KR101991276B1 - 신규 균주 페니실리움 아쿠아티쿰 및 이를 이용한 퇴행성 뇌질환 치료제 - Google Patents

신규 균주 페니실리움 아쿠아티쿰 및 이를 이용한 퇴행성 뇌질환 치료제 Download PDF

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Abstract

본 발명은 신규 진균인 페니실리움 아쿠아티쿰(Penicillium aquaticum) 및 이를 이용한 퇴행성 뇌질환 치료 및 예방에 관한 발명이다.

Description

신규 균주 페니실리움 아쿠아티쿰 및 이를 이용한 퇴행성 뇌질환 치료제{Novel fungus Penicillium aquaticum and therapeutic agent for degenerative brain disease using the same}
본 발명은 새로운 진균인 페니실리움 아쿠아티쿰(Penicillium aquaticum)과 이를 이용하여 퇴행성 뇌질환을 치료 및 예방하는 기술에 관한 것이다.
오늘날 평균 수명의 증가에 따라 파킨슨병(Parkinson's　disease)과 알츠하이머병(alzheimer's　disease) 같은 퇴행성 뇌질환이 심각한 사회적 문제로 나타나고 있다.
퇴행성 뇌질환에서 뇌의 신경염증(neuroinflammation)을 일으키는 활성 별아교세포증(astrocytosis)과 활성산소(reactive oxygen species, ROS)가 신경세포 퇴화를 일으키는 주요 병인으로 대두되고 있다. 모노아민산화효소, 즉 모노아민옥시데이즈(monoamine oxidase, MAO) 중 특히 모노아민옥시데이즈-B(MAO-B)는 활성 별아교세포증을 동반하는 뇌의 신경염증 상태에서 증가하는 것으로 알려져 있으며 특히 퇴행성 뇌질환 중 알츠하이머병과 파킨슨병에 대한 연구가 많이 이루어져 왔다. 알츠하이머병 동물모델 뇌의 해마 부위에서 모노아민옥시데이즈-B의 활성이 증가하고 모노아민옥시데이즈-B의 작용에 의해 생성되는 억제성 신경전달물질 가바 (GABA) 또한 증가한다는 것이 알려져 있으며, 파킨슨병 환자 뇌의 흑질에서도 활성 별아교세포증이 관찰된다.
모노아민옥시데이즈-B의 억제는 퇴행성뇌질환 특히 파킨슨 병과 알츠하이머 병의 치료에 효과적임이 알려져 있고, 여러 문헌을 통해 모노아민옥시데이즈-B 억제제가 알츠하이머병 및 파킨슨병 치료제로서 사용되고 있음을 알 수 있다. 또한 한국 등록특허 제10-1813988호에서는 모노아민옥시데이즈-B의 활성을 억제하는 화합물을 이용하여 알츠하이머 병 및 파킨슨 병을 치료할 수 있는 약학적 조성물을 개시하고 있다.
활성산소 종에 의해 유발되는 산화적 스트레스 또한 신경세포 퇴화를 일으키는 주요 원인으로 알려져 있으며 여러 문헌에 의하면 활성산소 제거제가 알츠하이머병과 파킨슨병을 치료제로 이용될 수 있다는 것을 알 수 있다.
한국등록특허 제10-1813988호
본 발명은 신규 진균인 페니실리움 아쿠아티쿰(Penicillium aquaticum)을 제공하고, 이를 이용하여 퇴행성 뇌질환을 치료 및 예방할 수 있는 조성물을 제공하고자 한다.
본 발명은 페니실리움 아쿠아티쿰(Penicillium aquaticum)(기탁번호: KCTC 13456BP)을 제공한다.
본 발명은 페니실리움 아쿠아티쿰(Penicillium aquaticum)(기탁번호: KCTC 13456BP), 페니실리움 아쿠아티쿰(Penicillium aquaticum)(기탁번호: KCTC 13456BP)의 배양액 및 페니실리움 아쿠아티쿰(Penicillium aquaticum)(기탁번호: KCTC 13456BP)의 배양 여과액으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 모노아민옥시데이즈 B(monoamine oxidase B) 활성 증가에 의해 나타나는 퇴행성 뇌질환의 치료 또는 예방용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 페니실리움 아쿠아티쿰(Penicillium aquaticum)(기탁번호: KCTC 13456BP), 이의 배양액 또는 이의 배양 여과액은 모노아민옥시데이즈-B의 활성 억제와 활성산소제거 능력이 우수하여 알츠하이머 병 및 파킨슨 병을 포함한 퇴행성 뇌질환의 예방과 치료를 위한 주요 유효성분으로 활용할 수 있다.
도 1은 신규 진균인 페니실리움 아쿠아티쿰(Penicllium aquaticum) CNUFC-YSW8-1 균주에 의한 MAO-B 저해의 상대적 백분율을 계산하는 방법을 나타낸다.
도 2는 신규 진균인 페니실리움 아쿠아티쿰(Penicllium aquaticum) CNUFC-YSW8-1 균주 및 CNUFC-YSW8-2 균주의 계통수(phylogenetic tree)를 보여준다.
도 3은 신규 진균인 페니실리움 아쿠아티쿰(Penicllium aquaticum) CNUFC-YSW8-1 균주의 형태학적 구조를 보여준다[A 및 E는 Czapek yeast autolysate agar (CYA) 배지에서의 콜로니, B 및 F는 malt extract agar (MEA) 배지에서의 콜로니, C 및 G는 malt extract agar (MEA) 배지에서의 콜로니, D 및 H는 creatine sucrose agar (CREA) 배지에서의 콜로니, M~Q 및 S~W는 분생자경(conidiophore), R 및 X는 분생포자(conidia), I는 CREA 배지에서 CNUFC-YSW8-1 균주에 의한 산(acid) 생산, J는 MEA 배지에서의 텍스쳐(texture), K는 MEA 배지에서의 균핵(sclerotia), L은 CYA 배지에서의 텍스쳐이다. X~R은 광학현미경으로 관찰한 결과이고, S~X는 SEM 사진이다. 스케일 바(scale bar)는 M~R은 20㎛, T 및 U는 10㎛, S, V 및 W는 5㎛, X는 2㎛이다.
도 4는 페니실리움 아쿠아티쿰(Penicillium aquaticum) CNUFC-YSW8-1 균주의 배양체 여과액으로 처리한 배양 초기의 대뇌피질 별아교세포(cortical astrocytes)의 영상을 보여준다.
도 5는 페니실리움 아쿠아티쿰(Penicillium aquaticum)(기탁번호: KCTC 13456BP)의 BenA gene 서열이다.
도 6은 페니실리움 아쿠아티쿰(Penicillium aquaticum)(기탁번호: KCTC 13456BP)의 CaM gene 서열이다.
도 7은 페니실리움 아쿠아티쿰(Penicillium aquaticum)(기탁번호: KCTC 13456BP)의 RPB2 gene 서열이다.
이하 본 발명에 대하여 구체적으로 상세히 설명하고자 한다. 본 명세서에서 사용되는 용어는 따로 정의하지 않는 경우 해당 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 일반적으로 이해하는 내용으로 해석되어야 할 것이다. 본 명세서의 도면 및 실시예는 통상의 기술자가 본 발명을 쉽게 이해하고 실시하기 위한 것으로 도면 및 실시예에서 발명의 요지를 흐릴 수 있는 내용은 생략될 수 있으며, 본 발명이 도면 및 실시예로 한정되는 것은 아니다.
본 발명은 신규 진균인 페니실리움 아쿠아티쿰(Penicillium aquaticum)과 이를 이용한 퇴행성 뇌질환 치료에 관한 발명이다.
본 발명의 신규 진균인 페니실리움 아쿠아티쿰은 담수에서 채취하여 분리 및 동정 후 페니실리움 아쿠아티쿰(Penicillium aquaticum) CNUFC-YSW8-1 및 페니실리움 아쿠아티쿰(Penicillium aquaticum) CNUFC-YSW8-1로 명명하고, 2018년 1월 9일 자로 한국생물자원센터에 기탁번호 KCTC13456BP로 기탁하였다.
본 발명의 신규 진균인 페니실리움 아쿠아티쿰(Penicillium aquaticum)(기탁번호 : KCTC13456BP)은 페니실리움 마크로스크레로토리움(Penicillium macrosclerotiorum)과 연관성이 높으나, MEA(Blakeslee's malt extract agar) 배지에서 성장이 제한되고 YES(yeast extract sucrose agar) 배지에서 성장이 빠른 페니실리움 마크로스크레크레로토리움과 달리 페니실리움 아쿠아티쿰(기탁번호 : KCTC13456BP)은 MEA 배지에서 성장이 빠르고 YES 배지에서 적당한 성장(moderate growth)을 보여 페니실리움 마크로스크레로토리움과 다른 새로운 균주에 해당한다. 또한 페니실리움 아쿠아티쿰(기탁번호 : KCTC13456BP)은 CREA(creatine sucrose agar) 배지에서 산을 생산하고 5℃ 및 37℃ 조건의 CYA(Czapek yeast autolysate agar) 배지에서 제한적으로 자랄 수 있으나, 페니실리움 마크로스크레로토리움은 CREA 배지에서 산을 생산하지 못하고 5℃ 및 37℃ 조건의 CYA 배지에서 균사생장이 거의 이루어지지 않는 차이를 보였다.
본 발명의 페니실리움 아쿠아티쿰(Penicillium aquaticum)(기탁번호 : KCTC13456BP)는 모노아민옥시데이즈 B(monoamineoxidase B, MAO-B)의 활성 억제 및 활성산소 제거 효과가 있어 모노아민옥시데이즈 B의 활성이 증가로 발병하거나 모노아민옥시데이즈 B의 증가가 주요 병증인 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료를 위한 치료제로 사용할 수 있다.
본 발명에서 퇴행성 뇌질환은 모노아민옥시데이즈 B 활성 증가와 활성산소 증가와 관련성이 높은 알츠하이머 병 또는 파킨슨 병이나 이에 제한되지 않고, 모노아민옥시데이즈 B 활성 증가 및 활성산소 증가로 인해 발병하거나 모노아민옥시데이즈 B 및 활성산소증가가 주요 병증인 퇴행성 뇌질환을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면 페니실리움 아쿠아티쿰(Penicillium aquaticum)(기탁번호 : KCTC13456BP) 균체 자체로 모노아민옥시데이즈 B의 활성을 억제할 수 있다. 균체 자체뿐만 아니라, 페니실리움 아쿠아티쿰(Penicillium aquaticum)(기탁번호 : KCTC13456BP)의 배양액, 페니실리움 아쿠아티쿰(Penicillium aquaticum)(기탁번호 : KCTC13456BP)의 배양액을 여과한 배양 여과액도 모노아민옥시데이즈 B의 활성 억제 및 활성산소를 제거하는데 사용할 수 있다.
배양액 및 배양액의 여과액 외에도 배양액의 동결건조 분말, 배양 여과액의 동결건조 분말 또는 동결건조 분말을 용해한 용액을 퇴행성 뇌질환의 치료제로 사용할 수 있다.
본 발명에서 배양액은 균체를 배지에 배양하여 균체가 생성한 물질, 균체 자체 및 배지를 포함할 수 있다.
본 발명에서 배양 여과액은 배양액을 원심분리하여 얻은 상등액, 상층액을 여과하여 얻은 액체를 포함할 수 있다.
본 발명은 페니실리움 아쿠아티쿰(Penicillium aquaticum)(기탁번호: KCTC 13456BP), 페니실리움 아쿠아티쿰(Penicillium aquaticum)(기탁번호: KCTC 13456BP)의 배양액 및 페니실리움 아쿠아티쿰(Penicillium aquaticum)(기탁번호: KCTC 13456BP)의 배양 여과액로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 모노아민옥시데이즈 B(monoamine oxidase B) 활성 증가에 의해 나타나는 퇴행성 뇌질환 치료 또는 예방용 약학적 조성물을 제공할 수 있다.
본 발명에서 약학적 조성물은 페니실리움 아쿠아티쿰(Penicillium aquaticum)(기탁번호: KCTC 13456BP), 이의 배양액 및 배양액의 여과액 외에도 페니실리움 아쿠아티쿰(Penicillium aquaticum)(기탁번호: KCTC 13456BP)의 균체, 배양액 또는 배양 여과액에 존재하는 모노아민옥시데이즈 B 활성을 억제하고 활성산소를 제거할 수 있는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염, 용매화물 또는 전구체 화합물을 포함할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 퇴행성 뇌질환을 치료하기 위한 치료제로서, 정제 또는 액상의 형태로 경구 투여나 주사로 투여할 수 있다. 정제 또는 액상과 같은 제형은 공지의 방법에 따라 제조할 수 있으며 경구 투여나 주사 투여시 환자의 증상에 따라 투여량을 적절하게 조절할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물의 제조 방법은 페니실리움 아쿠아티쿰(Penicillium aquaticum)(기탁번호: KCTC 13456BP)을 배양 배지에 배양하는 단계 및 아쿠아티쿰(Penicillium aquaticum)(기탁번호: KCTC 13456BP)을 배양하여 얻은 배양액을 수득하여 제형화 하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물의 제조 방법은 배양액을 원심분리하여 층분리가 일어난 배양액의 상등액을 얻어 상등액을 제형화하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물의 제조 방법은 배양액을 원심분리하여 층분리가 일어난 배양액의 상등액을 여과하여 얻은 배양 여과액을 제형화하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명에서 페니실리움 아쿠아티쿰(Penicillium aquaticum)(기탁번호: KCTC 13456BP)을 배양하기 위한 배지는 MEA(Blakeslee's malt extract agar) 배지, YES(yeast extract sucrose agar)배지, CREA(creatine sucrose agar) 배지 및 CYA(Czapek yeast autolysate agar) 배지에서 선택되는 배지일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
이하에서 본 발명에 대한 실시예를 통해 보다 구체적으로 설명하며, 본 발명이 하기 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.
이하 실시예에서 사용한 실험재료는 다음과 같다.
실험재료 및 방법
세레길린(Selegiline), MTT 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide(Sigma, St. Louis, Mo., USA), AAD-2004(Korea, GNT Pharma), 다른 화합물들은 Merck, Sigma, Junsei에서 구입하여 사용하였다.
진균의 동정
실시예 1-1. 새로운 진균의 동정을 위한 샘플링 및 분리
광주 영산강(Korea, Gwangju, Yeongsan River)에서 담수 샘플을 채취하고, 무균의 50㎖ 원뿔 튜브에 담아 실험실로 옮기고 4℃에서 보관하였다. 배양 전, 밀도 감소 및 균주(strain) 회복 개선을 위해 모든 샘플을 멸균된 증류수로 희석하였다.
각각의 샘플은 실온에서 15분간 진탕 시킨 다음 각 샘플의 100㎕ 앨리쿼트(aliquot)를 9㎖의 멸균 증류수와 혼합하였다(혼합물). 이후 혼합물을 10-1 내지 10-4까지 순차적으로 희석하여 준비하였다. 샘플에서 진균을 배양하기 위해 희석액으로부터 100㎕ 앨리쿼트를 채취해 1L 초순수증류수에 PDA(39g potato dextrose agar [Becton, Dickinson, and Co., Sparks, MD, USA] in), GPYA(5g yeast extract[Difco-Becton], 5g peptone[Difco-Becton], 20g glucose[Daejung Chemicals and Metals Co., Ltd., Korea], 15g agar 및 살균수 1000㎖) 및 SDA(40g glucose, 10g peptone, 15g agar 및 살균수 1000㎖)에 스프레딩하였다. 항생제인 클로람페니콜(최종 농도 50ppm, 수용성, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)도 처리하였다.
배양체(culture)의 형태가 구별될 때까지 접종된 페트리 플레이트를 3-7 일 동안 25에서 배양 한 다음, 각각의 진균들을 골라서 새로운 PDA 플레이트 상으로 옮겼다. 전남대학교 환경미생물학연구실에서 순수분리된 진균을 -80 에서 20 % 글리세롤에 보관 하였다.
실시예 1-2. DNA 추출, PCR 및 시퀀싱(sequencing)
분리한 진균을 셀로판으로 덮힌 PDA에서 25 조건으로, 3 내지 5일 동안 배양하였다. Solgent Genomic DNA prep kit(Solgent Co. Ltd., 대전, 한국)를 이용하여 총 게놈 DNA를 추출하였다. Bt2a/Bt2b (Glass & Donaldson 1995), CMD5/CMD6 (Samson et al., 2004) 및 RPB2-5F/RPB2-7cR (Liu et al., 1999) 프라이머 세트로 부분 BenA 유전자(베타 튜블린(beta-tubulin) 암호화), 부분 CaM 유전자(칼모듈린(calmodulin) 암호화) 및 부분 RPB2 유전자(RNA 중합 효소 II 암호화)를 증폭하였다([표 1]).
PCR을 위한 샘플 각각은 2㎕의 곰팡이 DNA 주형(10 ng); 각 프라이머(5pM/㎕) 1.5㎕; Taq DNA 중합효소, dNTP, 완충액 및 트래킹 다이(tracking dye)를 함유한 1㎕ Accupower®PCR premix(Bioneer Corp., 대전, 한국); 및 14㎕의 멸균 수(sterile water)를 함유한다. PCR 생성물을 Accuprep®PCR 정제 키트 (Bioneer)로 정제하고 ABI 3700 Automated DNA sequencer(Applied Biosystems Inc., Foster City, CA, USA)로 서열 분석 하였다.
[표 1]
Figure 112018006929717-pat00001
실시예 1-3. 계통발생분석(Phylogenetic analysis)
GenBank 데이터베이스([표 1])에서 얻은 곰팡이 시퀀스는 Clustal_X v.1.83 (Thompson et al., 1997)을 사용하여 정렬하고 Bioedit v.5.0.9.1(Hall 1999)로 분석하였다. 계통 발생 분석은 MEGA 6(Tamura et al., 2013)을 기본 설정으로 사용하여 수행되었다. CNUFC-YSW8-1, CNUFC-YSW8-2 및 Gracilenta 섹션(the section Gracilenta) 관련 종을 포함하는 계통 발생 수는 최대 우도 분석(the maximum likelihood analysis)에 의해 BenA, CaM 및 RPB2에 대한 복합 데이터 세트를 사용하여 구성되었고, Talaromyces flavus가 아웃 그룹으로 선정되었다.
각각의 균주에 대한 Basic Local Alignment Search Tool (BLASTn)(NCBI) 검색에 의해 서열 일치율을 얻었다. 내부 브랜치의 신뢰성은 1000 부트 스트랩 복제(1000 bootstrap replicates)를 사용하는 p-거리 대체 모델을 사용하여 평가하였다.
실시예 1-4. 형태학적 분석
분리한 진균을 블레이크슬리(Blakeslee)의 맥아 추출물 한천(MEA; Blakeslee 1915), yeast extract sucrose 한천(YES; Frisvad 1981), Czapek yeast autolysate agar(CYA; Pitt 1979) 및 크레아틴 자당 한천(CREA; Frisvad 1981)에서 배양하였다. 플레이트 (각 배지에 대해 3 복제물)를 3-점(three-point)에 접종하였다. 7일간 배양한 후 암실에서 5, 20℃, 25, 30 및 37에서의 성장을 시험하였다. 샘플을 락토페놀용액(Junsei Chemical Co. Ltd., Tokyo, Japan)에 마운팅하고 DIC 광학 장치(Olympus, Tokyo, Japan)가 장착된 Olympus BX51 현미경으로 관찰 하였다.
미세 균질 구조는 주사 전자 현미경(SEM)(Hitachi S4700; Hitachi, Tokyo, Japan)로 관찰하였다. 분리 균주를 0.05M 인산 완충액(pH 7.2) 중 2.5% 파라 포름알데히드 - 글루타르알데히드 paraformaldehyde-glutaraldehyde)에 2시간 동안 고정시킨 후, 카코딜염산(cacodylate) 버퍼(Junsei Chemical Co. Ltd.)로 세척 하였다. 카코딜염산에 1 시간 동안 희석한 1% 오스뮴테트록시드(Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA)에 시료를 고정시킴으로써 세포막을 보존 하였다. 샘플을 다시 카코딜염산 버퍼로 세척하고, 에탄올(graded ethanol) (Emsure, Darmstadt, Germany) 및 이소아밀아세테이트(isoamyl acetate)(Junsei Chemical Co. Ltd.)로 탈수시키고 흄 후드(fume hood)에서 건조시켰다. 마지막으로, 샘플을 금으로 스퍼터 코팅하고 한국기초과학연구소에서 Hitachi S4700 FE-SEM(field emission scanning electron microscope)을 사용하여 관찰 하였다.
실시예 1-5. 계통발생분석 결과(Phylogenetic analysis)
Penicllium aquaticum CNTFC-YSW8-1, Penicllium aquaticum CNUFC-YSW8-2 및 관련 종 사이의 계통 발생 관계를 분석하기 위해 ITS와 BenA(서열번호 7), CaM(서열번호 8) 및 RPB2(서열번호 9) 유전자를 이용하였다([표 2]). BenA은 베타 튜블린(beta tubulin)을 인코딩(encoding)하는 유전자이고, CaM은 칼모듈린(calmodulin)을 인코딩하는 유전자이고 및 RPB2는 RNA 폴리머레이즈 II를 인코딩하는 유전자이다.
[표 2]
Figure 112018006929717-pat00002
CNUFC-YSW8-1과 -2 균주의 ITS rDNA 서열을 GenBank에서 추출한 관련 종과 비교했을 때, BLASTn 검색에 의한 서열 분석 결과 CNUFC-YSW8-1과 -2가 Penicillium macrosclerotiorum CBS 116871(GenBank 접근번호 KJ834511), Penicillium sp. F40 (GenBank 접근번호 JF439502)) 및 Penicillium sp. F33 (GenBank 접근번호 JF439500)와 99.4 % (509/512 bp)의 유전자 상동성을 나타냈다. P. macrosclerotiorum CBS 116871의 2개 베타 튜불린 서열은 새로운 진균의 BenA와 96.0 % (408/425 bp) 및 95.9 % (400/417 bp)의 서열 상동성을 보였다. P. macrosclerotiorum AS3.6581과 CBS 116871의 칼모듈린 서열은 새로운 진균과 각각 95.8 % (395/412 bp)와 95.7 % (387/404 bp)의 서열 상동성을 나타냈다(도 2). P. macrosclerotiorum CBS 116871의 두 RPB2 서열은 새로운 진균과 98.3 % (855/869 bp) 및 98.1 % (887/895 bp)의 서열 상동성을 나타냈다.
계통수(phylogenetic trees)는 CNUFC-YSW8-1 및 -2의 BenA, CaM 및 RPB2와 GenBank에서 추출한 Gracilenta 섹션에 속하는 관련 종(도 2)에 대한 데이터 세트를 통해 추론되었다. 계통 발생 분석은 Gracilenta 섹션에 분리한 진균을 두었고, 분리 진균은 별도의 클레드(clade)를 형성하여 분리 진균이 별개의 Penicillium 종이라는 것을 보여 주었다.
실시예 1-6. 형태태학적 분석 결과
진균 콜로니는 MEA 배지에서 빠르게 성장하여 29 내지 30nm 직경에 도달하였다. 25℃ 조건의 7일 동안 녹색 분백(greenish glaucous) 에서 어두운 녹색까지; 올리브 황색에서 올리브 회색으로 바뀌었다. 분생자경 (conidiophores)는 단일 윤생상(monoverticillate)으로 형성되며, 대(stipe)는 완만하고, 길이가 다양하며, 격벽을 형성하며, 2-3.5㎛ 폭을 가지며, 포자형성기관인 피알라이드(phialide)는 매끄러우며, 꽃모양이며, verticil 당 4-10개 이었다. 분생포자(conidia)는 약간 거칠며, 구형에서 반구형의 모양이며 크기는 2.0~4.0㎛ × 2.0~4.0㎛ 이었다(도 3 M~X).
새로운 진균은 MEA, CYA 및 YES 각각의 배지에서 다양한 성장속도 및 다양한 온도 범위에서 성장하였다. MEA, CYA 및 YES에서 Penicllium aquaticum CNUFC-YSW8-1 균주의 평균 성장 속도는 24시간 동안 각각 4mm, 4.5mm 및 4mm이었고, 최적의 성장은 25℃에서 관찰되었고, 20℃에서는 느린 성장이 관찰되었고, 37℃에서는 생장을 하나 현저히 떨어지는 것이 관찰되었다(도 3 A~H).
새로운 진균을 Penicillium aquaticum sp. nov. CNUFC-YSW8-1 및 CNUFC-YSW8-2로 명명하고 한국생명공학연구원 생물자원센터(KCTC)에 기탁하였다.
기탁번호 : KCTC 13456BP
기탁일자 : 2018년 1월 8일
기탁처 : 한국생명공학연구원 생물자원센터
신규 Penicllium aquaticum 의 MAO-B 활성 억제 및 활성산소 제거 확인
실시예 2-1. 배양 브로스(culture broth)의 준비
Penicllium aquaticum CNUFC-YSW8-1은 PDA 배지(Becton, Dickinson and Co.)에서 25℃조건으로 7일간 배양하였다. 121에서 15분간 멸균한 500㎖ 삼각 플라스크에 100㎖내 감자추출즙액배지(potato dextrose broth, PDB)에 진균 균사(fugal mycelia) 6.5mm를 넣었다. Penicllium aquaticum CNUFC-YSW8-1을 수평 항온 배양기에서 150rpm으로 10일 동안 25℃에서 배양하였다. 그 후 원심 분리로 배양액을 분리하고 0.2㎛ 멤브레인 필터를 사용하여 배양액을 여과하였다.
실시예 2-2. Mao-B 억제 어세이 (Mao-B inhibition assay) 실험
Amplex Red Monoamine Oxidase Assay Kit(Thermo Fisher Scientific, A12214)을 사용하여 MAO-B 효소 활성 분석을 수행 하였다. 수행 방법은 제조사의 실험 방법에 따라 수행하였다. 이 키트에는 5 X 반응 버퍼(5× reaction buffer), Amplex Red 시약, 겨자무과산화효소(horseradish peroxidase), DMSO, H2O2 및 벤질 아민(MAO-B 기질)이 포함되어 있다. 먼저 MAO-B 효소(Sigma, M7441) 0.5㎍을 1X 반응 완충액 (0.05M 인산 나트륨, pH 7.4) 100㎕에 용해시켰다.
MAO-B 용액에 Penicillium aquaticum 배양 여과액 1㎕를 첨가하여 37℃에서 1 시간 배양하였다. 다음으로 400μM Amplex Red 시약, 2units/㎖ 겨자무과산화효소, 2mM benzylamine를 포함하는 100㎕의 반응 혼합물을 시료에 첨가하고 37℃에서 2시간 동안 배양하였다. 색 변화는 Infinite M200 PRO 마이크로 플레이트 리더(TECAN)로 570nm에서의 흡광도를 측정하여 정량화 하였다.
MAO-B 억제 효과 확인을 위해, MAO-B 억제제로 알려진 세레길린(selegiline)을 사용하였다. 세레길린을 기준으로 배양 여과액의 MAO-B에 대한 상대적 저해 효과를 계산하였다. 구체적으로 세레길린에 대한 MAO-B 억제 분석을 수행하고 570nm에서의 흡광도가 투여량의 변화에 따라 변하는 셀레길린의 용량-반응 곡선(dose-response curve)을 그렸다. 다음으로 최대 흡광도를 0% 억제로하고, 최소 흡광도를 100% 억제로 간주하였다. 마지막으로, 배양액 여과액의 흡광도를 세레길린의 용량-반응 곡선에 적용하고 Penicllium aquaticum CNUFC-YSW8-1에 의한 MAO-B 저해의 상대적 백분율을 계산하였다(도 1).
실시예 2-3. H 2 O 2 생성 어세이 ( H 2 O 2 production assay)
H2O2 생성은 Amplex Red Monoamine Oxidase Assay Kit (Thermo Fisher Scientific, A12214)를 사용하였고, 매뉴얼을 일부 변형하여 측정하였다. 먼저, 10μM H2O2, Amplex Red 시약, 2unit/㎕ 겨자무과산화효소 및 10μM AAD-2004 또는 배양 여과액을 1 x 반응 완충액(0.05M 인산 나트륨, pH 7.4)에 용해시켰다. 이후 시료를 37℃에서 15분 동안 배양하였다. 15분 배양 후, Infinite M200 PRO 마이크로 플레이트 리더 (TECAN)로 흡광도 값을 540 및 580nm에서 분광 광도계로 측정 하였다. 이어서, 흡광도 값과 농도 사이의 표준 곡선 방정식을 사용하여 H2O2 생성을 측정 하였다.
H2O2 소거 효과를 입증하기 위해, 강력한 H2O2 소거제(scavenger)로 알려진 AAD-2004를 비교 대상으로 사용하였다. 10μM AAD-2004의 H2O2 소거 효과와 배양 여과액의 H2O2 상대적 소거 효과를 계산하였다. 10μM H2O2를 사용하여 10μM AAD-2004에 의한 H2O2 소거 효과를 확인하였고, 10μM AAD-2004의 흡광도 값을 100% 소거 효과로하고, 약물이 없는(no-drug) 조건의 흡광도를 0% 소거 효과로서 간주했다. 이 후 AAD-2004를 기준으로 Penicllium aquaticum CNUFC-YSW8-1의 H2O2 소거 효과의 상대 백분율을 계산했다.
실시예 2-4. MTT 어세이 ( MTT assay)
한국 세포주 은행(서울대학교, 한국)에서 얻은 HEK 293T 세포, 또는 C57BL/6J 마우스(P0)에서 일차 배양된 대뇌피질 별아교세포 (primary cultured cortical astrocytes)를 준비하였다. 준비된 세포를 트립신 처리 후 96 웰-플레이트에 도말 하였다. 이들 세포를 일정 컨플루언시(confluency)에 도달할 때까지 6 내지 24 시간 동안 배양하였다. 배양 후 Penicllium aquaticum CNUFC-YSW8-1의 배양 여과액 100㎕를 각 웰에 넣었다. 이 후 추가로 12 내지 24시간 더 배양하였다.
PBS(1mg/㎖, 2.41mM)에 녹인 티아졸릴블루테트라졸륨브로마이드(thiazolyl blue tetrazolium bromide)(MTT; Sigma, M1218) 20㎕를 세포에 첨가하고 세포를 37℃에서 3 내지 4 시간 동안 배양하였다. 현미경을 통해 관찰시 보라색 침전물이 분명하게 보이면 배지를 제거하였다. 다음으로, 100㎕ 디메틸술포사이드(dimethyl sulfoxide, DMSO)를 첨가하여 포르마잔 결정(formazan crystals)을 용해시켰다. 플레이트는 빛으로부터 보호하였고, 부드럽게 10 내지 15 분 동안 회전시켰다. 색 변화는 Infinite M200 PRO 마이크로 플레이트 리더(TECAN)로 570 nm에서의 흡광도를 측정하여 정량화 하였다.
실시예 2-5. MAO-B 억제 활성(inhibitory activity) 및 H 2 O 2 소거 효과(scavenging effect)
Penicillium aquaticum CNUFC-YSW8-1의 배양 여과액을 벤질 아민과 같은 기질을 알데히드로 전환시켜 H2O2를 생성하는 인간 MAO-B(hMAO-B)에 대해 시험 하였다. 억제 효과는 Amplex Red® MAO Assay Kit(Thermo Fisher Scientific)을 사용하여 H2O2의 양을 벤질 아민 및 배양 여과액으로 동시 처리 한 후 측정하여 시험 하였다. 배양 여액의 MAO-B에 대한 억제 효과는 세레길린에 의한 완전 억제의 57.7 %였다 ([표 3]).
[표 3]
Figure 112018006929717-pat00003
실시예 2-6. 세포독성( Cytotoxicity )
MTT 어세이 수행 결과 Penicillium aquaticum CNUFC-YSW8-1의 배양 여과액을 처리하였을 때 세포 생존율은 80.08%로 나타났고, 대조군인 안티마이신(antimycin) 100Μm을 처리하였을 때 세포 생존율은 1.25%에 불과한 것으로 나타났다(상기 [표 3], 도 4).
<110> CHONNAM NATIONAL UNIVERSITY <120> Novel fungus penicillium aquaticum and therapeutic agent for degenerative brain disease using the same <130> P18010220022 <160> 9 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BenA Forward primer(Bt2a) <400> 1 ggtaaccaaa tcggtgctgc tttc 24 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BenA Reverse primer(Bt2b) <400> 2 accctcagtg tagtgaccct tggc 24 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CaM Forward primer(CMD5) <400> 3 ccgagtacaa ggargccttc 20 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CaM Reverse primer(CMD6) <400> 4 ccgatrgagg tcatracgtg g 21 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RPB2 Forward primer(5F) <400> 5 gaygaymgwg atcayttygg 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RPB2 Reverse primer(7CR) <400> 6 cccatrgctt gyttrcccat 20 <210> 7 <211> 431 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Penicillum aquaticum CNUFC-YSW8-1 sp. nov. (BenA gene [encoding beta tubulin] <400> 7 ggcaaccacc tcaattggcc tttcaatata ctgaccagat atacaggcag accattgctg 60 gtgagcacgg ccttgacggc gatggccagt aagttatctc tcagcacaca atgggacacg 120 gaatggcggt ctgatgtttt gacagctaca atggcacctc cgacctccag ctggagcgta 180 tgaacgttta cttcacccac gtaaggagcc ttgtacctca ttactacact actcaatggc 240 atatccatgc tgatatgact cgcgttttct ctttaggcca gcggtgataa gtacgttccc 300 cgtgccgtcc tggtcgattt ggagcccggt accatggatg ctgtccgtgc cggtcccttt 360 ggcaagcttt tccgccccga caacttcgtc ttcggtcagt ccggtgctgg taacaactgg 420 gccaagggtc a 431 <210> 8 <211> 450 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Penicillum aquaticum CNUFC-YSW8-1 sp. nov. (CaM gene [encoding calmodulin]) <400> 8 ttttcgcggc aacaggacaa ggatggcgat ggtgagtgag attccttcgg gcagcttgcg 60 cgtcctccca agaagcgaag actggaggaa taagtatatt gagacatttg caattcatag 120 gccagatcac caccaaggag ctgggcaccg tcatgcgctc tctcggtcag aacccctccg 180 agtcggagct gcaggatatg atcaacgagg tcgatgccga caacaacggc accattgact 240 tccccggtac gcaatacccc ttctagtcct gccgccttcc tgtccgggac ccatattgac 300 aagcgcccgc agagttcctc accatgatgg cccgcaagat gaaggacacc gactccgagg 360 aggagatccg ggaggccttc aaggtgttcg atcgtgacaa caacggcttc atctccgccg 420 ccgagctgcg ccacgtcatg acctccatcg 450 <210> 9 <211> 888 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Penicillum aquaticum CNUFC-YSW8-1 sp. nov. (RPB2 gene [encoding RNA polymerase II]) <400> 9 ttatctcaat gttggcctca agtccatcac cctgactggt ggtctcaagt acgccttggc 60 aacgggtaac tggggtgaac agaagaaggc cgctagcgcc aaggctggtg tgtctcaagt 120 gctcagtcgt tatacctatg cctctacctt atctcacttg cgccgtacca atacgcccat 180 tggccgagat ggcaagattg ccaagccgcg ccaacttcat aacactcact ggggcctggt 240 gtgtcctgct gaaactcctg aaggtcaagc ttgtggtctt gtcaagaatt tggcactcat 300 gtgctatatt actgtcggca cacccagcga gcccatcatc gatttcatga tcaaccgcaa 360 catggaagtc ctcgaagaat ttgagcctca agtcacaccg aatgctacca aggtgtttgt 420 gaacggtgtc tgggttggta tccaccgtga tccttcccac cttgtcagca ccatgcaatc 480 tttgcgtcga cgaaacttga tttctcccga ggtcagtctg attcgtgata ttcgtgagcg 540 agaattcaag attttcaccg acgccggacg agtgtgtcgc cccttgttcg tggtggataa 600 tgatcccaag agccggaatg ctggatcatt ggtcctcaac aaggaccaca ttcgcagtct 660 agaacaagac aaggatttgc cgccagatct agacccagaa gaacgccggg aacgctattt 720 cggatgggaa ggactggtga gatcaggagc tgtggaaatt gtggatgcgg aggaagagga 780 aacgattatg attgtgatga cacccgaaga cttggagatc tccaagcaac ttcaagctgg 840 ctatgcactg ccagaggagg agaccaatga tcccaacaag cgagtccg 888

Claims (5)

  1. 페니실리움 아쿠아티쿰(penicillium aquaticum) CNUFC-YSW8-1(기탁번호: KCTC 13456BP).
  2. 제1항에 있어서,
    상기 페니실리움 아쿠아티쿰 CNUFC-YSW8-1은 모노아민옥시데이즈 B(monoamine oxidase B) 활성을 억제하는 것을 특징으로 하는 페니실리움 아쿠아티쿰(Penicillium aquaticum) CNUFC-YSW8-1(기탁번호: KCTC 13456BP).
  3. 제1항에 있어서,
    상기 페니실리움 아쿠아티쿰 CNUFC-YSW8-1은 활성산소를 소거하는 것을 특징으로 하는 페니실리움 아쿠아티쿰(Penicillium aquaticum) CNUFC-YSW8-1(기탁번호: KCTC 13456BP).
  4. 페니실리움 아쿠아티쿰(Penicillium aquaticum) CNUFC-YSW8-1(기탁번호: KCTC 13456BP)의 배양액 및 페니실리움 아쿠아티쿰(Penicillium aquaticum) CNUFC-YSW8-1(기탁번호: KCTC 13456BP)의 배양 여과액으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 모노아민옥시데이즈 B(monoamine oxidase B) 활성 증가에 기인하여 나타나는 퇴행성 뇌질환 치료 또는 예방용 약학적 조성물.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 퇴행성 뇌질환은 파킨슨병(Parkinson's　disease) 또는 알츠하이머병(alzheimer's　disease)인 약학적 조성물.
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Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1999062335A1 (fr) * 1998-06-02 1999-12-09 Nissan Chemical Industries, Ltd. Derive de phenylhydrazine, agent antibacterien et antifongique, algicide industriel et agent de prevention de la fixation d'organismes, comprenant ledit derive
KR20170032815A (ko) * 2015-09-15 2017-03-23 경희대학교 산학협력단 신규 유산균 및 퇴행성 뇌질환 또는 인지기능의 예방, 개선 또는 치료용 조성물
KR101813988B1 (ko) 2009-10-19 2018-01-02 아미쿠스 세라퓨틱스, 인코포레이티드 중추신경계의 퇴행성 질환을 예방 및/또는 치료하는 신규 조성물

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