂)、乙酸乙酯(EtOAc)或丁醇(n-BuOH)提取并分馏而得到的二氯甲烷分馏物、乙酸乙酯分馏物、丁醇分馏物或水分馏物。

8.如权利要求1所述的组合物，其中，

所述提取物稳定免疫功能。

9.如权利要求1所述的组合物，其中，

所述提取物抑制IL-4的表达。

10.如权利要求1所述的组合物，其中，

所述皮炎选自皮肤瘙痒症、脂溢性皮炎、接触性皮炎、特应性皮炎、糖尿病性皮炎、毛囊炎、痤疮、过敏性皮炎和神经性皮炎。

11.如权利要求1所述的组合物，其进一步包含化妆品学上、药学上或食物学上可接受的赋形剂或载体。

12.如权利要求1所述的组合物，其中，

所述组合物作为有效成分添加于药物、食物或化妆品。

13.一种花生地上部提取物的制备方法，所述制备方法包括在超声波照射下将花生地上部与水、C1-C6的醇或其混合物接触的步骤。

14.如权利要求13所述的制备方法，所述制备方法进一步包括：

在将所述花生地上部提取物悬浮于水后，用二氯甲烷、乙酸乙酯、丁醇或其组合进行分馏。

15.一种用于改善个体的皮炎或由皮炎引起的继发性疾病的方法，其包括将权利要求1至14中任一项的组合物以有效改善皮炎或由皮炎引起的继发性疾病的量施用于个体的步骤。