CN115181699B - 一株长双歧杆菌cb20y1及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株长双歧杆菌cb20y1及其应用。本发明从健康产妇粪便微生物样本中分离筛选获得一株长双歧杆菌cb20y1，于2022年6月27日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No：M 2022984，保藏地址为中国，武汉，武汉大学。该长双歧杆菌cb20y1对引起痤疮的微生物抑菌谱广泛，对引起痤疮的微生物具有显著抑菌活性，而且对多种抗生素具有耐药性，配合抗生素用药；是具有良好开发应用前景的痤疮抑制剂，可作为治理痤疮的药物或修复皮肤的日化品，为痤疮的治疗和皮肤的修复提供新的选择。

Description

一株长双歧杆菌cb20y1及其应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株长双歧杆菌cb20y1及其应用。
背景技术
痤疮是毛囊皮脂腺单位的一种慢性炎症性皮肤病，普遍发生于青少年、成人、甚至儿童，主要发生于面颈部、胸背部等，会给人们带来抑郁、焦虑等心理问题。研究表明，痤疮的发病与皮肤微生态紊乱有关，微生物紊乱是痤疮的重要发病机制之一，痤疮患者较健康人群的表皮微生物多样性降低，且痤疮患者表皮的大肠杆菌(Escherichia coli，E.coli)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa，P.aeruginosa)、痤疮丙酸杆菌(Propionibacterium acnes，P.acnes)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，S.aureus)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis，S.epidermidis)等有害菌的丰度增加，有害菌的丰度增加会抑制有益菌得到生长，导致皮肤微生态中的正常微生物菌群出现紊乱。有害菌痤疮丙酸杆菌能够促进皮脂腺细胞促肾上腺皮质素释放激素(corticotropin-releasing hormone，CRH)上调，从而促进皮脂分泌；同时，痤疮丙酸杆菌还可以产生多种酶(如蛋白酶、脂肪酶、透明质酸酶、神经酰胺糖苷内切酶等)，进而通过损伤表皮细胞的完整性而使毛囊漏斗部过度角化，引起皮脂管的梗阻，形成痤疮；另外，痤疮丙酸杆菌可将皮脂中的甘油三酯转化为游离脂肪酸，进一步加强痤疮的恶化进程。
研究发现，人体中生存的微生物数量是人体细胞的10倍以上，基因数是150倍以上，人体微生物从许多方面影响甚至决定着人体健康，因此被称为“第二基因组”。皮肤微生物与皮肤细胞共同形成微生态环境，包括物理屏障、代谢脂质、拮抗病原、营养皮肤、调理免疫等，皮肤的微生态环境影响着人体皮肤的健康，抑制有害菌的丰度，维护皮肤“生态系统”平衡，可维持皮肤的健康，达到“微生态”护肤。相较于使用抗炎抗菌类化学药物修复治疗，利用微生物维持皮肤微生态环境可以避免了药物的副作用或不良反应，可让皮肤“城墙”变得更加牢固，从整体上修复皮肤微生态，重塑健康肌肤。因此十分有必要开发维持皮肤微生态环境、抑制皮肤有害菌丰度的微生物。
针对痤疮，寻找可显著抑制痤疮患者皮肤微生态环境中的丰度增加的有害菌大肠杆菌(Escherichia coli，E.coli)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa，P.aeruginosa)、痤疮丙酸杆菌(Propionibacterium acnes，P.acnes)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，S.aureus)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis，S.epidermidis)等的微生物菌株也尤为重要。现有技术公开了人源肠道长双歧杆菌菌株3594、人源粪便长双歧杆菌菌株3678和鼠源长双歧杆菌菌株3679对痤疮丙酸杆菌和表皮葡萄球菌具有抑制作用，但是其仅仅涉及痤疮丙酸杆菌和表皮葡萄球菌。而且菌株作为纯培养体，个体的特异性比较强，受环境的影响较大，不断挖掘、探索新的、防治效果更好的痤疮的有害菌防治菌株十分必要并且重要，从而丰富有害菌抑菌菌库，为有害菌的抑制提供新资源。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有技术中痤疮治疗的不足，提供一株长双歧杆菌cb20y1及其应用。该cb20y1菌株分离自健康产妇粪便微生物样本，对引起痤疮的微生物具有显著的抑制作用，同时对多种抗生素具有耐药性，可与抗生素联合使用。
本发明的目的在于提供一株长双歧杆菌cb20y1。
本发明的目的还在于提供所述长双歧杆菌cb20y1在制备治疗痤疮的药物中的应用。
本发明的目的还在于提供所述长双歧杆菌cb20y1在制备皮肤修护的日化品中的应用。
本发明的目的还在于提供一种含有长双歧杆菌cb20y1的药物。
本发明的目的还在于提供一种含有长双歧杆菌cb20y1的日化品。
本发明的上述目的通过以下技术手段实现：
一株长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)cb20y1，于2022年6月27日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No：M 2022984，保藏地址为中国，武汉，武汉大学。
该菌株采集自健康产妇粪便微生物样本，经分离纯化筛选获得。该菌株的16SrRNA的核苷酸序列长度为1000bp，序列在NCBI中进行核酸序列比对分析，该菌株与长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)同源性为98％以上，鉴定其为长双歧杆菌，命名为Bifidobacterium longum cb20y1。
所述长双歧杆菌cb20y1在制备抑制引起痤疮的微生物的制剂方面的应用也在本发明的保护范围之内。
优选地，所述应用中的微生物为大肠杆菌(Escherichia coli)、痤疮丙酸杆菌(Propionibacterium acnes)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)、白色念珠菌(Candida albicans)或表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)。
进一步优选地，所述应用中的微生物为大肠杆菌(Escherichia coli)、痤疮丙酸杆菌(Propionibacterium acnes)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)或白色念珠菌(Candida albicans)。
更进一步优选地，所述应用中微生物的为大肠杆菌(Escherichia coli)、痤疮丙酸杆菌(Propionibacterium acnes)或金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)。
本发明实验结果表明，长双歧杆菌cb20y1对大肠杆菌(Escherichia coli)、痤疮丙酸杆菌(Propionibacterium acnes)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)具有显著的抑制作用，其抑菌率达100％；同时对绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)、白色念珠菌(Candida albicans)和表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)也具有很强的抑制作用，抑菌率在95％～99％之间；而且对痤疮丙酸杆菌(Propionibacterium acnes)的抑菌率显著高于化学药物克林霉素。本发明的长双歧杆菌cb20y1对多种痤疮的有害菌抑制效果显著，抑菌谱广，在痤疮的治疗方面具有巨大的应用价值及潜力。
所述长双歧杆菌cb20y1在制备治疗痤疮的药物中的应用也在本发明的保护范围之内。优选地，是利用长双歧杆菌cb20y1的发酵上清液；所述药物中长双歧杆菌cb20y1可以作为药物主要成分，也可作为辅料添加。
所述长双歧杆菌cb20y1在制备修护痤疮皮肤的日化品中的应用也在本发明的保护范围之内。
优选地，所述应用中的制剂、药物或日化品还包括抗生素，所述抗生素为氯霉素(Cm)、新霉素(Neo)、庆大霉素(Gen)或萘啶酸(NA)。
一种抑制引起痤疮的微生物的制剂，含有长双歧杆菌cb20y1的菌体和/或发酵产物。
优选地，所述发酵产物为发酵上清液和/或发酵溶胞物。
进一步优选地，所述发酵产物为发酵上清液。
所述发酵上清液是长双歧杆菌cb20y1经发酵后，过滤除菌后得到。
作为发酵上清液的一个具体实施例，所述发酵上清液是将长双歧杆菌cb20y1的菌悬液在37℃，按照体积百分数3％～5％的接种量接种至发酵培养基中，维持pH恒定6.5在发酵罐进行发酵，转速200r/min，培养19～21h后结束发酵；发酵结束后，将发酵液经过经过离心过滤除菌处理，得到的滤液即为长双歧杆菌cb20y1发酵上清液。
一种组合物，所述组合物由所述长双歧杆菌cb20y1和抗生素组成；所述抗生素为氯霉素(Cm)、新霉素(Neo)、庆大霉素(Gen)或萘啶酸(NA)。
一种药物，含有所述长双歧杆菌cb20y1的菌体和/或发酵产物。
一种日化品，含有所述长双歧杆菌cb20y1的发酵产物。
优选地，所述日化品为化妆品或护肤品。
优选地，所述发酵产物为发酵上清液和/或发酵溶胞物。
进一步优选地，所述发酵产物为发酵上清液。
所述发酵上清液是长双歧杆菌cb20y1经发酵后，过滤除菌后得到。
作为发酵上清液的一个具体实施例，所述发酵上清液是将长双歧杆菌cb20y1的菌悬液在37℃，按照体积百分数3％～5％的接种量接种至发酵培养基中，维持pH恒定6.5在发酵罐进行发酵，转速200r/min，培养19～21h后结束发酵；发酵结束后，将发酵液经过经过离心过滤除菌处理，得到的滤液即为长双歧杆菌cb20y1发酵上清液。
相比现有技术，本发明具有以下有益效果：
本发明从健康产妇粪便微生物样本中分离筛选获得一株长双歧杆菌cb20y1，于2022年6月27日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No：M 2022984。该长双歧杆菌cb20y1对引起痤疮的微生物抑菌谱广泛，对引起痤疮的微生物具有显著抑菌活性，而且对多种抗生素具有耐药性，配合抗生素用药；是具有良好开发应用前景的痤疮抑制剂，可作为治理痤疮的药物或修复皮肤的日化品，为痤疮的治疗和皮肤的修复提供新的选择。
具体实施方式
以下结合具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
MRS固体培养基：大豆蛋白胨30g/L、牛肉膏10g/L、葡萄糖20g/L、乙酸钠2g/L、柠檬酸氢二铵2g/L、K2PO4·3H2O 2.6g/L、MgSO4·7H2O 0.2g/L、MnSO40.05g/L、吐温80 0.5mL/L、琼脂20g/L、半胱氨酸氨酸盐0.5g/L。
MRS液体培养基：大豆蛋白胨30g/L、牛肉膏10g/L、葡萄糖20g/L、乙酸钠2g/L、柠檬酸氢二铵2g/L、K2PO4·3H2O 2.6g/L、MgSO4·7H2O 0.2g/L、MnSO40.05g/L、吐温80 0.5mL/L、L-半胱氨酸氨酸盐0.5g/L。
发酵培养基：20g葡萄糖，30g大豆蛋白胨，0.35g MgSO4 7H2O，1g L-半胱氨酸盐酸盐，采用去离子水定容至1L，调pH调至6～6.5。
实施例1菌株的分离和纯化
收集得到健康产妇粪便微生物样本，经过无菌无氧水梯度稀释后，将不同梯度的稀释液涂布于MRS固体培养基，37℃培养48小时至长出菌落。挑取典型单菌落，采用平板划线法在MRS固体培养基进一步纯化，得到纯菌落。
实施例2纯菌落的鉴定
1.纯菌落的筛选
将对实施例1得到的纯菌落进行筛选。采用琼脂扩散法，以痤疮丙酸杆菌作为指示菌，将灭菌后的MARS培养基放于室温待其冷却至48～50℃，吸取指示菌稀释液100μl加入到10ml的MARS培养基中并将其倒入90mm的培养皿中，摇匀，待其冷却凝固后，用直径2.7mm的打孔器打孔，每孔加入5μl各实施例1纯菌落的菌悬液，静置30min后，于37℃培养24h，观察并测量抑菌圈大小，经过抑菌活力比较，发现了一株抑菌活性最高的菌株，记录为菌株cb20y1。
2.cb20y1菌株的16S rDNA分子生物学鉴定
提取cb20y1菌株的基因组，以提取的基因组为模板，采用通用引物27F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG，1492R：TACGGCTACCTTGTTACGACTT进行扩增和测序，测序得到的序列如SEQ ID NO:1所示，序列在NCBI中进行核酸序列比对分析，本发明分离纯化得到的菌株cb20y1的16S rDNA序列与Bifidobacterium longum同源性最高，进化距离最近，经鉴定为一株长双歧杆菌，命名为长双歧杆菌cb20y1(Bifidobacterium longum cb20y1)，于2022年6月27日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No：M 2022984，保藏地址为中国，武汉，武汉大学。
实施例3cb20y1菌株的发酵上清液制备
菌种活化：将保存于-80℃冰箱的实施例2得到的长双歧杆菌cb20y1的甘油冻存管取出，置于室温融化，在无菌环境下使用接种环挑取菌种，划线接种于MRS固体斜面，37℃培养48小时，观察平板上菌落形态确认为长双歧杆菌cb20y1且无污染后，挑取平板上的单菌接种至MRS液体培养基中，37℃摇瓶，厌氧培养24小时。
菌株发酵：将活化后的菌液在37℃，按照体积百分数3％～5％的接种量接种至长双歧杆菌cb20y1发酵培养基中，维持pH恒定6..5在发酵罐进行发酵(转速：200r/min)，培养19～21h。发酵完成后，得到发酵液，将发酵液经过过滤除菌处理，得到的滤液即为长双歧杆菌cb20y1的发酵上清液。
实施例4cb20y1菌株的发酵上清液的细胞毒性测试
以3×104细胞/孔的密度将SZ95细胞(人皮脂腺细胞)接种到96孔板中，37℃、5％CO2条件下培养24小时后吸除上清。按照实验方案分组，实验组：每孔分别加入100μL 5wt％添加量的实施例3制备的长双歧杆菌cb20y1的发酵上清液；对照组：每孔中加入100μL DMEM(无血清)培养基。37℃、5％CO2条件下培养24小时后吸除上清，加入100μL含有5mg/mL MTT溶液的DMEM(无血清)培养基，37℃温育4小时后，除去MTT溶液，加入100μL DMSO避光低速震荡10分钟，使用酶标仪于490nm处测定培养液吸光值，并按照以下公式计算细胞相对存活率。每组实验设置3个平行，结果以均值±标准差表示。
An为实验组吸光值，A0为对照组吸光值。
根据国际标准《ISO 10993-5:2009》描述的毒性评价标准，细胞存活率高于70％时可定义为无细胞毒性，结果显示，浓度为5wt％实施例3制备的长双歧杆菌cb20y1d发酵上清液的细胞存活率为89.54％，无细胞毒性，可应用于皮肤涂覆类制剂。
实施例5cb20y1菌株的发酵上清液的抑菌效果测试
1.方法
将引起粉刺生长最常见的6种细菌抑菌功效评价如表1所示。分三级：显效、有效和无效，当表1所示各种菌种抑菌率均达到≥90％，判定为能显著有效地预防和抑制青春痘产生；当对表1所示菌种的抑菌率达到≥90％和菌种的抑菌率达到≥50％～90％，判定为能有效地预防和抑制青春痘产生；只要祛痘产品对菌种的抑菌率<50％，则判定为无效。
表1引起粉刺生长最常见的6种细菌抑菌功效评价
以表1中的引起粉刺生长最常见的6种细菌作为病原菌，分别将病原菌在各自的液体培养基中培养至对数生长期后(大肠杆菌LB液体培养基，绿脓杆菌LB液体培养基，白色念珠菌YPD液体培养基，痤疮丙酸杆菌BHI液体培养基，金黄色葡萄球菌LB液体培养基，表皮葡萄球菌LB液体培养基)，然后分别均按照体积百分数1％的接种量接种至对应添加有活性物质的培养基(大肠杆菌、绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌为LB液体培养基，白色念珠菌为YPD液体培养基，痤疮丙酸杆菌为BHI液体培养基)中；其中活性物质为终浓度为5wt％实施例3制备的长双歧杆菌cb20y1的发酵上清液(实验组)和终浓度为100μg/ml的克林霉素(阳性对照组)，以不添加活性物质的培养基作为阴性对照，加样信息如表2所示，
表2
加样结束后，37℃培养16小时后，枪头吹打重悬，酶标仪600nm处测量吸光值(菌悬液在600nm处的吸光值在一定程度上能够反映菌的数量，吸光值越大，菌的浓度越高)。按照如下公式计算抑菌率：
抑菌率(％)＝(ODA1-ODA2)/(ODA1-ODA0)×100。
ODA0为添加了对应培养基培养前OD值，ODA1为添加了对应培养基培养16h后的OD值，ODA2为添加了cb20y1菌株发酵上清液或阳性对照后培养16h后的OD值。
2.结果
实验测得长双歧杆菌cb20y1的发酵上清液对引起粉刺生长最常见的6种细菌的抑菌率如表3所示，
表3
表3显示，长双歧杆菌cb20y1的发酵上清液对大肠杆菌(E.coli)、绿脓杆菌(P.aeruginosa)、白色念珠菌(C.Albicans)、痤疮丙酸杆菌(P.acnes)、金黄色葡萄球菌(S.aureus)、表皮葡萄球菌(S.epidermidis)均有显著的抑制效果，其中对绿脓杆菌(P.aeruginosa)和痤疮丙酸杆菌(P.acnes)的效果显著优于阳性对照药物克林霉素。
实施例6抗生素耐药性试验
双层平板法检测候选长双歧杆菌cb20y1菌株对抗生素的抗性。双层平板下层为1.5％的琼脂营养培养基，上层用0.5％的软琼脂培养基，上层培养基与实施例2得到的长双歧杆菌cb20y1制备的母液以100：1混匀。待平板固化和表面干燥后，放入商品化抗生素药敏片(氯霉素Cm，呋喃唑酮Fz，红霉素Ery，四环素TCs，氨苄西林Amp，新霉素Neo，庆大霉素Gen，萘啶酸NA和利福平Rif，)过夜培养，根据抑菌圈大小，观察益生菌对抗生素的抗性。根据NCCLS标准进行判读：抑菌圈直径≤12mm为抗生素耐药，抑菌圈直径≥18mm为抗生素素敏感。
长双歧杆菌cb20y1对9种抗生素抑菌效果如表4所示，
表4
表4显示，氯霉素(Cm)、新霉素(Neo)、庆大霉素(Gen)和萘啶酸(NA)对长双歧杆菌cb20y1的抑菌圈直径均为0，具有显著的抗生素耐药性。说明表明本发明的长双歧杆菌cb20y1对氯霉素、新霉素、庆大霉素、萘啶酸具有明显的耐药性。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 广东粤港澳大湾区国家纳米科技创新研究院
<120> 一株长双歧杆菌cb20y1及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1000
<212> DNA
<213> Bifidobacterium longum cb20y1(Bifidobacterium longum)
<400> 1
ggcgcatggg ggctacctgc agtcgacggg attccatcag gctttgcttg gtggtgagag 60
tggcgaacgg gtgagtaatg cgtgaccgac ctgccccata caccggaata gctcctggaa 120
acgggtggta atgccggatg ctccaacttt ccgcatggtt tgctgggaaa gctttcgcgg 180
tatgggatgg ggtcgcgtcc tatcagcttg acggcggggt aacggcccac cgtggcttcg 240
acgggtagcc ggcctgagag ggcgaccggc cacattggga ctgagatacg gcccagactc 300
ctacgggagg cagcagtggg gaatattgca caatgggcgc aagcctgatg cagcgacgcc 360
gcgtgaggga tggaggcctt cgggttgtaa acctctttta tcggggagca agcgagagtg 420
agtttacccg ttgaataagc accggctaac tacgtgccag cagccgcggt aatacgtagg 480
gtgcaagcgt tatccggaat tattgggcgt aaagggctcg taggcggttc gtcgcgtccg 540
gtgtgaaagt ccatcgctta acggtggatc cgcgccgggt acgggcgggc ttgagtgcgg 600
taggggagac tggaattccc ggtgtaacgg tggaatgtgt agatatcggg aagaacacca 660
atggcgaagg caggtctctg ggccgttact gacgctgagg agcgaaagcg tggggagcga 720
acaggattag ataccctggt agtccacgcc gtaaacggtg gatgctggat gtggggcccg 780
ttccacgggt tccgtgtcgg agctaacgcg ttaagcatcc cgcctgggga gtacggccgc 840
aaggctaaaa ctcaaagaaa ttgacggggg cccgcacaag cggcggagca tgcggattaa 900
ttcgatgcaa cgcgaagaac cttacctggg cttgacatgt tcccgacggt cgtaaaaaac 960
ggcttccctt cgggcgggtt cccaggtggg gatggcctcg 1000

Claims (8)

1.一株长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)cb20y1，其特征在于，于2022年6月27日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No：M 2022984，保藏地址为中国，武汉，武汉大学。
2.权利要求1所述长双歧杆菌cb20y1在制备抑制引起痤疮的微生物的制剂方面的应用，其特征在于，所述应用中的微生物为大肠杆菌(Escherichia coli)、痤疮丙酸杆菌(Propionibacterium acnes)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)、白色念珠菌(Candida albicans)或表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)。
3.权利要求1所述长双歧杆菌cb20y1在制备治疗痤疮的药物中的应用。
4.权利要求1所述长双歧杆菌cb20y1在制备修护痤疮皮肤的日化品中的应用。
5.一种抑制引起痤疮的微生物的制剂，其特征在于，含有权利要求1所述长双歧杆菌cb20y1的菌体和/或发酵产物，所述发酵产物为发酵上清液，所述发酵上清液是长双歧杆菌cb20y1经发酵后，过滤除菌后得到。
6.一种组合物，其特征在于，所述组合物由权利要求1所述长双歧杆菌cb20y1和抗生素组成；所述抗生素为氯霉素、新霉素、庆大霉素或萘啶酸。
7.一种药物，其特征在于，含有权利要求1所述长双歧杆菌cb20y1的菌体和/或发酵产物，所述发酵产物为发酵上清液，所述发酵上清液是长双歧杆菌cb20y1经发酵后，过滤除菌后得到。
8.一种日化品，其特征在于，含有权利要求1所述长双歧杆菌cb20y1的发酵产物，所述发酵产物为发酵上清液，所述发酵上清液是长双歧杆菌cb20y1经发酵后，过滤除菌后得到。
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