KR100543115B1 - 에탄올과 아세트알데하이드 분해효소 활성과 감소능이 우수한 젖산균 - Google Patents

에탄올과 아세트알데하이드 분해효소 활성과 감소능이 우수한 젖산균 Download PDF

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Abstract

본 발명은, 건강한 한국 성인의 분변에서 분리한 것으로써, 에탄올과 아세트알데하이드 분해효소 활성과 감소능이 우수한 젖산균인 락토바실러스 브레비스 HY7401균주(기탁기관: 농업생명공학연구원, 기탁번호: KACC 91069, 기탁일: 2003.10.06)에 관한 것이다.
본 발명의 균주는 에탄올과 아세트알데하이드 분해효소 활성 및 감소능이 우수하기 때문에, 소화기관에서 섭취한 에탄올을 아세트알데하이드로, 그리고 에탄올 분해에 의해 생성되어 간 손상 유발인자로 작용하는 아세트알데하이드를 초산으로 전환시킴으로써, 간 보호 작용이 높으며, 특히 본 발명의 균주는 건강한 한국 성인의 생체에서 분리한 것이어서 한국인의 장내 정착할 가능성이 높고, 따라서, 본 발명의 균주 또는 균주를 배양한 배양물을 식음용하였을 때, 간 보호 기능 및 정장 효과를 기대할 수 있다.
분변, 에탄올, 아세트알데히드, 분해효소, 젖산균

Description

에탄올과 아세트알데하이드 분해효소 활성과 감소능이 우수한 젖산균{Lactic acid bacteria having high alcohol dehydrogenase and acetaldehyde dehydrogenase activity, and metabolize ethanol and acetaldehyde}
도 1은 실시예 1과 비교예 1 내지 12의 알콜 분해효소 활성 시험의 결과를 보인 그래프,
도 2는 실시예 2와 비교예 13 내지 24의 아세트알데하이드 분해효소 활성 시험의 결과를 보인 그래프,
도 3은 실시예 3과 비교예 25 내지 28의 알콜 감소 시험의 결과를 보인 그래 프,
도 4는 실시예 4와 비교예 29 내지 32의 아세트알데하이드 감소 시험의 결과를 보인 그래프,
도 5,6은 실시예5의 혈중 에탄올 및 아세트알데하이드 감소 시험의 결과를 보인 그래프
본 발명은 에탄올과 아세트알데하이드 분해효소 활성이 매우 높고 에탄올과 아세트알데하이드 감소능이 우수하여 소화 장기에서 섭취한 에탄올과 아세트알데하이드 흡수 억제가 탁월한 새로운 젖산균에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 상술한 우수한 특성을 나타내는 락토바실러스 브레비스에 관한 것이다.
젖산균은 동물의 장내에 분포하여 유해 미생물 생장의 억제, 이상 발효의 치료, 혈중 콜레스테롤 저하, 면역 기능의 증진 등의 효과를 나타내며, 항암 작용도 있는 것으로 보고되고 있다.
이러한 젖산균을 사람이 섭취하여 건강을 증진할 수 있도록 발효 유제품 및 정장제가 상용화되어 널리 음용 또는 식용되고 있다.
발효 유제품 및 정장제에 사용되는 대표적인 균주로는 락토바실러스 애시도필러스(L. acidophilus), 락토바실러스 카세이(L. casei), 락토바실러스 불가리쿠스(L. bulgaricus), 락토바실러스 브레비스(L. brevis), 스트렙토코커스 써모필러스(Str. thermophilus) 등이 있다.
최근에는 젖산균에 의한 간 보호기능에 관한 연구들이 보고되고 있다. 사람이 섭취한 에탄올은 위와 소장의 상부에서 확산작용에 의해 쉽게 흡수된다. 에탄올 대사는 주로 간 조직에서 일어나는데, 에탄올이 알콜 분해효소(alcohol dehydrogenase, ADH)에 의해 아세트알데하이드로 산화되고, 아세트알데하이드는 알 데하이드 분해효소(aldehyde dehydrogenase, ALDH)에 의해 초산으로 전환된다.
에탄올 산화에 의해 생성되는 대사산물인 아세트알데하이드는 반응성이 강한 독성물질로 단백질과 결합하여 효소 활성 저해, 지질과 산화의 증가로 미토콘드리아에 손상, 글루타치온 결핍 초래 및 피리독신, 비타민 A, 아연 및 셀레늄 등의 결핍을 초래, 투불린 중합 저해에 의한 단백질 분비 및 이동 저해 등을 발생하는 간 손상을 유발하는 주요 인자로 지적되고 있다.
또한 아세트알데하이드에 의한 유리기(free radical) 생성은 간의 콜라겐(collagen) 합성을 촉진시키므로, 이는 만성적인 에탄올 섭취자에 있어 간 섬유화(간경변)의 원인이 되는 것으로 보고되고 있다. 이밖에도 만성적인 알콜 섭취는 지방간, 알콜성 간염, 그리고 간경변 등을 발생시킬 수 있다.
또한 에탄올은 소화 장기에서도 에탄올 또는 아세트알데하이드 형태로 흡수되는데, 소화 장기에 존재하는 많은 미생물에 의해 에탄올이 아세트알데하이드로 쉽게 전환된다. 이때 장내에 존재하는 젖산균이 에탄올을 아세트알데하이드로, 그리고 아세트알데하이드를 초산으로 전환시켜 에탄올 및 아세트알데하이드의 흡수를 억제함과 동시에 간을 보호하는 기능이 있는 것으로 보고되고 있다.
젖산균이 인체에 유용한 효과를 나타내려면 장내에 정착할 수 있어야 하는데, 젖산균은 숙주 특이성을 나타내기 때문에, 사람을 위한 정장제 또는 발효제품을 위해서는 사람으로부터 분리한 젖산균을 사용해야 실제로 인체내에 정착할 수 있으며 소기의 효과를 얻을 수 있다.
따라서, 본 발명의 목적은, 에탄올과 아세트알데하이드 분해효소 활성이 매우 높고 에탄올과 아세트알데하이드 감소능이 우수한 새로운 젖산균을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은, 인체에 섭취되었을 때 유용한 특성을 나타내는 락토바실러스 브레비스(락토바실러스 브레비스 HY7401)을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 한국인에 적합한 새로운 젖산균을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 락토바실러스 브레비스 HY7401를 이용하여 제조한 발효제품을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 락토바실러스 브레비스 HY7401를 이용하여 제조한 정장제를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 락토바실러스 브레비스 HY7401를 이용하여 제조한 건강보조식품을 제공하는 것이다.
젖산균은 인간의 구강, 장, 질, 분변 등에 널리 분포한다. 따라서, 이들로부터 젖산균을 분리하여 그 특성을 시험함으로써 원하는 성질을 갖는 젖산균을 획득하는 방법이 행해지고 있으며, 특히 분변으로부터 젖산균을 분리하는 방법이 유용하게 사용되고 있다.
본 발명에서는 숙주 특이성을 고려하여, 한국인을 위한 발효제품에 사용되는 젖산균으로서 한국인의 인체로부터 젖산균을 분리함으로써, 상기한 숙주 특이성의 관계에서 젖산균의 유용한 효과를 극대화할 수 있는 것이다.
본 발명자들은 이러한 점을 고려하여 한국인의 생리에 맞는 발효제품을 제조하는데 적합한 균주를 분리하고자 한국 성인들로부터 젖산균을 분리하여 시험하던 중, 에탄올과 아세트알데하이드 분해능이 우수하고 에탄올과 아세트알데하이드 감소가 우수한 새로운 젖산균을 분리하는데 성공하여 본 발명에 도달하였다.
이하, 본 발명의 구성을 좀더 상세히 설명한다.
본 발명에 따른 균주를 분리하기 위하여 건강한 한국인 성인의 분변을 0.02 % 소디움 아지드(sodium azide)가 포함된 엠알에스(MRS) 액체 배지에 넣고 37 ℃에서 24시간 배양하였다. 배양후 10 ul 백금이를 사용하여 배양액을 취하여 다시 0.02 % 소디움 아지드가 포함된 엠알에스 한천 평판배지에 도말하고 37 ℃에서 48 시간동안 배양하였다. 형성된 균락중에서 알콜 분해효소 활성 및 아세트알데하이드 분해효소 활성을 시험하여 본 발명의 균주를 분리하였다. 본 발명의 젖산균은 2003. 10. 6. 자로 농업생명공학연구원에 기탁되었다(기탁번호: KACC 91069).
본 발명에 따른 젖산균의 특성은 다음과 같다.
1) 균의 형태
엠알에스(MRS) 한천평판배지에서 37 ℃, 2일간 배양했을 때 균의 형태
① 세포의 형태: 간균
② 운동성: 없음
③ 포자형성능: 없음
④ 그람(Gram) 염색: 양성
2) 균총의 형태
엠알에스(MRS) 한천평판배지에서 37 ℃, 2일간 배양했을 때 균총의 형태
① 형상: 원형
② 융기: 볼록
③ 표면: 매끄러움(Smooth)
3)생리적 성질
① 생육온도: 생장가능 생육온도: 25 ∼ 40 ℃
최적 생장온도: 36 ∼ 38 ℃
② 생육 pH: 생장가능 생육 pH: 5.0 ∼ 7.5
최적 pH: 6.0 ∼ 6.5
③ 산소에 대한 영향: 통성혐기성
4) 카탈라제: -
5) 가스형성여부: +
6) 15 ℃에서 생육: +
7) 45 ℃에서 생육: -
8) 인돌생산: -
9) 젖산생산: +
10) Bergey's manual의 당 발효 시험
아미그달린: -
아라비노스: +
셀로비오스: -
에스큘린: +
과당: +
갈락토스: +
포도당: +
글루코네이트: -
유당: -
말토스: +
만니톨: -
만노스: -
멜레지토스: -
멜리비오스: +
라피노스: -
리보스: +
람노스: -
살리신: -
소르비톨: -
자당: -
트레할로스: -
크실로스: -
이와 같은 균의 형태학적, 생리적 및 생장 특성에 근거하여 본 발명의 균주는 락토바실러스 브레비스로 동정하였고, 본 발명자들은 이를 락토바실러스 브레비스 HY7401로 명명하였다.
본 발명의 젖산균은 배양물 또는 동결건조된 분말 형태로 제공될 수 있다. 이와 같이 본 발명의 젖산균 자체 또는 본 발명의 균주를 이용하여 당 또는 단백질을 발효시킴으로써 얻어지는 본 발명의 균주가 포함된 배양물은, 에탄올 및 아세트알데하이드 분해 그리고 감소 효과가 기대되며 또한 정장제로 사용될 수 있는 것이다.
이하, 실시예 및 비교예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명한다. 이들 실시예 및 비교예에서 사용된 MRS 배지 및 YM 배지의 조성은 각각 다음 표 1 및 2 와 같다.
MRS 액상배지의 조성
프로테오스 폡톤 No. 3 10 g
육 추출물 10 g
효모 추출물 5 g
포도당 20 g
트윈 80(Tween 80) 1 g
암모니움 시트레이트 2 g
소디움 아세테이트 5 g
황산마그네슘(MgSO4ㆍ7H2O) 0.1 g
황산망간(MnSO4ㆍ4H2O) 0.05 g
인산칼륨(dibasic) 2 g
증류수 1000 ㎖
YM 액상배지의 조성
효모 추출물 3 g
맥아 추출물 3 g
펩톤 5 g
포도당 10 g
증류수 1000 ㎖
실시예 1(알콜 분해효소 활성 시험)
MRS 액상배지에 본 발명의 락토바실러스 브레비스 HY7401 균주를 접종하여 37 ℃에서 24시간 배양하였다. 이 배양물을 3,000 rpm, 4 ℃에서 10분간 원심분리하여 균체를 얻은 후 멸균 100 mM 칼륨인산 완충용액(pH 7.4)으로 3회 세척하였다. 균체를 다시 멸균 100 mM 칼륨인산 완충용액(pH 7.4)에 현탁시킨 후 초음파 세포파쇄기를 이용하여 얼음수조에서 세포를 파쇄하였다. 세포 파쇄 후 100,000 g에서 30분간 원심분리하여 조효소액을 얻었다.
조효소액은 -80 ℃에서 보관하면서 시험에 사용하였다. 조효소액을 이용한 알콜 분해효소 활성시험은 노소바 등(Nosova, T. et al., Alcohol & Alcoholism, 2000. 35:561-568)의 방법에 따라 시행하였다. 2.5 mM의 산화된 니코틴아마이드 아데닌 디누클레오타이드(NAD+)가 함유된 0.1 M 글리신 완충용액(pH 9.6)에 최종 농도가 25 mM이 되도록 에탄올을 첨가한 후 100 ul의 조효소액을 첨가하여 25 ℃ 항온수조에서 반응시켰다. 반응이 완료된 후 환원되는 니코틴아마이드 아데닌 디누클레오타이드(NADH)의 양을 분광광도계를 이용하여 25 ℃, 340 nm에서 흡광도를 측정하였다. 조효소액의 단백질 함량은 브레포드 분석에 기초한 단백질 분석 키트(Protein assay kit, Bio-Rad)를 이용하여 측정하였다. 알콜 분해효소 활성은 조효소액의 단백질 mg 그리고 반응시간 당 생성되는 환원된 니코틴아마이드 아데닌 디누클레오타이드(NADH)의 양으로 계산하였다.
비교예 1 내지 12(알콜 분해효소 시험)
상기 실시예와 동일한 방법 및 조건으로 공시 균주인 락토바실러스 루테리 HY7701, 락토바실러스 루테리 HY7702, 락토바실러스 루테리 SD2112, 락토바실러스 플란타룸 HY7303, 락토바실러스 람노서스 ATCC 21052, 락토바실러스 브레비스 HY7402, 락토바실러스 브레비스 HY7403, 락토바실러스 브레비스 HY7404, 락토바실러스 브레비스 HY7405, 락토바실러스 퍼멤텀 CS332 및 락토바실러스 퍼멤텀 CSL9의 알콜 분해효소 활성을 시험하였으며, 알콜 분해효소가 존재하는 캔디다 쉐해태 KCCM 11895(ATCC 22984, Appl. Microbiol. Biotechnol., 1988, 29:282-288)는 YM 액체배지에 접종하여 25 ℃에서 진탕배양하여 공시균주들과 동일한 방법으로 알콜 분해효소 활성을 시험하여 비교예 1부터 12로 하였다. 실시예 1, 비교예 1 내지 12의 결과를 도 1에 나타낸다.
실시예 2(아세트알데하이드 분해효소 시험)
본 발명의 락토바실러스 브레비스 HY7401을 실시예 1과 동일한 방법 및 조건으로 배양하여 조효소액을 얻었다. 조효소액을 이용한 아세트알데하이드 분해효소 활성시험은 노소바 등(Nosova, T. et al., Alcohol & Alcoholism, 2000. 35:561-568)의 방법에 따라 시행하였다. 1 mM의 산화된 니코틴아마이드 아데닌 디누클레오타이드 포스페이트(NADP+)가 함유된 60 mM 소디움 피로포스페이트 완충용액(pH 8.8)에 최종 농도가 100 uM이 되도록 아세트알테하이드와 0.1 mM의 4-메칠피라졸을 첨가한 후 100 ul의 조효소액을 첨가하여 25 ℃ 항온수조에서 반응시켰다.
반응이 완료된 후 환원되는 니코틴아마이드 아데닌 디누클레오타이드 포스페이트(NADPH)의 양을 분광광도계를 이용하여 25 ℃, 340 nm에서 흡광도를 측정하였다. 조효소액의 단백질 함량은 실시예 1과 동일한 방법으로 측정하였다. 아세트알데하이드 분해효소 활성은 조효소액의 단백질 mg 그리고 반응시간 당 생성되는 환원된 니코틴아마이드 아데닌 디누클레오타이드 포스페이트(NADPH)의 양으로 계산하였다.
비교예 13 내지 24(아세트알데하이드 분해효소 시험)
상기 실시예 2 및 비교예 1내지 12와 동일한 방법 및 조건으로 공시 균주인 락토바실러스 루테리 HY7701, 락토바실러스 루테리 HY7702, 락토바실러스 루테리 SD2112, 락토바실러스 플란타룸 HY7303, 락토바실러스 람노서스 ATCC 21052, 락토바실러스 브레비스 HY7402, 락토바실러스 브레비스 HY7403, 락토바실러스 브레비스 HY7404, 락토바실러스 브레비스 HY7405, 락토바실러스 퍼멤텀 CS332, 락토바실러스 퍼멤텀 CSL9 및 캔디다 쉐해태 KCCM 11895의 아세트알데하이드 분해효소 활성을 시험하여 비교예 13 내지 24로 하였다. 실시예 2, 비교예 13 내지 24의결과를 도 2에 나타낸다.
실시예 3(알콜 감소 시험)
본 발명의 락토바실러스 브레비스 HY7401에 의한 알콜 감소는 실시예 1과 동일한 방법 및 조건에서 균체를 얻은 다음 100 mM 칼륨인산 완충용액(pH 7.4)에 현탁하였다. 450 ul의 균체 현탁액과 50 ul의 250 mM 에탄올을 밀폐된 시험관에서 혼합한 다음 37 ℃에서 1시간 동안 정치시켰다. 반응이 완료된 후 5,000 rpm, 4 ℃에서 5분간 원심분리하였으며, 상등액 내에 에탄올 함량은 에탄올 정량 키트(Roche)를 사용하여 측정하였다. 흡광도는 분광광도계를 이용하여 25 ℃, 340 nm에서 측정하였다.
비교예 25 내지 28(알콜 감소 시험)
상기 실시예3과 동일한 방법 및 조건으로 공시 균주인 락토바실러스 플란타룸 HY7303, 락토바실러스 람노서스 ATCC 21052, 락토바실러스 퍼멤텀 CS332, 및 락토바실러스 브레비스 HY7402의 알콜 감소를 시험하여 비교예 25 내지 28로 하였다. 실시예 3, 비교예 25 내지 28의 결과를 도 3에 나타낸다.
실시예 4(아세트알데하이드 감소 시험)
본 발명의 락토바실러스 브레비스 HY7401에 의한 아세트알데하이드 감소는 실시예 3과 동일한 방법 및 조건에서 균체를 얻은 다음 100 mM 칼륨 인산완충용액(pH 7.4)에 현탁하였다. 450 ul의 균체 현탁액과 50 ul의 50 mM 아세트알데하이드를 밀폐된 시험관에서 혼합한 다음 37 ℃에서 1시간 동안 정치시켰다. 반응이 완료된 후 5,000 rpm, 4 ℃에서 5분간 원심분리하였으며, 상등액 내에 아세트알데하이드 함량은 아세트알데하이드 정량 키트(Roche)를 사용하여 측정하였다. 흡광도는 분광광도계를 이용하여 25 ℃, 340 nm에서 측정하였다.
비교예 29 내지 32
상기 실시예 4와 동일한 조건 및 방법으로 공시 균주인 락토바실러스 플란타룸 HY7303, 락토바실러스 람노서스 ATCC 21052, 락토바실러스 퍼멤텀 CS332, 및 락토바실러스 브레비스 HY7402의 아세트알데하이드 감소를 시험하여 비교예 29 내지 32로 하였다. 상기 실시예 4와 비교예 29 내지 32의 결과들 도 4에 표시한다.
실시예 5(혈중 에탄올 및 아세트알데하이드 시험)
6주된 Sprague-Dawley계 웅성 래트(대한 바이오링크 주식회사)를 실온 25 ±1℃, 습도 50 ±5%, 명암 12시간 주기의 일정한 조건에서 고형사료(CJ 주식회사 제품)로 1주간 예비사육한 다음 시험용으로 하였다. 래트는 ① 에탄올군, ② 에탄올/HY7401군으로 분류하였으며, 각 군은 10마리로 하였으며 시험 기간은 14일로 하였으며, 사료 및 음용수는 자유롭게 섭취시켰다. 시험 기간중에 EtOH군에는 증류수를, EtOH/HY7401군에는 체중 kg 당 공시시료 용액 2 ml을 1일 1회씩 2주간 각각 강제 경구투여하였다.
공시시료 용액은 다음과 같이 제조하였다.
본 발명의 락토바실러스 브레비스 HY7401 균주를 MRS 액체배지에 접종하여 37 ℃에서 24시간 배양하였다. 이 배양물을 3,000 rpm, 4 ℃에서 10분간 원심분리하여 균체를 얻은 후 생리식염수로 2회 세척하였다. 다시 생리식염수에 1010 CFU/ml 수준이 되도록 현탁하여 공시시료 용액으로 하였다.
시험 14일째 2시간 동안 음식을 주지 않은 다음 15% 에탄올 용액으로 에탄올 1.0g/kg BW를 강제 경구투여하고, 에탄올 투여 후 30분, 1 및 6시간이 지나서 채혈하여 혈중 에탄올 및 아세트알데하이드의 양을 측정하였다. 혈중 에탄올 및 아세트알데하이드 측정은 Penton(Clin. Chem., 1987, 33:2094-2095) 의 방법을 약간 변형하여 혈청에 N,N'-dimethylformamide를 일정량 가하여 원심분리시키고 상징액을 표 3의 조건에서 개스크로마토그래피로 분석하였다. 실시예 5의 결과는 도 5와 6에 나타낸다.
개스크로마토그래피의 조건
컬럼 15% PEGS Chromosorb WAW 5 mm ID x 15 ml L glass column
온도 컬럼(Column) 130℃
주입구(Injector) 150℃
검출기 FID
이동상 흐름 속도 (Flow Rate) 공기(Air) 0.7 kg/cm2
수소(Hydrogen) 0.8 kg/cm2
질소(Nitrogen) 50 ml/min
머무름 시간 아세트알데하이드 0.67 min
에탄올 1.64 min
이상의 설명 및 실시예로부터 명백한 바와 같이, 본 발명에 따른 락토바실러스 브레비스 HY7401은 에탄올과 아세트알데하이드 분해효소 활성이 매우 높고 에탄올과 아세트알데하이드 감소능이 우수한 특성이 있다. 따라서, 본 발명의 균주를 포함하는 음식물을 섭취하였을 때 소화 장기에서 에탄올을 아세트알데하이드로 전환시켜 에탄올 흡수를 억제하고 간 손상 유발인자인 아세트알데하이드를 초산으로 전환시켜 흡수를 억제함으로써 간 보호 기능이 있다. 특히 본 발명의 균주는 건강한 한국성인의 생체에서 분리한 것이기 때문에 한국인의 장내 정착할 가능성이 높다.
그러므로, 본 발명의 균주 또는 균주를 배양한 배양물이나 발효식품을 식음 용하였을 때, 간 보호 기능 효과를 기대할 수 있다.

Claims (5)

  1. 삭제
  2. 한국인의 분변에서 분리한 에탄올과 아세트알데하이드 분해효소 활성과 감소능이 우수한 락토바실러스 브레비스 HY7401(기탁기관: 농업생명공학연구원, 기탁번호: KACC 91069, 기탁일: 2003.10.6)균주.
  3. 제2항에 따른 균주를 이용하여 발효시킨 발효식품.
  4. 제2항의 균주를 포함하는 정장제.
  5. 제2항의 균주를 포함하는 건강보조식품.
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