JP2024058887A - プラズマローゲン産生促進用培地、プラズマローゲン含有組成物の製造方法及びプラズマローゲンの製造方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】乳酸菌におけるプラズマローゲンの産生を促進することができるプラズマローゲン産生促進用培地、プラズマローゲン含有組成物の製造方法及びプラズマローゲンの製造方法を提供する。【解決手段】プラズマローゲン産生促進用培地は、炭素源であるラクトースを含み、乳酸菌の培養に使用される。【選択図】図２
Description
本発明は、プラズマローゲン産生促進用培地、プラズマローゲン含有組成物の製造方法及びプラズマローゲンの製造方法に関する。
プラズマローゲンは、抗酸化作用を有するリン脂質の一種で、グリセロリン脂質の一つである。プラズマローゲンは哺乳動物の全ての組織に存在し、人体のリン脂質の約１８％を占める。特に、プラズマローゲンは、脳神経、心筋、骨格筋、白血球及び精子に多いことが知られている。
プラズマローゲンの多くは、ドコサヘキサエン酸及びアラキドン酸等の多価不飽和脂肪酸と結合しているため、多価不飽和脂肪酸の貯蔵、及びこれら多価不飽和脂肪酸から産生されるプロスタグランジン及びロイコトリエン等の細胞間シグナルの２次メッセンジャーの放出等に関与する。さらにプラズマローゲンは、細胞融合及びイオン移送等に関与している。プラズマローゲンのビニルエーテル結合（アルケニル結合）が特に酸化ストレスに敏感であるため、プラズマローゲンは細胞の抗酸化機能も果たしている。
さらに、プラズマローゲンは神経新生の促進作用、リポポリサッカロイド（ＬＰＳ）による神経炎症の抑制作用、及び脳内アミロイドβ（Ａβ）タンパクの蓄積の抑制作用等を有することが知られている。例えば、特許文献１には、プラズマローゲンを含む抗中枢神経系炎症剤が開示されている。
プラズマローゲンは、認知症、パーキンソン病、うつ病及び統合失調症等の脳神経病の他、糖尿病、メタボリックシンドローム、虚血性心疾患、感染症及び免疫異常において減少していることが知られている。例えば、非特許文献１において、アルツハイマー病の脳でエタノールアミン型プラズマローゲンが前頭葉と海馬とで非常に有意に減少していることが報告された。さらに非特許文献２では、アルツハイマー病患者の血清でプラズマローゲンが減少していることが報告されている。非特許文献３では、虚血性心疾患の患者群において、コリン型プラズマローゲンが正常コントロール群に比べて減少していることが報告されている。
減少しているプラズマローゲンを外的に補充することにより、それら疾患の予防及び改善効果が期待できると考えられる。したがって、今後、疾患の予防及び治療、あるいは健康維持のためにプラズマローゲンの需要が高まることが予想される。
プラズマローゲンは、非脊椎動物及び脊椎動物には広く存在しているが、真菌及び植物細胞では確認されていない。細菌では、例えば非特許文献４に開示されたエンテロコッカス・フェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）及び特許文献２に開示されたビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ）等のいくつかの偏性嫌気性菌によるプラズマローゲンの合成が報告されているが、通性嫌気性細菌及び好気性細菌にはプラズマローゲンは見られない（非特許文献５参照）。
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細菌によってプラズマローゲンを生合成できれば、細菌の培養によって容易にプラズマローゲンを得ることができる。さらに、細菌におけるプラズマローゲン産生量を増加させることができれば、安価に大量のプラズマローゲンを得ることができる。
本発明は、上記実情に鑑みてなされたものであり、乳酸菌におけるプラズマローゲンの産生を促進することができるプラズマローゲン産生促進用培地、プラズマローゲン含有組成物の製造方法及びプラズマローゲンの製造方法を提供することを目的とする。
本発明者は、乳酸菌の培養に使用する培地の炭素源をラクトースとすることでプラズマローゲンの産生量が大きく増加することを見いだし、本発明を完成させた。
本発明の第１の観点に係るプラズマローゲン産生促進用培地は、
炭素源であるラクトースを含み、
乳酸菌の培養に使用される。
炭素源であるラクトースを含み、
乳酸菌の培養に使用される。
この場合、乳酸菌湿重量あたりの前記乳酸菌によるプラズマローゲン産生量が、前記ラクトースを含まない培地で培養した場合と比較して、少なくとも１．５倍である、
こととしてもよい。
こととしてもよい。
また、前記ラクトースとして、１０００ｍＬあたり３．０～１０．０ｇのラクトース一水和物を含む、
こととしてもよい。
こととしてもよい。
また、前記乳酸菌は、受領番号がＮＩＴＥ ＡＰ-０３７５９であるＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ Ｋ４株である、
こととしてもよい。
こととしてもよい。
本発明の第２の観点に係るプラズマローゲン含有組成物の製造方法は、
上記本発明の第１の観点に係るプラズマローゲン産生促進用培地で前記乳酸菌を培養する培養ステップを含む。
上記本発明の第１の観点に係るプラズマローゲン産生促進用培地で前記乳酸菌を培養する培養ステップを含む。
この場合、前記乳酸菌を処理して乳酸菌処理物を得る処理ステップをさらに含む、
こととしてもよい。
こととしてもよい。
本発明の第３の観点に係るプラズマローゲンの製造方法は、
上記本発明の第１の観点に係るプラズマローゲン産生促進用培地で前記乳酸菌を培養する培養ステップと、
前記乳酸菌からプラズマローゲンを得る取得ステップと、
を含む。
上記本発明の第１の観点に係るプラズマローゲン産生促進用培地で前記乳酸菌を培養する培養ステップと、
前記乳酸菌からプラズマローゲンを得る取得ステップと、
を含む。
本発明によれば、乳酸菌におけるプラズマローゲンの産生を促進することができる。
本発明に係る実施の形態について図面を参照して説明する。なお、本発明は下記の実施の形態及び図面によって限定されるものではない。なお、下記の実施の形態において、“有する”、“含む”又は“含有する”といった表現は、“からなる”又は“から構成される”という意味も包含する。
（実施の形態１）
本実施の形態に係るプラズマローゲン産生促進用培地は、炭素源であるラクトースを含み、乳酸菌の培養に使用される。
本実施の形態に係るプラズマローゲン産生促進用培地は、炭素源であるラクトースを含み、乳酸菌の培養に使用される。
ラクトースは、ガラクトース及びグルコースからなる二糖である。ラクトースは、本実施の形態に係るプラズマローゲン産生促進用培地中に単体として含まれていてもよいし、水和物又は他の形態として含まれていてもよい。ラクトースが当該培地中にラクトース一水和物として含まれている場合、培地１０００ｍＬあたり１．０～１５．０ｇ、好ましくは３．０～１０．０ｇ、さらに好ましくは４．５～５．５ｇのラクトース一水和物が含まれていてもよい。
本実施の形態に係るプラズマローゲン産生促進用培地に含まれる窒素源は、特に限定されないが、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、動物または植物由来の抽出物等であり、例えば、ペプトン、酵母抽出物、カゼイン、肉抽出物等の公知の乳酸菌用基本培地に含まれる窒素源等が挙げられる。基本培地は、例えば、ＧＹＰ培地、食品グレード培地、ＭＲＳ培地、ＢＣＰ培地、Ｍ１７培地、又はＴＹＧ培地等が挙げられる。
本実施の形態に係るプラズマローゲン産生促進用培地は、ラクトース及び窒素源以外に、塩類、脂質及びミネラル等の任意の他の成分をさらに含有してもよい。また、ラクトースの他に、別の糖等の炭素源をさらに含有してもよい。プラズマローゲン産生促進用培地に含み得る他の成分は、具体的には、酢酸ナトリウム、グルタミン酸ナトリウム、塩化ナトリウム、硫酸マグネシウム、硫酸マンガン、硫酸鉄、グルコース、グルコン酸、及びオレイン酸エステル等の公知の乳酸菌用基本培地に含まれる成分等が挙げられる。
本実施の形態に係るプラズマローゲン産生促進用培地は、乳酸菌の増殖及びプラズマローゲンの産生を阻害しない限り、任意の他の成分を含有し得る。また、当該培地が静置培養用の培地である場合には、寒天等を加えて固めてもよい。
本実施の形態に係るプラズマローゲン産生促進用培地の一例は、培地１０００ｍＬあたり、トリプトン１０ｇ、酵母抽出物５ｇ、ＮａＣｌ５ｇ、ラクトース一水和物５ｇを含む培地である。
本実施の形態に係るプラズマローゲン産生促進用培地の別の例は、培地１０００ｍＬあたり、カゼイン膵臓消化物５．０ｇ、大豆ペプトン５．０ｇ、牛肉抽出物５．０ｇ、酵母抽出物２．５ｇ、アスコルビン酸０．５ｇ、硫酸マグネシウム０．２５ｇ、β－グリセロリン酸二ナトリウム１９．０ｇ、ラクトース一水和物５．０ｇを含む培地である。
本実施の形態に係るプラズマローゲン産生促進用培地で培養される乳酸菌は、プラズマローゲンを産生するものであれば特に限定されないが、例えば、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、リューコノストック属（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）、ラクトコッカス属（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）及びペディオコッカス属（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）の乳酸菌等が挙げられる。より具体的にはＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｌａｃｔｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｋｅｉ、Ｌａｃｔｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｃｈｎｅｒｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｕｒｖｅｃｋｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｒｉｓｐａｔｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｕｒｖａｔｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｈａｌｉｖａｔｉｃｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｅｎｔｏｓｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｒｕｃｔｉｖｏｒａｎｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｈｉｌｇａｒｄｉｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｃｉｔｒｉｕｍ、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｏｅｎｏｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃ ｃｕｓｆａｅｃａｌｉｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃ ｃｕｓｆａｅｃｉｕｍ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｃｒｅｍｏｒｉｓ、Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ、Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ｐｅｎｔｏｓａｃｅｕｓ等が挙げられる。特に好ましくは、乳酸菌は、受領番号がＮＩＴＥ ＡＰ-０３７５９であるＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ Ｋ４株である。本株は、２０２２年１０月１１日（受領日）に、独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）（千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８）に、ＮＩＴＥ ＡＰ-０３７５９（受領番号）として寄託されている。乳酸菌は、上記したものの１種を単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。
乳酸菌は、好気条件又は嫌気条件で培養することでプラズマローゲンを産生する。好気条件とは、雰囲気中に酸素が含まれる状態をいう。好気条件には微好気条件も含まれる。好気条件とは、微生物の嫌気条件での培養に使用する試薬及び装置を使わずに培養することである。嫌気条件とは、雰囲気中に実質的に酸素が含まれない状態で培養することである。
乳酸菌の培養は、本実施の形態に係るプラズマローゲン産生促進用培地を用いて、乳酸菌に適した培養条件で行う。例えば、本実施の形態に係るプラズマローゲン産生促進用培地又は公知の乳酸菌用培地を用いて前培養した乳酸菌を、本実施の形態に係るプラズマローゲン産生促進用培地に加えて、乳酸菌に適したｐＨ、温度、通気及び時間等の条件で、静置培養又は振とう培養等の公知の培養方法により培養する。
乳酸菌の培養条件の一例として、乳酸菌を本実施の形態に係るプラズマローゲン産生促進用培地１～１００ｍＬに植菌して２５～４０℃、２７～３５℃又は２８～３２℃で一晩前培養し、次いで前培養した乳酸菌を、本実施の形態に係るプラズマローゲン産生促進用培地に添加し、２５～４０℃、２７～３５℃又は２８～３２℃で、１２時間～５日間、静置培養又は振とう培養する等を挙げることができる。
プラズマローゲンは、グリセロール骨格のｓｎ－１位にビニルエーテル結合を有し、ｓｎ－２位にエステル結合を有することで特徴づけられるグリセロリン脂質に特有のサブクラスに属する。本実施の形態におけるプラズマローゲンは、一般にプラズマローゲンに分類されるグリセロリン脂質であれば特に制限されない。プラズマローゲンとして、例えば、エタノールアミン型プラズマローゲン（Ｐｌｓ）、コリン型プラズマローゲン（ＰｌｓＣｈｏ）、イノシトール型プラズマローゲン及びセリン型プラズマローゲン等を挙げることができる。なお、Ｐｌｓはグリセロール骨格のｓｎ－３位におけるリンに結合する酸素原子に－ＣＨ２ＣＨ２２ＮＨ２が結合した構造を有する。ＰｌｓＣｈｏはグリセロール骨格のｓｎ－３位におけるリンに結合する酸素原子に－ＣＨ２ＣＨ２Ｎ（ＣＨ３）３が結合した構造を有する。本実施の形態に係るプラズマローゲン産生促進用培地で培養された乳酸菌が産生するプラズマローゲンは、ｓｎ－１位の酸素原子に結合する炭素鎖を構成する炭素数が多様で、哺乳類が有するプラズマローゲンに加え、当該炭素数が哺乳類では見られない炭素数であるプラズマローゲンも含有する。
本実施の形態に係るプラズマローゲン産生促進用培地で培養された乳酸菌は、下記実施例に示されるように、ラクトースを含有しない培地で培養した場合と比較して、大量のプラズマローゲンを産生することができる。具体的には、乳酸菌湿重量あたりのプラズマローゲン産生量が、ラクトースを含有しない培地で培養した場合と比較して、１．５倍以上、好ましくは２．０倍以上、さらに好ましくは２．５倍以上となる。
（実施の形態２）
本実施の形態では、プラズマローゲン含有組成物の製造方法が提供される。プラズマローゲン含有組成物は、上記実施の形態１に係るプラズマローゲン産生促進用培地で培養された乳酸菌の菌体又はその処理物を含む。本実施の形態に係る製造方法は、上記実施の形態１に係るプラズマローゲン産生促進用培地で乳酸菌を培養する培養ステップを含む。菌体は培養後の培養液の遠心分離による沈殿として得ることができる。
本実施の形態では、プラズマローゲン含有組成物の製造方法が提供される。プラズマローゲン含有組成物は、上記実施の形態１に係るプラズマローゲン産生促進用培地で培養された乳酸菌の菌体又はその処理物を含む。本実施の形態に係る製造方法は、上記実施の形態１に係るプラズマローゲン産生促進用培地で乳酸菌を培養する培養ステップを含む。菌体は培養後の培養液の遠心分離による沈殿として得ることができる。
本実施の形態に係るプラズマローゲン含有組成物の製造方法は、菌体の処理物を得る処理ステップをさらに含んでもよい。処理ステップでは、培養ステップで培養した乳酸菌の菌体に対し、抽出又は破砕等の処理を行い、処理物を得る。当該ステップで得られる菌体の処理物は、例えば、凍結乾燥させた菌体、アセトンで乾燥させた菌体、菌体に対して溶媒抽出処理を施した抽出物及び菌体又は乾燥菌体を超音波等で破砕した破砕物等、菌体に何らかの処理を加えて得られる菌体、菌体由来の、又は菌体の一部を含む組成物である。溶媒抽出に用いる溶媒としては、水、有機溶媒及びこれらの混合物を用いることができる。有機溶媒としては、エーテル、クロロホルム、ベンゼン、ヘキサン、メタノール、エタノール、イソプロパノール及びこれらの混合溶液等が例示される。抽出溶媒を用いて抽出された抽出物は、液状のまま、又は濃縮若しくは希釈して、液状、ゲル状あるいはペースト状の形態で用いることができる。さらに、これを乾燥した乾燥物として用いることができる。乾燥は、噴霧乾燥、凍結乾燥、減圧乾燥及び流動乾燥等の公知の方法で行うことができる。
本実施の形態に係るプラズマローゲン含有組成物の製造方法により製造されたプラズマローゲン含有組成物は、上記実施の形態１に係るプラズマローゲン産生促進用培地で培養された乳酸菌により産生されたプラズマローゲンを含有する。したがって、プラズマローゲン含有組成物は、生体におけるプラズマローゲンを外的に補充するのに有用である。例えば、プラズマローゲン含有組成物は、プラズマローゲンが減少している疾患の治療及び予防に使用される。当該疾患としては、例えば、炎症性疾患、中枢神経系炎症疾患、認知症、パーキンソン病、うつ病、統合失調症、糖尿病、メタボリックシンドローム、虚血性心疾患、感染症及び免疫異常等が挙げられる。
別の実施の形態では、プラズマローゲン含有組成物の製造方法により製造されたプラズマローゲン含有組成物は、上記に例示したプラズマローゲンが減少している疾患の治療薬又は予防薬として使用される。また、他の実施の形態では、プラズマローゲン含有組成物は、上記に例示したプラズマローゲンが減少している疾患の治療薬又は予防薬として使用される。また、別の実施の形態では、上記実施の形態１に係るプラズマローゲン産生促進用培地で培養された乳酸菌の菌体又はその処理物を含む、プラズマローゲンが減少している疾患の治療用経口組成物が提供される。当該経口組成物としては、具体的には、サプリメント、食品組成物、飲食品、機能性食品及び食品添加剤が挙げられる。
なお、別の実施の形態では、上記実施の形態１に係るプラズマローゲン産生促進用培地で培養された乳酸菌を使用したプラズマローゲンの製造方法が提供される。プラズマローゲンの製造方法は、培養ステップと、取得ステップと、を含む。培養ステップでは、上述のように、上記実施の形態１に係るプラズマローゲン産生促進用培地で乳酸菌を培養する。取得ステップでは、当該乳酸菌の菌体からプラズマローゲンを得る。取得ステップでは、上記のように溶媒抽出及び超音波等を介した破砕等で菌体を処理することでプラズマローゲンを得ることができる。取得ステップで得たプラズマローゲンを、公知の方法で精製、あるいはプラズマローゲンを単離してもよいし、精製したプラズマローゲンを濃縮してもよい。
（実施例１．培地の違いによるプラズマローゲン産生量の比較）
［乳酸菌の培養］
通性嫌気性の乳酸菌であるＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ Ｋ４株（受領番号：ＮＩＴＥ ＡＰ-０３７５９）（以下、「Ｋ４」ともいう）を、ＭＲＳ培地、ＴＹＧ培地、又はＭ１７培地の３種類の培地で培養した。それぞれの培地の組成は以下のとおりである。
ＭＲＳ培地：ＭＲＳ Ｂｒｏｔｈ（Ｓｏｌａｂｉａ Ｂｉｏｋａｒ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社製、（ペプトン２０．０ｇ、酵母抽出物５．０ｇ、グルコース２０．０ｇ、Ｔｗｅｅｎ８０ １．０８ｇ、リン酸二カリウム２．０ｇ、酢酸ナトリウム５．０ｇ、クエン酸アンモニウム２．０ｇ、硫酸マグネシウム０．２ｇ、硫酸マンガン０．０５ｇ）／１０００ｍＬ）、ｐＨ６．４±０．２
ＴＹＧ培地：（トリプトン１０．０ｇ、酵母抽出物５．０ｇ、グルコース１０．０ｇ、ＮａＣｌ５．０ｇ）／１０００ｍＬ、ｐＨ７．０
Ｍ１７培地：Ｍ１７ Ｂｒｏｔｈ（ベクトン・ディッキンソン社製、（カゼイン膵臓消化物５．０ｇ、大豆ペプトン５．０ｇ、牛肉抽出物５．０ｇ、酵母抽出物２．５ｇ、アスコルビン酸０．５ｇ、硫酸マグネシウム０．２５ｇ、β－グリセロリン酸二ナトリウム１９．０ｇ）／１０００ｍＬ）、ラクトース一水和物５．０ｇ／１０００ｍＬ、ｐＨ６．９±０．２
［乳酸菌の培養］
通性嫌気性の乳酸菌であるＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ Ｋ４株（受領番号：ＮＩＴＥ ＡＰ-０３７５９）（以下、「Ｋ４」ともいう）を、ＭＲＳ培地、ＴＹＧ培地、又はＭ１７培地の３種類の培地で培養した。それぞれの培地の組成は以下のとおりである。
ＭＲＳ培地：ＭＲＳ Ｂｒｏｔｈ（Ｓｏｌａｂｉａ Ｂｉｏｋａｒ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社製、（ペプトン２０．０ｇ、酵母抽出物５．０ｇ、グルコース２０．０ｇ、Ｔｗｅｅｎ８０ １．０８ｇ、リン酸二カリウム２．０ｇ、酢酸ナトリウム５．０ｇ、クエン酸アンモニウム２．０ｇ、硫酸マグネシウム０．２ｇ、硫酸マンガン０．０５ｇ）／１０００ｍＬ）、ｐＨ６．４±０．２
ＴＹＧ培地：（トリプトン１０．０ｇ、酵母抽出物５．０ｇ、グルコース１０．０ｇ、ＮａＣｌ５．０ｇ）／１０００ｍＬ、ｐＨ７．０
Ｍ１７培地：Ｍ１７ Ｂｒｏｔｈ（ベクトン・ディッキンソン社製、（カゼイン膵臓消化物５．０ｇ、大豆ペプトン５．０ｇ、牛肉抽出物５．０ｇ、酵母抽出物２．５ｇ、アスコルビン酸０．５ｇ、硫酸マグネシウム０．２５ｇ、β－グリセロリン酸二ナトリウム１９．０ｇ）／１０００ｍＬ）、ラクトース一水和物５．０ｇ／１０００ｍＬ、ｐＨ６．９±０．２
前培養として、Ｋ４の単一コロニーを寒天培地から１０ｍＬの各液体培地へ接種し、３０℃で１６～２４時間静置培養した。次いで、この培養液を、１０～３５ｍＬの各液体培地に３％植菌して３０℃で１６～３６時間静置培養した。
［菌体からの脂質抽出及びリン脂質の検出］
培養後の培養液を遠心分離し、菌体を回収した。菌体に生理食塩水を加えて混和し、遠心分離後、上清を取り除くことで菌体を洗浄した。菌体にさらに生理食塩水を加えて再洗浄した。上清を取り除き、使用するまで－３０℃で保管した。
培養後の培養液を遠心分離し、菌体を回収した。菌体に生理食塩水を加えて混和し、遠心分離後、上清を取り除くことで菌体を洗浄した。菌体にさらに生理食塩水を加えて再洗浄した。上清を取り除き、使用するまで－３０℃で保管した。
解凍した菌体の総重量を測定した。１ｍＬの水を菌体に添加して混和後、３．７５ｍＬのクロロホルム／メタノール（１：２、ｖ／ｖ）を添加して混和した。１０分間超音波処理し、室温に３０分間置いた。１．２５ｍＬのクロロホルムを加え、次いで１．２５ｍＬの水を加えた。遠心分離後、クロロホルム層をガラス管に移し、残った水層を２ｍＬのクロロホルムで再抽出した。合わせたクロロホルム層を窒素ガス下で乾燥し、ヘキサン／イソプロパノール（３：２、ｖ／ｖ）に、菌体濃度が１２０ｍｇ／ｍＬとなるように再懸濁し、０．４５μｍフィルターで濾過した。菌体懸濁液１０μＬを高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）に注入し、蒸発光散乱器（ＥＬＳＤ）で検出した。
脂質標準試料として、ホスファチジルコリン（２５ｍｇ、クロロホルムに５ｍｇ／ｍＬ、Ａ－２９Ｂ、ＳＲＬ社製）を窒素ガスで乾固し、イソプロパノール／クロロホルム（２：１、ｖ／ｖ）を１ｍＬ加えて混和した。試料を超音波で溶解して－３０℃に脂質ストックとして保管した。脂質ストックをＨＩＰ（ヘキサン／イソプロパノール（３：２、ｖ／ｖ））で系列希釈し、脂質標準液を調製した。脂質標準液を０．４５μｍのフィルターを通した後、１０μＬをＨＰＬＣ用のサンプルとした。
ＨＰＬＣの条件は次の通りである。
カラム：Ｌｉｃｈｒｏｓｐｈｅｒｅ ＤＩＯＬ（２５０×３ｍｍ、５μｍ、メルク社製）
移動相Ａ：０．０８％トリエチルアミンを含むヘキサン／イソプロパノール／酢酸（８２：１７：１）
移動相Ｂ：０．０８％トリエチルアミンを含むイソプロパノール／水／酢酸（８５：１４：１）
流量：０．８ｍＬ／分
カラム温度：５０℃
グラジエント：
０分 移動相Ａ ９６％ 移動相Ｂ ４％
２１分 移動相Ａ ６３％ 移動相Ｂ ３７％
２５分 移動相Ａ １５％ 移動相Ｂ ８５％
２６分 移動相Ａ １５％ 移動相Ｂ ８５％
２９分 移動相Ａ ９６％ 移動相Ｂ ４％
３４分 移動相Ａ ９６％ 移動相Ｂ ４％
カラム：Ｌｉｃｈｒｏｓｐｈｅｒｅ ＤＩＯＬ（２５０×３ｍｍ、５μｍ、メルク社製）
移動相Ａ：０．０８％トリエチルアミンを含むヘキサン／イソプロパノール／酢酸（８２：１７：１）
移動相Ｂ：０．０８％トリエチルアミンを含むイソプロパノール／水／酢酸（８５：１４：１）
流量：０．８ｍＬ／分
カラム温度：５０℃
グラジエント：
０分 移動相Ａ ９６％ 移動相Ｂ ４％
２１分 移動相Ａ ６３％ 移動相Ｂ ３７％
２５分 移動相Ａ １５％ 移動相Ｂ ８５％
２６分 移動相Ａ １５％ 移動相Ｂ ８５％
２９分 移動相Ａ ９６％ 移動相Ｂ ４％
３４分 移動相Ａ ９６％ 移動相Ｂ ４％
ＥＬＳＤの条件は次の通りである。
エバポレータ温度：６０℃
ネブライザー温度：３０℃
窒素ガス流量：１．００ ＳＬＭ
エバポレータ温度：６０℃
ネブライザー温度：３０℃
窒素ガス流量：１．００ ＳＬＭ
濃度の異なる脂質標準液についてもＨＰＬＣ－ＥＬＳＤで検出した。各濃度のピーク面積で検量線を作成し、大腸菌から得られた保持時間１０～２０分のリン脂質に相当するピークの面積比からリン脂質量を算出した。
［酸加水分解処理によるプラズマローゲンの変化］
上述のように菌体からクロロホルム／メタノールで抽出し、窒素ガスで乾燥させた脂質に０．５ｍＬの２，４－ジニトロフェニルヒドラジン－塩酸塩溶液（ＤＮＰＨ－ＨＣｌ溶液、東京化成工業社製）を添加し混和した。超音波処理により乳化させた後、室温に３０分置き、酸加水分解された脂質に０．５ｍＬの超純水を添加して混和後、１．９ｍＬのクロロホルム／メタノール（１：２、ｖ／ｖ）を添加して混和した。室温に１０分間置き、０．６２５ｍＬのクロロホルムを加えて混和した。続いて０．６２５ｍＬの水を加えて混和した。室温にて３０００ｒｐｍで遠心分離後、クロロホルム層をガラス管に移し窒素ガス下で乾燥した。乾燥させた脂質をアセトニトリル１００μＬに再懸濁した後、０．４５μｍのフィルターを通した。１０μＬをＨＰＬＣ用のサンプルとして、ＨＰＬＣに注入し、波長３５６ｎｍのＵＶ（紫外線）で検出した。
上述のように菌体からクロロホルム／メタノールで抽出し、窒素ガスで乾燥させた脂質に０．５ｍＬの２，４－ジニトロフェニルヒドラジン－塩酸塩溶液（ＤＮＰＨ－ＨＣｌ溶液、東京化成工業社製）を添加し混和した。超音波処理により乳化させた後、室温に３０分置き、酸加水分解された脂質に０．５ｍＬの超純水を添加して混和後、１．９ｍＬのクロロホルム／メタノール（１：２、ｖ／ｖ）を添加して混和した。室温に１０分間置き、０．６２５ｍＬのクロロホルムを加えて混和した。続いて０．６２５ｍＬの水を加えて混和した。室温にて３０００ｒｐｍで遠心分離後、クロロホルム層をガラス管に移し窒素ガス下で乾燥した。乾燥させた脂質をアセトニトリル１００μＬに再懸濁した後、０．４５μｍのフィルターを通した。１０μＬをＨＰＬＣ用のサンプルとして、ＨＰＬＣに注入し、波長３５６ｎｍのＵＶ（紫外線）で検出した。
標準として使用したアルデヒド標準溶液について以下のように調製した。テトラデカノール（Ｃ１４Ｈ２８Ｏ、東京化成工業社製、Ｔ２６９６）、ヘキサデカノール（Ｃ１６Ｈ３２Ｏ、東京化成工業社製、Ｈ１２９６）、ヘプタデカノール（Ｃ１７Ｈ３４Ｏ、東京化成工業社製、Ｈ１２９５）及びオクタデカノール（Ｃ１８Ｈ３６Ｏ、東京化成工業社製、Ｏ０３６８）を別々のスピッツに取り、アセトニトリルで１ｍｇ／ｍＬとした。調製した１ｍｇ／ｍＬの溶液２００μＬ（Ｃ１４Ｈ２８Ｏのみ１００μＬ、２００μＬ及び４００μＬ）を別々のスピッツに取り、窒素ガスで乾固した試料にＤＮＰＨ－ＨＣｌ溶液を０．５ｍＬ加えて混和した。超音波でエマルジョン化させ、試料を３０分間室温に置いた。超純水０．５ｍＬとクロロホルム／メタノール（１：２、ｖ／ｖ）１．９ｍＬとを試料に加え、ボルテックス混和した。室温に１０分間置き、クロロホルム０．６２５ｍＬを加え、ボルテックスで混和した。試料に超純水０．６２５ｍＬ加え、ボルテックスで混和した。試料を５分間、室温で遠心（３０００ｒｐｍ）した。下層を別のスピッツに移し、窒素ガスで乾固し、これをアセトニトリル２ｍＬに溶解してストックアルデヒド標準液として－３０℃に保管した。
Ｃ１４Ｈ２８Ｏのストックアルデヒド標準液を各濃度１２０μＬ取り、０．４５μｍフィルターで濾過し、１０μＬをＨＰＬＣに注入した。４種のアルデヒドを混合した混合アルデヒド標準溶液を調製するために、４種類のストックアルデヒド標準液を各３０μＬずつ取り混和した。得られた混合アルデヒド標準溶液を０．４５μｍフィルターで濾過し、１０μＬをＨＰＬＣに注入した。
ＨＰＬＣの条件は次の通りである。
カラム：ＸＢｒｉｄｇｅ ＢＥＡ Ｃ１８（３．０×１５０、２．５μｍ、Ｗａｔｅ
ｒｓ社製）
カラム温度：４０℃
移動相Ａ：アセトニトリル
移動相Ｂ：水
流量：０．３ｍＬ／分
カラム温度：４０℃
グラジエント：
０分 移動相Ａ ３０％ 移動相Ｂ ７０％
２５分 移動相Ａ １００％ 移動相Ｂ ０％
４０分 移動相Ａ １００％ 移動相Ｂ ０％
４０．１分 移動相Ａ ３０％ 移動相Ｂ ７０％
５０分 移動相Ａ ３０％ 移動相Ｂ ７０％
カラム：ＸＢｒｉｄｇｅ ＢＥＡ Ｃ１８（３．０×１５０、２．５μｍ、Ｗａｔｅ
ｒｓ社製）
カラム温度：４０℃
移動相Ａ：アセトニトリル
移動相Ｂ：水
流量：０．３ｍＬ／分
カラム温度：４０℃
グラジエント：
０分 移動相Ａ ３０％ 移動相Ｂ ７０％
２５分 移動相Ａ １００％ 移動相Ｂ ０％
４０分 移動相Ａ １００％ 移動相Ｂ ０％
４０．１分 移動相Ａ ３０％ 移動相Ｂ ７０％
５０分 移動相Ａ ３０％ 移動相Ｂ ７０％
アルデヒドの算出はリン脂質と同様に面積比で算出した。
（結果）
ＭＲＳ培地で培養したＫ４と、Ｍ１７培地で培養したＫ４の湿重量当たりのプラズマローゲン由来アルデヒドの相対量を図１（Ａ）に、ＴＹＧ培地で培養したＫ４と、Ｍ１７培地で培養したＫ４の湿重量当たりのプラズマローゲン由来アルデヒドの相対量を図１（Ｂ）に示す。いずれの培地で培養した場合もプラズマローゲン由来アルデヒドが検出された。ＭＲＳ培地又はＴＹＧ培地で培養した場合と比較して、Ｍ１７培地で培養した場合に多くのアルデヒドが検出され、ＭＲＳ培地と比較すると約３倍、ＴＹＧ培地と比較すると約２．６倍であった。Ｍ１７培地を用いることで、Ｋ４のプラズマローゲン産生量を増加させることができることが示された。
ＭＲＳ培地で培養したＫ４と、Ｍ１７培地で培養したＫ４の湿重量当たりのプラズマローゲン由来アルデヒドの相対量を図１（Ａ）に、ＴＹＧ培地で培養したＫ４と、Ｍ１７培地で培養したＫ４の湿重量当たりのプラズマローゲン由来アルデヒドの相対量を図１（Ｂ）に示す。いずれの培地で培養した場合もプラズマローゲン由来アルデヒドが検出された。ＭＲＳ培地又はＴＹＧ培地で培養した場合と比較して、Ｍ１７培地で培養した場合に多くのアルデヒドが検出され、ＭＲＳ培地と比較すると約３倍、ＴＹＧ培地と比較すると約２．６倍であった。Ｍ１７培地を用いることで、Ｋ４のプラズマローゲン産生量を増加させることができることが示された。
（実施例２．プラズマローゲンの産生を促進する培地組成の探索）
実施例１において、Ｍ１７培地で培養したＫ４においてプラズマローゲンの産生量が増加した要因を探索するために、ＴＹＧ培地の炭素源をグルコース（１０．０ｇ／１０００ｍＬ）からラクトース一水和物（５．０ｇ／１０００ｍＬ）に変更したＴＹＬ培地を以下のように調製した。
ＴＹＬ培地：（トリプトン１０．０ｇ、酵母抽出物５．０ｇ、ＮａＣｌ５．０ｇ、ラクトース一水和物５．０ｇ）／１０００ｍＬ
実施例１において、Ｍ１７培地で培養したＫ４においてプラズマローゲンの産生量が増加した要因を探索するために、ＴＹＧ培地の炭素源をグルコース（１０．０ｇ／１０００ｍＬ）からラクトース一水和物（５．０ｇ／１０００ｍＬ）に変更したＴＹＬ培地を以下のように調製した。
ＴＹＬ培地：（トリプトン１０．０ｇ、酵母抽出物５．０ｇ、ＮａＣｌ５．０ｇ、ラクトース一水和物５．０ｇ）／１０００ｍＬ
前培養として、Ｋ４のグリセロールストックから各培地１０ｍＬへ菌体を接種し、３０℃で一晩（～１６時間）静置培養した。次いで、この培養液を、９０ｍＬの各培地へ３％植菌して３０℃で２３～２５時間静置培養した。
実施例１に記載された手順にしたがって、菌体からの脂質抽出、酸加水分解処理、及びアルデヒドの検出を行い、ＴＹＧ培地で培養したＫ４と、ＴＹＬ培地で培養したＫ４のプラズマローゲン産生量を比較した。
（結果）
ＴＹＧ培地で培養したＫ４と、ＴＹＬ培地で培養したＫ４の湿重量当たりのプラズマローゲン由来アルデヒドの相対量を図２に示す。ＴＹＬ培地では、ＴＹＧ培地で培養した場合の約２．７倍のプラズマローゲン由来アルデヒドが検出された。このことから、ＴＹＬ培地に含まれるラクトースが、ＴＹＧ培地に含まれるグルコースよりもプラズマローゲンの産生を促進することが示された。
ＴＹＧ培地で培養したＫ４と、ＴＹＬ培地で培養したＫ４の湿重量当たりのプラズマローゲン由来アルデヒドの相対量を図２に示す。ＴＹＬ培地では、ＴＹＧ培地で培養した場合の約２．７倍のプラズマローゲン由来アルデヒドが検出された。このことから、ＴＹＬ培地に含まれるラクトースが、ＴＹＧ培地に含まれるグルコースよりもプラズマローゲンの産生を促進することが示された。
本発明は、プラズマローゲンの製造に有用である。
Claims (7)
- 炭素源であるラクトースを含み、
乳酸菌の培養に使用される、
プラズマローゲン産生促進用培地。 - 乳酸菌湿重量あたりの前記乳酸菌によるプラズマローゲン産生量が、前記ラクトースを含まない培地で培養した場合と比較して、少なくとも１．５倍である、
請求項１に記載のプラズマローゲン産生促進用培地。 - 前記ラクトースとして、１０００ｍＬあたり３．０～１０．０ｇのラクトース一水和物を含む、
請求項１又は２に記載のプラズマローゲン産生促進用培地。 - 前記乳酸菌は、受領番号がＮＩＴＥ ＡＰ-０３７５９であるＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ Ｋ４株である、
請求項１又は２に記載のプラズマローゲン産生促進用培地。 - 請求項１又は２に記載のプラズマローゲン産生促進用培地で前記乳酸菌を培養する培養ステップを含む、
プラズマローゲン含有組成物の製造方法。 - 前記乳酸菌を処理して乳酸菌処理物を得る処理ステップをさらに含む、
請求項５に記載のプラズマローゲン含有組成物の製造方法。 - 請求項１又は２に記載のプラズマローゲン産生促進用培地で前記乳酸菌を培養する培養ステップと、
前記乳酸菌からプラズマローゲンを得る取得ステップと、
を含む、
プラズマローゲンの製造方法。
Priority Applications (2)
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| PCT/JP2023/032623 WO2024084851A1 (ja) | 2022-10-17 | 2023-09-07 | プラズマローゲン産生促進用培地、プラズマローゲン含有組成物の製造方法及びプラズマローゲンの製造方法 |
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| JP2024058887A true JP2024058887A (ja) | 2024-04-30 |
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| WO (1) | WO2024084851A1 (ja) |
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| WO2023162873A1 (ja) * | 2022-02-22 | 2023-08-31 | 株式会社 レオロジー機能食品研究所 | プラズマローゲン合成用乳酸菌、プラズマローゲン含有組成物及びプラズマローゲンの製造方法 |
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2022
- 2022-10-17 JP JP2022166287A patent/JP2024058887A/ja active Pending
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