WO2016200002A1 - 피부암의 치료 또는 전이 억제용 조성물 - Google Patents

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WO2016200002A1
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aiii
skin cancer
skin
thymosaponin
metastasis
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PCT/KR2015/014371
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채성욱
김기모
임아랑
김승형
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한국 한의학 연구원
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Definitions

  • the present invention relates to a composition for treating or inhibiting metastasis of skin cancer, and in particular, inhibiting the treatment or metastasis of skin cancer containing thymosaponin AIII, a pharmaceutically acceptable salt thereof, or a timothy extract comprising thymosaponin AIII as an active ingredient. It relates to a composition for.
  • Skin cancer refers to all cancers occurring in the skin, and relatively common cancers, but because of the low risk of life, such as stomach cancer, liver cancer, lung cancer is not considered important. It does not require complicated examinations or expensive medical equipment compared to other cancers, and can be easily detected with the naked eye and diagnosed through simple biopsy. Many skin cancer patients simply overlook dermatitis or spots or boils when they first develop their skin, so it is difficult to find them early and visit the hospital.
  • BCC basal cell carcinoma
  • SCA squamous cell carcinoma
  • NMSC nonmelanoma skin cancer
  • Melanoma has a worse prognosis than other skin cancers, so early recurrences are common and can shorten life, even if detected early. Skin lesions appear as yellowish brown or blackish spots or nodules, usually caused by sun exposure after middle age. Occasionally, it occurs on the hands, toes, especially the thumb, and the tip of the toes, and black vertical lines can be seen on the nails.
  • the therapeutic drugs for skin cancer have only been used to alleviate the symptoms of skin cancer so far, and the development of fundamental therapeutic drugs has not been achieved, and many side effects are known.
  • the treatment of skin cancer in particular, the development of therapeutic agents that inhibit the metastasis of skin cancer Is absent.
  • Anemarrhena asphodeloides Bunge is a perennial herb of the monocotyledonous lily tree, which uses the rhizome of the genus, and is native to China and distributed evenly in the Hwanghae Republic in Korea. Leaves are gathered slowly from the root and grow, and are divided into exogenous leaf, normal leaf, and endogenous leaf from the outer part of the leaf. The leaf of the middle part is the largest and the shape of the leaf is lanceolate lanceolate, and the tip is quite pointed. The leaves are also hard and glossy on the outside.
  • roots and stems contain timomosaponin, chimonin, prococathechi acid, pantothenic acid, and antipyretic, cardiovascular, diuretic, diuretic, antibacterial. It has an action, expectorant action, sedative action, hypoglycemic action, anticancer action, and is used as an antipyretic agent.
  • 0722303 discloses a luteinizing hormone secretion accelerator including thymosaponin A, a chymo extract, or a fraction as an active ingredient, but thymosaponin AIII, No technique has been reported for a composition for treating or inhibiting metastasis of skin cancer, which contains a pharmaceutically acceptable salt thereof or a hair extract containing thymosaponin AIII as an active ingredient.
  • the present invention is derived from the above requirements, the present invention is that the hair extract and thymosaponin AIII inhibits metastasis in melanoma-induced mice and human cells, and cancer cells in the animal model melanoma-induced mouse is moved to the lung This invention was completed by confirming the effect which suppresses doing.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for treating or inhibiting metastasis of skin cancer containing a thymosaponin AIII, a pharmaceutically acceptable salt thereof, or a thymosaponin AIII as an active ingredient.
  • the present invention provides a health functional food composition for inhibiting metastasis of skin cancer containing thymosaponin AIII, a pharmaceutically acceptable salt thereof, or a chymo extract comprising thymosaponin AIII as an active ingredient.
  • the present invention provides a skin external preparation for treating or inhibiting metastasis of skin cancer containing a thymosaponin AIII, a pharmaceutically acceptable salt thereof, or a hair extract containing thymosaponin AIII as an active ingredient.
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for inhibiting or inhibiting metastasis of skin cancer, a health functional food composition, and an external preparation for skin containing thymosaponin AIII, a pharmaceutically acceptable salt thereof, or a hair extract containing thymosaponin AIII as an active ingredient.
  • the composition according to the invention has the effect of inhibiting the spread of skin cancer, especially melanoma cells to the lung.
  • FIG. 1 is a diagram showing the effect of inhibiting skin cancer metastasis of the hair extract
  • (A) is a microscopic picture of the migrated cells after H & E staining
  • (B) is a graph showing the number of cells moved (* Indicates that the p value was less than 0.05, and 10 ⁇ g / ml of the hair extract treatment group compared to the TPA (12- O- Tetradecanoylphorbol-13-acetate) treatment group significantly reduced the metastasis of cancer cells.
  • the p value is less than 0.01, which means that 50 ⁇ g / ml of the hair extract extract group compared to the TPA group significantly reduces the metastasis of cancer cells).
  • FIG. 2 is a diagram showing the effect of thymosaponin AIII on skin cancer metastasis inhibition in mouse (B16-F10) and human (WM-115) cells.
  • B) is a graph showing the number of migrated cells (* p value is less than 0.05, the cancer cells of the 50 ⁇ g / ml thymosaponin AIII treatment group compared to the TPA (12- O -Tetradecanoylphorbol-13-acetate) treatment group Means that the metastasis of was significantly reduced, and ** indicates that the p value was less than 0.01, and that the treatment group of 100 ⁇ g / ml thymosaponin AIII compared to the TPA treatment group significantly reduced the metastasis of cancer cells. it means).
  • FIG. 3 is a diagram confirming the cancer cell metastasis inhibition effect by thymosaponin AIII in the animal model
  • (A) is a photograph of the lung showing the number of colonies of melanoma metastasized to the lung depending on whether the thymosaponin AIII treatment
  • (B) Is a graph showing the number of colonies of cancer cells that metastasized to the lung (** is a p value of less than 0.01, and thymosaponin AIII was administered to mice induced with melanoma relative to the number of cancer cell colonies identified in the lungs of melanoma-induced mice). Mean that the number of colonies of cancer cells identified in the lung of one mouse was statistically significantly reduced).
  • FIG. 4 is a diagram confirming the gene expression inhibitory effect of thymosaponin AIII in the animal model, it shows the gene expression amount of (A) NF- ⁇ B, (B) IKK- ⁇ and (C) COX-2.
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for treating or inhibiting metastasis of skin cancer, which contains thymosaponin AIII, a pharmaceutically acceptable salt thereof, or a hair extract containing thymosaponin AIII as an active ingredient.
  • the extraction solvent of the hair extract is preferably water, at least one extraction solvent selected from C 1 to C 4 lower alcohols, acetone, ethyl acetate, butyl acetate, 1,3-butylene glycol and hexane, and the lower alcohol. It is preferable to use ethanol, methanol or isopropanol, and even more preferred extraction solvent is to use ethanol, but is not limited thereto.
  • the thymosaponin AIII is characterized by consisting of the following general formula (1), modification of the functional group of the following general formula (1) to increase the effect is possible.
  • the skin cancer is characterized by being melanoma, but not limited thereto, and is characterized in that the melanoma is suppressed from metastasis to the lung.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may further comprise a pharmaceutically acceptable carrier, excipient or diluent.
  • Pharmaceutically acceptable carriers included in the pharmaceutical composition of the present invention are conventionally used in the preparation, saline solution, sterile water, Ringer's solution, buffered saline solution, dextrose solution, maltodextrin solution, glycerol, ethanol, lactose, dex Straw, sucrose, sorbitol, mannitol, starch, acacia rubber, calcium phosphate, alginate, gelatin, calcium silicate, microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, cellulose, syrups, methyl cellulose, methylhydroxybenzoate, propyl Hydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil, and the like.
  • composition of the present invention may be administered orally or parenterally, and the parenteral administration may be administered by injection or application to the skin.
  • suitable dosages of the pharmaceutical compositions of the present invention may be prescribed in various ways depending on factors such as the formulation method, mode of administration, age, weight, sex, morbidity, condition of food, time of administration, route of administration, rate of excretion and response to response of the patient. Can be.
  • the present invention relates to a health functional food composition for inhibiting metastasis of skin cancer containing thymosaponin AIII, a pharmaceutically acceptable salt thereof, or a chymo extract comprising thymosaponin AIII as an active ingredient.
  • the dietary supplement composition of the present invention can be prepared by adding the extract or thymosaponin AIII as it is or mixing with other food or food ingredients, and can be appropriately prepared according to conventional methods.
  • foods to which the above-described extract or thymosaponin AIII may be added include caramel, meat, sausage, bread, chocolate, candy, snacks, confectionery, pizza, ramen, other noodles, gums, dairy products including ice cream, various soups , Beverages, tea, drinks, alcoholic beverages and vitamin complexes may be any one of the forms selected, including all the health functional foods in the conventional sense. That is, the kind of food is not particularly limited.
  • the dietary supplement composition includes various nutrients, vitamins, minerals (electrolytes), synthetic and natural flavors, colorants and enhancers (cheese, chocolate, etc.), pectic acid and salts thereof, alkonic acid and salts thereof, organic acids, protective colloids. Thickeners, pH adjusters, stabilizers, preservatives, glycerin, alcohols, carbonation agents used in carbonated drinks and the like. It may also contain pulp for the production of natural fruit juices and vegetable drinks. The above components can be used independently or in combination.
  • the health functional food composition of the present invention may contain various flavors or natural carbohydrates, etc.
  • the natural carbohydrate is glucose, monosaccharides such as fructose, disaccharides such as maltose, sucrose, and dextrin, Polysaccharides such as cyclodextrin, and sugar alcohols such as xylitol, sorbitol, and erythritol.
  • the ratio of the said natural carbohydrate is not important, it is preferable that it is 0.01-0.04g with respect to 100g of the composition of this invention, More preferably, it contains 0.02-0.03g, but it is not limited to this.
  • the sweetening agent natural sweetening agents such as tautin and stevia extract, synthetic sweetening agents such as saccharin and aspartame, and the like can be used.
  • the present invention relates to a skin external preparation for treating or inhibiting metastasis of skin cancer, which contains thymosaponin AIII or a pharmaceutically acceptable salt thereof isolated from the hair extract or hair extract.
  • the external preparation for the skin is preferably in the form of a cream, but is not limited thereto.
  • a suitable formulation for topical application may be any one selected from powders, gels, ointments, creams, and liquids, and specifically, solutions, gels, and solids.
  • Skin lotions, powders, ointments, in the form of emulsions, suspensions, microemulsions, microcapsules, or ionic (liposomal) and nonionic vesicle dispersants obtained by dispersing an oil phase in an anhydrous product, an aqueous phase, It may be provided in the form of a spray or cone stick. It may also be used in the form of a foam or in the form of an aerosol further containing a compressed propellant.
  • Jimo was purchased from OmniHub, and the samples were stored in a herbal storage refrigerator maintained at a temperature of 5.5 ⁇ 0.3 ° C. and a humidity of 55 ⁇ 5%.
  • the extract was extracted by reflux cooling twice per hour using 70% ethanol corresponding to a volume of 10 times the total weight of the hair. Thereafter, the filtrate obtained using the filter paper was removed by using a vacuum condenser to remove the solvent to complete the preparation of the extract.
  • the hair extract was fractionated with n-hexane, ethanol and butanol (n-BuOH), and the n-BuOH fraction was purified using diaion HP-20 resin.
  • Small fractions (A1-A5) were obtained using gradient elution of water and methanol [H 2 O: MeOH (100: 0 to 70:30)].
  • the small fraction (A4) was separated by LiChroprepRP-18 reverse phase resin with gradient elution of water and methanol [H 2 O: MeOH (100: 0 to 50:50)] to separate thymosaponin AIII.
  • WM-115 and mouse (B16-F10) were purchased from ATCC, USA. Melanoma cell lines of mouse (B16-F10) were treated with 10% bovine serum in DMEM (Dulbecco modified Eagle medium) medium. Cultures in a medium containing 1% penicillin / streptomycin were used for the experiment. Human (WM-115) melanoma cells also contained 10% bovine serum, 2 mM glutamine, 1% non-essential amino acid (NEAA) and 1% in Eagle Minimum Essential Medium (EMEM) medium. Cultured in a medium containing Sodium Pyruvate (NaP) (37 °C, 5% CO 2 incubator). When cells formed a monolayer, the cells were washed with buffer and treated with tyrosine (trypsin) -EDTA solution to release the cells and passaged.
  • DMEM Dynabecco modified Eagle medium
  • NEAA non-essential amino acid
  • EMEM Eagle Minimum Essential Medium
  • H & E staining was used to fix the cultured cells, then carefully remove the cells on the upper surface with a cotton swab and microscopically examine the transferred cells (100 ⁇ ) to take pictures and transfer them. The number of cells was counted.
  • C57BL / 6 was purchased from 7-week-old males from Catacco Bio Korea (Korea) and used for 1 week. The normal state was observed during the adaptation period and healthy animals were used for the experiment. Breeding environment was maintained at a temperature of 23 °C, humidity 50%, contrast cycle 12 hours (07: 00-19: 00 / lighting time). During the test period, 9 animals per group were raised in a polycarbonate cage (200 ⁇ 320 ⁇ 145mm, Three-shine Co., Daejeon, Korea), and the feed was free of mouse feed 5L79 (Charles river, USA). Negative water was freely supplied with constant water sterilized by ultraviolet rays.
  • B16-F10 cells a melanoma cell line diluted in serum free media at a concentration of 5 ⁇ 10 4 cells / 200 ⁇ l, were injected into the tail vein of the mouse.
  • Model rats with metastasized cancer cells (B1-F10 cells) were made into the lungs, and the mice were intraperitoneally administered with 12.5 mg / kg / day and 25 mg / kg / day of the drug (timosaponin AIII) for 14 days after the cancer cell inoculation.
  • the lungs were then removed and the number of cancer cells metastasized to the lungs was counted.
  • TaqMan RNA assays (Applied Biosystems) technique was amplified using a Real-Time PCR system (QuantStudio 6, Applied Biosystems) and RNA was quantitatively measured.
  • Lungs from normal C57BL / 6 mice and mice transplanted with melanoma (B16-F10) cell lines were extracted, 500 ⁇ l of Trizol was added, and the cells were pulverized with a homogenizer, and 100 ⁇ l of chloroform was added thereto. Then mix again for 15 seconds. After standing on ice for 15 minutes, it was centrifuged at 13,000rpm, and recovered about 200 ⁇ l of the supernatant and mixed with 200 ⁇ l of 2-propanol in the same amount, then slowly shaken and left for 15 minutes on ice.
  • RNA extracted from mouse lung tissue transplanted with normal C57bl / 6 mice and melanoma (B16-F10) cell line was denatured at 75 ° C. for 10 minutes, followed by 2.5 ⁇ l of 10 mM dNTPs mix, 1 ⁇ l of random sequence.
  • hexanucleotides (25 pmole / 25 ⁇ l), 1 ⁇ l RNase inhibitor (20 U / ⁇ l) as RNA inhibitor, 1 ⁇ l 100 mM DTT, 4.5 ⁇ l 5 ⁇ RT buffer (250 mM Tris-HCl, pH8.3, 375 mM KCl, After addition of 15 mM MgCl 2 ), 1 ⁇ l of M-MLV RT (200 U / ⁇ l) was added again and the final volume was 20 ⁇ l with DEPC treated distilled water.
  • the 20 ⁇ l reaction mixture was mixed well, centrifuged at 2,000 rpm for 5 seconds to react for 60 minutes in a heating block at 37 ° C. to synthesize cDNA, and then left at 95 ° C. for 5 minutes to obtain M- Synthesized cDNA was used for PCR after inactivation of MLV RT.
  • Real-time PCR was performed using Applied Biosystems QuantStudio 6 (Applied Biosystems, USA). mRNA gene expression was determined using a TaqMan probe (FAM dye-labeled, ABi, USA), a mouse HPRT probe set as an internal standard; Endogenous Control (VIC / MGB Probe, Probe limited) from Applied Biosystems was used, and the reaction was performed so that the final concentration of the primer was 200 nM. Real-time PCR was performed for 1) pre-denaturation at 50 ° C. for 2 minutes; 2) 10 minutes at 94 ° C .; 3) 40 cycles for 15 seconds at 95 ° C. and 1 minute at 60 ° C .; It carried out on the conditions to perform.
  • HPRT hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase
  • thymosaponin AIII an active ingredient isolated from the hair extract, was treated, metastasis of mouse (B16-F10) and human (WM-115) cells was inhibited.
  • the thymosaponin AIII was treated with a concentration of 0, 10, 50, 100 nM, and it was confirmed that the effect appeared depending on the treatment concentration.
  • the effect of inhibiting metastasis to the lung using mouse B16 melanoma cells showed that the size and number of colonies of melanoma increased in the group not treated with the drug compared to the normal group.
  • the group treated with thymosaponin AIII it was confirmed that the extent of B16 melanoma cells metastasis to the lung was suppressed depending on the amount of thymosaponin AIII.

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Abstract

본 발명은 티모사포닌 AⅢ, 약학적으로 허용가능한 이의 염 또는 티모사포닌 AⅢ를 포함하는 지모 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부암의 치료 또는 전이 억제용 조성물에 관한 것이다. 상세하게는 지모 추출물과 티모사포닌 AⅢ가 마우스(B16-F10) 및 사람(WM-115) 세포에서 흑색종 세포의 폐 전이를 억제하고, 동물모델인 마우스(B16)에서 유발된 흑색종 세포의 항전이 효과를 확인함으로써, 티모사포닌 AⅢ, 약학적으로 허용가능한 이의 염 또는 티모사포닌 AⅢ를 포함하는 지모 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부암의 치료 또는 전이 억제용 약학 조성물, 건강기능 식품 조성물 및 피부 외용제로 제공하는 것이다.

Description

피부암의 치료 또는 전이 억제용 조성물
본 발명은 피부암의 치료 또는 전이 억제용 조성물에 관한 것으로, 상세하게는 티모사포닌 AⅢ, 약학적으로 허용가능한 이의 염 또는 티모사포닌 AⅢ를 포함하는 지모 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부암의 치료 또는 전이 억제용 조성물에 관한 것이다.
피부암은 피부에서 발생 되는 모든 암을 말하며, 비교적 흔한 암이지만 생명의 위험이 적기 때문에 위암, 간암, 폐암 등과 같이 중요하게 생각하지 않고 있다. 다른 부위의 암에 비해 복잡한 검사나 고가의 의료장비 등이 필요치 않고, 쉽게 육안으로 발견할 수 있으며 간단한 조직검사를 통해 진단할 수 있다. 많은 피부암 환자들이 처음 피부에 암이 발생했을 때 단순히 피부염 또는 점이나 종기로 간과하기 때문에 병원을 늦게 방문하여 조기 발견이 어려우므로 병의 완치가 어렵게 되고 가끔 생명을 잃는 경우가 있다. 피부암 중 흔하고 많은 비중을 차지하는 피부암으로는 기저(基底)세포 암종(Basal cell carcinoma, BCC)으로 약 80%에 달하며 그밖에도, 약 16%에 달하는 편평상피(扁平上皮)세포 암종(squamous cell carcinoma, SCC), 그리고 약 4% 해당하는 흑색종(melanoma)이 있다. 기저세포암종(BCC)과 편평상피세포 암종(SCC)를 합쳐서 비흑색종성 암종(nonmelanoma skin cancer, NMSC)라 일컫는다. 흑색종은 표피 내에 있는 멜라노사이트로부터 발생하는데 대부분이 전이암이나 사망에 이르게 하는 암 종이며, 2000년에는 47,000명이 새로운 흑색종으로 판명되었으며 이 중 7,700명이 사망하였다고 보고된 바 있다(R. T. Greenlee et al. Cancer J. Clin., 50: 7-33, 2000). 자외선에 의해 발생되는 흑색종은 자외선의 만성적인 노출에 의해서라기 보다는 극심한 선탠 등의 간헐적인 노출에 의해서 발생하는 것으로 추측되고 있다(B. A. Gilchrest et al. New Engl. J Med., 340: 1341-1348, 1999). 흑색종은 다른 피부암보다 예후가 나쁘기 때문에 조기 발견이 되더라도 재발이 흔하며 생명을 단축할 수 있다. 피부병변은 황갈색이나 검은색을 띄는 반점이나 결절로 나타나며, 보통 중년 이후에 태양 노출부에 의해 잘 발생한다. 때로는 손, 발가락 특히 엄지손, 발가락의 말단에서도 생기며 손발톱에 검은 색의 세로줄이 보일 수 있는데 이때에는 흑색종을 의심하여 철저한 조사를 하여야 한다.
그러나, 아직까지는 피부암의 치료 약물들이 단지 피부암의 증상만을 완화하는 것이고, 근본적인 치료약의 개발이 이루어지지 못했을 뿐만 아니라, 많은 부작용이 알려져 있어 현재까지는 피부암의 치료, 특히 피부암의 전이를 억제하는 치료제의 개발은 전무한 실정이다.
한편, 지모(知母, Anemarrhena asphodeloides Bunge)는 외떡잎식물 백합목 지모과의 여러해살이풀로서 지모과의 뿌리줄기를 사용하며, 원산지는 중국이며 우리나라에서는 황해도 지방에 고루 분포한다. 뿌리에서 잎들이 소복히 모여 자라나고 잎의 바깥 부분부터 외생엽, 정상엽, 내생엽으로 구분되며 가운데 부분의 정상엽이 가장 크기가 크며, 잎의 모양은 장협 피침형으로써 끝부분이 상당히 뾰족하다. 또한 잎은 단단한 편이며 겉 부분이 광택이 난다. 이러한 뿌리와 줄기에는 티모사포닌(Timosaponin), 치모닌(Chimonin), 프로코카테시산 (Prococathechi acid), 판토텐산(Pantothenic acid) 등이 함유되어 있으며, 해열 작용, 강심 작용, 이뇨 작용, 양허증, 항균 작용, 거담 작용, 진정 작용, 혈당강하 작용, 항암 작용이 있으며, 해열제로 사용된다.
지모 추출물 또는 티모사포닌 AⅢ를 유효성분으로 함유하는 약제들에 관한 기술로는 한국등록특허 제0316379호에 개시된 6~24중량부의 안중산(安中散)제제; 25~100중량부의 보화환(保和丸)제제; 그리고 각각 1~6중량부의 해표소, 계내금, 오공, 건칠, 반지련, 지모 및 0.25~1중량부의 목향으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 암치료용 한방조성물이 있고, 미국공개특허 제2010-0009017호에 지모 추출물을 사용하는 항암방법에 대하여 개시되어 있으며, 한국등록특허 제0722303호에 티모사포닌 에이, 지모추출물 또는 분획물을 유효성분으로 포함하는 황체형성 호르몬 분비 촉진제에 관해 개시되어 있으나, 티모사포닌 AⅢ, 약학적으로 허용가능한 이의 염 또는 티모사포닌 AⅢ를 포함하는 지모 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부암의 치료 또는 전이 억제용 조성물에 대하여 언급된 기술은 보고된 바 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명은 지모 추출물 및 티모사포닌 AⅢ가 흑색종이 유도된 마우스 및 사람 세포에서 전이를 억제하는 것과 동물모델인 흑색종이 유도된 마우스에서 암세포가 폐로 이동하는 것을 억제하는 효과를 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 티모사포닌 AⅢ, 약학적으로 허용가능한 이의 염 또는 티모사포닌 AⅢ를 포함하는 지모 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부암의 치료 또는 전이 억제용 약학 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 티모사포닌 AⅢ, 약학적으로 허용가능한 이의 염 또는 티모사포닌 AⅢ를 포함하는 지모 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부암의 전이 억제용 건강기능 식품 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 티모사포닌 AⅢ, 약학적으로 허용가능한 이의 염 또는 티모사포닌 AⅢ를 포함하는 지모 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부암의 치료 또는 전이 억제용 피부 외용제를 제공한다.
본 발명은 티모사포닌 AⅢ, 약학적으로 허용가능한 이의 염 또는 티모사포닌 AⅢ를 포함하는 지모 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부암의 치료 또는 전이 억제용 약학 조성물, 건강기능 식품 조성물 및 피부 외용제에 관한 것이다. 본 발명에 따른 조성물은 피부암, 특히 흑색종 세포가 폐로 전이되는 것을 억제하는 효과가 있는 것이다.
도 1은 지모 추출물의 피부암 전이 억제효능을 나타낸 도면으로, (A)는 H&E 염색 후, 이동한 세포를 현미경으로 관찰한 사진이고, (B)는 이동한 세포의 수를 그래프로 나타낸 것이다(*는 p값이 0.05 미만으로, TPA(12-O-Tetradecanoylphorbol-13-acetate) 처리군 대비 10㎍/㎖의 지모 추출물 처리군이 암세포의 전이를 통계적으로 유의하게 감소시킨 것을 의미하고, **는 p값이 0.01 미만으로, TPA 처리군 대비 50㎍/㎖의 지모 추출물 처리군이 암세포의 전이를 통계적으로 유의하게 감소시킨다는 것을 의미한다).
도 2는 마우스(B16-F10)와 사람(WM-115) 세포에서 티모사포닌 AⅢ의 피부암 전이 억제 효능을 나타낸 도면으로, (A)는 H&E 염색 후, 이동한 세포를 현미경 관찰한 사진이고, (B)는 이동한 세포의 수를 그래프로 나타낸 것이다(*는 p값이 0.05 미만으로, TPA(12-O-Tetradecanoylphorbol-13-acetate) 처리군 대비 50㎍/㎖의 티모사포닌 AⅢ 처리군이 암세포의 전이를 통계적으로 유의하게 감소시킨 것을 의미하고, **는 p값이 0.01 미만으로, TPA 처리군 대비 100㎍/㎖의 티모사포닌 AⅢ의 처리군이 암세포의 전이를 통계적으로 유의하게 감소시킨다는 것을 의미한다).
도 3은 동물모델에서 티모사포닌 AⅢ에 의한 암세포 전이 억제효과를 확인한 도면으로, (A)는 티모사포닌 AⅢ의 처리 여부에 따른 폐로 전이된 흑색종의 콜로니 수를 나타낸 폐의 사진이고, (B)는 폐로 전이된 암세포의 콜로니 수를 그래프로 나타낸 도면이다(**는 p값이 0.01 미만으로, 흑색종이 유도된 마우스의 폐에서 확인된 암세포 콜로니 수 대비 흑색종이 유도된 마우스에 티모사포닌 AⅢ를 투여한 마우스의 폐에서 확인된 암세포의 콜로니 수가 통계적으로 유의하게 감소되었다는 것을 의미한다).
도 4는 동물모델에서 티모사포닌 AⅢ에 의한 유전자 발현 억제효과를 확인한 도면으로, (A) NF-κB, (B) IKK-α 및 (C) COX-2의 유전자 발현량을 나타낸 것이다.
도 5는 티모사포닌 AⅢ의 화학 구조를 나타낸 도면이다.
본 발명은 티모사포닌 AⅢ, 약학적으로 허용가능한 이의 염 또는 티모사포닌 AⅢ를 포함하는 지모 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부암의 치료 또는 전이 억제용 약학 조성물에 관한 것이다. 상기 지모 추출물의 추출용매는 물, C1 내지 C4의 저급 알코올, 아세톤, 에틸아세테이트, 부틸아세테이트, 1,3-부틸렌 글리콜 및 헥산 중에서 선택된 하나 이상의 추출용매인 것이 바람직하며, 상기 저급 알코올로는 에탄올, 메탄올 또는 이소프로판올을 이용하는 것이 바람직하고, 더욱더 바람직한 추출용매는 에탄올을 이용하는 것이지만 이에 한정하지 않는다. 상기 티모사포닌 AⅢ는 하기 화학식 1로 이루어진 것이 특징이며, 효과를 상승시키기 위한 하기 화학식 1의 기능기의 변형은 얼마든지 가능하다.
화학식 1
Figure PCTKR2015014371-appb-C000001
상기 피부암은 흑색종인 것이 특징이지만 이에 한정하지 않으며, 흑색종이 폐로 전이되는 것을 억제하는 것이 특징이다.
본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물에 포함되는 약학적으로 허용되는 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한 상기 성분들 이외에 항산화제, 완충액, 정균제, 희석제, 계면활성제, 결합제, 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제 또는 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 경구 또는 비경구 투여할 수 있으며, 비경구 투여는 주사 또는 피부에 도포하는 방법으로 투여할 수 있는 것이다. 본 발명의 약학 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다.
또한, 본 발명은 티모사포닌 AⅢ, 약학적으로 허용가능한 이의 염 또는 티모사포닌 AⅢ를 포함하는 지모 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부암의 전이 억제용 건강기능식품 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 건강기능식품 조성물은 지모 추출물 또는 티모사포닌 AⅢ를 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 혼합하여 제조될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 제조될 수 있다. 상기 지모 추출물 또는 티모사포닌 AⅢ를 첨가할 수 있는 식품의 예로는 카라멜, 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 수프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올음료 및 비타민 복합제 중에서 선택된 어느 하나의 형태일 수 있으며, 통상적인 의미에서의 건강기능식품을 모두 포함한다. 즉, 상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 건강기능식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 및 천연 풍미제, 착색제 및 증진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알킨산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 또한, 천연 과일 주스 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 상기의 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 또한, 본 발명의 건강기능식품 조성물은 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있으며, 상기 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 단당류, 말토스, 슈크로스와 같은 이당류, 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 다당류, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 크게 중요하지 않지만, 본 발명의 조성물 100g에 대하여, 0.01 ~ 0.04g 인 것이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 0.02 내지 0.03g을 포함하는 것이지만 이에 한정하지 않는다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다.
또한, 본 발명은 지모 추출물 또는 지모 추출물로부터 분리된 티모사포닌 AⅢ 또는 약학적으로 허용가능한 이의 염을 유효성분으로 함유하는 피부암의 치료 또는 전이 억제용 피부 외용제에 관한 것이다. 상기 피부 외용제는 크림 형태인 것이 바람직하지만 이에 한정하지 않으며, 국소적용에 적합한 제형으로, 분말제, 겔제, 연고제, 크림제 및 액제 중에서 선택된 어느 하나인 것이 바람직하며, 구체적으로는 용액, 겔, 고체, 반죽 무수 생성물, 수상에 유상을 분산시켜 얻은 에멀젼, 현탁액, 마이크로에멀젼, 마이크로캡슐, 미세과립구 또는, 이온형(리포좀) 및 비이온형의 소낭 분산제의 형태로, 스킨, 로션, 파우더, 연고, 스프레이 또는 콘실 스틱의 형태로 제공될 수 있다. 또한 포말(foam)의 형태로 또는 압축된 추진제를 더 함유한 에어로졸 형태로도 사용될 수 있다.
이하, 실시예를 이용하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들에 의해 제한되지 않는다는 것은 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어 자명한 것이다.
[재료 및 방법]
1. 지모 추출물의 제조
지모는 옴니허브로부터 구입하였고, 시료는 온도 5.5±0.3℃, 습도 55±5%로 유지되는 약재보관용 냉장고에서 보관을 하였다. 지모 추출물은 지모의 총 중량의 10배량의 부피에 해당되는 70% 에탄올을 사용하여 1시간씩 2회 환류냉각 추출하였다. 이후에, 여과지를 이용하여 획득한 여액을 감압농축기를 이용하여 용매를 제거함으로써 지모 추출물의 제조를 완성하였다.
2. 티모사포닌 AⅢ의 분리 및 구조 결정
지모로부터 티모사포닌 AⅢ를 분리하기 위해, 지모 추출물을 n-헥산(hexane), 에탄올 및 부탄올(n-BuOH)을 이용하여 분획한 후, n-BuOH 분획을 다이아이온(diaion) HP-20 레진을 이용하여 물과 메탄올의 기울기 용리[H2O:MeOH (100:0 내지 70:30)]를 이용하여 소분획(A1-A5)을 획득하였다. 상기 소분획(A4)을 LiChroprepRP-18 역상 레진을 물과 메탄올의 기울기 용리[H2O:MeOH (100:0 내지 50:50)]하여 티모사포닌 AⅢ를 분리하였다.
3. 세포배양
인간(WM-115) 및 마우스(B16-F10)의 흑색종 세포주를 미국 ATCC에서 구입하였으며, 마우스(B16-F10)의 흑색종 세포주는 DMEM(Dulbecco modified Eagle medium) 배지에 10%의 소혈청과 1%의 페니실린/스트렙토마이신이 포함된 배지에서 배양하여 실험에 사용하였다. 또한, 인간(WM-115) 흑색종 세포는 EMEM(Eagle Minimum Essential Medium) 배지에 10%의 소혈청, 2mM의 글루타민, 1%의 비필수 아미노산(Non-Essential Amino Acids; NEAA)과 1%의 피루브산나트륨(Sodium Pyruvate; NaP)이 포함된 배지에서 배양하였다(37℃, 5% CO2 배양기). 세포가 단층을 형성하면 완충용액으로 세척한 후, 티로신(trypsin)-EDTA 용액을 처리하여 세포를 유리시켜 계대배양 하였다.
4. 세포이동분석(Migration assay)
사람 및 마우스 흑색종 세포에서 약물에 의한 화학주화성(chemotaxis) 억제작용을 확인하기 위해, 6.5mm의 직경 폴리카보네이트 필터(8μm pore size)가 장착된 Transwell 챔버를 이용하여 수행하였다(Corning Costar, Cambridge, MA, USA). 실험을 수행하기 전에 Transwell의 바닥을 젤라틴(gelatin)으로 코팅하여 상온에 보관 후, 1%의 소 혈청이 포함된 배지를 각각의 웰에 넣은 후, 세포를 1×105 cells/㎖으로 맞추고, 처리된 약물(티모사포닌 AⅢ)과 함께 upper well에 조심스럽게 넣은 다음 챔버를 37℃의 배양기에서 24시간 동안 배양하였다. 24시간 배양 후, 배양된 세포를 고정하기 위해 H&E(hematoxylin and eosin) 염색한 다음, upper 표면에 있는 세포를 조심스럽게 면봉으로 제거하고 이동된 세포를 현미경 관찰하여(100×) 사진을 찍고 이동된 세포의 수를 카운트하였다.
5. 실험동물 및 시료투여
C57BL/6는 7주령의 수컷을 쌤타코바이오코리아(대한민국)로부터 구입하여 1주 동안 적응시킨 후 사용하였다. 적응기간 중 일반 상태를 관찰하여 건강한 상태의 동물을 실험에 사용하였다. 사육환경은 온도 23℃, 습도 50%, 명암주기 12시간 (07:00-19:00/조명시간)으로 유지하였다. 시험기간 중 실험동물은 폴리카보네이트(polycarbonate) 케이지(200×320×145mm, Three-shine Co., Daejeon, Korea)에 군당 9마리로 사육하였고 사료는 마우스 전용사료 5L79(Charles river, USA)를 자유급이 하였으며, 음수는 자외선으로 소독한 상수 도수를 자유 급이 하였다.
시료투여는 총 4개의 그룹인 1) 대조군(normal group), 2) 흑색종 세포(melanoma cells) 이식군, 3) 흑색종 세포 이식 및 약물 투여군(12.5 mg/kg/day), 4) 흑색종 세포 이식 및 약물 투여군(25 mg/kg/day)으로 나누어 실험을 하였고, 시료투여는 복강투여 하였다.
6. 생체 내 폐 전이 분석(In vivo lung metastasis assay)
티모사포닌 AⅢ의 항전이 효과를 확인하기 위하여, 5×104 cell/200㎕의 농도로 무혈청 배지(serum free media)에 희석시킨 흑색종 세포주인 B16-F10 세포를 마우스의 꼬리정맥에 주사하여 폐로 암세포(B1-F10 세포)가 전이된 모델 쥐를 만들고, 모델 쥐에 암세포 접종 다음날부터 14일간 약물(티모사포닌 AⅢ)을 각각 12.5mg/kg/day, 25 mg/kg/day로 복강 투여한 후, 폐를 적출하여 폐로 전이된 암세포의 수를 카운트하였다.
7. 생체 내 폐조직의 Real-Time PCR
티모사포닌 AⅢ에 의한 암전이 또는 항암효능 관련 유전자 발현억제를 확인하기 위하여, 동물의 폐조직에서 RNA를 추출하고 MicroRNA 역전사 키트를 사용하여 상보적 DNA를 얻었다. TaqMan RNA assays(Applied Biosystems)기법으로 Real-Time PCR system(QuantStudio 6, Applied Biosystems)을 이용하여 증폭하고, RNA를 정량측정하였다.
(1) RNA 추출
정상 C57BL/6 생쥐와 흑색종(B16-F10) 세포주를 이식한 마우스의 폐를 적출하여 500㎕의 Trizol을 넣고 조직파쇄기(homogenizer)로 세포들을 분쇄하였으며 여기에 100㎕의 클로로포름(chloroform)을 첨가한 후 15초간 다시 혼합하였다. 이를 얼음에 15 분간 방치한 후, 13,000rpm에서 원심 분리하였고 약 200㎕의 상층액을 회수하여 200㎕의 2-propanol과 동량 혼합 후, 천천히 흔들고 얼음에서 15분간 방치하였다.
이를 다시 13,000rpm에서 원심 분리한 후, 80%의 에탄올로 세척하고, 3분간 진공펌프로 건조하여 RNA를 추출하였다. 추출한 RNA는 DEPC를 처리한 20㎕의 증류수에 녹여 75℃의 히팅블럭(heating block)에서 불활성화시킨 후, cDNA 합성에 사용하였다.
(2) 역전사(reverse transcription)
정상 C57bl/6 생쥐와 흑색종(B16-F10) 세포주를 이식한 마우스 폐조직에서 추출된 total RNA 3㎍을 75℃에서 10분 동안 변성시킨 다음 이에 2.5㎕의 10mM dNTPs mix, 1㎕의 random sequence hexanucleotides(25pmole/25㎕), RNA 저해제로서 1㎕의 RNase inhibitor(20 U/㎕), 1㎕의 100mM DTT, 4.5㎕의 5× RT 완충용액(250mM Tris-HCl, pH8.3, 375mM KCl, 15mM MgCl2)를 가한 후, 1㎕의 M-MLV RT(200 U/㎕)를 다시 가하고, DEPC 처리된 증류수로서 최종 부피가 20㎕가 되도록 하였다.
상기 20㎕의 반응 혼합액을 잘 섞은 뒤, 2,000rpm에서 5초간 원심침강하여 37℃의 히팅블럭(heating block)에서 60분 동안 반응시켜 cDNA를 합성한 다음, 95℃에서 5분 동안 방치하여 M-MLV RT를 불활성화시킨 후 합성이 완료된 cDNA를 PCR에 사용하였다.
(3) 실시간 중합효소 연쇄반응(Real-Time PCR)
실시간 중합효소 연쇄반응(Real-Time PCR)은 Applied Biosystems QuantStudio 6(Applied Biosystems, USA)을 이용하여 수행하였다. mRNA 유전자 발현은 TaqMan probe(FAM dye-labeled, ABi, USA)를, 내부 표준(internal standard)으로 생쥐 HPRT probe set; Endogenous Control (VIC/MGB Probe, Probe limited) from Applied Biosystems를 사용하였고, 프라이머의 최종 농도가 200nM이 되도록 반응시켰다. 실시간 중합효소 연쇄반응(Real-Time PCR)은 1) pre-denaturation으로 50℃에서 2분간; 2) 94℃에서 10분간; 3) 95℃에서 15초간 및 60℃에서 1분간, 40 cycles; 수행하는 조건으로 실시하였다.
실험군과 대조군의 내부 표준(internal standard)으로 HPRT(hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase)를 사용하였다. 타겟 그룹의 상대적 정량(relative quantitative; RQ)은 Real-Time PCR 결과로부터 획득한 값을 하기의 수식에 적용하여 계산하였다.
yield(Y) = x(1+e)n
(x: starting quantity, n: number of cycles, e: efficiency)
실시예 1. 지모 추출물의 Melanoma cell line(B16-F10) 세포에서 암세포 전 이 억제 확인
도 1에 개시한 바와 같이, TPA(12-O-Tetradecanoylphorbol-13-acetate)를 처리하였을 때, 흑색종 세포의 전이가 일어남을 확인하였고, 지모 추출물을 처리하였을 때, 전이가 유의성 있게 억제됨을 확인할 수 있었으며, 약물 처리농도에 의존적으로 효과가 나타남을 확인하였다.
실시예 2. 지모로부터 분리된 티모사포닌 AⅢ에 의한 피부암 전이 억제 확인
도 2에 개시한 바와 같이, 지모 추출물로부터 분리한 유효성분인 티모사포닌 AⅢ를 처리하였을 때, 마우스(B16-F10) 및 사람(WM-115) 세포의 전이가 억제됨을 확인하였다. 상기 티모사포닌 AⅢ는 농도를 0, 10, 50, 100nM로 처리하였으며, 처리농도에 의존적으로 효과가 나타남을 확인하였다.
실시예 3. 동물모델에서의 티모사포닌 AⅢ에 의한 폐전이 억제 확인
도 3에 개시한 바와 같이, 마우스 B16 흑색종 세포를 이용하여 폐로의 전이 억제 효과를 관찰한 결과, 약물을 처리하지 않은 군에서는 흑색 암종의 콜로니의 크기나 숫자가 정상군에 비해서 증가하였음을 알 수 있었고, 티모사포닌 AⅢ를 처리한 군은 B16 흑색종 세포가 폐로 전이되는 정도가 티모사포닌 AⅢ의 양에 의존적으로 억제되는 것을 확인하였다.
실시예 4. 동물모델에서의 티모사포닌 AⅢ에 의한 mRNA 발현량의 변화 확인
도 4에 개시한 바와 같이, 마우스에 B16 흑색종 세포를 이용하여 폐에서의 유전자 발현량을 관찰한 결과, 약물을 처리하지 않은 군에서는 NF-κB, IKK-α, COX-2의 유전자 발현량이 정상군에 비해서 증가하였음을 알 수 있었고, 티모사포닌 AⅢ를 처리한 군은 B16 흑색종 세포에 의한 NF-κB, IKK-α, COX-2의 유전자 발현량이 티모사포닌 AⅢ의 양에 의존적으로 억제됨을 확인하였다.

Claims (10)

  1. 티모사포닌 AⅢ, 약학적으로 허용가능한 이의 염 또는 티모사포닌 AⅢ를 포함하는 지모 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부암의 치료 또는 전이 억제용 약학 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 지모 추출물의 추출용매는 물, C1 내지 C4의 저급 알코올, 아세톤, 에틸아세테이트, 부틸아세테이트, 1,3-부틸렌 글리콜 및 헥산 중에서 선택된 하나 이상의 추출용매인 것을 특징으로 하는 피부암의 치료 또는 전이 억제용 약학 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 피부암은 흑색종인 것을 특징으로 하는 피부암의 치료 또는 전이 억제용 약학 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 전이는 폐(lung)로의 전이인 것을 특징으로 하는 피부암의 치료 또는 전이 억제용 약학 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 유효성분 이외에 추가로 담체, 부형제 또는 희석제를 포함하는 것을 특징으로 하는 피부암의 치료 또는 전이 억제용 약학 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 경구투여, 주사 또는 피부 도포의 방법으로 투여하는 것을 특징으로 하는 피부암의 치료 또는 전이 억제용 약학 조성물.
  7. 티모사포닌 AⅢ, 약학적으로 허용가능한 이의 염 또는 티모사포닌 AⅢ를 포함하는 지모 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부암의 전이 억제용 건강기능식품 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 증진제, 펙트산 및 그의 염, 알킨산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올 및 탄산음료에 사용되는 탄산화제 중에서 선택된 하나 이상을 더 함유하는 것을 특징으로 하는 피부암의 전이 억제용 건강기능식품 조성물.
  9. 티모사포닌 AⅢ, 약학적으로 허용가능한 이의 염 또는 티모사포닌 AⅢ를 포함하는 지모 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부암의 치료 또는 전이 억제용 피부 외용제.
  10. 제9항에 있어서, 상기 피부 외용제의 제형은 분말제, 겔제, 연고제, 크림제 및 액제 중에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 피부암의 치료 또는 전이 억제용 피부 외용제.
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