CN114621881A - 酿酒酵母发酵液和包括酿酒酵母发酵液的护肤品 - Google Patents

酿酒酵母发酵液和包括酿酒酵母发酵液的护肤品 Download PDF

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Abstract

本发明所属IPC分类号C12N1/20，尤其是涉及酿酒酵母发酵液和包括酿酒酵母发酵液的护肤品。所述酿酒酵母发酵液由酿酒酵母形成的单菌落在YPD发酵培养基内进行深层发酵震荡培养。本发明中通过添加酿酒酵母发酵过滤液的方式避免直接加入活菌，保持产品品质稳定，达到同样的护肤效果，避免了大多数护肤品中年无法直接添加活的益生菌、并且益生菌数量难维持、产品品质难把控的缺陷。

Description

酿酒酵母发酵液和包括酿酒酵母发酵液的护肤品
技术领域
本发明所属IPC分类号C12N1/20，尤其是涉及酿酒酵母发酵液和包括酿酒酵母发酵液的护肤品。
背景技术
皮肤是人体重要器官之一，而在皮肤上栖息着许多微生物种群，它们与宿主的皮肤构成皮肤的微生态系，与皮肤的健康和生理功能休戚相关。皮肤上的菌群分为常驻菌与暂驻菌，常驻菌包括葡萄球菌、棒状杆菌、丙酸杆菌等，是在健康皮肤上长期生活的菌群，是保护皮肤的屏障。常驻菌可以分泌抗菌肽防止病原菌感染，并分解角质细胞的碎屑和脂质，维持皮肤的酸性环境，保护皮肤菌群的多样性，维护皮肤健康；暂驻菌是由外界环境带来的微生物，包括金黄色葡萄球菌、溶血链球菌及肠球菌等，它们是引起皮肤炎症、感染的主要病原菌。
若护肤品通过添加益生元、益生菌等物质，或通过杀灭有害菌，恢复皮肤微生态平衡，改善皮肤状态，就可以称之为微生态护肤品。当在皮肤上使用含有酿酒酵母发酵液的护肤品时，通过发酵作用，会产生酵母多糖等物质，酵母葡聚糖能够供应多种细胞生长因子，加速真皮层胶原蛋白和弹力纤维蛋白的合成，除皱，使肌肤富有弹性。
专利CN107693431A利用活性益生菌在皮肤上杀灭和抑制有害菌的繁殖、增生，调整人体皮肤微生态平衡，使皮肤达到健康状态但是，大部分化妆品是油水配方，无法直接添加活的益生菌，并且益生菌数量难维持，产品品质难把控，所以益生菌很少被加入在护肤品中。
发明内容
为了解决上述技术问题，作为本发明的第一个方面，提供了酿酒酵母发酵液，所述酿酒酵母发酵液由酿酒酵母形成的分离菌株在YPD发酵培养基内进行深层发酵震荡培养。
酿酒酵母形成的分离菌株(单菌落)的分离方法包括以下步骤：将含有啤酒渣的无菌水经平板划线、培养、筛选得到菌落。
在本发明的一些实施方式中，使用无菌水将啤酒渣稀释1倍(按质量计)得到含有啤酒渣的无菌水，用接种环蘸取含有啤酒渣的无菌水在固体YPD培养基上分步划线后，进行培养(培养的条件为：30℃培养48h)、取平板上形态为乳白色光滑湿润的菌落，进行筛选出菌落为酿酒酵母的单菌落。
在本发明中，为了鉴别选出菌株是否为酿酒酵母的单菌落，对其进行核酸扩增、电泳检验、测序及BLAST比对分析。
在一些实施方式中，使用枪头蘸取1μL单菌落在10μL的无菌水中混匀得到单菌落水溶液，取2μL单菌落水溶液作为模板进行PCR聚合酶链式反应并进行核酸凝胶电泳检验，通过ITSrDNA扩增产物进行测序并利用测序结果，在NCBI网站中进行BLAST序列比对，准确确定发酵液内容菌种类型。
在一些实施方式中，PCR聚合酶链式反应时，扩增体系如下：Template DNA，1μL；Forward primer，1μL；Reverse primer，1μL；dNTP，0.2μL；Buffer，5μL；Phanta，0.2μL；ddH2O，4μL，总计12.4μL。
在一些实施方式中，所述单菌落的GeneBankID分别为MW687625.1和MW837771.1。
在本发明的另一些实施方式中，还能够对筛选酿酒酵母的单菌落进行扩大培养和保存。
在一些实施方式中，扩大培养的步骤为：将单菌落水溶液加入到液体YPD培养基中进行扩大培养，培养条件为30℃，200rpm，培养48h。
在一些实施方式中，冻存的步骤为：将扩大培养得到的菌液与冻存液混合后将混合液置于-20℃或者-80℃保存，作为冻存菌种。
浑浊的菌液与冻存液的比例和冻存液的种类可以根据需要进行选择，在一些实施方式中，冻存液为体积浓度为50％的甘油，菌液与体积浓度为50％的甘油的体积比为1：1。
在一些实施方式中，按体积量为3～10％的接种量将酿酒酵母形成的单菌落接种于YPD发酵培养基内进行深层发酵震荡培养。
YPD发酵培养基的培养基成分为蛋白胨20.0g/L、酵母提取物10.0g/L、葡萄糖20.0g/L。
YPD发酵培养基的制备方法为简单混合。
在本发明中YPD发酵培养基培养制备完成后经过115℃持续高温湿热灭菌15min后，方可使用，并且本发明中的YPD发酵培养基为自然pH，无需额外调整。
在一些实施方式中，深层发酵震荡培养的条件为：30℃，200rpm，培养48h。
在另一些实施方式中，深层发酵震荡培养的条件为：28℃，200rpm，培养48h。
本发明的第二个方面提供了一种包括酿酒酵母发酵液的护肤品，所述护肤品中包括上述酿酒酵母发酵液均质、过滤灭菌后的酿酒酵母发酵产物滤液。
在一些实施方式中，均质的方法为：超声破碎均质。
在一些实施方式中，超声的功率为300～500W(优选为400W)。
在一些实施方式中，超声破碎均质的超声时间为：超声2s，停7s，按照上述条件循环超声，超声时间为12～20min(优选为15min)。
在一些实施方式中，所述酿酒酵母发酵产物滤液在护肤品中的质量含量大于3％(比如说大于4％、大于6％、大于7％、大于8％、大于10％、大于15％、大于20％或为5～20％)。
在一些实施方式中，所述护肤品为保湿水、精华、乳液、眼霜、面霜等。
对于18-22岁女性的一次问卷调查中显示，90.91％的调查对象有补水保湿与修复皮肤状态的需求，继续调查这部分女性最常使用的产品，结果显示54.55％的女性正在使用保湿水，因为保湿水的肤感较乳液来说更清透。本发明中还提供了一种保湿水，所述保湿水的原料包括8～12wt％的酿酒酵母发酵液均质、过滤灭菌后的酿酒酵母发酵产物滤液。
在一些实施方式中，所述保湿水的原料包括，按质量分数计，
酿酒酵母发酵产物滤液8～12％；
油相：
Figure BDA0003446918750000031
Figure BDA0003446918750000041
水相：
Figure BDA0003446918750000042
上述保湿水的制备方法，包括以下步骤：
(1)将保湿水油相中的原料加热至80～90℃，维持20～40min，然后冷却至60～70℃，得到料A，备用；
(2)将保湿水水相中的原料加热至80～90℃，维持20～40min，然后冷却至70～80℃，然后加料A缓慢加入水相中进行搅拌，当温度降至40～45℃时加入酿酒酵母发酵产物滤液，继续搅拌10～30min，开启均质机均质1～10min，降温、然后送检待出料得到保湿水。
有益效果：
1.本发明中的酿酒酵母发酵液对表皮葡萄球菌等常见菌生长无影响，而对金黄色葡萄球菌和铅黄肠球菌等致病菌生长有显著抑制效果；
2.本发明中通过对酿酒酵母发酵液进行均质破壁、过滤灭菌后将其用在护肤品中，同时在护肤品中添加额外添加烟酰胺成分，可以在保湿的同时提亮肤色，同时护肤品还具有改善皮肤微生态功能；
3.本发明中通过添加酿酒酵母发酵过滤液的方式避免直接加入活菌，保持产品品质稳定，达到同样的护肤效果，避免了大多数护肤品中年无法直接添加活的益生菌、并且益生菌数量难维持、产品品质难把控的缺陷；
4.本发明中的酿酒酵母发酵产物滤液在体系中添加的时候不但能够改善皮肤微生态功能，同时制备得到的护肤品还具有很好的稳定性；
5.本发明中针对已选定的皮肤常见致病菌进行抑菌实验模拟皮肤测试，验证酿酒酵母发酵液在皮肤表面的有抑菌效果。
附图说明
图1为实施例1中含有啤酒渣的无菌水的图片；
图2为实施例1中TSrDNA扩增产物测序结果；
图3为实施例1中基因序列比对结果；
图4为实施例2中含有啤酒渣的无菌水的图片；
图5为实施例2中TSrDNA扩增产物测序结果；
图6为实施例2中基因序列比对结果；
图7为酿酒酵母发酵液对皮肤菌群的影响的柱状图。
具体实施方式
实施例1
本实施例供了一种酿酒酵母发酵液，制备包括以下步骤：
菌种分离：
使用无菌水将啤酒渣A(从精酿啤酒工厂得到的啤酒渣England)稀释1倍(按质量计)得到含有啤酒渣的无菌水(如图1所示，为含有啤酒渣的无菌水)，为用接种环蘸取含有啤酒渣的无菌水在固体YPD培养基上分步划线后，置于30℃培养48h，取平板上形态为乳白色光滑湿润的1个单菌落。使用枪头蘸取1μL单菌落在10μL的无菌水中混匀得到单菌落水溶液，取2μL单菌落水溶液作为模板进行PCR聚合酶链式反应并进行核酸凝胶电泳检验，扩增体系如表1所示，并进一步通过ITSrDNA扩增产物进行测序并利用测序结果，在NCBI网站中进行BLAST序列比对，准确确定发酵液内容菌种类型，图2为ITSrDNA扩增产物测序结果，结果表明，分离出的1株单菌落均为酿酒酵母。基因比对后完成菌种鉴定，获得1株不同的酿酒酵母。图3为基因序列比对结果，单菌落的GeneBankID是MW687625.1(记为England)基因比对后完成单菌落的菌种鉴定。另外，将剩余的8μL单菌落水溶液加入到液体YPD培养基中进行扩大培养，培养条件为30℃，200rpm，培养48小时，得到浑浊的菌液，将浑浊的菌液与50％(体积浓度)的甘油按1:1的比例混合，将混合液置于-20℃或者-80℃保存，作为冻存菌种。
发酵：
取上述得到的单菌落，按体积量为5％的接种量分别单菌落接种于YPD发酵培养基内进行深层发酵震荡培养(培养条件为30℃，200rpm，培养48h)，分别得到England酿酒酵母发酵液和Wild酿酒酵母发酵液。
YPD发酵培养基的配方组分如表2所示，YPD发酵培养基的制备方法为简单混合，YPD发酵培养基配制完成后，需经过115℃持续高温湿热灭菌15min后，方可使用。
实施例2
本实施例供了一种酿酒酵母发酵液，制备包括以下步骤：
菌种分离：
使用无菌水将啤酒渣B(从精酿啤酒工厂得到的啤酒渣Wild)稀释1倍(按质量计)得到含有啤酒渣的无菌水(如图4所示，为含有啤酒渣的无菌水)，用接种环蘸取含有啤酒渣的无菌水在固体YPD培养基上分步划线后，置于30℃培养48h，取平板上形态为乳白色光滑湿润的1个单菌落。使用枪头蘸取1μL单菌落在10μL的无菌水中混匀得到单菌落水溶液，取2μL单菌落水溶液作为模板进行PCR聚合酶链式反应并进行核酸凝胶电泳检验，扩增体系如表1所示，并进一步通过ITSrDNA扩增产物进行测序并利用测序结果，在NCBI网站中进行BLAST序列比对，准确确定发酵液内容菌种类型，图5为ITSrDNA扩增产物测序结果，结果表明，分离出的1株单菌落均为酿酒酵母。基因比对后完成菌种鉴定，获得1株不同的酿酒酵母。图6为基因序列比对结果，单菌落的GeneBankID是MW837771.1(记为Wild)基因比对后完成单菌落的菌种鉴定。另外，将剩余的8μL单菌落水溶液加入到液体YPD培养基中进行扩大培养，培养条件为30℃，200rpm，培养48小时，得到浑浊的菌液，将浑浊的菌液与50％(体积浓度)的甘油按1:1的比例混合，将混合液置于-20℃或者-80℃保存，作为冻存菌种。
发酵：
取上述得到的单菌落，按体积量为5％的接种量分别单菌落接种于YPD发酵培养基内进行深层发酵震荡培养(培养条件为30℃，200rpm，培养48h)，分别得到England酿酒酵母发酵液和Wild酿酒酵母发酵液。
YPD发酵培养基的配方组分如表2所示，YPD发酵培养基的制备方法为简单混合，YPD发酵培养基配制完成后，需经过115℃持续高温湿热灭菌15min后，方可使用。
表1
Figure BDA0003446918750000071
表2
Figure BDA0003446918750000072
实施例3
本实施例提供了一种保湿水，所述保湿水的原料包括，按质量分数计，
酿酒酵母发酵产物滤液 10％；
油相：
Figure BDA0003446918750000073
水相：
Figure BDA0003446918750000074
Figure BDA0003446918750000081
其中酿酒酵母发酵产物滤液为实施例1中的酿酒酵母发酵液均质(400W功率超声2s、停7s，按照上述条件循环超声共15min)、过滤灭菌后的酿酒酵母发酵产物滤液。
所述保湿水的制备方法，包括以下步骤：
(1)将保湿水油相中的原料加热至85℃，维持30min，然后冷却至65℃，得到料A，备用；
(2)将保湿水水相中的原料加热至85℃，维持30min，然后冷却至75℃，然后加料A缓慢加入水相中进行搅拌，当温度降至40℃时加入酿酒酵母发酵产物滤液，继续搅拌20min，开启均质机均质5min，降温、然后送检待出料得到保湿水。
实施例4
本实施例提供了一种保湿水，其具体实施方式同实施例3，不同之处在于，酿酒酵母发酵产物滤液为实施例2中的酿酒酵母发酵液均质(400W功率超声2s、停7s，按照上述条件循环超声共15min)、过滤灭菌后的酿酒酵母发酵产物滤液。
性能测试
1.抑菌实验模拟皮肤测试，如表3所示，为皮肤常见菌群，分别将实施例1和2中的酿酒酵母发酵液通过离心，去上清，加入20μLPBS，通过超声(功率400W，超声2s，停7s，总时长为15min)进行破碎处理后，破碎液由颗粒状浑浊液变为浑浊稳定的均质液。将破碎后的混合液添加2mL到3mLBS液体培养基中，对照组为5mL不添加发酵破碎混合液的BS液体培养基，分别接种相同量10μL的皮肤菌(表皮葡萄球菌，金黄色葡萄球菌，肺炎链球菌，乙型溶血链球菌，铅黄肠球菌)种子液进行培养，12h之后通过测定其培养液在600nm处的吸光值的变化量来对比其生物量。结果表明酿酒酵母对皮肤微生态的调节有着显著性的作用。其中酿酒酵母发酵液的添加能够抑制皮肤致病菌金黄色葡萄球菌的生长，添加发酵液破碎混合液的BS培养基中金黄色葡萄球菌的生物量比没有添加发酵破碎混合液的BS培养基中的生物量降低了16.82％，如图7所示，图7为酿酒酵母发酵液对皮肤菌群的影响的柱状图，因此酿酒酵母发酵液能够使得皮肤菌群更加稳定健康。
图7中England为实施例1中的酿酒酵母发酵液和Wild为实施例2中的酿酒酵母发酵液，control为不添加发酵破碎混合液而接种相同皮肤菌的BS培养基。
表3
Figure BDA0003446918750000091
2.稳定性按照下述方法进行实验：
(1)热稳定性测试：分别将实施例3～4中的保湿水放入(50±2)℃的恒温培养箱中24h取出，恢复室温后无变色、分层、沉淀变化为合格，否则为不合格；
(2)冷储性测试：分别将实施例3～4中的保湿水放入(-5～-10)℃±1℃的冰箱中24h，恢复室温后无变色、分层、沉淀变化为合格，否则为不合格。
(3)机械稳定性：分别将实施例3～4中的保湿水样品置于离心机中，以3500rpm的转速试验30min，观察样品无分离、分层状况为合格，否则为不合格。
测试结果如表4所示：
表4
Figure BDA0003446918750000092

Claims (10)

1.一种酿酒酵母发酵液，其特征在于，所述酿酒酵母发酵液由酿酒酵母形成的分离菌株在YPD发酵培养基内进行深层发酵震荡培养。
2.根据权利要求1所述的酿酒酵母发酵液，其特征在于，酿酒酵母形成的分离菌株的分离方法包括以下步骤：将含有啤酒渣的无菌水经平板划线、培养、筛选得到菌落。
3.根据权利要求1或2所述的酿酒酵母发酵液，其特征在于，YPD发酵培养基的培养基成分为蛋白胨20.0g/L、酵母提取物10.0g/L、葡萄糖20.0g/L。
4.根据权利要求3所述的酿酒酵母发酵液，其特征在于，YPD发酵培养基培养制备完成后经过115℃持续高温湿热灭菌15min后，方可使用。
5.根据权利要求2所述的酿酒酵母发酵液，其特征在于，培养的条件为：30℃培养48h。
6.根据权利要求1或2所述的酿酒酵母发酵液，其特征在于，深层发酵震荡培养的条件为：30℃，200rpm，培养48h。
7.一种包括酿酒酵母发酵液的护肤品，其特征在于，所述护肤品中包括权利要求1～6任一项所述的酿酒酵母发酵液均质、过滤除菌后的酿酒酵母发酵产物滤液。
8.根据权利要求7所述的包括酿酒酵母发酵液的护肤品，其特征在于，均质的方法为：超声破碎均质。
9.根据权利要求8所述的包括酿酒酵母发酵液的护肤品，其特征在于，超声的功率为300～500W。
10.根据权利要求8或9所述的包括酿酒酵母发酵液的护肤品，其特征在于，超声时间为12～20min。
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