CN115786165B - 一株头葡萄球菌及其在抗衰老化妆品中的应用 - Google Patents

一株头葡萄球菌及其在抗衰老化妆品中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一株头葡萄球菌及其应用。该头葡萄球菌已于2022年6月1日在中国典型培养物保藏中心保藏，菌株名称为Staphylococcus capitis CCSM0349，保藏编号为CCTCC No：M 2022772，该菌株分离于健康人的面部皮肤，该菌株的TSB发酵上清，具有良好的清除DPPH自由基活性，清除率为89.4％，可显著降低维生素K诱导的人角质形成细胞ROS含量(下降47.9％)，展示出良好的抗氧化效果。本发明菌株CCSM0349在对抗自由基对皮肤损伤，在抗氧化、抗衰老护肤品开发方面具有良好的应用前景，本发明为功能性皮肤菌的挖掘打下基础。

Description

一株头葡萄球菌及其在抗衰老化妆品中的应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，尤其是涉及一株抗氧化功能的头葡萄球菌及其应用。
背景技术
皮肤是人体最大的器官，作为机体的屏障保护机体免受外来微生物、抗原或有毒物质的侵害。在人体皮肤表层或毛囊中栖息着大量的微生物，构成了人体皮肤菌群，其在维持皮肤健康中发挥着重要的作用，被称为皮肤的微生物屏障。皮肤微生物群、宿主皮肤及环境构成皮肤微生态系统，它们之间相互作用、相互制约，保持协调的、生理的、动态的平衡。平衡皮肤微生态，有利于皮肤健康。在日常生活中，化妆品的频繁使用、过度清洁、过度护理、化学品、药品、过度的紫外线暴露、不良生活方式、环境污染等因素可导致皮肤微生态失调。皮肤微生态失调，皮肤生物屏障就会被削弱或者破坏，影响皮肤正常的生理机能，乃至被感染，促进皮肤的老化。
机体自身代谢过程中以及受到外界污染、太阳照射等，会不断在人体内产生自由基，而过量自由基的产生会导致机体出现各种疾病和皮肤的衰老。研究表明在光老化的皮肤中，UV 辐照后会使皮肤细胞内的ROS增多，诱发MMPs水平增高，导致皮肤的胶原蛋白和弹性蛋白被降解，皮肤变得粗糙、松弛和起皱。皮肤上的表皮葡萄球菌、痤疮丙酸杆菌等对UV引起的皮肤损伤有保护作用，能显著降低紫外辐射诱导的ROS水平之外，还能通过影响多个信号通路直接调节皮肤细胞MMPs的表达水平，减少UV辐照后胶原蛋白和弹性蛋白的降解，维持皮肤的健康。
借助于高通量测序、宏基因组学、代谢组学和生物信息学等分析技术的发展，我们对人体皮肤微生物组成、结构和功能有了更深入的认识。作为皮肤微生态中重要角色的皮肤菌群，在维护皮肤健康中发挥着重要的作用。在健康皮肤上存在大量潜在的有益菌，基于皮肤菌在维护皮肤健康中重要的作用，将来皮肤菌以及代谢产物可能用于皮肤健康的护理中，但目前国内缺乏健康人群来源的皮肤菌以及功能菌株的筛选。
发明内容
本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一株头葡萄球菌及其筛选和应用。本发明提供的头葡萄球菌对DPPH自由基具有良好的清除活性，显著降低维生素K3 引起的人角质形成细胞ROS含量。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
本发明提供了一株分离自人体健康皮肤的头葡萄球菌(Staphylococcuscapitis) CCSM0349，该头葡萄球菌已于2022年6月1日在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏单位地址：中国武汉，武汉大学，保藏编号为CCTCC No：M 2022772。
(1)菌落特征：头葡萄球菌(Staphylococcus capitis)CCSM0349在TSA平板上划线分离 37℃好氧培养16h，菌株生长良好。其菌落为小而白的圆形凸起，菌落直径大约为0.5～1mm，边缘整齐，表面光滑湿润，不透明，挑取能拉丝，不具有溶血圈。
(2)菌体特征：菌体呈球形，直径0.9～1.0μm左右，排列成葡萄状，也有单个排列，无鞭毛，不能运动，不产芽孢，革兰氏染色阳性。
(3)培养学特征
头葡萄球菌(Staphylococcus capitis)CCSM0349的最低生长温度为15℃，最高生长温度为 45℃，在30～40℃生长温度最佳；最高和最低初始生长pH为9.0和4.0，最适生长初始pH 为6.0；菌株CCSM0349的延迟期相对较短，2h进入对数生长期，16h达到稳定期。
本发明还提供了上述头葡萄球菌在制备化妆品上的应用。
上述化妆品具有抗氧化效果。
上述抗氧化包括清除DPPH自由基和降低维生素K引起的人角质形成细胞ROS。
本发明还提供了一种化妆品，所述化妆品的原料中包括头葡萄球菌。
上述头葡萄球菌为其发酵上清液。
上述头葡萄球菌的发酵上清液采用下述方式制成：
将S.capitis CCSM0349菌株划线于TSA平板，置于37℃恒温培养16～20h，活化2次。将活化好的S.capitis CCSM0349接种到TSB液体培养基中，37℃摇床振荡培养16～20h，调整OD600在0.9～1.1之间，作为种子液。按照1％～3％的接种量将种子液接种到250mL三角瓶中，置于37℃恒温震荡培养箱中，以160r/min的速度培养12h，得到头葡萄球菌的发酵液；将上述发酵液以10000r/min的离心15min，得到的离心上清液即为头葡萄球菌的发酵上清。
本发明还提供了上述述头葡萄球菌发酵上清在化妆品中的应用。
本发明还提供了上述的头葡萄球菌或其发酵上清液在抗衰老化妆品中的应用。
与现有技术相比，本发明提供了一株健康人源(分离自健康人皮肤上)的头葡萄球菌，未见有关头葡萄球菌筛选的报道。经过试验证明，该头葡萄球菌CCSM0349具有良好的抗氧化效果，所述头葡萄球菌具有高DPPH自由基清除率和降低维生素K3引起的人角质形成细胞ROS含量。其中，所述头葡萄球菌发酵上清DPPH自由基清除率为89.40％，ROS清除率为47.90％。本发明菌株在对抗自由基对皮肤损伤，在抗氧化护肤品开发方面具有良好的应用前景，填充了头葡萄球菌在抗氧化功效筛选中的空白。
附图说明
图1头葡萄球菌CCSM0349的菌落形态及显微镜照片；
图2头葡萄球菌CCSM0349的生长曲线；
图3头葡萄球菌CCSM0349发酵上清对人皮肤角质形成细胞的细胞毒性；
图4头葡萄球菌CCSM0349对人角质形成细胞活性氧ROS的清除效果。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，而不构成对本发明的限制。
以下实施例中所用的菌种培养基如下：
胰酪大豆胨琼脂血培养基(TSA)：胰蛋白胨15.0g/L，大豆胨5.0g/L，氯化钠5.0g/L，琼脂15.0g/L，121℃高压灭菌15min，冷却50℃左右时，加入5％无菌脱纤维羊血，混匀，倒平板。
胰酪大豆胨液体培养基(TSB)：胰蛋白胨17.0g/L，大豆木瓜蛋白酶消化物3.0g/L，氯化钠5.0g/L，磷酸二氢钾2.5g/L，葡萄糖2.5g/L，121℃高压灭菌15min，备用。
保藏培养基：120g脱脂乳粉，880mL蒸馏水，118℃高压灭菌15min，备用。
实施例1、菌株CCSM0349的分离、筛选与纯化
(1)招募完美肌肤志愿者
要求皮肤健康，素颜状态下，皮肤细腻、毛孔小，无痤疮、脓疱、无炎症、无脱屑等情况，有斑者可参加，近3个月未擦拭药膏；年龄18～30岁，性别不限。
(2)样品采集
要求志愿者采样前一晚洗脸后可做基础护肤(涂水、乳等)，第二天早上不能洗脸，一般中午或下午取样。在采样皮肤部位处选取一块大约4cm×4cm区域，将聚合纤维材料的无菌棉签在润湿液(0.9％氯化钠和0.1％吐温-20)中润湿，在选取区域内来回涂擦50次(擦拭棉拭子要有一定的力度)，用无菌镊子将无菌棉签放置在取样管中，并用封口膜封口。将收集的样品放入冰盒里冷藏，带回实验室并放置于4℃冰箱内，尽快进行菌株的分离。
(3)样品预处理
在超净工作台中用无菌剪刀将带有样品的无菌棉签头剪下，放置于5mL离心管(EP管)中，吸取5mL无菌水于离心管中，充分混匀。
(4)平板筛选
取上述样品液0.5mL加入4.5mL无菌水进行梯度稀释，选择合适的稀释度，吸取0.1mL 稀释液涂布于TSA固体血平板，每个稀释度涂布2个平板，分别置于37℃培养箱中好氧培养 24h，厌氧菌筛选置于厌氧袋中加入厌氧包密闭培养48h。
(5)划线分纯和保藏
根据凝固酶阴性葡萄球菌菌株在血平板上的菌落特点，不产溶血圈、菌落大小、颜色、湿润、光泽等差异，挑取单菌落分别划线TSA血平板，置于37℃恒温培养箱里培养16h，待多次划线分纯后，采用脱脂乳粉作为保护剂保藏于保存管，冷冻干燥后保藏于-85℃深冷冰箱中。
实施例2菌株CCSM0349的微生物学鉴定
将实施例1的CCSM0349进行微生物学鉴定
(1)菌落特征：
菌株在TSA血琼脂平板上划线，37℃培养16h后，观察菌株在平板上的菌落形态特征。结果如图1所示，从图1可以看出，头葡萄球菌在TSA血平板上菌落为白而小，形成圆形凸起，边缘整齐，菌落直径大约为0.5～1mm，表面光滑，湿润，不透明，挑取能拉丝，无溶血圈；
(2)菌体特征：
将步骤(1)中得到的头葡萄球菌挑取少量菌体于载玻片上进行涂片，进行革兰氏染色，在显微镜下观察菌体形态特征。结果见图1所示，从图1可以看出，革兰氏染色阳性。菌体特征呈球形，直径0.9～1.0μm左右，排列成葡萄状，也有单个排列，无鞭毛，不能运动，不产芽孢。
(3)培养学特征：
将菌株CCSM0349接种到TSB液体培养基中，置于不同温度下培养，研究表明，CCSM0349的最低生长温度为15℃，最高生长温度为45℃，在30～40℃生长温度最佳；接种到不同pH的TSB液体培养基中，37℃恒温培养，CCSM0349菌株的最高生长pH为9.0、最低生长pH为4.0，最适生长pH为6.0；
(4)遗传学特性：
菌株CCSM0349的16S rDNA序列分析
CCSM0349基因组DNA提取方法：挑取纯化的CCSM0349单菌落接种到10mL TSB培养基中，37℃培养14～16h后将菌液离心(8000r/min，15min)收集菌体。
采用基因组DNA抽提试剂盒(生工生物工程(上海)股份有限公司)提取。
PCR扩增采用两种合成的通用引物(16s 27F:GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG；16s1492R：CGGCTACCTTGTTACGACTT)，PCR产物采用柱式PCR产物纯化试剂盒(生工生物工程(上海)股份有限公司)回收，纯化后送美吉生物工程(上海)股份有限公司测序。所得CCSM0349的16S rDNA核苷酸序列见(序列表),序列长度为：1424bp。
送GenBank(GenBank accetion number：)做Blast分析。菌株CCSM0349同源性最高菌株的是MT197286.1，同源性为100％。
根据Goodfellow和O’Donnell所说的DNA的G+C(mol％)≤10％～12％及16S rRNA的序列同源性≥95％的种可归为一个属，并且Embley和Stackebrangdt认为当16S rRNA的序列同源性≥97％时可以认为是一个种。由此可以推断：菌株CCSM0349与Staphylococcuscapitis 属于同一个种。因此菌株CCSM0349鉴定为头葡萄球菌(Staphylococcuscapitis)。
依据上述的菌落、菌体形态、培养学、生理生化鉴定等微生物学特性及其遗传特性16s rDNA对CCSM0349鉴定为头葡萄球菌Staphylococcus capitis，该菌株已于2022年6月1日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，其保藏编号为CCTCC NO：M 2022772。
实施例3 Staphylococcus capitis CCSM0349的生长曲线的绘制
将活化好的头葡萄球菌(Staphylococcus capitis)CCSM0349按2％(v/v)接种量接入TSB肉汤液体培养基中，37℃恒温振荡培养24h，每隔2h在600nm处测定培养液的OD值，以 OD600值对时间作图得到头葡萄球菌(Staphylococcus capitis)CCSM0349在TSB肉汤液体培养基中的生长曲线，其结果如图2所示，从图2中可以看出，头葡萄球菌(Staphylococcus capitis) CCSM0349在TSB肉汤液体培养基中生长迅速，在2h左右进入对数期，16h左右进入稳定期。
实施例4 Staphylococcus capitis CCSM0349发酵上清的DPPH自由基清除率测定
(1)Staphylococcus capitis CCSM0349发酵上清的制备
将S.capitis CCSM0349菌株划线于TSA平板，置于37，恒温培养16～20h，活化2次。将活化好的S.capitis CCSM0349接种到TSB液体培养基中，37℃摇床振荡培养16～20h，调整菌体OD600在0.9～1.1范围，作为种子液。以1％～3％接种量将种子液接种到250mL三角瓶中，置于37℃，以160r/min的速度培养12h，得到头葡萄球菌的发酵液；将上述发酵液以10000r/min离心15min，获得的离心上清液即为发酵上清液。
(2)用DPPH清除自由基法测Staphylococcus capitis CCSM0349的代谢产物中的DPPH 自由基清除率，步骤如下：
①、用无水乙醇配制DPPH浓度为0.1mm/L母液，避光低温保存。
取100μL系列质量浓度的样品溶液和100μL DPPH溶液加入96孔板中，记为溶液s；
取100μL系列的样品溶液和100μL无水乙醇溶液置于96孔板中，记为溶液b；
取100μL 50％乙醇溶液和100μL DPPH溶液置于96孔板中，记为溶液c；
混匀，恒温37℃黑暗环境下反应30min；
②、用酶标仪在517nm处分别测As，Ab，Ac孔中所得的反应液的OD值，As，Ab， Ac孔中所得的反应液，每样至少做3次平行，取其平均值，根据DPPH自由基清除率公式：清除率＝100％×[Ac-(As-Ab)]/Ac
计算Staphylococcus capitis的发酵上清的DPPH自由基清除率为89.40±1.95％。
实施例5 Staphylococcus capitis CCSM0349发酵上清清除人角质形成细胞的ROS测定
(1)Staphylococcus capitis CCSM0349发酵上清的制备
将S.capitis CCSM0349菌株划线于TSA平板，37℃恒温培养16～20h，活化2次。将活化好的S.capitis CCSM0349接种到TSB液体培养基中，37℃摇床振荡培养16～20h，调整菌体OD600在0.9～1.1范围，作为种子液。以1％～3％接种量将种子液接种到250mL三角瓶中，置于37℃，以160r/min的速度培养12h，得到头葡萄球菌的发酵液；将上述发酵液以10000 r/min离心15min，获得的离心上清液，将发酵上清浓缩到原体积的1/4，即为头葡萄球菌的浓缩发酵上清液。
(2)细胞培养
人原代皮肤角质细胞(NEKs)分离自正常皮肤组织，用Promocell专用完全培养基在37℃， 5％CO2条件下常规培养，待细胞生长至近融合状态，以胰蛋白酶消化传代，每5d传代1次。
(3)细胞活力检测
取处于最佳生长状态的NEKs细胞，常规处理，细胞悬浮液密度调整到8×104～1×105个 /mL，以每孔100μL细胞悬液接种于96孔板中，置于37℃、5％CO2培养箱培养。分别加入0.1％、0.5％、1％、5％和10％CCSM0349发酵上清的浓缩液培养24h，设置对照组，每个实验组设置3个平行孔。培养24h后，每孔加10μL CCK-8试剂(日本同仁CK-04)，常规孵育2h。使用酶标仪测定450nm波长处测定吸光值，参比波长为600nm或以上。
(4)ROS检测
取处于最佳生长状态的NEKs细胞，用Promocell专用培养基培养，常细胞悬浮液密度调整到8×104-1×105个/mL，以每孔100μL细胞悬液接种于96孔板中，置于37℃、5％CO2培养箱培养。将维生素K3、维生素E和5％CCSM0349发酵上清的浓缩液加入反应孔中，以维生素E为阳性对照，培养24h后，每孔加1μL ROS荧光显色试剂(CellRox，Thermo)，常规孵育4h。使用酶标仪测定荧光值，激发光波长为485nm，发射光为520nm。
从图3可以看出，与对照组相比，CCSM0349发酵上清的浓缩液的添加量低于5％时，未显示细胞毒性，而且能显著促进人原代皮肤角质细胞的生长。在此选择5％CCSM0349发酵上清的浓缩液进行ROS实验。实验结果表明(图4)，维生素K3处理后角质细胞分泌大量的ROS，加入CCSM00349发酵上清浓缩液，可显著降低ROS的量，ROS清除率为47.9％。可见，头葡萄球菌CCSM0349发酵上清可显著降低维生素K3引起的ROS的表达，显示出良好的抗氧化效果。

Claims (6)

1.一株头葡萄球菌(Staphylococcus capitis) CCSM0349，其特征在于，该头葡萄球菌已于2022年 6 月 1 日在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC No：M2022772。
2.如权利要求1所述头葡萄球菌的发酵上清液在制备化妆品上的应用，其特征在于，所述头葡萄球菌的发酵上清液采用下述方式制成：
将所述头葡萄球菌菌株划线于TSA平板，置于37℃恒温培养16～20 h，活化2次；将活化好的头葡萄球菌接种到TSB液体培养基中，37℃摇床振荡培养16～20 h，调整OD600在0.9～1.1之间，作为种子液；按照1%～3%的接种量将种子液接种到250 mL三角瓶中，置于37℃恒温振荡培养箱中，以160 r/min的速度培养12 h，得到头葡萄球菌的发酵液；将上述发酵液以10000 r/min的速度离心15 min，得到的离心上清液即为头葡萄球菌的发酵上清。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述化妆品具有抗氧化效果。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述抗氧化效果包括清除DPPH自由基和降低维生素K引起的人角质细胞分泌ROS的水平。
5.一种化妆品，其特征在于：所述化妆品的原料中包括如权利要求1所述头葡萄球菌的发酵上清液，所述头葡萄球菌的发酵上清液采用下述方式制成：
将所述头葡萄球菌菌株划线于TSA平板，置于37℃恒温培养16～20 h，活化2次；将活化好的头葡萄球菌接种到TSB液体培养基中，37℃摇床振荡培养16～20 h，调整OD600在0.9～1.1之间，作为种子液；按照1%～3%的接种量将种子液接种到250 mL三角瓶中，置于37℃恒温振荡培养箱中，以160 r/min的速度培养12 h，得到头葡萄球菌的发酵液；将上述发酵液以10000 r/min的速度离心15 min，得到的离心上清液即为头葡萄球菌的发酵上清。
6.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述头葡萄球菌的发酵上清液在抗衰老化妆品中的应用。
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