KR102446515B1

KR102446515B1 - 비쑥 추출물, 이의 분획물 또는 이로부터 분리한 화합물을 유효성분으로 포함하는 비만의 예방 또는 개선용 지방세포 분화 억제 조성물 및 건강기능식품

Info

Publication number: KR102446515B1
Application number: KR1020200109992A
Authority: KR
Inventors: 서영완; 공창숙; 오정환; 이정임
Original assignee: 한국해양대학교 산학협력단
Priority date: 2019-08-29
Filing date: 2020-08-31
Publication date: 2022-09-23
Also published as: KR20210027202A

Abstract

본 발명은 비쑥 추출물, 이의 분획물 또는 이로부터 분리한 화합물을 유효성분으로 포함하여, 지방세포 분화 억제에 의해 비만의 예방 또는 개선이 가능한 항비만 조성물에 관한 것이다.

Description

비쑥 추출물, 이의 분획물 또는 이로부터 분리한 화합물을 유효성분으로 포함하는 비만의 예방 또는 개선용 지방세포 분화 억제 조성물 및 건강기능식품{COMPOSITION FOR SUPPRESSING ADIPOCYTE DIFFERENTIATION CONTAINING ARTEMISIA SCOPARIA EXTRACT, FRACTION THEREOF OR COMPOUND SEPARATED THEREFROM AS AN ACTIVE INGREDIENT FOR PREVENTING OR IMPROVING OBESITY, HEALTH FUNCTIONAL FOOD}

비만은 체내 에너지 대사의 불균형으로 인하여 지방이 과도하게 축적되어 있는 상태를 말하는 것으로, 제2당뇨, 심혈관질환 및 고혈압과 같은 만성 대사성 증후군질환의 주요 위험 요인이 될 뿐만 아니라 우울증, 자존감상실, 정신적 장애를 일으키는 원인이 된다.

세계보건기구에 따르면, 비만 인구는 계속적으로 증가하고 현재 성인의 39%가 과제중이며, 13%가 비만이라고 보고하고 있으며, 한국인의 경우 고도비만(체질량지수 30~35 미만)과 초고도비만(체질량지수 35 이상) 인구가 가파르게 증가하고 있는데, 이같은 추세라면 2025년 우리나라 성인 17명 중 1명이 고도비만이 될 것이란 전망까지 나온다.

비만을 예방하고 치료하기 위하여 운동과 식이요법 등 많은 프로그램들이 개발되고 있으며, 이와 함께 비만 예방 및 치료를 위한 건강기능식품 개발에 대한 관심이 높아지고 있다. 특히 천연식물로부터 부작용이 없는 비만 예방 및 치료 효과를 가지는 성분의 개발에 많은 관심이 집중되고 있다.

한편, 쑥은 지구 북반구에 200여 종이 있고, 국내에는 사자발쑥, 사철쑥(인진쑥), 제비쑥, 물쑥, 개사철쑥, 비쑥 및 큰비쑥 등 38종이 보고되고 있다. 쑥에는 사람에 유익한 성분이 다수 포함되어 있어 예로부터 널리 이용되어 왔으며, 쑥에 포함된 유효성분을 생약학적 방법으로 연구한 결과, 쑥에 포함된 다양한 유효성분들이 혈액순환촉진, 이뇨작용, 강장작용, 지혈, 피부질환치료, 건위, 황달치료 및 항암작용 등의 효과를 나타내는 것으로 알려져 있다.

그중 비쑥은 국화과의 여러해살이풀로써 간척지의 습한 곳이나 바닷가에 자라는데, 비쑥의 꽃과 잎은 전통적으로 이뇨제, 소염제 및 간염 치료제로 사용된 바 있다(Park,1999).

특히 현재까지 알려진 비쑥의 약리작용으로는 항산화작용, 항염작용 등이 있으나, 비만을 예방하고 개선 혹은 치료할 수 있도록 하는 작용에 대한 연구는 아직 미미한 실정이므로, 비쑥을 이용하여 지방생성을 억제하여 비만의 예방과 치료제로써의 가능성을 규명할 수 있도록 하는 기술개발 연구가 절실히 요구되는 시점이다.

국내 공개특허공보 제10-2015-0056190호, 2015.05.26.자 공개.

본 발명은 상기한 문제점을 해소하기 위하여 발명된 것으로, 비쑥으로부터 비만을 예방하거나 개선할 수 있도록 비쑥 추출물, 이의 분획물 또는 이로부터 분리한 화합물을 유효성분으로 포함하는 지방세포 분화 억제용 조성물을 제공하는 것을 기술적 해결과제로 한다.

상기의 기술적 과제를 해결하기 위하여 본 발명은, 비쑥(Artemisia scoparia)을 비극성용매 및 극성용매로 추출한 비쑥 추출물 또는 이의 비쑥 분획물로부터 분리되는 화합물로써, 하기 화학식 1 및 화학식 2로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 화합물을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는, 비만의 예방 또는 개선용 지방세포 분화 억제 조성물을 제공한다.
[화학식 1]

[화학식 2]

삭제

본 발명에 있어서, 상기 화합물은, MAPK(mitogen-activated protein kinase) 및 AMPK(adenosine monophosphate-activated protein kinase) 신호전달 경로의 조절을 통해 지방전구세포의 지방세포 분화를 억제하는 것을 특징으로 한다.

상기의 다른 기술적 과제를 해결하기 위하여 본 발명은, 비쑥(Artemisia scoparia)을 비극성용매 및 극성용매로 추출한 비쑥 추출물 또는 이의 비쑥 분획물로부터 분리되는 화합물로써, 하기 화학식 1 및 화학식 2로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 화합물을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는, 비만의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.
[화학식 1]

[화학식 2]

삭제

상기 과제의 해결 수단에 의한 본 발명의 비쑥 추출물 또는 이의 분획물로부터 분리되는 화합물을 유효성분으로 포함하는 지방세포 분화 억제용 조성물, 이의 제조방법은, 다음과 같은 효과가 있다.

첫째, 염분성분이 높은 바닷가 지역에서 자라고 식용 쑥의 일종인 비쑥은 부작용 없는 천연식물로써, 항비만 건강기능식품에 안정적인 소재로 활용될 수 있는 효과가 있다.

둘째, 지방전구세포인 3T3-L1의 분화를 억제하기 위해 비쑥 추출물과 그 추출물의 유기용매 분획물인 비쑥 분획물 또는 이로부터 분리된 reynosin 및 santamarine과 같은 화합물이 지방세포 분화 전사인자인 PPARγ, C/EBPα, SREBP-1c의 발현을 저하시킴으로써 지방세포로의 분화작용을 억제하여 지방을 감소시키는 효과가 있다.

셋째, MAPKs 및 AMPK 경로를 통해 지방세포 분화를 억제하는 작용기전을 밝혀 우수한 항비만 작용을 갖는 약학적 유효성분을 제공하는 효과가 있다.

도 1은 본 발명에 따른 비쑥 추출물, 이의 분획물의 제조방법을 나타낸 순서도.
도 2는 본 발명에 따른 비쑥으로부터 세스퀴테르페노이드(sesquiterpenoid)의 분리방법을 나타낸 순서도.
도 3은 본 발명에 따른 3T3-L1 세포에 대한 비쑥 추출물의 세포 독성 효과를 나타낸 그래프.
도 4는 본 발명에 따라 분화된 3T3-L1 세포의 세포내 지질 축적에 대한 비쑥 추출물의 효과를 나타낸 그래프.
도 5는 본 발명에 따른 비쑥 추출물이 주요 지방 생성 전사인자의 발현에 미치는 영향을 나타낸 그래프.
도 6은 본 발명에 따른 비쑥 추출물이 3T3-L1 세포에서 MAPK 경로의 단백질 수준에 미치는 영향을 나타낸 그래프.
도 7은 본 발명에 따른 3T3-L1 세포에 대한 비쑥 분획물의 세포 독성 효과를 나타낸 그래프.
도 8 및 도 9는 본 발명에 따라 분화된 3T3-L1 세포의 세포내 지질 축적에 대한 비쑥 분획물의 효과를 나타낸 그래프.
도 10은 본 발명에 따른 물 분획물이 3T3-L1 지방세포에서 주요 지방 생성 전사인자(PPARγ, C/EBPα 및 SREBPlc)의 mRNA 및 단백질 발현 수준에 미치는 영향을 나타낸 그래프.
도 11은 본 발명에 따른 n-부탄올 분획물이 3T3-L1 지방세포에서 주요 지방 생성 전사인자(PPARγ, C/EBPα 및 SREBPlc)의 mRNA 및 단백질 발현 수준에 미치는 영향을 나타낸 그래프.
도 12는 본 발명에 따른 85% aq.MeOH 분획물이 3T3-L1 지방세포에서 주요 지방 생성 전사인자(PPARγ, C/EBPα 및 SREBPlc)의 mRNA 및 단백질 발현 수준에 미치는 영향을 나타낸 그래프.
도 13은 본 발명에 따른 n-헥산 분획물이 3T3-L1 지방세포에서 주요 지방 생성 전사인자(PPARγ, C/EBPα 및 SREBPlc)의 mRNA 및 단백질 발현 수준에 미치는 영향을 나타낸 그래프.
도 14는 본 발명에 따른 85% 메탄올 분획물이 3T3-L1 지방세포에서 MAPK 및 AMPK 경로의 단백질 수준에 미치는 영향을 나타낸 그래프.
도 15는 본 발명에 따른 3T3-L1 세포에 대한 화합물의 세포 독성 효과를 나타낸 그래프.
도 16은 본 발명에 따른 reynosin, santamarine 및 genistein이 Oil red O 염색으로 분화된 3T3-L1 지방세포의 지질 축적에 미치는 영향을 나타낸 사진.
도 17은 본 발명에 따라 분화된 3T3-L1 지방세포의 지질 축적에 대한 reynosin, santamarine 및 genistein의 효과를 나타낸 그래프.
도 18은 본 발명에 따른 reynosin이 3T3-L1 지방세포에서 주요 지방 생성 전사인자(PPARγ, C/EBPα 및 SREBPlc)의 mRNA 발현 수준에 미치는 영향을 나타낸 그래프.
도 19는 본 발명에 따른 reynosin이 3T3-L1 지방세포에서 주요 지방 생성 전사인자(PPARγ, C/EBPα 및 SREBPlc 및 leptin)의 단백질 발현 수준에 미치는 영향을 나타낸 그래프.
도 20은 본 발명에 따른 santamarine이 3T3-L1 지방세포에서 주요 지방 생성 전사인자(PPARγ, C/EBPα 및 SREBPlc)의 mRNA 발현 수준에 미치는 영향을 나타낸 그래프.
도 21은 본 발명에 따른 santamarine이 3T3-L1 지방세포에서 주요 지방 생성 전사인자(PPARγ, C/EBPα 및 SREBPlc 및 leptin)의 단백질 발현 수준에 미치는 영향을 나타낸 그래프.
도 22는 비쑥의 genistein이 3T3-L1 지방세포에서 주요 지방 생성 전사인자(PPARγ, C/EBPα 및 SREBPlc)의 mRNA 발현 수준에 미치는 영향을 나타낸 그래프.
도 23은 비쑥의 genistein이 3T3-L1 지방세포에서 주요 지방 생성 전사인자(PPARγ, C/EBPα 및 SREBPlc)의 단백질 발현 수준에 미치는 영향을 나타낸 그래프.
도 24는 본 발명에 따른 reynosin이 3T3-L1 지방세포에서 MAPK 및 AMPK 경로의 단백질 수준에 미치는 영향을 나타낸 그래프.
도 25는 본 발명에 따른 santamarine이 3T3-L1 지방세포에서 MAPK 및 AMPK 경로의 단백질 수준에 미치는 영향을 나타낸 그래프.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

설명에 앞서, 비만은 제2당뇨, 고혈압, 고질혈증 등의 여러 대사 및 심혈관질환을 일으키는 만성 질환으로 전세계적으로 그 인구가 증가되고 있으며, 이를 예방하고 치료하기 위한 연구가 활발히 진행되고 있다.

그러던 과정에서 천연으로부터 항비만 효과를 가지는 생리활성 성분을 찾기 위하여 탐색하던 중 전통적으로 이뇨제, 소염제 및 간염치료제로 사용된 비쑥이 세포내 지방구 형성을 억제하는 것을 확인할 수 있었다.

지방조직은 Adipocyte 불리는 특별화된 세포로 TG(triglycerol)로써 과도한 에너지를 저장할 수 있으며, 지방대사와 관련된 호르몬을 분비하여 체내의 모든 대사경로에 영향을 준다.

Adipocyte는 pre-adipocyte가 adipogenesis 과정에 의하여 분화되어 생성되게 되며 이때, proliferator-activated receptor γ(PPARγ), CCAAT-enhancer-binding protein α(C/EBPα) 및 Sterol response element binding protein 1c (SREBP-1c) 등과 같은 지방전사인자(adipogenic transcription factors)가 단계적으로 작용한다. 이러한 지방전사인자는 mitogen-activated protein kinases(MAPKs)와 AMP-activated protein kinase(AMPK) 경로와 밀접하게 연결되어 있다.

MAPKs는 PPARγ를 인산화시켜 활성을 억제하고 또한 C/EBPs의 발현을 감소시켜 지방세포로의 분화를 억제한다. 이와 함께 지방산의 합성과 분해를 매개하는 AMPK는 세포내 에너지가 감소하는 경우, 에너지를 생성하기 위하여 활성화되어 지방산의 분해 및 당 흡수를 촉진하고 지방산과 콜레스테롤 합성을 억제한다.

한편, 비만의 예방과 치료제 개발을 위하여 천연으로부터 활성물질을 탐색하던 중 비쑥이 지방세포내 지질 축적을 억제하는 것을 확인하였는데, 비쑥의 경우 항산화, 식물독성 및 항염증 등의 효과가 있으며, 활성성분으로 essential oil, flavonoids, coumarins 등이 있다.

따라서 본 발명에서는 비쑥 추출물의 지질 축적 효과를 바탕으로 활성 분획물을 찾기 위하여 4개의 용매 분획물로 나누었으며, 그들의 지질 축적 억제 효과를 확인하기로 한다. 또한, 그들의 효과를 분자 생물학적 수준에서 확인하기 위하여 지방전사인자인 PPARγ, C/EBPα 및 SREBP-1c의 발현수준을 확인하고, MAPKs 및 AMPK pathway를 통해 지방세포 분화 억제 효과의 작용기전을 확인하기로 한다.

단, 본 명세서에서 기재된 '예방'은 본 발명에 따른 조성물의 투여로 비만 증상을 억제시키거나 비만을 지연시키는 모든 행위를 의미한다. 또한 본 명세서에서 기재된 '치료' 또는 '개선'은 본 발명에 따른 조성물의 제공으로 비만 증상이 호전되게 변경되는 모든 행위를 의미한다.

일 양태로, 본 발명은 지방세포 분화 억제용 조성물에 관한 것으로, 비쑥(Artemisia scoparia)을 비극성용매 및 극성용매로 추출한 비쑥 추출물 또는 이의 비쑥 분획물을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 한다.

관련하여, 비쑥 추출물은 비쑥의 전초를 비극성용매로 추출하여 비극성용매 추출물을 수득하고, 비쑥을 극성용매로 추출하여 극성용매 추출물로 수득하여 비극성용매 추출물과 극성용매 추출물을 혼합하여 제조될 수 있다.

비극성용매와 극성용매를 함께 사용하여 비쑥을 추출하는 이유는, 극성용매로만 추출하게 되면 비쑥의 유용성분이 100% 추출되지 않을 수 있기 때문에 세포벽면을 다 녹여 유기성분을 모두 추출할 수 있는 비극성용매인 디클로로메탄을 함께 사용하는 것이 바람직하다.

비극성용매와 극성용매는 서로 섞일 수 있는 성질로써, 비극성용매로 추출할 때 극성이 함께 딸려올 수도 있기 때문에 비극성용매 추출물과 극성용매 추출물을 혼합하여 조추출물(Crude Extract)인 비쑥 추출물을 형성하는 것이 바람직하다.

단, 비극성용매는 디클로로메탄(dichloromethane, CH₂Cl₂)일 수 있으며, 극성용매는 메탄올(methanol, CH₃OH) 및 에탄올(ethanol, C₂H₅OH) 중 어느 하나 이상일 수 있다.

한편, 비쑥 분획물은 상술한 바와 같이 제조된 비쑥 추출물을 디클로로메탄과 물을 이용해 디클로로메탄층과 물층으로 분리한 후, 디클로로메탄층을 농축한 다음 n-헥산(n-hexane) 및 85% 메탄올(85% aq.MeOH)로 분획하고, 물층을 농축한 다음 n-부탄올(n-BuOH) 및 물(H₂O)로 분획함으로써 얻은 n-헥산 분획물, 85% 메탄올 분획물, n-부탄올 분획물 및 물 분획물 중 어느 하나 이상일 수 있다.

즉 비쑥 분획물은 물 또는 유기용매를 이용하여 순차적으로 분획한 것으로, 비쑥 추출물을 디클로로메탄과 물을 이용해 디클로로메탄층과 물층으로 분리한 후, 디클로로메탄층을 농축한 다음 n-헥산(n-hexane) 및 85% 메탄올(85% aq.MeOH)로 분획하고, 물층을 농축한 다음 n-부탄올(n-BuOH) 및 물(H₂O)로 분획함으로써, 이로부터 얻은 n-헥산 분획물, 85% 메탄올 분획물, n-부탄올 분획물 및 물 분획물 중 어느 하나 이상인 비쑥 분획물을 제조할 수 있게 된다. 참고로, 본 발명의 지방세포 분화 억제용 조성물은 식용으로 활용되는 비만의 예방 또는 개선용 항비만 건강기능식품에 적용될 수 있기 때문에 비쑥을 주정인 에탄올(ethyl alcohol, ethanol)만을 사용하여 추출도 가능하다.

다른 양태로, 본 발명은 지방세포 분화 억제용 조성물에 관한 것으로, 비쑥을 비극성용매 및 극성용매로 추출한 비쑥 추출물 또는 이의 비쑥 분획물로부터 분리되는 화합물로써, 하기 화학식 1 및 화학식 2로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 화합물을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 한다.

[화학식 1]

[화학식 2]

화학식 1은 레이노신(reynosin)이고, 화학식 2는 산타마린(santamarine)으로써, 레이노신, 산타마린으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 화합물은 비쑥 분획물 중에서 85% 메탄올 분획물을, 메탄올과 물의 혼합용액을 이용하여 역상 진공 크로마토그래피하여 크로마토그래피 분획물을 수득하고, 이에 대한 역상 HPLC를 하여 분리해 얻을 수 있다.

이때 화합물 1은 MAPK(mitogen-activated protein kinase) 및 AMPK(adenosine monophosphate-activated protein kinase) 신호전달 경로의 조절을 통해 지방전구세포의 지방세포 분화를 억제하고, 화합물 2는 JNK(c-Jun amino-terminal kinases) 및 p38 MAPK 신호전달 경로의 조절을 통해 지방전구세포의 지방세포 분화를 억제할 수 있다.

또 다른 양태로, 본 발명은 비만의 예방 또는 개선용 항비만 건강기능식품에 관한 것으로, 비쑥 추출물, 이의 분획물 또는 이로부터 분리되는 화학식 1 및 화학식 2로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 화합물을 유효성분으로 하는 지방세포 분화 억제용 조성물을 포함하는 것을 특징으로 한다.

관련하여, 건강기능식품은 음료, 환, 정제(tablet), 캡슐(capsule) 및 산제 중에서 선택된 어느 하나로 제조되거나, 경우에 따라 다른 식품 또는 식품의 성분에 첨가하여 제조될 수 있으며, 통상적인 방법에 따라 적절하게 제조될 수 있다. 이러한 건강기능식품은 영양제, 비타민 및 천연 풍미제 등의 첨가제를 추가로 투입하여 제조될 수 있다.

이하, 본 발명의 실시예를 더욱 상세하게 설명하면 다음과 같다. 단, 이하의 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위하여 예시하는 것일 뿐, 이에 의하여 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 비쑥 추출물, 이의 분획물의 제조

도 1은 본 발명에 따른 비쑥 추출물, 이의 분획물의 제조방법을 순서도로 나타낸 것으로, 도 1에서와 같이 건조된 비쑥 시료를 추출하기 위하여 methylene chloride에 담그고 24시간 방치한 후 여과하였다. 이 과정을 2번 반복하였으며, 얻어진 추출액은 40℃ 수욕 상에서 진공 증발기로 농축하였다. Methylene chloride로 추출하고 남은 잔사에 동량의 methanol(MeOH)을 첨가하여 상술한 바 있듯이 동일한 과정을 반복하여 추출물을 얻었다. 두 용매로 추출한 양을 합하여 얻어진 조추출물(Crude Extract) 34.9g을 용매 극성에 따라 순차적으로 분획하여, n-hexane, 85% aq.MeOH, n-butanol(n-BuOH), 물(water) 분획물을 각각 5.38g, 6.80g, 6.46g 및 17.23g을 얻었다.

<실시예 2> 비쑥 분획물로부터 화합물의 분리

도 2는 본 발명에 따른 비쑥으로부터 세스퀴테르페노이드(sesquiterpenoid)의 분리방법을 순서도로 나타낸 것으로, 도 2를 참조하면, 실시예 1에서의 85% aq.MeOH 분획층 2.52g을 MeOH과 물의 혼합용액(50, 60, 70, 80, 90% aq.MeOH 그리고 100% MeOH)을 이용하여 C18 역상 진공 크로마토그래피를 실시하였으며, 6개의 크로마토그래피 분획(Rfc 1~6)을 얻었다.

그중 70% aq.MeOH 분획물(Fr3, 0.070g)에 대한 역상 HPLC(YMC-A, 2 ㎖/min, 60% aq.MeOH)를 실시하여 모두 5개의 피크를 얻었으며 화합물 1과 화합물 2 각각을 11.2mg과 15.0mg로 얻었다.

<시험예 1> 비쑥으로부터 활성성분의 구조 분석 시험

1-1. 화합물 1 및 화합물 2의 분리 정제

실시예 2의 화합물 1 및 화합물 2로부터 효능 성분의 분리 정제 및 구조 결정을 확인해 보았다.

1-2. 화학식 1로 표시되는 화합물 1의 구조 분석

화합물 1은 무정형의 흰색 고체로 얻어졌으며, 하기 표 1에 비쑥으로부터 분리된 화합물 1에 대한 ¹H 및 ¹³C NMR 스펙트럼 데이터를 확인활 수 있다.

Position	δ_H	δ_C
1	3.49(1H, dd, J = 11.6, 4.5Hz)	78.8
2	1.80, 1.56(1H, m)	32.1
3	2.32(1H, ddd, J = 13.5, 4.9, 1.8Hz), 2.15(1H, td, J = 13.5, 5.1)	34.8
4	-	145.1
5	2.24(1H, br d, J = 10.9 Hz)	54.1
6	4.10(1H, t, J = 10.9Hz)	81.5
7	2.61(1H, tdd, J = 11.2, 3.1, 3.0Hz)	50.7
8	2.08, 1.60(1H, m)	22.4
9	2.05(1H, m), 1.38(1H, td, J = 13.3, 3.8)	36.9
10	-	44.2
11	-	141.3
12	-	171.7
13	6.00(1H, d, J = 3.1Hz), 5.49(1H, d, J = 3.0Hz)	117.3
14	0.80(3H, s)	12.0
15	4.95, 4.79(1H, s)	110.2
Measured in CD₃OD at 600 and 150 MHz, respectively. Assignments were aided by ¹H COSY, gHSQC and gHMBC experiments.

표 1을 참조하면, 화합물 1의 ¹H NMR 스펙트럼은 1개의 tertiary methyl(δ 0.80, s), 2개의 oxymethines(δ 4.10, t, J = 10.9Hz; δ 3.49, dd, J = 11.6, 4.5Hz) 및 2개의 exomethylenes[(δ 6.00, d, J = 3.1Hz; δ 5.49, d, J = 3.0Hz) 그리고 4.95, s; δ 4.79, s)]기의 존재를 보여 주었다.

¹³C NMR과 HSQC 스펙트럼은 하나의 ester carbonyl 탄소, 4개의 이중결합 탄소들(2개의 methylenes와 2개의 4차 탄소들), 2개의 oxymethine 탄소들, 8개의 지방족 탄소들(1개의 methyl, 4개의 methylenes, 2개의 methines, 그리고 하나의 4차 탄소)를 포함하여 15개의 탄소원자들이 존재함을 보여 주었다.

특히, ¹H과 ¹³C NMR 스펙트럼에서 δ_H 6.00(1H, d, J = 3.1Hz), δ_H 5.49(1H, d, J = 3.0 Hz), δ_H 4.10 (1H, t, J = 10.9 Hz), δ_C 171.7, δ_C 141.3, δ_C 117.3 및 δ_C 81.5에 존재하는 신호들은 α-exomethylene-γ-lactone의 존재함을 나타내었다.

HMBC 실험에서 δ_C 171.7(C-12)과 δ_H 6.00(H-13) 및 5.49(H-13) 사이의 correlation, 그리고 δ_C 141.3(C-11)과 δ_H 5.49(H-13) 사이의 correlation도 이 해석을 지지하였다. 상술한 데이터를 근거로 문헌조사를 한 결과 화합물 1은 Laurus nobilis, Costus speciosus, Diaspananthus uniflorus 및 Magnolia grandiflora에서 분리되었던 reynosin이라는 것이 확인되었다. 화합물 1의 NMR 스펙트럼 데이터는 문헌에 알려진 데이터와 잘 일치하였다.

1-3. 화학식 2로 표시되는 화합물 2의 구조 분석

화합물 2도 무정형의 흰색 고체로 분리되었으며, 하기 표 2에 비쑥으로부터 분리된 화합물 2에 대한 ¹H 및 ¹³C NMR 스펙트럼 데이터를 확인할 수 있다.

Position	δ_H	δ_C
1	3.61(1H, dd, J = 10.1, 6.7Hz)	75.8
2	2.32, 1.97(1H, m)	33.5
3	-	122.8
4	-	134.6
5	2.39(1H, d, J = 11.1Hz)	52.4
6	4.01(1H, t, J = 11.1Hz)	83.5
7	2.57(1H, tdd, J = 11.2, 3.1, 3.0Hz)	52.2
8	2.09, 1.66(1H, m)	22.1
9	2.02(1H, dt, J = 13.2, 3.4), 1.33(1H, td, J = 13.2, 3.3Hz)	35.6
10	-	42.2
11	-	141.0
12	-	172.8
13	6.00(1H, d, J = 3.2Hz), 5.36(1H, d, J = 3.1Hz)	117.1
14	0.87(3H, s)	11.4
15	1.81(3H, s)	23.6
Measured in CD3OD at 600 and 150 MHz, respectively. Assignments were aided by ¹H COSY, gHSQC and gHMBC experiments.

표 2를 참조하면, 화합물 2의 ¹H과 ¹³C NMR 스펙트럼은 화합물 1에 대해서 얻어진 것과 상당히 유사하였다.

하지만 ¹H NMR에서 유의적인 차이점들이 나타났다. 화합물 1의 δ 4.95(1H, s, H-15)와 4.79(1H, s, H-15)에서 나타났던 exomethylene 수소 피크들이 사라진 반면에 δ 5.36(1H, m, H-3)와 1.81(3H, s, H-15)에서 olefinic methine과 methyl 신호들이 나타났다. 대응하는 변화가 ¹³C NMR 스펙트럼에서도 발견되었다. 화합물 1의 δ 112에 나타났던 exomethylene 탄소신호가 사라진 대신에 δ 122.8과 22.1에 새로운 olefinic methine과 methyl 탄소신호들이 발견되었다. 이는 화합물 1의 exomethylene 탄소들인 C-4와 C-15 사이의 이중결합이 다른 위치로 이동하였음을 강하게 의미한다. 이동된 이중결합의 새로운 위치는 ¹H-¹H COSY, HSQC 및 HMBC와 2-D NMR 실험에 의하여 C-3와 C-4인 것으로 결정되었다. 문헌조사결과 이 화합물은 santamarine으로 확인되었으며, NMR 데이터는 문헌에 보고된 데이터와 잘 일치하였다.

이와 같은 화합물 1과 화합물 2는 현재까지 비쑥에서 분리된 바가 없으며, 본 발명을 통하여 처음으로 분리되었다.

<시험예 2> 항비만 효능 시험

2-1. 비만 효능 평가 선정

건강기능식품 기능성 평가 가이드 중 '체지방 감소에 도움'편에 명시되어 있는 바이오마커를 확인하고 시료의 바이오마커를 선정하기 위하여 효능을 검토하였다.

지방세포 분화/지방세포 크기 및 수를 측정하여 기능성을 평가할 수 있으며, 마우스 3T3-L1 지방전구세포를 지방세포로 분화를 유도하여 세포내 생성된 지방구를 Oil Red O 염색법을 이용하여 확인하였으며 지방세포의 크기 및 수를 측정함으로써, 체지방 축적 억제효능을 확인하였다. 그리고 에너지대사 조절 관여 호르몬인 leptin의 발현을 단백질 수준에서 관찰하였다.

2-2. 비만 효능 평가 방법

(1) 세포 배양 및 지방세포로의 분화 유도

3T3-L1 지방전구세포는 American Type Culture Collection(ATCC, Manassas, VA, USA)에서 구입하였으며, 10% fetal bovine serum(FBS)이 함유된 Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM)을 사용하여 37℃, 5% CO₂ incubator에서 배양하였다. 일주일에 2~3회 배지를 교환하였으며, 3~4일 후 세포가 confluent하게 되면 0.05% Trysin/EDTA를 처리하여 세포를 분리하여 실험에 사용하였다.

분리된 세포는 세포밀도가 3.3×10³cell/㎠인 suspension 용액을 만들어 6 well plate에 분주하였다. 세포가 confluent되고 2일 후에 5㎍/㎖의 insulin, 0.25μM dexamethazone, 0.5mM IBMX(methylisobutylxanthine)가 첨가된 배지와 함께 시료를 처리하여 분화를 유도하였다. 이틀 후, 5μg/㎖의 insulin만 포함된 배지로 교체하여 8일간 분화를 유도한 후 실험에 사용하였다.

(2) Cell viability 측정

시료가 3T3-L1 지방전구세포 생존에 미치는 영향을 확인하기 위하여 MTT assay를 수행하였다. 배양된 3T3-L1 지방전구세포를 96 well microplate에 2×105 cell/㎖로 100㎕씩 분주하여 37℃의 5% CO₂ incubator에서 24시간 배양하였다. 배지를 교체하고 시료를 농도별로 첨가하여 24시간 동안 배양한 후, 1mg/㎖의 MTT시약을 처리하였으며 형성된 formazan은 DMSO에 녹여 540nm에서 microplate reader(Tecan Austria GmbH, Austria)기로 측정하여 세포생존율을 확인하였다.

(3) Oil Red O 염색

3T3-L1 지방전구세포의 지방세포로의 분화능은 Oil Red O 염색법을 사용하여 확인하였다. 분화된 세포는 phosphate buffered saline(PBS)로 세척하여 3.7% formaldehyde로 1시간 동안 실온에서 방치하였다. 고정된 세포는 PBS로 세척하고 Oil Red O solution(0.5% w/v, 60% isopropanol과 40% 증류수)을 처리하여 실온에서 1시간 동안 염색하였다. 염색액을 제거하고 PBS로 세척한 후 세포내 지방구 생성 정도를 현미경으로 관찰하였으며, 정량적 분석을 위하여 지방구에 염색되어 있는 Oil Red O 시약을 100% isopropanol으로 용해하여 500nm에서 흡광도를 측정하였다.

(4) 비만관련 유전자의 발현 변화 검토

각각의 시료에 대한 비만 관련 유전자의 mRNA 발현 정도는 RT-PCR을 이용하여 확인하였으며, housekeeping 유전자인 β-actin을 internal control로 사용하였다. 관련하여, 하기 표 3에 RT-PCR에 사용되는 프라이머 서열을 나타내었다.

Primer		Sequence
PPARγ	Forward	5'-TTT-TCA-AGG-GTG-CCA-GTT-TC-3'
PPARγ	Reverse	5'-AATCCT-TGG-CCC-TCT-GAG-AT-3'
SREBP1c	Forward	5'-TGT-TGG-CAT-CCT-GCT-ATC-TG-3'
SREBP1c	Reverse	5'-AGGGAA-AGC-TTT-GGG-GTC-TA-3'
C/EBPα	Forward	5'-TTA-CAA-CAG-GCC-AGG-TTT-CC-3'
C/EBPα	Reverse	5'-AAG-GAA-GGC-TGG-AAA-AGA-GC-3'
β-actin	Forward	5'-CCA-CAG-CTG-AGA-GGG-AAA-TC-3'
β-actin	Reverse	5'-AAG-GAA-GGC-TGG-AAA-AGA-GC-3'

(5) 비만관련 유전자의 단백질 발현량 검토

지방분화 관련 유전자의 단백질 변화 및 신호전달 기전 연구는 Western blot을 이용하여 검토하였다.

(6)통계분석

각각의 실험 결과들의 유의성을 검증하기 위하여 분산분석(ANOVA)을 실행한 후, p<0.05 수준에서 Ducan's multiple range test를 실시하였으며, 그 결과는 평균(Mean) ± 표준편차(Standard deviation, SD)로 표시하였다. 모든 통계분석은 Statistic Analysis System v9.2(SAS Institute Inc., NC, USA) 통계프로그램을 이용하였다.

<시험예 3> 비쑥 추출물의 3T3-L1 지방세포 분화 조절효과

3-1. 비쑥 추출물이 3T3-L1 세포 생존에 미치는 영향

비쑥 추출물에 대한 지방분화 억제 효과를 평가하기 위하여 전구지방세포인 3T3-L1을 사용하였다. 지방분화 억제 효과를 확인하기 전, 추출물이 3T3-L1 세포 생존에 미치는 영향을 확인하기 위하여 MTT assay를 수행하였다.

관련하여, 도 3은 본 발명에 따른 3T3-L1 세포에 대한 비쑥 추출물의 세포 독성 효과를 그래프로 나타낸 것으로, 데이터는 세 가지 개별 실험의 평균 ± SD를 나타내었다. 도 3을 참조하면, 비쑥 추출물을 처리한 결과 시료를 첨가하지 않은 대조군과 비교 시, 10, 25, 50 및 100㎍/㎖의 농도에서 104.0, 100.3, 97.1 및 94.4%의 세포 생존율을 보였다. 90% 이상의 세포 생존율을 나타낸 100㎍/㎖ 이하의 농도에서 비쑥 추출물의 지방분화 억제 효과를 확인하였다.

3-2. 비쑥 추출물이 3T3-L1 지방세포 분화 조절에 미치는 효과

비쑥 추출물이 3T3-L1 지방전구세포의 지방세포 분화 및 지질 축적 억제 효과를 확인하기 위하여 Oil Red O 염색법을 사용하여 지방구 생성정도를 관찰하였다.

관련하여, 도 4는 본 발명에 따라 분화된 3T3-L1 세포의 세포내 지질 축적에 대한 비쑥 추출물의 효과를 그래프로 나타낸 것으로, 데이터는 세 가지 개별 실험의 평균 ± SD를 나타내었다. 도 4를 참조하면, 분화유도배지를 이용하여 지방세포로의 분화를 유도한 대조군의 경우, 지방세포로 분화를 유도하지 않은 세포에 비하여 세포내 지방구의 생성이 매우 증가하였다. 분화유도와 함께 비쑥 추출물을 10, 50 및 100㎍/㎖ 농도로 처리한 결과, 시료를 처리하지 않은 대조군에 비하여 농도 의존적으로 88.0, 85.8 및 81.1%로 세포내 지방구의 생성이 억제되는 것을 확인하였다.

3-3. 비쑥 추출물이 mRNA 및 단백질 수준에서 지방분화 전사인자 발현에 미치는 영향

지방전구세포의 분화는 전사인자와 효소 등의 복잡한 신호전달 단계에 의해 조절되고 활성화되는데, 특히 C/EBPα, PPARγ 및 SREBP1c 세 가지 전사인자가 중요한 역할을 한다. 분화과정초기에 C/EBPδ와 C/EBPβ가 활성화되어 PPARγ의 활성을 증가시키게 되며 이어 C/EBPα를 활성화 시켜 지방세포로의 분화를 완성하게 된다. 또한 SREBP1c 지방산 대사와 밀접하게 관련되어 있어 지방세포로의 분화유도를 촉진한다. 비쑥 추출물에 대한 지방세포 분화 억제 효과는 RT-PCR과 Western blotting을 이용하여 PPARγ, C/EBPα, SREBP1c의 mRNA와 단백질 발현을 분석하였다.

관련하여, 도 5는 본 발명에 따른 비쑥 추출물이 주요 지방 생성 전사인자의 발현에 미치는 영향을 그래프로 나타낸 것으로, 데이터는 세 가지 개별 실험의 평균 ± SD를 나타내었다. 도 5(a)는 분화초기단계에서 비쑥 추출물을 농도별(10, 50 및 100㎍/㎖)로 처리한 것이고, 도 5(b)는 지방세포 분화 억제 효과를 관찰한 것이다.

즉 분화초기단계에서 비쑥 추출물을 농도별(10, 50, 100 μg/mL)로 처리하였으며, 분화 완료 후 지방세포 분화 억제 효과를 관찰하였는 바, 분화를 유도하지 않은 대조군에 비하여 분화를 유도한 대조군에서 PPARγ, C/EBPα, SREBP1c의 mRNA와 단백질의 발현이 매우 높게 증가하였다. 분화 유도와 함께 비쑥 추출물을 처리한 경우, PPARγ, C/EBPα, SREBP1c의 발현이 감소됨을 확인하였다.

3-4. 비쑥 추출물의 지방분화 억제 효과에 따른 작용기전

비쑥 추출물의 지방분화 억제 효과에 대한 세포내 신호전달 경로를 확인하기 위하여 MAPK(mitogen activated protein kinase)의 신호전달 경로를 확인하였다. MAPK는 subfamily인 extracellular signal-regulated kinases(ERKs), c-Jun amino-terminal kinases(JNKs), p38 MAPK(p38) 등이 있으며, 세포막에서 핵으로 특이적이고 개별적인 인산화 반응을 통해 세포내 여러 가지 반응이 일어나도록 한다. 인산화된 MAPKs는 PPARγ를 인산화시켜 활성을 억제하고 C/EBPs의 발현을 감소시켜 지방세포로의 분화를 억제하게 된다.

도 6은 본 발명에 따른 비쑥 추출물이 3T3-L1 세포에서 MAPK 경로의 단백질 수준에 미치는 영향을 그래프로 나타낸 것이다. 도 6을 참조하면, 지방세포로의 분화과정 동안 인산화된 ERK, JNK, p38(pERK, pJNK, pp38)의 발현이 증가되었으며 비쑥 추출물을 처리 시, pERK, pJNK, pp38의 발현이 농도 의존적으로 감소되는 것을 확인하였다. 비쑥 추출물이 지방세포로의 분화 과정 동안 MAPKs의 인산화를 막음으로써 PPARγ 및 C/EBPα의 발현을 감소시켜 지방세포로의 분화를 억제할 수 있음을 알 수 있었다.

<시험예 4> 비쑥 분획물의 3T3-L1 지방세포 분화 조절효과

4-1. 비쑥 분획물이 3T3-L1 세포 생존에 미치는 영향

비쑥 분획물이 3T3-L1 세포 생존에 미치는 영향을 확인해 보았다. 비쑥 추출물에서 3T3-L1 세포의 지방분화 억제 효과를 바탕으로 용매 분획을 통하여 4종의 용매 분획물 H₂O, n-BuOH, 85% aq.MeOH, n-hexane층을 획득한 바 있다. 분획물의 지방분화 억제 효과를 평가하기 전에 시료가 3T3-L1 세포 생존에 미치는 영향을 확인하기 위하여 MTT assay를 수행하였다.

관련하여, 도 7은 본 발명에 따른 3T3-L1 세포에 대한 비쑥 분획물의 세포 독성 효과를 그래프로 나타낸 것으로, 4종의 비쑥 분획물을 10, 25, 50, 100㎍/㎖의 농도로 처리하고 시료를 첨가하지 않은 대조군과 비교하여 백분율로 나타내었다.

도 7(a)를 참조하면, H₂O층 처리 결과, 101.8, 97.1, 98.1, 90.8%의 세포 생존율을 보였으며, 도 7(b)를 참조하면, n-BuOH층에서는 105.1, 103.6, 91.5, 90.7%, 도 7(d)를 참조하면, n-hexane층에서는 106.2, 108.8, 101.9, 96.8%로 100㎍/㎖의 농도에서도 3T3-L1 세포가 90% 이상 생존하는 것을 확인하였다.

반면 도 7(c)를 참조하면, 85% aq.MeOH층은 시료의 농도가 증가할수록 3T3-L1 세포의 생존율이 98.0, 94.1, 59.8, 5.3%로 감소되었다. 85% aq.MeOH층의 세포 독성을 고려하여 90% 이상의 세포 생존율을 나타내는 농도인 25㎍/㎖ 이하의 농도에서 지방분화 억제 효과를 확인하였다.

4-2. 비쑥 분획물이 3T3-L1 지방세포 분화 조절에 미치는 효과

비쑥 추출물 및 분획물이 3T3-L1 지방전구세포의 지방세포 분화 및 지질 축적 억제 효과를 확인하기 위하여 Oil Red O 염색법을 사용하여 지방구 생성정도를 관찰하였다.

관련하여, 도 8 및 도 9는 본 발명에 따라 분화된 3T3-L1 세포의 세포내 지질 축적에 대한 비쑥 분획물의 효과를 그래프로 나타낸 것으로, 데이터는 세 가지 개별 실험의 평균 ± SD를 나타내었다.

도 8 및 도 9를 참조하면, 분화유도배지를 이용하여 지방세포로의 분화를 유도한 대조군의 경우, 지방세포로의 분화를 유도하지 않은 세포에 비하여 세포내 지방구의 생성이 매우 증가한 것을 확인하였다.

분화유도와 함께 4종의 분획물을 1, 10, 25㎍/㎖의 농도로 처리한 결과, 도 8(a)에서와 같이 H₂O층은 80.5, 87.6, 72.1%, 도 8(b)에서와 같이 n-BuOH층은 81.7, 69.8, 63.0%, 도 9(a)에서와 같이 85% aq.MeOH층은 87.8, 71.2, 42.0%, 도 9(b)에서와 같이 n-hexane층은 82.1, 68.8, 62.7%로 농도 의존적으로 지방세포로의 분화된 3T3-L1의 세포내 지방구 형성을 억제하였다. 특히, 도 9(a)의 85% aq.MeOH층은 25㎍/㎖의 농도에서 50% 이상의 지방구 형성을 억제하는 것을 확인하였다.

4-3. 비쑥 분획물이 mRNA 및 단백질 수준에서 지방분화 전사인자 발현에 미치는 영향

관련하여, 도 10 내지 도 13은 본 발명에 따른 비쑥 분획물이 3T3-L1 지방세포에서 주요 지방 생성 전사인자(PPARγ, C/EBPα 및 SREBPlc)의 mRNA 및 단백질 발현 수준에 미치는 영향을 그래프로 나타낸 것이다. 도 10은 물(H₂O) 분획물, 도 11은 n-부탄올 분획물, 도 12는 85% aq.MeOH 분획물, 도 13은 n-헥산 분획물의 경우를 나타낸 것이다.

도 10 내지 도 13에 따른 각각의 (a)는 전사인자의 mRNA 수준에 대한 샘플의 효과를 RT-PCR로 분석한 것으로, mRNA 수준의 조절은 밴드의 밀도에 의해 정량화되고 하우스 키핑 유전자 β-액틴에 대해 정규화되었다. mRNA 수준에 대한 샘플의 효과는 완전히 분화된 미처리 대조군 세포의 백분율로써 제공되었다.

도 10 내지 도 13 각각의 (b)는 전사인자의 단백질 수준에 대한 샘플의 효과를 단백질흡입법(Western blotting)으로 분석한 것으로, 단백질 수준을 밴드의 밀도에 의해 정량화하고 하우스 키핑 단백질 β-액틴에 대해 정규화하였다. 단백질 수준에 대한 샘플의 효과는 완전히 분화된 미처리 대조군 세포의 백분율로써 제공되었다.

이러한 도 10 내지 도 13을 참조하면, 분화유도와 동시에 4종의 비쑥 분획물(H₂O, n-BuOH, 85% aq.MeOH, n-hexane)을 농도별(10, 50, 100㎍/㎖)로 처리하였으며, 지방분화 유도 8일 후 지방세포 분화 억제 효과를 관찰하였다. 4종의 비쑥 분획물 처리 결과, 시료를 처리하지 않은 adipocyte보다 시료를 첨가한 모든 분획물에서 지방세포 분화 전사인자인 PPARγ, C/EBPα, SREBP-1c의 mRNA 및 단백질 발현이 감소됨을 확인할 수 있었다. 특히, 85% aq.MeOH 분획물에서 지방세포 분화 전사인자가 농도 의존적으로 감소됨을 확인하였다.

4-4. 비쑥 분획물 중 85% 메탄올 분획물의 지방분화 억제 효과에 따른 작용기전

4종의 분획물 중 가장 활성이 좋았던 85% aq.MeOH 분획물의 지방분화 억제 효과에 대한 작용기전을 분석하기 위하여 MAPK 및 AMPK(5'-adenosine monophosphate-activated protein kinase) 신호전달 경로를 확인하였다. AMPK는 지방산의 합성과 분해를 매개함으로써 체내 에너지 항상성 유지에서 중요한 역할을 한다. 대사성 스트레스나 운동에 의해 세포내의 에너지가 감소하는 경우, 즉 ATP가 고갈되어 AMP/ATP 비율이 증가하는 경우에 활성화되어 ATP를 소비하는 과정(지방산과 콜레스테롤 합성)을 억제하고 ATP를 생산하는 과정(지방산 산화와 해당과정)을 촉진한다.

관련하여, 도 14는 본 발명에 따른 85% 메탄올 분획물이 3T3-L1 지방세포에서 MAPK 및 AMPK 경로의 단백질 수준에 미치는 영향을 그래프로 나타낸 것으로, 데이터는 세 가지 개별 실험의 평균 ± SD를 나타내었다.

도 14(a)를 참조하면, 완전히 분화된 adipocyte에서 pp38, pERK, pJNK의 단백질 발현이 증가하였으며 85% aq.MeOH 분획물을 처리한 결과, 농도 의존적으로 감소되었다. 도 14(b)를 참조하면, AMPK는 85% aq.MeOH 분획물을 처리한 결과 시료를 처리하지 않은 대조군보다 pAMPK의 발현이 증가되었다. 이러한 도 14에 따르면, 비쑥의 85% aq.MeOH 분획물의 지방세포로의 분화 억제 효과는 MAPKs와 AMPK 신호전달 기전과 관련이 있음을 확인할 수 있었다.

<시험예 5> 비쑥으로부터 분리된 화합물의 3T3-L1 지방세포 분화 조절효과

상술한 85% aq.MeOH 분획물의 지방세포 분화 억제 효능을 바탕으로 추가적인 분리 정제를 통해 활성성분을 분리하였으며 분리된 화합물의 지방세포 분화 억제효능을 시험해 보았다.

즉, 비쑥의 85% aq.MeOH 분획물로부터 분리된 2종의 화합물 reynosin과 santamarine의 지방분화 조절효과는 preadipocyte인 3T3-L1 세포를 이용하여 관찰하였으며 지방세포 분화 억제 효능을 가지는 genistein과 비교하여 상대적으로 효능을 평가하였다.

5-1. 비쑥 화합물이 3T3-L1 세포 생존에 미치는 영향

비쑥 화합물에 대한 지방분화 억제 효과를 평가하기 위하여 전구지방세포인 3T3-L1을 사용하였다. 지방분화 억제 효과를 확인하기 전, 2종의 화합물 reynosin, santamarine과 genistein이 3T3-L1 세포 생존에 미치는 영향을 확인하기 위하여 MTT assay를 수행하였다.

비쑥 화합물 및 genistein은 10, 20, 40, 60, 80μM 의 농도로 3T3-L1 세포에 처리하였으며, 그 결과는 본 발명에 따른 3T3-L1 세포에 대한 화합물의 세포 독성 효과를 그래프로 나타낸 도 15를 통해 확인된다. 도 15(a)는 화합물 1인 reynosin, 도 15(b)는 화합물 2인 santamarine, 도 15(c)는 genistein의 경우를 나타낸 것이다.

도 15(a)를 참조하면, reynosin의 경우, 시료를 첨가하지 않은 대조군과 비교 시, 낮은 농도순으로 101.4, 100.7, 100.8, 103.7, 91.4%의 세포 생존율을 보였다.

도 15(b)를 참조하면, santamarine의 경우, 102.0, 102.4, 103.4, 103.3, 85.9%의 세포 세존율을 나타냈으며, 도 15(c)를 참조하면, genistein은 104.3, 100.4, 97.4, 94.8, 92.2%로 나타났다. 단, 시료의 독성을 고려하여 60μM 이하의 농도에서 비쑥 화합물의 지방분화 억제 효과를 확인할 수 있었다.

5-2. 비쑥 화합물이 3T3-L1 지방세포 분화 조절에 미치는 효과

비쑥 화합물의 3T3-L1 지방전구세포의 지방세포 분화 및 지질 축적 억제 효과를 확인하기 위하여 Oil Red O 염색법을 통한 지방구 생성정도를 관찰하였다. 관련하여, 도 16은 본 발명에 따른 reynosin, santamarine 및 genistein이 Oil red O 염색으로 분화된 3T3-L1 지방세포의 지질 축적에 미치는 영향을 사진으로 나타낸 것이고, 도 17은 본 발명에 따라 분화된 3T3-L1 지방세포의 지질 축적에 대한 reynosin, santamarine 및 genistein의 효과를 그래프로 나타낸 것이다. 도 16 및 도 17을 참고하면, 각각의 시료는 20, 40, 60μM을 처리하였으며, 시료를 첨가하지 않고 분화를 유도한 대조군과 비교하여 백분율로 나타내었다.

도 17(a)의 reynosin을 처리한 경우, 농도 의존적으로 지방구의 형성이 감소되었으며, 지방구의 형성 정도는 91.9, 82.1, 45.0%로 나타났다. 도 17(b)의 santamarine의 처리 시, 농도 의존적으로 세포내 지방구의 형성이 감소되었으며, 96.4, 85.3, 47.6%로 나타났다. 도 17(c)를 참조하면 genistein을 처리한 결과, 99.5. 92.8, 86.7%로 세포내 지방구 형성이 감소되었다.

이러한 도 16과 도 17에 따르면, 60μM 농도에서 reynosin과 santamarine은 각각 45.0%와 47.6%를 나타냈으며, 이는 동일 농도에서 genistein의 86.7%보다 20% 이상 세포내 지방구 형성을 억제한 것을 의미한다. 40μM 농도에서도 reynosin과 santamarine은 각각82.1%와 85.3%를 나타냈으며, genistein의 92.8%보다 지방구의 형성을 억제하였음을 보여주었다. 분리된 2종의 화합물인 reynosin과 santamarine은 동일 농도에서 genistein보다 지방구 형성을 효과적으로 억제함을 확인할 수 있었다.

5-3. 비쑥 화합물이 mRNA 및 단백질 수준에서 지방분화 전사인자 발현에 미치는 영향

비쑥 화합물 및 genistein에 대한 지방세포 분화 억제 효과는 20, 40, 60μM의 농에서 관찰되었으며, qPCR과 Western blotting을 이용하여 PPARγ, C/EBPα, SREBP1c의 mRNA와 단백질 발현을 분석하였다.

도 18은 본 발명에 따른 reynosin이 3T3-L1 지방세포에서 주요 지방 생성 전사인자(PPARγ, C/EBPα 및 SREBPlc)의 mRNA 발현 수준에 미치는 영향을 그래프로 나타낸 것이다. reynosin을 처리한 경우, PPARγ, C/EBPα, SREBP1c의 mRNA 발현이 농도의존적으로 감소되는 것을 확인하였다(도 18(a), 도 18(b) 및 도 18(c) 참고).

또한 단백질 수준에서도 농도 의존적으로 감소하는 것을 확인하였으며, 이는 본 발명에 따른 reynosin이 3T3-L1 지방세포에서 주요 지방 생성 전사인자(PPARγ, C/EBPα 및 SREBPlc 및 leptin)의 단백질 발현 수준에 미치는 영향을 그래프로 나타낸 도 19를 통해 확인할 수 있다.

도 19를 참조하면, 지방세포에서 생산되는 호르몬으로써 에너지 섭취 및 소비 조절에 중요한 역할을 하는 leptin에 대한 단백질 발현 수준을 검토한 결과, 농도가 증가할수록 leptin의 분비가 증가함을 확인할 수 있었다.

도 20은 본 발명에 따른 santamarine이 3T3-L1 지방세포에서 주요 지방 생성 전사인자(PPARγ, C/EBPα 및 SREBPlc)의 mRNA 발현 수준에 미치는 영향을 그래프로 나타낸 것이다. santamarine을 처리한 경우, reynosin과 유사하게 PPARγ, C/EBPα, SREBP1c의 발현이 감소되었다(도 20(a), 도 20(b) 및 도 20(c) 참고).

또한 santamarine을 처리한 경우, leptin 단백질 발현이 증가되었으며, 이는 본 발명에 따른 santamarine이 3T3-L1 지방세포에서 주요 지방 생성 전사인자(PPARγ, C/EBPα 및 SREBPlc 및 leptin)의 단백질 발현 수준에 미치는 영향을 그래프로 나타낸 도 21을 통해 확인할 수 있다.

도 22는 비쑥의 genistein이 3T3-L1 지방세포에서 주요 지방 생성 전사인자(PPARγ, C/EBPα 및 SREBPlc)의 mRNA 발현 수준에 미치는 영향을 그래프로 나타낸 것이다. 도 22를 참조하면, genistein 처리 시, PPARγ, C/EBPα, SREBP1c의 mRNA 및 단백질 발현이 농도 의존적으로 감소되는 것을 확인할 수 있었다(도 22(a), 도 22(b) 및 도 22(c) 참고).

genistein 처리 시 leptin 단백질 또한 농도 의존적으로 증가하였으며, 이는 비쑥의 genistein이 3T3-L1 지방세포에서 주요 지방 생성 전사인자(PPARγ, C/EBPα 및 SREBPlc)의 단백질 발현 수준에 미치는 영향을 그래프로 나타낸 도 23을 통해 확인할 수 있다.

이러한 결과로부터, reynosin과 santamarine의 처리 시, 지방분화 전사인자인 PPARγ, C/EBPα, SREBP1c의 발현이 양성 대조군으로 사용된 genistein에 비해 발현이 상당히 감소된 것으로 확인된다.

5-4. 비쑥 화합물의 지방분화 억제 효과에 따른 작용기전

비쑥 화합물의 지방분화 억제 효과에 대한 세포내 신호전달 경로를 확인하기 위하여 60μM의 농도에서 MAPK 및 AMPK의 신호전달 경로를 확인해 보았다.

관련하여, 도 24는 본 발명에 따른 reynosin이 3T3-L1 지방세포에서 MAPK 및 AMPK 경로의 단백질 수준에 미치는 영향을 그래프로 나타낸 것이다. 도 24를 참조하면, reynosin의 처리 시, MAPKs 신호전달 경로를 관찰한 결과 인산화 형태의 pERK, pJNK, pp38의 발현이 시료를 처리하지 않은 대조군에 비해 감소됨이 확인되었다(도 24(a), 도 24(b) 및 도 24(c) 참고). 또한 도 24(d)를 참조하면, AMPK의 신호전달 경로에서는 pAMPK의 발현이 대조군에 비해 증가하였다.

도 25는 본 발명에 따른 santamarine이 3T3-L1 지방세포에서 MAPK 및 AMPK 경로의 단백질 수준에 미치는 영향을 그래프로 나타낸 것이다. santamarine의 경우에는 도 25(c)의 pJNK, 도 25(a)의 pp38의 발현이 시료를 처리하지 않은 대조군에 비해 감소되었지만, 도 25(b)의 pERK는 대조군에 비해 증가되었다. 도 25(d)를 참조하면, AMPK의 신호전달 경로에서는 pAMPK의 발현이 대조군에 비해 증가하였다.

이에 따라 비쑥으로부터 분리된 reynosin의 지방분화 억제 효과는 MAPKs와 AMPK 경로에 의해서 일어나며, santamarine의 지방분화 억제 효과는 JNK/p38 MAPK와 AMPK의 신호경로를 통해서 일어난다.

상술한 실시예 및 시험예로부터, 비쑥의 항비만 효능 검증 결과, 비쑥 추출물과 비쑥 분획물에서 세포내 지질 축적 및 지방분화 전사인 PPARγ, C/EBPα, SREBP1c의 mRNA 및 단백질 발현을 효과적으로 억제할 수 있음을 알 수 있다.

특히 85% aq.MeOH 분획물이 가장 높은 지방세포 분화 억제 효능이 있고, 이들은 MAPKs 및 AMPK 신호전달 기전을 통해서 지방세포로의 분화를 억제할 수 있게 된다.

활성이 가장 좋았던 85% aq.MeOH 분획물로부터 분리한 2종의 화합물 reynosin과 santamarine은 항비만 효능을 가지는 genistein보다 동일 농도에서 효과적으로 세포내 지질 축적을 억제하고 PPARγ. C/EBPα, SREBP1c의 mRNA 및 단백질의 발현을 억제함으로써 항비만 효능 성분으로의 가능성이 있음을 알 수 있다.

따라서 본 발명에 따르면, reynosin과 santamarine 화합물의 분자생물학적 작용기전 분석에서 MAPK와 AMPK의 신호전달 경로를 통해 지방세포로의 분화를 억제하는 것을 확인한 바, 비쑥 추출물, 85% aq.MeOH 분획물 및 화합물 모두 MAPKs와 AMPK와 같은 동일한 기전을 통해 지방세포 분화 억제 효능을 가질 수 있다는 점에 큰 의미가 있다.

이상의 설명은 본 발명의 기술 사상을 예시적으로 설명한 것에 불과한 것으로, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 다양한 수정 및 변형이 가능할 것이다. 따라서 본 발명에 개시된 실시예는 본 발명의 기술 사상을 한정하기 위한 것이 아니라, 설명하기 위한 것이고, 이러한 실시예에 의하여 본 발명의 기술 사상의 범위가 한정되는 것도 아니다. 본 발명의 보호 범위는 특허청구범위에 의하여 해석되어야 하며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 기술사상은 본 발명의 권리범위에 포함되는 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims

비쑥(Artemisia scoparia)을 비극성용매 및 극성용매로 추출한 비쑥 추출물 또는 이의 비쑥 분획물로부터 분리되는 화합물로써,
하기 화학식 1 및 화학식 2로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 화합물을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는, 비만의 예방 또는 개선용 지방세포 분화 억제 조성물:
[화학식 1]

[화학식 2]
제1항에 있어서,
상기 화합물은, MAPK(mitogen-activated protein kinase) 및 AMPK(adenosine monophosphate-activated protein kinase) 신호전달 경로의 조절을 통해 지방전구세포의 지방세포 분화를 억제하는 것을 특징으로 하는, 비만의 예방 또는 개선용 지방세포 분화 억제 조성물.
비쑥(Artemisia scoparia)을 비극성용매 및 극성용매로 추출한 비쑥 추출물 또는 이의 비쑥 분획물로부터 분리되는 화합물로써,
하기 화학식 1 및 화학식 2로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 화합물을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는, 비만의 예방 또는 개선용 건강기능식품:
[화학식 1]

[화학식 2]
제3항에 있어서,
상기 화합물은, MAPK(mitogen-activated protein kinase) 및 AMPK(adenosine monophosphate-activated protein kinase) 신호전달 경로의 조절을 통해 지방전구세포의 지방세포 분화를 억제하는 것을 특징으로 하는, 비만의 예방 또는 개선용 건강기능식품.
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