CN109758484B

CN109758484B - 微生物在治疗和/或预防免疫介导的肠道疾病中的应用

Info

Publication number: CN109758484B
Application number: CN201910119143.7A
Authority: CN
Inventors: 王�锋
Original assignee: Shanghai Jiaotong University School of Medicine
Current assignee: Shanghai Jiaotong University School of Medicine
Priority date: 2019-02-18
Filing date: 2019-02-18
Publication date: 2020-12-25
Anticipated expiration: 2039-02-18
Also published as: CN109758484A

Abstract

本发明提供了微生物在制备治疗和/或预防免疫介导的肠道疾病的产品中的应用，所述的微生物为双歧杆菌和/或乳酸杆菌。优选的，所述的肠道疾病为CTLA‑4和/或PD‑1检测点阻断所诱导的肠道疾病。

Description

微生物在治疗和/或预防免疫介导的肠道疾病中的应用

技术领域

本发明涉及肠道菌群技术领域，具体涉及一种治疗和/或预防肠道疾病的包含短双歧杆菌(Bifidobacterium Breve)的产品及其应用，尤其在于短双歧杆菌(Bifidobacterium Breve)在治疗和/或预防由免疫检测点阻断所诱导的肠道疾病。

背景技术

双歧杆菌是典型的肠道菌群，与人体体重、消化能力、抵御感染、自身免疫疾病的患病风险及人体对癌症治疗药物的反应有关。

免疫检查点疗法在临床治疗取得了很大的成功。免疫检查点阻断药物通过降低阻断T细胞信号和功能的抑制信号促进T细胞抗肿瘤免疫。单克隆抗体(mAbs)抗CTLA-4(细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白-4)在黑色素瘤治疗中取得成功，并且是第一个经U.S.FDA批准的。然而，免疫检查点抑制剂(ICIs)的应用能够引起免疫相关不良反应，其中最常见的包括胃肠道irAE，其中最多的为结肠炎，严重可能危及生命。

有研究发现，肠道菌群组成的功能与调节免疫检查点治疗效率有关系。例如，双歧杆菌的存在能够通过触发特定的CD4+T细胞反应辅助抗CTLA-4治疗中的抗肿瘤反应。还有，抗菌免疫反应能够刺激宿主免疫系统，并且以CD8+T细胞依赖性的方式对抗PD-1治疗产生应答。对于免疫检查点抑制剂(ICIs)的应用能够引起的结肠炎的治疗具有很好的功效。

专利WO2018195180A1公开了一种预防和/或治疗受试者的小肠结肠炎的方法，包括给予受试者治疗有效量的包含微生物群和/或胆汁酸的组合物，所述的微生物群包含双歧杆菌。专利WO2018194889A1公开了一种治疗或预防个体自身免疫疾病的方法，包括给予个体胃肠道递送包含双歧杆菌在内的微生物群组合物，所述的自身免疫疾病包括炎症性肠道疾病。文献Bifidobacterium can mitigate intestinal immunopathology in thecontext of CTLA-4 blockade公开了双歧杆菌可以减轻由CTLA-4阻断条件下引起的肠道免疫疾病。但是对于是双歧杆菌属中的何种双歧杆菌具有治疗作用依然没有明确。

因此，专利IN201817023956A公开了一种细菌组合物用于治疗或预防胃肠疾病相关症状，所述的细菌组合物中可以包含长双歧杆菌。专利IN201817007344A、WO2018143678A1、CN108220206A、CN108486000A也公开了长双歧杆菌可以用于缓解结肠炎。专利CN108473944A公开了长双歧杆菌、短乳酸杆菌、植物乳酸杆菌具有治疗或预防肠损伤、结肠炎的功能。

在此基础上，本发明人惊奇的发现短双歧杆菌及短双歧杆菌与鼠李糖乳酸菌的混合均具有治疗和/或预防免疫检测点阻断所诱导的肠道疾病的功效。

发明内容

本发明的第一方面提供了一种微生物、其培养物、其裂解物或其提取物在制备治疗和/或预防免疫介导的肠道疾病的产品中的应用，所述的微生物选自双歧杆菌和/或乳酸菌。

在本发明的实施方式中，所述的双歧杆菌选自长双歧杆菌、短双歧杆菌、两歧双歧杆菌、青春双歧杆菌、婴儿双歧杆菌或乳酸双气杆菌。优选的，本发明所述的双歧杆菌为短双歧杆菌。

在本发明的实施方式中，所述的乳酸菌选自乳酸杆菌，例如，植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌和唾液乳杆菌。优选的，本发明所述的乳酸菌为鼠李糖乳杆菌。

在本发明的实施方式中，所述的免疫介导的肠道疾病为免疫检查点阻断所诱导的肠道疾病，包括选自CTLA-4、PD-1/PD-L1、TIM-3、LAG-3、4-1BB、OX40或CD27等免疫检测点阻断所诱导的肠道疾病。优选的，所述的免疫介导的肠道疾病为CTLA-4或PD-1检测点阻断所诱导的肠道疾病，或者，所述的免疫介导的肠道疾病为CTLA-4和PD-1检测点同时阻断所诱导的肠道疾病。

在本发明的实施方式中，所述的免疫介导的肠道疾病为免疫介导的肠道损伤和/或结肠炎。所述的肠道疾病选自十二指肠、空肠、回肠、盲肠、结肠或直肠疾病。优选的，所述免疫介导的肠道疾病选自免疫介导的肠道炎症或肠道损伤，本领域技术人员可以理解，所述的肠道炎症或肠道损伤的症状选自恶心、呕吐、腹痛、腹胀、腹泻、便秘、发热、肠梗阻或肠瘘等。

在本发明的一个具体的实施方式中，令人惊奇的发现，当施用双歧杆菌和乳酸菌的组合时，对治疗和/或预防免疫介导的肠道疾病具有优异的效果。因此，本发明的第二方面提供了组合物在制备治疗和/或预防免疫介导的肠道疾病的产品中的应用，所述的组合物包括：a)双歧杆菌、其培养物、其裂解物或其提取物，以及b)乳酸菌、其培养物、其裂解物或其提取物；优选的，所述的双歧杆菌为短双歧杆菌，所述的乳酸菌为鼠李糖乳杆菌。

本发明的第三方面提供了微生物、其培养物、其裂解物或其提取物在制备治疗和/或预防免疫检查点抑制剂的不良反应的产品中的应用，所述的微生物选自双歧杆菌和/或乳酸菌。

本领域技术人员可以理解，本发明所述的免疫检查点抑制剂包括了对免疫检查点起抑制作用的药物，包括对CTLA-4、PD-1/PD-L1、TIM-3、LAG-3、4-1BB、OX40或CD27等起抑制作用的生物药、化学药或天然提取物。

在本发明的实施方式中，所述的免疫检查点抑制剂优选为CTLA-4、PD-1/PD-L1、TIM-3、LAG-3、4-1BB、OX40或CD27的抗体，例如是单克隆抗体。在本发明的实施方式中，所述的免疫检查点抑制剂选自ipilimumab、nivolumab、pembrolizumab、atezolizumab、avelumab、durvalumab、sintilimab、特瑞普利单抗等。

在本发明的实施方式中，所述免疫检查点抑制剂的不良反应为肠道不良反应。优选的，所述的免疫检查点抑制剂的不良反应为肠道损伤和/或结肠炎。优选的，所述的治疗和/或预防免疫检查点抑制剂的不良反应是通过调节肠道菌群实现的，即本发明所述的预防免疫检查点抑制剂的不良反应的产品为调节肠道菌群的产品。

本发明的第四方面提供了组合物在制备治疗和/或预防免疫检查点抑制剂的不良反应的产品中的应用，所述的组合物包括a)双歧杆菌、其培养物、其裂解物或其提取物，以及b)乳酸菌、其培养物、其裂解物或其提取物；优选的，所述的双歧杆菌为短双歧杆菌，所述的乳酸菌为鼠李糖乳杆菌。

本发明所述的产品选自食品和/或药品。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的产品为食品，所述的食品包括双歧杆菌或乳酸菌、其培养物、其裂解物或其提取物，还包括食品学上接受的辅料。其中，所述的食品学上接受的辅料选自载体、赋形剂、稀释剂、润滑剂、润湿剂、乳化剂、悬浮液稳定剂、防腐剂、甜味剂以及香料中的一种或两种以上的组合。所述的食品的种类不受特别限制，可以为任何已知的食品，例如，奶制品、饼干、糕点、饮料、保健品等。所述食品选自固体、乳品、溶液制品、粉末制品和悬浮液制品中的至少一种形式。所述食品学上可接受的辅料选自乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖、淀粉、阿拉伯胶、磷酸钙、藻酸盐、明胶、硅酸钙、细结晶纤维素、纤维素、水、糖浆、甲基纤维素、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁和矿物油中的一种或两种以上的组合。

在本发明的另一个具体实施方式中，所述的产品为食品，所述的食品包括a)双歧杆菌、其培养物、其裂解物或其提取物，还包括b)乳酸菌、其培养物、其裂解物或其提取物及食品学上接受的辅料。其中，所述的食品学上接受的辅料选自载体、赋形剂、稀释剂、润滑剂、润湿剂、乳化剂、悬浮液稳定剂、防腐剂、甜味剂以及香料中的一种或两种以上的组合。所述的食品的种类不受特别限制，可以为任何已知的食品，例如，奶制品、饼干、糕点、饮料、保健品等。所述食品选自固体、乳品、溶液制品、粉末制品和悬浮液制品中的至少一种形式。所述食品学上可接受的辅料选自乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖、淀粉、阿拉伯胶、磷酸钙、藻酸盐、明胶、硅酸钙、细结晶纤维素、纤维素、水、糖浆、甲基纤维素、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁和矿物油中的一种或两种以上的组合。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的产品为药品，所述的药品包括双歧杆菌或乳酸菌、其培养物、其裂解物或其提取物，还包括药学上接受的辅料。其中，所述的药学上接受的辅料选自载体、稀释剂、粘合剂、润滑剂、润湿剂。优选的，所述的药品包含治疗有效量的本发明所述的短双歧杆菌。所述的短双歧杆菌可以配制成以下剂型的药品：糖浆剂，酏剂，悬浮剂，粉剂，颗粒剂，片剂，胶囊，锭剂，水溶液，霜剂，膏剂，洗液剂，凝胶剂，乳剂等。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的产品为药品，所述的药品包括a)双歧杆菌、其培养物、其裂解物或其提取物，还包括b)乳酸菌、其培养物、其裂解物或其提取物及药学上接受的辅料。其中，所述的药学上接受的辅料选自载体、稀释剂、粘合剂、润滑剂、润湿剂。优选的，所述的药品包含治疗有效量的本发明所述的短双歧杆菌和鼠李糖乳杆菌。所述的短双歧杆菌和鼠李糖乳杆菌可以配制成以下剂型的药品：糖浆剂，酏剂，悬浮剂，粉剂，颗粒剂，片剂，胶囊，锭剂，水溶液，霜剂，膏剂，洗液剂，凝胶剂，乳剂等。

本发明的还一方面提供了微生物与免疫检查点抑制剂联用在制备治疗和/或预防癌症的药物中的应用，优选的，所述的药物不产生肠道不良反应，所述的微生物选自双歧杆菌和/或乳酸菌，优选的，所说的肠道不良反应为肠道损伤和/或结肠炎。

优选的，所述的免疫检查点抑制剂选自对CTLA-4、PD-1/PD-L1、TIM-3、LAG-3、4-1BB、OX40或CD27等起抑制作用的生物药、化学药或天然提取物。在本发明的一个具体实施方式中，所述的免疫检查点抑制剂为CTLA-4抗体与和/或PD-1抗体联用。

本发明人惊奇的发现，当微生物与免疫检查点抑制剂联用时，所述药物中的微生物可以增强免疫检查点抑制剂对癌症的治疗作用。在本发明的一个具体实施方式中，所述药物中的微生物可以降低肿瘤的增长速率及减小肿瘤的体积。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的微生物为短双歧杆菌。

本发明所述的癌症包括淋巴瘤，母细胞瘤，髓母细胞瘤，视网膜母细胞瘤，肉瘤，脂肪肉瘤，滑膜细胞肉瘤，神经内分泌肿瘤，类癌肿瘤，胃泌素瘤，胰岛细胞癌，间皮瘤，神经鞘瘤，听神经瘤，脑膜瘤，腺癌，黑素瘤，白血病或淋巴样恶性肿瘤，鳞状细胞癌，上皮鳞状细胞癌，肺癌，小细胞肺癌，非小细胞肺癌，腺癌肺癌，肺鳞癌，腹膜癌，肝细胞癌，胃癌，肠癌，胰腺癌，成胶质细胞瘤，子宫颈癌，卵巢癌，肝癌，膀胱癌，肝癌，乳腺癌，转移性乳腺癌，结肠癌，直肠癌，结肠直肠癌，子宫癌，唾液腺癌，肾癌，前列腺癌，外阴癌，甲状腺癌，肝癌，肛门癌，阴茎癌，梅克尔细胞癌，食管癌，胆道肿瘤，头颈部癌和血液恶性肿瘤

在本发明的实施方式中，所述的联用可以为先后顺序或同时使用。例如，所述的先后顺序使用是指先使用微生物后使用免疫检查点抑制剂，或者，先使用免疫检查点抑制剂后使用微生物。

在本发明的实施方式中，所述的药物中微生物与免疫检查点抑制剂可以单独包装或同时包装。

本发明的还一方面提供了一种治疗和/或预防免疫介导的肠道疾病的产品，所述的产品包含微生物、其培养物、其裂解物或其提取物，所述的微生物选自双歧杆菌和/或乳酸菌。

本发明的还一方面提供了一种组合物，所述的组合物包括a)双歧杆菌、其培养物、其裂解物或其提取物，以及b)乳酸菌、其培养物、其裂解物或其提取物；优选的，所述的双歧杆菌为短双歧杆菌，所述的乳酸菌为鼠李糖乳杆菌。

本发明的还一方面提供了一种治疗和/或预防免疫介导的肠道疾病的方法，所述的方法包含向人或动物施用微生物、其培养物、其裂解物或其提取物，所述的微生物选自双歧杆菌和/或乳酸菌。

本发明的还一方面提供了一种调节肠道菌群的方法，所述的方法包括向肠道内施用有效量微生物、其培养物、其裂解物或其提取物，所述的微生物选自双歧杆菌和/或乳酸菌。优选的，所述的双歧杆菌为短双歧杆菌，所述的乳酸菌为鼠李糖乳杆菌。

在本发明的一个实施方式中，所述的肠道菌群包括Clostridium、Anaerostipes、Aporacetigenium、Peptoclostridium、Bifidobacterium、Lactobacillus、Kosakonia、Cronobacter、Enterobacter或Pediococcus中的一种或两种以上。

在本发明的实施方式中，所述调节肠道菌群的方法为非治疗目的。

本发明的还一方面提供了一种调节肠道菌群代谢产物的方法，所述的方法包括向肠道内施用有效量微生物、其培养物、其裂解物或其提取物，所述的微生物选自双歧杆菌和/或乳酸菌。优选的，所述的双歧杆菌为短双歧杆菌，所述的乳酸菌为鼠李糖乳杆菌。

在本发明的实施方式中，所述的肠道菌群代谢产物包括但不限于色氨酸代谢物、短链脂肪酸(Short-Chain Fatty Acids，SCFA)及多糖。

在本发明的实施方式中，所述的调节肠道菌群代谢产物的方法为非治疗目的。

本发明利用了不同的免疫检查点阻断条件下的小鼠DSS结肠炎模型研究了双歧杆菌对肠道菌群和宿主的免疫系统的影响。结果表明施用双歧杆菌不仅改变了自身菌群也改变其他肠道微生物群落从而调节免疫应答。同时，本发明还公开了乳酸菌被认为对双歧杆菌存在协同作用能够改善CTLA-4阻断条件下的结肠炎，另外本发明证明了双歧杆菌在CTLA-4诱导的肠道问题中改变了乳酸菌的丰度，表明双歧杆菌通过与其他菌群构建有利的肠道生态系统实现对肠道炎症的缓解。特别是，本发明确认了短双歧杆菌和鼠李糖乳酸杆菌能够帮助控制临床中CTLA-4诱导的毒性。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施例，其中：

图1：确定对CTLA-4阻断诱导的结肠炎模型小鼠起治疗作用的双歧杆菌及乳酸菌的菌种，其中，纵坐标为当时体重占初始体重的百分数，横坐标为相应菌种处理后的天数，图A为四种双歧杆菌处理后结肠炎小鼠体重的变化，图B为3中乳酸菌处理结肠炎小鼠后小鼠体重的变化。

图2：对短双歧杆菌(B.Breve)、鼠李糖乳杆菌(L.Rhamnosum)及PBS对照组处理结肠炎模型小鼠后的小鼠进行组织切片染色试验，观察肠结构及白细胞浸润程度。

图3：检测短双歧杆菌(B.Breve)、鼠李糖乳杆菌(L.Rhamnosum)及PBS对照组(Control)处理结肠炎模型小鼠后的小鼠血清中炎性因子(IL-6、CSF3、KC)水平，其中，纵坐标为血清中相应细胞因子水平(pg/mL)。

图4：分别向含有Treg细胞和不含有Treg细胞的小鼠给予双歧杆菌或PBS，16SrRNA测序获得的菌群组成坐标图，其中Ctrl组中左侧为对照组A，右侧为对照组B，De-Treg组中左侧为试验组C，右侧为试验组D。

图5：向各组小鼠施用双歧杆菌或PBS后，对照组和试验组小鼠肠道菌群中各菌的丰度变化值，其中，横坐标中从左到右组别分别为对照组B、对照组A、试验组D、试验组C，纵坐标为相应菌的相对丰度。

图6：短双歧杆菌对Treg细胞增殖的影响，其中，纵坐标为增殖比率。

图7：IL10敲除小鼠、注射IL-22抗体及Igg处理的小鼠制备CTLA-4阻断诱导的结肠炎模型小鼠，对这三种小鼠施用短双歧杆菌，各小鼠的体重变化结果，其中，纵坐标为当时体重占初始体重的百分数，横坐标为相应菌种处理后的天数。

图8：IL10敲除小鼠、注射IL-22抗体及Igg处理的小鼠的组织切片结果。

图9：IL-22阻断及IL10敲除后的小鼠血清中IL-6、CSF3、KC水平，其中，纵坐标为血清中相应细胞因子水平(pg/mL)。

图10：当IL-22阻断与IL10基因敲除同时发生的小鼠，短双歧杆菌处理对小鼠体重的影响，其中，纵坐标为当时体重占初始体重的百分数，横坐标为相应菌种处理后的天数。

图11：当IL-22阻断与IL10基因敲除同时发生的小鼠，短双歧杆菌处理对小鼠组织学评分情况，其中，纵坐标为组织学评分。

图12：短双歧杆菌处理结肠炎小鼠后结肠固有层Treg细胞的炎性相关基因表达情况。

图13：短双歧杆菌处理结肠炎小鼠后结肠固有层Treg细胞的IL10RA表达水平上升。

图14：短双歧杆菌处理结肠炎小鼠后结肠固有层Treg细胞、CD4、Th17细胞的IL10表达水平均上升。

图15：短双歧杆菌处理CTLA-4和PD-1阻断诱导的结肠炎模型小鼠后，小鼠的体重变化情况，其中，纵坐标为当时体重占初始体重的百分数，横坐标为相应菌种处理后的天数。

图16：短双歧杆菌处理CTLA-4和PD-1阻断诱导的结肠炎模型小鼠后，小鼠血清中IL-6细胞因子的水平，其中，纵坐标为血清中IL6细胞因子水平(pg/mL)。

图17：短双歧杆菌处理CTLA-4和PD-1阻断诱导的结肠炎模型小鼠后，小鼠组织切片结果。

图18：在CTLA-4和PD-L1联合阻断情况下，双歧杆菌对小鼠肿瘤大小(mm²)的影响，其中，纵坐标为肿瘤大小(mm²)，横坐标为天数。

图19：在CTLA-4和PD-L1联合阻断情况下，双歧杆菌或PBS处理的小鼠23天时肿瘤大小对比，其中，纵坐标为肿瘤大小(mm²)。

具体实施方式

本发明所述的“和/或”是指包括择一列出的项目以及任何数量的项目组合。

本发明所述的“治疗”是指在疾病已开始发展后通过施用本发明所述的产品产生减缓、中断、阻止、控制、停止、减轻、或逆转一种体征、症状、失调、病症、或疾病的进展或严重性，但不一定涉及所有疾病相关体征、症状、病症、或失调的完全消除。

本发明所述的“预防”是指通过施用本发明所述的产品来抑制症状或者延缓特定症状紧张的所有行为。

本发明所述的“药学上可接受的”或者“食品学上所接受的”是指既不显著刺激生物体也不抑制所施用的产品的活性物质的生物学活性及特性。

本发明所述的“有效量”是指在以单个或多个剂量给予至受试者或器官之后提供所希望的治疗和/或预防的本发明的产品的量或剂量。

本发明所述的“受试者”包括人或动物。

本发明所述的“培养物”是指通过在已知液体/固体培养基中培养微生物获得的产物及微生物本身。

本发明所述的“相对丰度”是指某一肠道菌的水平占肠道菌群总量的丰度。

本发明所述的“乳酸菌”是指能够代谢糖类、产生50％以上乳酸之细菌。

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的部分实施例，而不是全部。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1确定功能菌株

1、CTLA-4阻断诱导的结肠炎模型小鼠制备

给小鼠万古霉素(0.5g/L，Sigma)改变肠道共生菌，至少14天后，将2-4％的肝素样硫酸多醣体(DSS，MP生物医学)加入小鼠饮用水中服用7-12天。在DSS处理的开始，给小鼠注射200ug anti-CTLA-4mAb。

2、试验方案

1)体重变化试验

分别给结肠炎模型小鼠接种四种双歧杆菌：短双歧杆菌(B.Breve)、长双歧杆菌(B.Longum)、两歧双歧杆菌(B.Bifidum)、乳酸双歧杆菌(B.Angulatum)，每只小鼠口服填喂1x10⁹CFU，对照组施用等量的PBS，之后每天监测体重变化。

分别给结肠炎模型小鼠接种三种乳酸菌：植物乳杆菌(L.Plantarum)、鼠李糖乳杆菌(L.Rhamnosum)和唾液乳杆菌(L.Salivarius)每只小鼠口服填喂1x10⁹CFU，对照组施用等量的PBS，之后每天监测体重变化。

2)组织切片试验

对短双歧杆菌(B.Breve)、鼠李糖乳杆菌(L.Rhamnosum)及PBS对照组处理结肠炎模型小鼠后的小鼠进行组织切片染色试验。

组织切片及染色步骤：结肠组织用4％多聚甲醛固定，石蜡包埋，切片3-6um，并用苏木精和伊红染色。

3)炎性因子水平影响试验

检测短双歧杆菌(B.Breve)、鼠李糖乳杆菌(L.Rhamnosum)及PBS对照组(Control)处理结肠炎模型小鼠后的小鼠血清中炎性因子(IL-6、CSF3、KC)水平。

血清分离步骤：采集血样，在室温下凝血至少30min，在1200RCF下用离心机分离血清10min，检测IL-6、CSF3、KC水平。

3、试验结果

如图1A、B所示，确定对CTLA-4阻断诱导的结肠炎模型小鼠起治疗作用的双歧杆菌及乳酸菌的菌种为短双歧杆菌(B.Breve)和鼠李糖乳杆菌(L.Rhamnosum)。图2中结肠切片的H&E染色显示短双歧杆菌和鼠李糖乳杆菌治疗结肠炎小鼠，结肠结构部分恢复，白细胞浸润少。同时图3中表明通过短双歧杆菌(B.Breve)和鼠李糖乳杆菌(L.Rhamnosum)处理结肠炎模型小鼠，使得小鼠血清炎性因子IL-6、CSF3、KC水平明显下降。综上所述，短双歧杆菌(B.Breve)和鼠李糖乳杆菌(L.Rhamnosum)是改善CTLA-4阻断条件下产生的结肠炎的两种功能性菌株。

实施例2双歧杆菌对肠道菌群组成及肠道菌丰度的影响

短双歧杆菌调节CTLA-4阻断诱导的肠道疾病与Treg细胞有关，此试验预计验证Treg细胞是否直接调节微生物组成及短双歧杆菌对含有Treg细胞的个体产生的肠道菌群组成及肠道菌丰度的影响。

1、小鼠及组别：

试验所用小鼠为6-14周大的雌鼠，饲养在上海交通大学特定的无病原体设施中。小鼠实验得到了上海交通大学医学院动物保护与利用委员会的批准。

取50只C57BL/6N小鼠，随机分成五组，每组10只，在其中两组小鼠Treg细胞上携带一个DTR，以瞬间消耗Treg细胞(De-Treg)，另外三组小鼠Treg细胞上未携带一个DTR，即含有Treg细胞。具体组别信息如下：

对照组A(有Treg)：给予小鼠重悬在PBS中的短双歧杆菌，每只小鼠口服填喂1x10⁹CFU；

对照组B(有Treg)：给予小鼠等量PBS；

试验组C(De-Treg)：给予小鼠重悬在PBS中的短双歧杆菌，每只小鼠口服填喂1x10⁹CFU；

试验组D(De-Treg)：给予小鼠等量PBS；

对照组F(有Treg)：给予小鼠短双歧杆菌与鼠李糖乳杆菌的混合菌，每只小鼠口服填喂1x10⁹CFU。

2、实验方案：

分别向四组小鼠施用短双歧杆菌或PBS后，取各组小鼠粪便标本，进行16S rRNA测序，比较四组小鼠肠道菌群组成及各肠道细菌丰度。

3、实验结果

四组小鼠粪便中肠道菌群组成如图4所示。由图5所示，短双歧杆菌处理后，明显增加了对照组(有Treg细胞)小鼠粪便中双歧杆菌、乳酸菌、柯萨科菌和克罗诺杆菌的丰度，而在试验组(无Treg细胞)小鼠粪便中双歧杆菌、乳酸菌、柯萨科菌和克罗诺杆菌的丰度急剧下降，甚至无法检测到丰度水平。同时，短双歧杆菌处理后的对照组(A组)显示出短双歧杆菌处理后显著改变了梭菌属(Clostridium)、Anaerostipes、Aporacetigenium和Peptoclostridium的丰度，A组和C组中短双歧杆菌也改变了肠杆菌属(Enterobacter)和片球菌属(Pediococcus)的丰度，然而在其他组中这些菌的丰度变化不明显。更进一步的，给予小鼠短双歧杆菌与鼠李糖乳杆菌的混合菌(F组)对于肠道菌群丰度的影响更加明显。

实施例3短双歧杆菌对炎性相关基因表达水平的影响

1、短双歧杆菌抑制Treg细胞的增殖

将效应T细胞(Teff)与短双歧杆菌处理后的Treg细胞共培养同时将效应T细胞与PBS处理后的Treg细胞共培养，对比增殖比率，结果如图6所示，经短双歧杆菌处理后Treg细胞的增殖能力明显下降。

2、缺失IL10基因和/或阻断IL-22的表达会造成肠道疾病

将IL10敲除小鼠、注射IL-22抗体及Igg处理的小鼠(对照组)按照实施例1的步骤制备CTLA-4阻断诱导的结肠炎模型小鼠，然后分别对这三种小鼠施用短双歧杆菌。测量各小鼠的体重变化、组织切片染色及细胞因子(IL-6、CSF3、KC)的表达水平。

体重变化结果如图7所示，IL-22阻断及IL10敲除后的小鼠体重减轻更加严重，其中，双歧杆菌处理的对照组小鼠体重下降为初始体重的90％，然而IL10敲除小鼠、注射IL-22抗体的小鼠体重降低为初始体重的70％。

组织切片结果如图8所示，IL-22阻断及IL10敲除后的小鼠会产生更多的白细胞浸润，同时肠结构损伤更严重。

炎性因子表达水平检测的结果见图9所示，IL-22阻断及IL10敲除后的小鼠血清中IL-6、CSF3、KC水平升高。

同时，当IL-22阻断与IL10基因敲除同时发生的小鼠，即使采用双歧杆菌处理依然没有改善肠道疾病的功能(见图10、11)，表明IL-22与IL-10对于短双歧杆菌改善肠道疾病的重要性。

3、短双歧杆菌提高Treg细胞表达IL10的水平

按照实施例1的步骤制备CTLA-4阻断诱导的结肠炎模型小鼠，分别用短双歧杆菌与PBS处理结肠炎小鼠，检测小鼠结肠固有层Treg细胞的炎性相关基因(例如IL10RA、cxcr5和IL17RA)的表达情况。结果如图12-14所示，采用流式细胞术证实短双歧杆菌处理后的结肠固有层Treg细胞的IL10RA蛋白表达增加。

实施例4短双歧杆菌治疗CTLA-4及PD-1同时阻断诱导的结肠炎

1、CTLA-4和PD-1阻断诱导的结肠炎模型小鼠制备

给小鼠万古霉素(0.5g/L，Sigma)改变肠道共生菌，至少14天后，将2-4％的肝素样硫酸多醣体(DSS，MP生物医学)加入小鼠饮用水中服用7-12天。在DSS处理的开始，给小鼠注射200ug anti-CTLA-4mAb和200ug的anti-PD-1mAb。

2、试验方案及结果

采用PBS和短双歧杆菌分别处理CTLA-4和PD-1阻断诱导的结肠炎模型小鼠，比较小鼠体重变化、IL6血清浓度及淋巴细胞浸润情况。结果见图15-17所示，短双歧杆菌治疗的小鼠体重减轻较少，降低IL6血清浓度，同时淋巴细胞浸润少，结肠结构保留较好。

实施例5短双歧杆菌对于CTLA-4及PD-1同时阻断条件下肿瘤的影响

1、黑色素瘤模型制备

给小鼠以1×10⁵细胞/小鼠皮下注射B16-F10黑色素瘤细胞。

腹腔注射100ug的抗CTLA-4mAb和100ug抗PD-L1mAb，抗体注射共4次，每次时间间隔3天。

2、实验方案

分别用PBS或短双歧杆菌处理模型小鼠，然后用卡钳监测小鼠肿瘤大小，肿瘤长到500mm²后停止监测，肿瘤大小以长度与宽度的乘积确定。

3、实验结果

在CTLA-4和PD-L1联合阻断情况下，双歧杆菌处理的小鼠，肿瘤大小明显下降(见图18、19)，由此表明，短双歧杆菌在抗PD-L1单药治疗中具有增强抗肿瘤免疫的作用。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

Claims

1.微生物与免疫检查点抑制剂联用在制备治疗癌症的药物中的应用，所述的药物不产生肠道不良反应，所述的微生物为双歧杆菌，所述的双歧杆菌为短双歧杆菌，所述的免疫检查点为CTLA-4和PD-1。

2.根据权利要求1所述的应用，所述的不良反应为肠道损伤和/或结肠炎。