CN111135200A - 金针菇萃取物用于提升基因表现量及/或抑制脂肪累积的用途 - Google Patents

金针菇萃取物用于提升基因表现量及/或抑制脂肪累积的用途 Download PDF

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CN111135200A CN201911069851.0A CN201911069851A CN111135200A CN 111135200 A CN111135200 A CN 111135200A CN 201911069851 A CN201911069851 A CN 201911069851A CN 111135200 A CN111135200 A CN 111135200A
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Abstract

本发明涉及植物提取物领域，尤其是关于一种金针菇萃取物用于提升基因表现量及/或抑制脂肪累积的用途。本发明提供一种金针菇萃取物用于提升三酸甘油酯脂解酶基因基因、脂肪酶E基因、及/或体解偶联蛋白基因表现量的医药组合物的用途，其中所述金针菇萃取物是以溶剂萃取金针菇所获得，所述溶剂为水、醇、或醇水混合物。本发明还提供一种医药组合物用于制备抑制脂肪累积的药物的用途。本发明中，金针菇萃取物能有效促进代谢脂肪的活性，并有效减少脂肪细胞中脂肪油滴的堆积，以减少脂肪的堆积，进而达到减脂的功效。

Description

金针菇萃取物用于提升基因表现量及/或抑制脂肪累积的 用途
技术领域
本发明涉及植物提取物领域，尤其是关于一种金针菇萃取物与其化合物用于提升基因表现量及/或抑制脂肪累积的用途。
背景技术
世界卫生组织(World Health Organization，WHO)以「传染病」形容快速蔓延的肥胖，并称其为「全球肥胖症」(Globesity)。肥胖会引起许多相关的合并症，如糖尿病、高血脂、睡眠呼吸中止、狭心症、退化性关节炎、尿酸过高，甚至某些癌症等，进而可能造成死亡，因此病态性肥胖病患的平均寿命比起正常体重者少了许多。目前治疗肥胖最有效的方法为手术治疗，另外合法药物(目前只有罗氏鲜)、运动、热量控制、及低卡代餐等亦被证实是有效的方式。然而，除了手术治疗之外，大部份的病患使用其他方法减肥，大多在减重治疗结束后便会失去戒心而复胖，如此一瘦一胖的现象(溜溜球效应)而对身体的伤害更大。
综上所述，因应现代人因生活及饮食习惯改变所面临的肥胖及因肥胖造成的整体健康问题，且基于现代人生活水平提高且对于保健概念提高，研发一种能有效减少身体脂肪含量，且减缓复胖的机会的有效成分组成的组合物，着实有其必要性。
发明内容
缘此，本发明的一目的在提供一种金针菇萃取物用于制备提升酸甘油酯脂解酶基因(Adipose triglyceride lipase，ATGL)基因、脂肪酶E(lipase E，LIPE)基因、及/或体解偶联蛋白(Uncoupling Protein，UCP)基因表现量的医药组合物的用途，其中该金针菇萃取物是以溶剂萃取金针菇所获得，该溶剂为水、醇、或醇水混合物。
本发明的另一目的在提供一种医药组合物用于制备抑制脂肪累积的药物的用途，其中该医药组合物包含有效剂量的次黄嘌呤、尿嘧啶、或其组合，以及药学上可接受的载体。
在本发明的一实施例中，该溶剂为水，且该溶剂与该金针菇的液固比为1-15∶1-5，该萃取步骤是在70-100℃进行0.5-2小时。
在本发明的又一实施例中，该体解偶联蛋白基因是体解偶联蛋白1(UncouplingProtein 1，UCP1)基因、体解偶联蛋白2(Uncoupling Protein 2，UCP2)基因、或其二者的组合。
在本发明的又一实施例中，该金针菇萃取物是促进代谢脂肪的活性；且该金针菇萃取物的浓度至少为0.25mg/mL。
在本发明的又一实施例中，该金针菇萃取物中包含次黄嘌呤(Hypoxanthine)、尿嘧啶(Uracil)、或其组合。
在本发明的又一实施例中，该医药组合物中该次黄嘌呤、或该尿嘧啶是纯化自金针菇萃取物；且该金针菇萃取物是以一溶剂萃取一金针菇所获得，且该溶剂为水。
在本发明的另一实施例中，该医药组合物中该次黄嘌呤、或该尿嘧啶的浓度至少为40μg/mL。
本发明的金针菇萃取物的水层萃取物能显著提升ATGL基因、LIPE基因、UCP1基因、及UCP2基因的表现量，能促进代谢脂肪的活性，因此进一步由该水层萃取物中纯化出具有减脂功效的效性物质；而从本发明金针菇萃取物的水层萃取物中，纯化出的化合物次黄嘌呤(Hypoxanthine)、及尿嘧啶(Uracil)皆能够有效减少脂肪细胞中脂肪油滴的堆积，能减少脂肪的堆积，进而达到减脂的功效；其中，次黄嘌呤为抑制脂肪堆积功效最佳的化合物；而本发明亦首次证实次黄嘌呤的嘌呤骨架类型的化合物竟具有抑制脂肪累积的功效。因此，本发明的金针菇萃取物的水层萃取物以及从中纯化出的化合物次黄嘌呤、及尿嘧啶可用于制备抑制脂肪累积的组合物的用途，且该组合物是一医药品、或一食品，可藉由口服等方式给予一个体。
以下将配合图式进一步说明本发明的实施方式，下述所列举的实施例是用以阐明本发明，并非用以限定本发明的范围，任何熟习此技艺者，在不脱离本发明的精神和范围内，当可做些许更动与润饰，因此本发明的保护范围当视后附的申请专利范围所界定者为准。
附图说明
图1是本发明的一实施例的金针菇萃取物、该金针菇萃取物的正丁醇层萃取物、及该金针菇萃取物的水层萃取物调控ATGL基因、及LIPE基因的表现量的柱形图；**p值＜0.01；***p值＜0.001；
图2是本发明的一实施例的金针菇萃取物、该金针菇萃取物的正丁醇层萃取物、及该金针菇萃取物的水层萃取物调控UCP1基因、及UCP2基因的表现量的柱形图；**p值＜0.01；
图3是本发明的一实施例的金针菇萃取物的水层萃取物中纯化出的TCI-FV-01的氢光谱图；
图4是本发明的一实施例的金针菇萃取物的水层萃取物中纯化出的TCI-FV-03的氢光谱图；
图5是本发明的一实施例的金针菇萃取物的水层萃取物中纯化出的TCI-FV-01、及TCI-FV-03减少脂肪堆积的功效的柱形图；*p值＜0.05；**p值＜0.01；***p值＜0.001。
具体实施方式
本文中所使用数值为近似值，所有实验数据皆表示在20％的范围内，较佳为在10％的范围内，最佳为在5％的范围内。
使用Excel软件进行统计分析。数据以平均值±标准偏差(SD)表示，各组之间的差异以学生t检验(student′s t-test)分析。
金针菇(Flammulina velutipes)为口蘑科(Tricholomataceae)金针菇属(Flammulina)真菌，又称构菌、朴菇、冬菇、朴菰、冻菌、金菇等名。其菌柄细长，似金针菜，故称金针菇，其是一种木材腐生菌，易生长在柳、榆、白杨树等阔叶树的枯树干及树桩上，金针菇属于低热量的蔬菜，并含有铁、钙、镁、钾和多种微量元素，及大量维生素，是营养价值极高的食品。
如本文中所使用的，用语「金针菇萃取物」意为金针菇与溶剂以1-5∶1-15(w/w)比例经一特定时间与温度萃取而得。
如本文中所使用的，用语「金针菇萃取物的正丁醇层萃取物」意为将前述的金针菇萃取物与以1∶1(v/v)等比例混合的正丁醇(n-Butanol)与水进行混合，进行液相分配萃取，并将该正丁醇层萃取液经减压浓缩进行干燥所得的产物。
如本文中所使用的，用语「金针菇萃取物的水层萃取物」意为金针菇与以1∶1(v/v)等比例混合的正丁醇(n-Butanol)与水进行混合，进行液相分配萃取，并将该水层萃取液经减压浓缩进行干燥所得的产物。
依据本发明，以管柱层析法(Column chromatography)及薄层层析法(Thin layerchromatography，TLC)自本发明的金针菇萃取物中，所纯化出的两种化合物次黄嘌呤(Hypoxanthine)、及尿嘧啶(Uracil)，将于本文分别命名为TCI-FV-01、及TCI-FV-03。
本文所述的「有效浓度」或「有效量」是表示能有效提升ATGL基因、LIPE基因、UCP1基因、及UCP2基因的表现量、及/或能有效抑制脂肪细胞中脂肪油滴的堆积所需本发明的金针菇萃取物、次黄嘌呤、及/或尿嘧啶的浓度。有效浓度依所作用的对象而可能不同，但可藉由例如剂量递增试验(Dose escalation)以实验决定其有效浓度。
依据本发明，医药品可利用熟习此技艺者所详知的技术而被制造成一适合于非经肠地道(parenterally)或局部地(topically)投药的剂型，这包括，但不限于：注射品(injection)[例如，无菌的水性溶液(sterile aqueous solution)或分散液(dispersion)]、无菌的粉末(sterile powder)、外部制剂(external preparation)以及类似物。
依据本发明，医药品可进一步包含有一被广泛地使用于药物制造技术的医药上可接受的载剂(pharmaceutically acceptable carrier)。例如，该医药上可接受的载剂可包含一或多种选自于下列的试剂：溶剂(solvent)、缓冲液(buffer)、乳化剂(emulsifier)、悬浮剂(suspending agent)、分解剂(decomposer)、崩解剂(disintegrating agent)、分散剂(dispersing agent)、黏结剂(binding agent)、赋形剂(excipient)、安定剂(stabilizingagent)、螯合剂(chelating agent)、稀释剂(diluent)、胶凝剂(gelling agent)、防腐剂(preservative)、润湿剂(wetting agent)、润滑剂(lubricant)、吸收延迟剂(absorptiondelaying agent)、脂质体(liposome)以及类似物。有关这些试剂的选用与数量是落在熟习此项技术的人士的专业素养与例行技术范畴内。
依据本发明，该医药上可接受的载剂包含有一选自于由下列所构成的群组中的溶剂：水、生理盐水(normal saline)、磷酸盐缓冲生理盐水(phosphate buffered saline，PBS)、含有醇的水性溶液(aqueous solution containing alcohol)以及它们的组合。
依据本发明，该医药品可以一选自于由下列所构成的群组中的非经肠道途径(parenteral routes)来投药：皮下注射(subcutaneous injection)、表皮内注射(intraepidermal injection)、皮内注射(intradermal injection)以及病灶内注射(intralesional injection)。
依据本发明，食品产品可被当作食品添加物(food additive)，藉由习知方法于原料制备时添加，或是于食品的制作过程中添加，而与任一种可食性材料配制成供人类与非人类动物摄食的食品产品。
依据本发明，食品产品的种类包括但不限于：饮料(beverages)、发酵食品(fermented foods)、烘培产品(bakery products)、健康食品(health foods)以及膳食补充品(dietary supplements)。
本发明提供一种金针菇萃取物与从其水层萃取物中纯化出的化合物用于制备抑制脂肪累积的组合物的用途，本发明的金针菇萃取物能显著提升ATGL基因、LIPE基因、UCP1基因、及UCP2基因的表现量，能促进代谢脂肪的活性；而纯化自其中的次黄嘌呤、及尿嘧啶能够有效减少脂肪细胞中脂肪油滴的堆积，能减少脂肪的堆积，进而达到减脂的功效。
同时，本发明用于制备抑制脂肪累积的组合物，亦可包含一有效量的选自于本发明的金针菇萃取物、次黄嘌呤、及尿嘧啶中任一项或其任意组合物，及一医药上可接受的载体，且该组合物是一医药品、或一食品。
以下将详细说明本发明的金针菇萃取物的详细萃取方法；该金针菇萃取物、其正丁醇层萃取物、及其水层萃取物提升ATGL基因、LIPE基因、UCP1基因、及UCP2基因表现量的功效的测试；次黄嘌呤、及尿嘧啶自该金针菇萃取物中纯化的详细方法；以及该两种化合物减少脂肪细胞中脂肪堆积的功效的测试，以证实本发明的金针菇萃取物与纯化自其中的次黄嘌呤、及尿嘧啶分别能有效提升会促进代谢脂肪的活性的ATGL基因、LIPE基因、UCP1基因、及UCP2基因的表现量，并能同时有效减少脂肪细胞中脂肪油滴的堆积，能减少脂肪的堆积，进而达到减脂的功效。
化学分析材料
正己烷(n-hexane)、乙酸乙酯(Ethyl acetate)、丙酮(Acetone)、甲醇(Methanol)、乙醇(Ethanol)、正丁醇(n-butanol)、乙腈(Acetonitrile)、氯仿-d1(氘化程度为99.5％)、甲醇-d6(氘化程度为99.5％)、重水(Deuterium oxide，氘化程度大于99.8％)、及二甲基亚砜-d6(Dimethyl sulfoxide-d6，氘化程度＞99.9％)购自中国台湾默克公司。
化学分析仪器
化合物的分离是利用管柱层析法(Column chromatography)及薄层层析法(Thinlayer chromatography，TLC)。中压液相层析仪(Medium pressure liquidchromatography，MPLC)系统是
Figure BSA0000194008060000061
Rf+(Teledyne ISCO，Lincoln，NE)；管柱是选用自Sephadex LH-20(Amersham Biosciences)、Diaion HP-20(Mitsubishi Chemical)、Merck Kieselgel 60(40-63μm，Art.9385)、及Merck
Figure BSA0000194008060000071
RP-18(40-63um，Art.0250)。高效液相层析仪(High Performance Liquid Chromatography，HPLC)系统装配Hitachi L-2310系列帮浦、Hitachi L-2420 UV-VIS侦测器(侦测波长为200nm至380nm)、及D-2000 Elite资料处理软件；管柱是选用自分析级
Figure BSA0000194008060000072
HS C18(250×4.6mm，5μm；SUPELCO)与Mightysil RP-18 GP 250(250×4.6mm，5μm；Kanto Chemical)，以及半制备级
Figure BSA0000194008060000073
HS C18(250×10.0mm，5μm；SUPELCO)与制备级
Figure BSA0000194008060000074
HS C18(250×21.0mm，5μm；SUPELCO)。层析系统配备紫外灯UVP UVGL-25(波长为254nm及365nm)。薄层层析片是涂覆硅胶60 F254(0.25mm；Merck)或RP-18 F254S(0.25mm；Merck)的铝片。
化合物的化学结构是以质谱法(Mass spectrometry，MS)及核磁共振光谱法(Nuclear magnetic resonance spectrometry，NMR)进行分析。具体而言，使用二维离子阱串联傅里叶变换质谱(Bruker amaZon SL system)及电喷洒离子化串联质谱(ESI-MS/MS，Thermo Scientific Orbitrap Elite system)进行测定，单位为m/z；并使用400MHzVarian 400 FT-NMR取得一维与二维NMR光谱，以δ表示化学位移(Chemical shift)，其中单位为ppm；以四甲基硅烷(Tetramethylsilane，TMS)作为内部标准品(δ＝0)；偶合常数(J)以Hz为单位，并以s窗体峰(Singlet)，d表二重峰(Doublet)，t表三重峰(Triplet)，q表四重峰(Quartet)，p表五重峰，m表多重峰(Multiplet)，brs则表宽峰。
依据本发明，有关混合物的化学分离及化学结构分析的操作程序与参数条件等是落在熟习此项技术的人士的专业素养与例行技术范畴内。
实施例1本发明的金针菇萃取物的制备方法
在本发明一实施例中，将金针菇以低于60℃的温度进行烘干后磨成粉末，再将该金针菇粉末与水、醇、或醇水混合物的萃取溶剂以1-5∶1-15的液固比混合，萃取溶剂较佳为水，均质后在溶剂中以70-100℃进行萃取0.5-2小时后，再以400目的滤网过滤获得一滤液。最后，将该滤液于45-70℃进行减压浓缩，得到本发明的金针菇萃取物。
实施例2分离本发明的金针菇萃取物中提升脂肪代谢的基因表现量的效性物质
本发明实施例为分离本发明的金针菇萃取物中提升脂肪代谢的基因表现量的效性物质，先将10公升的本发明金针菇萃取物，与以1∶1(v/v)等比例混合的正丁醇(n-Butanol)与水进行混合，并分成3次进行液相分配萃取，接着将该3次的正丁醇层萃取液合并后经减压浓缩进行干燥，并得到正丁醇层萃取物共6.4g；其余水层萃取液则继续经减压浓缩进行干燥，并得到水层萃取物共100.0g。接着，分别将该正丁醇层萃取物、及该水层萃取物初步地进行提升脂肪代谢基因表现量的功效测试。
以下功效测试是以小鼠骨髓基质细胞(Bone marrow stromal cells)OP9细胞进行该正丁醇层萃取物、及该水层萃取物于提升脂肪代谢基因表现量的功效的测试。该小鼠骨髓基质细胞是购自美国典型培养物保藏中心
Figure BSA0000194008060000081
编号CRL-2749TM。该细胞于分化前是培养于前脂肪细胞扩增培养液(Pre-adipocyte Expansion Medium)，其中包含90％的MEMAM(Minimum Essential Medium Alpha Medium，购自Gibco，美国，12100-046)细胞培养液、20％的胎牛血清(Fetal Bovine Scrum，购自Gibco，美国)，且加入0.1％的青霉素/链霉素(Penicillin-streptomycin，购自Gibco，美国)；并使用分化培养液(DifferentiationMedium)使小鼠骨髓基质细胞进行分化，其中包含90％的MEMAM细胞培养液、20％的胎牛血清，且加入0.1％的青霉素/键霉素。
首先，将小鼠骨髓基质细胞分化成脂肪细胞，将1.5x105个小鼠骨髓基质细胞培养于含有2mL上述前脂肪细胞扩增培养液的6孔培养盘中，于37℃下培养7天，且期间每3天更换一次新鲜的上述分化培养液，7天后以显微镜观察脂滴的形成，确保细胞已完全分化，接着将细胞分成以下四组：(1)仅加入细胞培养液的控制组、(2)加入0.25mg/mL本发明的金针菇萃取物的原液的比较组、(3)加入7.7μg/mL本发明的金针菇萃取物的正丁醇层萃取物的实验组、及(4)加入242.2μg/mL本发明的金针菇萃取物的水层萃取物的实验组，并将该些组别的细胞分别于37℃下作用6小时后，测试各组OP9细胞中目标基因的表现量；首先，将该些OP9细胞以细胞裂解液(RB buffer，购自Geanaid公司，中国台湾，Cat No.RBD300)回收细胞后，使用RNA萃取试剂套组(购自Geneaid公司，中国台湾，Cat No.RBD300)分别收集该四组细胞内的RNA，接着利用
Figure BSA0000194008060000091
III反转录酶(购自Invitrogene公司，美国，编号18080-051)以2000ng的萃取RNA为模板，并以表一的组合引物及反转录酶进行反转录作用，以产生该些基因的mRNA所相应的cDNA产物，接着利用ABI StepOnePlusTM Real-Time PCRsystem(Thermo Fisher Scientific公司，美国)，以及KAPA SYBR FAST(购自Sigma公司，美国，编号38220000000)将该六组反转录后产物分别以表一的组合引物进行实时定量聚合酶连锁反应(Quantitative real-time polymerase chain reaction，qPCR)试验，条件为95℃反应1分钟预热后，再进行以下95℃反应15秒、58℃反应15秒、72℃反应30秒的总共40个循环的程序。用以定量ATGL基因、LIPE基因、PLIN1基因、PPARG基因、C/EBPA基因、GLUT4基因、UCP1基因、及UCP2基因的mRNA的表现量，其中定量数值是取由阈值循环数(Ct)，而目标基因的mRNA相对量是推导自方程式2-ΔΔCt，其中ΔCT＝CT比较组或实验组目标基因/控制组目标基因-CT ACTB(β-肌动蛋白，beta-actin)；ΔΔCT＝CT比较组或实验组目标基因-CT控制组目标基因；各组中各基因的fold change则为2-ΔΔCt。接着，再利用Excel软件决定变异系数与是否在统计上具有显著差异(*p值＜0.05；**p值＜0.01；***p值＜0.001)。
表一、定量实时反转录聚合酶连锁反应的组合引物
Figure BSA0000194008060000092
Figure BSA0000194008060000101
ATGL(Adipose triglyceride lipase)基因所编码的蛋白质为三酸甘油脂水解酶(Adipose triglyceride lipase，ATGL)。三酸甘油酯为脂肪细胞的脂滴或脂肪体中的主要构造成分，亦为脂肪细胞中储存能量的主要来源，而三酸甘油脂水解酶主要作用即为分解三酸甘油酯，三酸甘油酯水解酶存在于脂滴表面，被激活后三酸甘油脂水解酶会分解甘油三酯，为个体提供能量。因此，ATGL基因表现量上升，会促进脂肪细胞中脂肪的分解，并使其中脂肪累积量降低。
LIPE(lipase E)基因所编码的蛋白质为脂肪酶，其具有长形(Long form)与短形(Short form)。长形主要表达在类固醇生成组织(例如睾丸中)，其主要功能为将胆固醇酯(Cholesteryl esters)转化为游离的胆固醇，以利后续产生类固醇类激素。短形则主要表达在脂肪组织中，其主要功能为将存储的三酸甘油酯水解成游离的脂肪酸。因此，LIPE基因表达量上升，会促进脂肪细胞中脂肪的分解，并使其中脂肪累积量降低。
UCP1(Uncoupling Protein 1)基因及UCP2(Uncoupling Protein 2)基因所编码的蛋白质为体解偶联蛋白(UCP)，其为线粒体阴离子载体蛋白(Mitochondrial anioncarrier proteins，MACP)家族的成员之一，主要功能为将三磷酸腺核苷(Adenosinetriphosphate，ATP)还原，并促进阴离子从线粒体的内膜向外转移，及促进质子从外部到线粒体内膜的返回转移，并将过程中产生的能量以热能释放出来；其中，UCP1基因仅在棕色脂肪细胞中表达，棕色脂肪细胞该细胞含有大量的粒线体，能够燃烧脂肪油滴以产生热能；而UCP2基因则在许多组织中表达，且以骨骼肌表达量最高，被认为与非颤抖性生热(Nonshivering thermogenesis)有关。因此，UCP1基因及UCP2基因的表现量上升，能够促进脂肪的分解，并使脂肪的累积量降低。
本发明金针菇萃取物的正丁醇层萃取物、及水层萃取物提升ATGL基因、LIPE基因、UCP1基因、及UCP2基因的表现量的实验结果如图1及图2所示。OP9细胞经本发明的金针菇萃取物作用后，相较于控制组，会显著提升UCP1基因的表现量，然会却反而会降低ATGL基因、LIPE基因、及UCP2基因的表现量，而PLIN1基因、PPARG基因、C/EBPA基因、及GLUT4基因的表现量均与控制组差异不大；经本发明金针菇萃取物的正丁醇层萃取物作用后，相较于控制组，反而会降低ATGL基因、LIPE基因、UCP1基因、及UCP2基因的表现量，而PLIN1基因、PPARG基因、C/EBPA基因、及GLUT4基因的表现量均与控制组差异不大；经本发明金针菇萃取物的水层萃取物作用后，相较于控制组，皆能显著提升ATGL基因、LIPE基因、UCP1基因、及UCP2基因的表现量，而PLIN1基因、PPARG基因、C/EBPA基因、及GLUT4基因的表现量均与控制组差异不大。该结果显示本发明的金针菇萃取物的水层萃取物能藉由显著提升ATGL基因、LIPE基因、UCP1基因、及UCP2基因四种与脂肪代谢相关基因的表现量，以促进代谢脂肪的活性，且并非任意与脂肪代谢相关的基因，皆能够受到本发明的金针菇萃取物的水层萃取物调控。并且经由此结果可推测该水层萃取物中含有效性物质的机率较高，因此后续将以依据生物活性导引分离方法(Bioassay guided fractionation)追踪其中的效性物质，并进行该些效性化合物的结构分析。PLIN1基因、PPARG基因、C/EBPA基因、GLUT4基因
首先，将水层萃取物共100.0g以Diaion HP-20(购自Mitsubishi Chemical，日本)为层析材料，以水与甲醇为混合溶剂并渐减极性，经管柱层析后共分离得到5个划分层(F1-F5)，依据生物活性导引分离方法(Bioassay guided fractionation)追踪其中的效性物质。再将第三个划分层(F3)以硅胶管柱层析，其中冲提液为以14∶1(v/v)比例混合的二氯甲烷与甲醇，并渐增极性冲提以进行纯化，经管柱层析后再经薄层层析片(TLC)点片合并，总共得到3个次划分层(F3-1-F3-3)。
接着，将第四个划分层(F4)以硅胶管柱层析进行纯化分离，其中冲提液为以5∶1(v/v)比例混合的二氯甲烷与甲醇，总共得到6个次划分层(F4-1-F4-6)。再将次划分层F4-2以中压液相层析仪(Medium pressure liquid chromatography，MPLC)进行纯化，其中是使用以1∶4比例混合的甲醇与水的混合溶液作为冲提相，共得到七个划分层(F4-2-1-F4-2-7)，其中再将划分层F4-2-1以再结晶方式分离得到共6mg的化合物TCI-FV-03(结构式请参照表二)；而划分层F4-2-2则以HPLC进行纯化分离，并以95∶5比例混合的水与甲醇作为移动相，分离得到共10.0mg的化合物TCI-FV-01(结构式请参照表二)。
接着，将化合物TCI-FV-01及TCI-FV-03总共二个化合物皆经由核磁共振光谱仪(NMR)与质谱仪(MS)等分析后，再经由过去文献比对其光谱数据，确定其化学结构，其名称及结构式如表二所示，光谱数据则如图3及图4所示。其中该些化合物的化学名称，分别为化合物TCI-FV-01是次黄嘌呤(Hypoxanthine)；化合物TCI-FV-03则是尿嘧啶(Uracil)。
表二、化合物TCI-FV-01、及TCI-FV-03的化学结构式
Figure BSA0000194008060000131
实施例3本发明金针菇萃取物中的化合物减少脂肪堆积的功效
本发明实施例以小鼠骨髓基质细胞OP9细胞进行从本发明的金针菇萃取物中分离出的化合物TCI-FV-01、及TCI-FV-03于减少脂肪堆积的功效的测试；其中，细胞中的脂质是以油红O染色试剂(购自Sigma，美国)进行检测，该染剂是以100％的异丙醇配置成3mg/mL的油红O储备溶液，并将该储备溶液以ddH2O配置成60％的作用溶液。
为测试本发明的金针菇萃取物中分离出的化合物TCI-FV-01、及TCI-FV-03于减少脂肪堆积的功效的再验证，以抑制油滴累积活性平台进行测试，首先将小鼠骨髓基质细胞分化成脂肪细胞，将8x104个小鼠骨髓基质细胞培养于含有500μL上述前脂肪细胞扩增培养液的24孔培养盘中，于37℃下培养7天，且期间每3天更换一次新鲜的上述分化培养液，7天后以显微镜观察脂滴的形成，确保细胞已完全分化，接着将细胞分成以下三组：(1)仅含细胞培养液的控制组、(2)加入40μg/mL化合物TCI-FV-01的实验组、及(3)加入40μg/mL化合物TCI-FV-03的实验组，并将各组分别于37℃培养7-10天，且同样每3天更换一次新鲜的分化培养液。
接着，使用油红O将细胞内的脂质染色，以评估本发明金针菇萃取物中化合物TCI-FV-01、及TCI-FV-03是否确实能减少脂肪堆积。首先，将培养基轻轻地取出，并在不影响贴附于培养基底部的细胞的情况下移除细胞培养液，并以1mL的磷酸盐缓冲溶液(Phosphatebuffered saline，PBS)清洗细胞两次，再加入1mL的10％甲醛(购自Echo chemical，中国台湾，Cat.TG1794-4-0000-72NI)并于室温下反应30分钟以固定细胞，接着移除甲醛后以1mL的PBS轻轻地清洗细胞两次，接着于每孔细胞内加入1mL的60％异丙醇(购自Echochemical，中国台湾，PH-3101)反应1分钟后，移除异丙醇并加入1mL的油红O作用溶液，于室温下反应1小时，接着移除油红O溶液并迅速地以1mL的60％异丙醇进行脱色5秒钟，再使用显微镜拍照并进行量化。接着，加入100％异丙醇于染色的细胞中，并置于振荡器上反应10分钟以溶解油滴，接着取100μL溶液至96孔培养盘中，使用测量ELISA读数器(BioTek)读取各组的OD510nm读值，以量化各组细胞中油红O的量。再利用Excel软件进行Student t-test以决定各组样本群体之间是否在统计上具有显著差异(*p值＜0.05；**p值＜0.01；***p值＜0.001)。
本发明的金针菇萃取物的水层萃取物中分离出的化合物TCI-FV-01、及TCI-FV-03于减少脂肪堆积的功效再验证的测试结果如表三及图5所示，其中以控制组为100％。脂肪细胞经本发明的金针菇萃取物中分离出的化合物TCI-FV-01、及TCI-FV-03作用后，相较于控制组，能分别显著降低其中油滴含量达53.8％、及60.1％；其中TCI-FV-01能降低46.2％的油滴累积，为功效最佳的化合物；且TCI-FV-01为嘌呤骨架类型的化合物，本发明亦首次证实该种类物质具有优异的抑制脂肪细胞中油滴累积的功效。由该些结果显示本发明的金针菇萃取物中纯化出的化合物TCI-FV-01、及T TCI-FV-03能显著降低脂肪细胞中脂肪的累积，未来可应用于减脂亦或代谢症候群相关疾病应用的组合物。
表三、本发明金针菇萃取物中化合物降低脂肪细胞中脂肪含量的百分比
组别 成分名称 油滴含量百分比(％)
控制组 细胞培养液 100.0
TCI-FV-01 次黄嘌呤 53.8
TCI-FV-03 尿嘧啶 60.1
综上所述，本发明的金针菇萃取物的水层萃取物能显著提升ATGL基因、LIPE基因、UCP1基因、及UCP2基因的表现量，能促进代谢脂肪的活性，因此进一步由该水层萃取物中纯化出具有减脂功效的效性物质；而从本发明金针菇萃取物的水层萃取物中，纯化出的化合物次黄嘌呤(Hypoxanthine)、及尿嘧啶(Uracil)皆能够有效减少脂肪细胞中脂肪油滴的堆积，能减少脂肪的堆积，进而达到减脂的功效；其中，次黄嘌呤为抑制脂肪堆积功效最佳的化合物；而本发明亦首次证实次黄嘌呤的嘌呤骨架类型的化合物竟具有抑制脂肪累积的功效。因此，本发明的金针菇萃取物的水层萃取物以及从中纯化出的化合物次黄嘌呤、及尿嘧啶可用于制备抑制脂肪累积的组合物的用途，且该组合物是一医药品、或一食品，可藉由口服等方式给予一个体。
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Figure ISA0000194008080000021
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Claims (10)

1.一种金针菇萃取物用于制备提升三酸甘油酯脂解酶基因基因、脂肪酶E基因、及/或体解偶联蛋白基因表现量的医药组合物的用途，其中所述金针菇萃取物是以溶剂萃取金针菇所获得，所述溶剂为水、醇、或醇水混合物。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述体解偶联蛋白基因是体解偶联蛋白1基因、体解偶联蛋白2基因、或其二者的组合。
3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述金针菇萃取物是促进代谢脂肪的活性。
4.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述溶剂为水，且所述溶剂与所述金针菇的液固比为1-15∶1-5，所述萃取步骤在70-100℃进行0.5-2小时。
5.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述金针菇萃取物的浓度至少为0.25mg/mL。
6.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述金针菇萃取物中包含次黄嘌呤(Hypoxanthine)、尿嘧啶(Uracil)、或其组合。
7.一种医药组合物用于制备抑制脂肪累积的药物的用途，其特征在于，所述医药组合物包含有效剂量的次黄嘌呤、尿嘧啶、或其组合，以及药学上可接受的载体。
8.根据权利要求7所述的用途，其特征在于，所述次黄嘌呤、或所述尿嘧啶是纯化自金针菇萃取物。
9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于，所述金针菇萃取物是以溶剂萃取金针菇所获得，且所述溶剂为水。
10.根据权利要求7所述的用途，其特征在于，所述次黄嘌呤、或所述尿嘧啶的浓度至少为40μg/mL。
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