CN117180332B

CN117180332B - 用于改善修复皮肤的樟树叶提取物及其提取方法和用途

Info

Publication number: CN117180332B
Application number: CN202311466524.5A
Authority: CN
Inventors: 缪晓; 梁鑫淼; 黄丽华; 丰加涛; 刘佳佳; 赵培; 曹达虎; 王嘉文
Original assignee: Ganjiang Traditional Chinese Medicine Innovation Center; Jiangxi Ruixiu Lang Technology Co ltd
Current assignee: Ganjiang Traditional Chinese Medicine Innovation Center; Jiangxi Ruixiu Lang Technology Co ltd
Priority date: 2023-11-07
Filing date: 2023-11-07
Publication date: 2024-02-27
Anticipated expiration: 2043-11-07
Also published as: CN117180332A

Abstract

本申请涉及医药技术领域，具体涉及一种用于改善修复皮肤的樟树叶提取物及其提取方法和用途。该提取方法采用水上蒸馏的方式或采用水中蒸馏的方式从芳樟醇型樟树的樟树叶中提取得到樟树叶提取物。本申请提供的一种用于改善修复皮肤的樟树叶提取物，具有保湿、屏障修复、抗炎、抗皱抗衰、美白祛斑、抑菌等多种作用，能够适于制备药物组合物或护肤品，应用价值较高。

Description

用于改善修复皮肤的樟树叶提取物及其提取方法和用途

技术领域

本申请涉及医药技术领域，具体涉及一种用于改善修复皮肤的樟树叶提取物及其提取方法和用途。

背景技术

表皮屏障功能缺陷是最常见的炎症性皮肤病的主要特征。表皮屏障受损后，透过表皮的外源性过敏原和微生物会增加，从而产生免疫激活和随后的炎症反应。因此屏障修复治疗是治疗慢性炎症性皮肤病的重要策略。

精油是从植物的叶子、花朵、种子、果实、根部、树皮、树脂、木心等部位以水蒸汽蒸馏法、冷压榨法、脂吸法、二氧化碳超临界萃取等方法提炼出来的。精油分子量小、渗透性强，具有抗炎、抗氧化、抗菌等广泛的药理活性。随着科学技术的发展和人们健康意识的增强，传统的护肤方式已难以满足消费者需求，消费者更注重护肤品成分的安全性、作用性及其更多个性化的需求。具有作用性的植物精油在化妆品领域的应用前景非常广阔。

樟树提取的精油主要可分为樟树精油和樟叶精油两种。樟树精油主要利用樟树干和根部通过蒸馏得到，具有抗风湿、止痛、利关节、行血气和止痒杀菌等作用，在治疗关节疼痛、风湿、神经痛及慢性支气管炎等方面有重要应用。不过樟树精油提取需要对樟树进行破坏性砍伐和挖掘，严重影响樟树的可持续利用。利用樟树叶提取精油不破坏樟树本身，是实现樟树可持续和高值化应用的重要途径。樟叶精油主要利用樟树叶通过不同方式进行提取得到，主要提取方式有水蒸气蒸馏法、溶剂提取法和超临界提取法，其中水蒸气蒸馏法可分为水中蒸馏、水上蒸馏和水气蒸馏。水中蒸馏是将原料置于筛板或直接放入蒸馏锅，锅内加水浸过料层，锅底进行加热，但是水中蒸馏植物长时间在100℃的水中泡着，对于提取一些芳香物质会有损耗；水上蒸馏是将原料置于筛板，锅内加入水量要满足蒸馏要求，但水面不得高于筛板，并能保证水沸腾至蒸发时不溅湿料层，一般采用回流水，保持锅内水量恒定以满足蒸气操作所需的足够饱和蒸汽；水气蒸馏是在筛板下安装一条带孔环行管，由外来蒸气通过小孔直接喷出，进入筛孔对原料进行加热，但水散作用不充分，需预先在锅外进行水散。溶剂提取法是采用有机溶剂对烘干的樟树叶进行浸提或动态提取，其提取率高，缺点是成分复杂，含有大量非挥发性成分和蜡质成分，且精油中含有有机溶剂，很难完全去除。超临界提取樟叶精油主要利用超临界状态的二氧化碳对烘干粉碎后的樟树叶进行动态提取，不过其提取物亦含有大量的长链烷烃、植物蜡和脂肪酸等成分，需要进一步处理方可得到樟叶精油，超临界提取樟叶精油所需设备昂贵、操作复杂，关于超临界提取樟叶精油的报道和应用较少。目前关于樟叶精油的化学成分组成研究较多，根据樟树叶精油主要成分的不同，可以将樟树分为不同化学类型樟树，如龙脑樟、桉油樟和芳樟醇型樟树等。然而对于不同类型樟树叶精油的作用和应用研究却非常少，这严重影响樟树叶和樟树叶精油的经济价值和市场应用。

本申请利用江西本地特色化学型樟树叶为原料，经过水上蒸馏或水中蒸馏的方式得到樟树叶提取物，通过皮肤修复作用试验，得到一种用于改善修复皮肤的樟树叶提取物及其药物组合物和护肤品。

发明内容

本申请实施例的一个目的在于解决上述问题，并提供相应的有益效果。

本申请实施例的另一个目的在于提出一种用于修复皮肤的樟树叶提取物及其制备方法、用途、药物组合物和护肤品，以通过从樟树叶中提取一种单方精油（天然提取物），具有保湿、屏障修复、抗炎、抑菌、抗皱抗衰等多种作用。

为实现以上目的，本申请实施例提供了以下诸方面技术方案。

在第一方面，本申请实施例提供一种用于修复皮肤的樟树叶提取物，上述樟树叶提取物采用水上蒸馏或水中蒸馏的方式提取得到，采用水上蒸馏得到的樟树叶提取物中的组分按质量百分比计包括芳樟醇97.47%、α-松油醇0.28%、石竹烯0.74%、蛇麻烯0.22%、橙花叔醇0.63%、桉油精0.12%、顺式芳樟醇氧化物0.07%、樟脑0.13%、橙花醇0.09%；

采用水中蒸馏得到的樟树叶提取物中的组分按质量百分比计包括芳樟醇95.44%、樟脑1.34%、去氢芳樟醇0.32%、石竹烯0.3%、α-蒎烯0.08%、桉油精0.18%、顺式芳樟醇氧化物0.19%、4-萜烯醇0.1%、α-松油醇0.1%、蛇麻烯0.12%、双环大牻牛儿烯0.17%、匙叶桉油烯醇0.17%。

在第二方面本申请实施例提供一种用于修复皮肤的樟树叶提取物及其制备方法，所述提取方法包括：

采用水上蒸馏的方式从芳樟醇型樟树的樟树叶中提取得到樟树叶提取物，具体为：

从芳樟醇型樟树中摘取新鲜樟树叶，洗净，置于不锈钢精油提取器上部筛板上；

在蒸馏器底部加入适量的水，以不没过樟树叶，并将底部水加热至沸腾，以使产生的蒸汽通过筛板由下而上加热料层，并使油水混合蒸汽通过冷凝管进入油水分离器；

蒸馏完成后，将油水分离器中液体混合物静置分层，取上层油相，得到樟树叶提取物；

采用水中蒸馏的方式从芳樟醇型樟树的樟树叶中提取得到樟树叶提取物，具体为：

从芳樟醇型樟树中摘取新鲜樟树叶，洗净，置于不锈钢精油提取器中；在蒸馏器底部加入足量的水，使其没过樟树叶，加热至沸腾，使油水混合蒸汽通过冷凝管进入油水分离器；

蒸馏完成后，将油水分离器中液体混合物静置分层，取上层油相，得到樟树叶提取物。

在第三方面，本申请实施例还提供一种用于改善修复皮肤的樟树叶提取物在制备具有屏障修复作用的药物组合物或护肤品中的用途。

在第四方面，本申请实施例还提供一种用于改善修复皮肤的樟树叶提取物在制备具有抗皱作用的药物组合物或护肤品中的用途。

在第五方面，本申请实施例还提供一种用于改善修复皮肤的樟树叶提取物在制备具有抗炎作用的药物组合物或护肤品中的用途。

在第六方面，本申请实施例还提供一种用于改善修复皮肤的樟树叶提取物在制备具有保湿作用的药物组合物或护肤品中的用途。

在第七方面，本申请实施例还提供一种用于改善修复皮肤的樟树叶提取物在制备具有保湿、屏障修复、抗炎、抗皱抗衰、美白祛斑、抑菌中两种或两种以上作用的药物组合物或护肤品中的用途。

在第八方面，本申请实施例还提供了一种药物组合物，包含：生理上或药学上可接受的辅料制剂；和上述的用于改善修复皮肤的樟树叶提取物；其中，所述樟树叶提取物在药物组合物中的浓度为10μg/mL～500μg/mL。

在第九方面，本申请实施例还提供了一种护肤品，包含：化妆品基质溶剂；和上述的用于改善修复皮肤的樟树叶提取物；其中，所述樟树叶提取物在护肤品中的浓度为10μg/mL～500μg/mL。

与现有技术相比，本申请实施例的有益效果包括：

在一些实施例中，本申请实施例提供的芳樟醇型樟叶精油（樟树叶提取物），能够促进HaCaT细胞增殖，具有较强的屏障修复作用。

在一些实施例中，本申请实施例提供的芳樟醇型樟叶精油（樟树叶提取物），能够显著抑制透明质酸酶活性，促进透明质酸合成，具有较好的保湿作用。

在一些实施例中，本申请实施例提供的芳樟醇型樟叶精油（樟树叶提取物），可以显著抑制MMP-1基因表达，具有较好的抗皱作用。

在一些实施例中，本申请实施例提供的芳樟醇型樟叶精油（樟树叶提取物），能够抑制LPS诱导引起的Raw264.7 细胞NO释放，具有较好的抗炎作用。

在一些实施例中，本申请实施例提供的芳樟醇型樟叶精油（樟树叶提取物），能够抑制痤疮丙酸杆菌和金黄色葡萄球菌，具有较好的抑菌改善痤疮的作用。

在一些实施例中，本申请实施例提供的芳樟醇型樟叶精油（樟树叶提取物），能够抑制黑色素合成，具有较好的美白祛斑作用。

本申请的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本申请的实施例了解到。

附图说明

图1所示为本申请实施例中实施例1的樟树叶提取物的一个总离子流图；

图2所示为本申请实施例中实施例4透明质酸（HA）浓度与OD值的拟合曲线；

图3所示为本申请实施例中实施例6 NO浓度与OD值之间拟合标准曲线示意图；

图4所示为本申请实施例中实施例7樟树叶提取物对痤疮丙酸杆菌的抑菌曲线；

图5所示为本申请实施例中实施例7樟树叶提取物对金黄色葡萄球菌的抑菌曲线。

具体实施方式

为了便于理解本申请，下面将参照相关附图对本申请进行更全面的描述。附图中给出了本申请的若干个实施例。但是，本申请可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本申请的公开内容更加透彻全面。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本申请的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本申请的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本申请。本文所使用的术语“及／或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

在本文中，除非另有说明，用语“％”是指“质量％”；用语“μg/mL”是指：微克每毫升。在本文中，除非另有说明，本文用语“％”均是指基于本申请组合物的总重量而言的。

在本文中，限定的所有范围是指：包括给定范围内的每个特定范围以及给定范围之间的子范围的组合。例如，1～5的范围具体包括1、2、3、4和5，也包括如2～5、3～5、2～3、2～4、1～4等子范围。

实施例1

采用水上蒸馏的方式从新鲜樟树叶中提取所述芳樟醇型樟叶精油。

具体地，申请人于6-9月期间，从江西省九江市永修县种植的芳樟醇型樟树中摘取新鲜樟树叶，采集的新鲜樟树叶，洗净，置于不锈钢精油提取器上部筛板上，在蒸馏器底部加入适量的水，将底部水电加热至沸腾，所产生的蒸汽通过筛板由下而上加热料层，油水混合蒸汽通过冷凝管进入油水分离器，蒸馏2h。蒸馏完成后将油水分离器中液体混合物静置分层，取上层油相，即得到樟树叶提取物。

采用水中蒸馏的方式从新鲜樟树叶中提取所述芳樟醇型樟叶精油。

具体地，申请人于6-9月期间，从江西省九江市永修县种植的芳樟醇型樟树中摘取新鲜樟树叶，将采集的新鲜樟树叶，洗净，置于不锈钢精油提取器中；在蒸馏器底部加入足量的水，使其没过樟树叶，加热至沸腾，使油水混合蒸汽通过冷凝管进入油水分离器；

需要指出的是，上述两种提取方式涉及的芳樟醇型樟树的拉丁学名为“Camphora officinarum”，樟科樟属。

樟树叶提取物的组分检测

实施例2

在本实施例中，申请人将提取得到的芳樟醇型樟叶精油送至上海中医药大学创新中药研究院进行气质联用检测，具体流程为：

检测仪器选用安捷伦气相色谱四极杆质谱联用仪，色谱柱采用安捷伦 HP-5 MSUI（30 m×0.25 mm×0.25 μm），载气为高纯氦，载气流速为1.0 mL/min，进样口温度为250℃，分流比为10:1，进样量为1μL，升温程序设置为50℃——180℃（3℃/min）——300℃（20℃/min, 保持 5 min），离子源为EI⁺，离子源温度为230℃，全离子扫描模式，扫描范围为40-600 m/z，溶剂延迟4 min。

检测步骤为：将待测精油（芳樟醇型樟叶精油）混匀，移取 0.5 mL 置于1.5 mL离心管中，离心 1 min；取上清液 50 μL，称重，加入乙酸乙酯，配成浓度为100 mg/mL的精油溶液；按 1:10 的质量比，加入无水硫酸钠粉末，混匀，静置，离心；取上清液10μL，以乙酸乙酯稀释100倍，得浓度为1mg/mL的待测溶液；将待测溶液离心1min，取上清液，气质联用检测。

气质联用检测的原始数据经 AgiLent MassHunter QuaLitative AnaLysis（VB.07.00）软件分析，得各组分峰的信息（保留时间，积分峰面积，峰面积总和百分比，以及峰高）；通过质谱数据库（NIST 2020 V2.4）和保留指数库（NIST Chemistry WebBook）匹配，对各组分峰的结构进行归属。

表1 组分峰信息表

表2 组分峰归属表

表3 组分峰信息表

表4 组分峰归属表

水上蒸馏检测结果请参阅图1中的a，并如上表1所示的组分峰信息表和上表2所示的组分峰归属表，可知，本实施例中水上蒸馏的樟树叶提取物其组分包括：桉油精，质量百分比为0.12%；顺式芳樟醇氧化物，质量百分比为0.07%；芳樟醇，质量百分比为97.47%；樟脑，质量百分比为0.13%；α-松油醇，质量百分比为0.28%；橙花醇，质量百分比为0.09%；石竹烯，质量百分比为0.74%；蛇麻烯，质量百分比为0.22%；橙花叔醇，质量百分比为0.63%。

水中蒸馏检测结果请参阅图1中的b，并如上表3所示的组分峰信息表和上表4所示的组分峰归属表，可知，本实施例中水上蒸馏的樟树叶提取物其组分包括：α-蒎烯，质量百分比为0.08%；桉油精，质量百分比为0.18%；顺式芳樟醇氧化物，质量百分比为0.19%；芳樟醇，质量百分比为95.44%；去氢芳樟醇，质量百分比为0.32%；樟脑，质量百分比为1.34%；4-萜烯醇，质量百分比为0.1%；α-松油醇，质量百分比为0.1%；石竹烯，质量百分比为0.3%；蛇麻烯，质量百分比为0.12%；双环大牻牛儿烯，质量百分比为0.17%；匙叶桉油烯醇，质量百分比为0.17%。

此外，由于芳樟醇的质量百分比最高，因此申请人将该樟树叶提取物命名为芳樟醇樟叶精油。

樟树叶提取物的皮肤屏障修复作用评价实验

实施例3

1、测试内容

1.1 HaCaT细胞增殖实验

1.2HaCaT细胞紧密连接蛋白ZO-1基因表达检测

2、实验材料

2.1实验细胞

人永生化角质形成细胞系HaCaT细胞。

2.2试剂和耗材

DMEM高糖培养基，胰酶，胎牛血清，PBS缓冲液，CCK8检测试剂盒， PCR引物及试剂盒、12孔细胞培养板、24孔细胞培养板、96孔细胞培养板，一次性吸管， 1000μL、200μL、10μL移液枪及Tip头，50 mL、15 mL、2 mL离心管等。

2.3仪器设备

生物安全柜、细胞恒温培养箱、倒置显微镜、实时荧光定量PCR仪、全自动酶标仪、离心机、水浴锅、-80度冰箱、-20度冰箱、4度冰箱。

3 实验方法

3.1 HaCaT细胞增殖实验

将HaCaT细胞以2×10⁵个/孔的密度接种于96孔板，放入细胞培养箱中培养24 h，之后加入含10、25、50、100、250μg/mL由实施例1提取得到的樟树叶提取物共孵育24h，每组设3个复孔。之后移除96孔板内的培养基，每孔加入100μL含10% CCK8试液的培养基。培养箱内孵育1h 后取出，利用酶标仪检测波长450nm处的OD值，计算细胞存活率。细胞存活率（%）=(精油组OD值-PBS孔OD值)/(空白组OD值-PBS孔OD值)×100%。该实验用于确定精油对HaCaT细胞的无毒性浓度，后续测试将根据本实验的结果选择合适的测试浓度。

3.2 HaCaT细胞ZO-1蛋白表达检测

HaCaT细胞接种于含10%胎牛血清、1%双抗DMEM高糖培养基的12孔板中，接种密度为1×10⁵个/孔，培养24 h后，除空白组外，其余各孔为精油干预组，加入含精油的培养基。24 h后收集细胞，提取RNA，根据试剂盒说明进行操作，RT-PCR法检测表皮紧密连接相关蛋白ZO-1基因表达。按照 95℃、30s，95℃、5s，60℃、30s，95℃、15s，60℃、1 min，95℃、15s的条件进行实时定量PCR反应，共45个循环。每组 3个重复，取平均Ct值，以β-actin内参基因，采用相对定量法，目的基因的相对表达含量 = 2^-△△Ct。

4 实验结果

4.1 精油对HaCaT细胞存活率的影响

用CCK8检测芳樟醇型樟叶精油对HaCaT细胞作用24h细胞存活率的影响。结果（表5）显示，水上蒸馏提取芳樟醇型樟叶精油在浓度为10-100μg/mL时可以显著促进细胞增殖（P<0.05，P<0.01），在浓度为250μg/mL时对细胞活力没有影响（P>0.05）；水中蒸馏提取芳樟醇型樟叶精油在浓度为10μg/mL-100μg/mL时对细胞活力没有影响（P>0.05），在浓度为250μg/mL时显著抑制细胞活力，对细胞产生细胞毒性。

表5 精油对细胞存活率的影响

备注：与空白组相比较，^*P<0.05，^**P<0.01。

4.2 精油对HaCaT细胞紧密连接蛋白ZO-1基因表达的影响

表皮细胞紧密连接被认为是表皮屏障功能的“主要控制因子”。紧密连接蛋白（tight junction， TJ）是维持表皮机械屏障功能的重要结构。TJ 包含多个蛋白家族，这些蛋白的表达量与屏障的物理防御功能关系密切，TJ结构的稳定反应了屏障功能的完成性。多种TJ蛋白交互连接，形成TJ复合体，蛋白质复合物将细胞彼此连接，由ZO蛋白直接结合肌动蛋白，从而在细胞骨架和TJ复合体之间形成稳定连接。ZO-1是ZO蛋白家族重要组成蛋白。根据RT-PCR结果显示如表6，与空白组相比较，水上蒸馏提取芳樟醇型樟叶精油可以显著促进ZO-1基因表达（P<0.001）；水中蒸馏组降低了ZO-1基因表达（P<0.05）。相比较，水上蒸馏提取芳樟醇型樟叶精油对维持紧密连接结构起到促进作用，进而达到促进屏障修复作用。

表6精油对ZO-1基因相对表达的影响

备注：与空白组相比，^*P<0.05，^***P<0.001。

樟树叶提取物的皮肤保湿作用评价实验

实施例4

1、测试内容

1.1 体外透明质酸酶抑制作用

1.2 HaCaT细胞透明质酸表达检测

1.3 HaCaT细胞丝聚蛋白（FLG）基因表达检测

2、实验材料

2.1实验细胞

人永生化角质形成细胞系HaCaT细胞。

2.2试剂和耗材

DMEM高糖培养基，胰酶，胎牛血清，透明质酸酶，透明质酸，PCR引物及试剂盒，6孔细胞培养板板、12孔细胞培养板、96孔酶标板，一次性吸管，1000μL、200μL、10μL移液枪及Tip头，50mL、15mL、2mL离心管等耗材

2.3仪器设备

3、实验方法

3.1体外透明质酸酶抑制作用检测

首先采用DNS法绘制透明质酸酶与底物透明质酸（HA）反应的酶活标准曲线。配制含有143U/mL透明质酸酶的精油溶液，其中所含精油的浓度为25μg/mL。反应体系为：500μL透明质酸标准溶液或配制好的精油溶液，再加入0.5% HA 500 μL，37℃水浴30min，之后沸水浴5 min使酶失活，取200 μL反应液，加入DNS溶液400 μL，沸水浴5 min，取150 μL加入96孔板，每样设3个复孔，酶标仪测定A540值。按照标准曲线的线性回归方程计算溶液的残余酶活性，并评价精油对酶活性的影响。

3.2 HaCaT细胞透明质酸表达检测

HaCaT细胞接种于12孔板中，接种密度为1×10⁵个/孔，培养24h使之贴壁。除空白组外，其余各孔为精油干预组，加入含精油的培养基，精油的浓度为25μg/mL。继续培养24h后，ELISA法检测细胞中透明质酸（HA）含量。

3.3 HaCaT细胞丝聚蛋白基因表达检测

HaCaT细胞接种于6孔板中，接种密度为1×10⁵个/孔，培养24h使之贴壁。除空白组外，其余各孔为精油干预组，加入含精油的培养基，精油的浓度为25μg/mL。继续培养24h后实验结束，RT-PCR检测丝聚蛋白（FiLaggrin，FLG）基因表达。按照 95℃、30s，95℃、5s，60℃、30s，95℃、15s，60℃、1 min，95℃、15s的条件进行实时定量PCR反应，共45个循环。每组3个重复，取平均Ct值，以β-actin内参基因，采用相对定量法，目的基因的相对表达含量 =2^-△△Ct。

4 实验结果

4.1体外透明质酸酶抑制作用

透明质酸（HyaLuronic acid,HA）是一种多糖类物质，是构成皮肤细胞间质和细胞外基质的主要成分，其在真皮和表皮中结合和保留水分子的独特能力决定着皮肤的水合作用。HA具有极强亲水性，能够吸附大量水分子，形成一层水分膜，有效锁住肌肤的水分，具有良好保湿性能。透明质酸合成酶合成HA，透明质酸酶降解HA。对透明质酸酶抑制率越大表明对HA的降解作用越弱，则HA含量越高，对皮肤保湿作用越明显。结果见表7，水上蒸馏和水中蒸馏提取芳樟醇型樟叶精油在25μg/mL浓度对透明质酸酶活性均表现出显著的抑制作用，平均抑制率分别高达79.59%和76.30%，芳樟醇型樟叶精油可以减少透明质酸的降解，保证透明质酸的含量，提示具有较强的保湿作用。

表7精油对透明质酸酶活性抑制作用

4.2 精油对HaCaT细胞透明质酸表达的影响

4.2.1标准曲线制备

根据试剂盒操作步骤，建立HA浓度与OD值之间的线性关系，结果如图2所示，线性方程：y=0.0056x+0.0042，R²=0.9993。

4.2.2精油对细胞HA含量的影响

ELISA检测细胞中HA含量，根据HA浓度与OD值的线性方程得到芳樟醇型樟叶精油组细胞HA含量，结果显示见表8，与空白组相比较，水上蒸馏和水中蒸馏提取芳樟醇型樟叶精油均可显著促进HaCaT细胞HA表达（P<0.05），提示精油具有较好保湿作用。并且两种蒸馏方法提取的精油对HaCaT细胞HA表达没有明显差异，提示二者保湿效果相近。

表8精油对细胞中HA含量的影响（单位：pg/mL）

备注：与空白组相比，^*P<0.05。

4.3 精油对细胞丝聚蛋白FLG mRNA表达的影响检测

透明质酸可以与角质形成细胞表面CD44受体结合，进而上调丝聚蛋白（FLG）表达，修护肌肤屏障，增强肌肤对外界环境的防御功能，减少水分流失。同时FLG也可以降解形成天然保湿因子，调节皮肤水合功能，进而达到保湿作用。RT-PCR检测芳樟醇型樟叶精油对HaCaT细胞中FLG基因表达的影响，结果见表9，与空白组相比较，水上蒸馏和水中蒸馏提取芳樟醇型樟叶精油均可以显著促进FLG mRNA表达（P<0.05），表明精油在保湿以及修复肌肤屏障方面具有一定促进作用。相同浓度下，水中蒸馏提取芳樟醇型樟叶精油对促进FLG基因表达作用强于水上蒸馏提取芳樟醇型樟叶精油（P<0.001）。

表9精油对FLG基因相对表达的影响

备注：与空白组相比，^*P<0.05，^**P<0.01；与芳樟醇型樟叶精油（水上蒸馏）组相比，

^***P<0.001。

樟树叶提取物的皮肤抗皱作用评价实验

实施例5

1、测试内容

1.1 精油对HSF细胞存活率的影响

1.2 HSF细胞MMP-1基因表达检测

2、实验材料

2.1实验细胞

人永生化成纤维细胞HSF。

2.2试剂和耗材

HSF专用培养基，胰酶，胎牛血清，PBS缓冲液，CCK8检测试剂盒，PCR引物及试剂盒，96孔板，一次性吸管，1000μL、200μL、10μL移液枪及Tip头，50mL、15mL、2mL离心管等耗材。

2.3仪器设备

生物安全柜、细胞恒温培养箱、倒置显微镜、全自动酶标仪、实时荧光定量PCR仪、离心机、水浴锅、-80度冰箱、-20度冰箱、4度冰箱。

3、实验方法

3.1精油对HSF细胞存活率的影响

将HSF细胞以6×10⁴个/mL的密度、100μL/孔接种于96孔细胞培养板，放入细胞培养箱中培养24 h，加入不同浓度的精油共孵育24 h，精油的浓度梯度为0、10μg/mL、25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、250μg/mL，每组设4个复孔。之后移除96孔板内的培养基，每孔加入100μL含10% CCK8试液的培养基。培养箱内孵育1h 后取出，利用酶标仪检测波长450nm处的OD值，计算细胞存活率。细胞存活率（%）=(精油组OD值-PBS孔OD值)/(未处理空白组OD值-PBS孔OD值)×100%。该实验用于确定精油对HSF细胞生长的影响，后续测试将根据本实验的结果选择合适的测试浓度。

3.2 精油对成纤维细胞基质金属蛋白酶（MMP-1）基因表达的影响

将HSF细胞以6×10⁴个/mL的密度接种于6孔板，培养24h 使之贴壁。精油的浓度为25μg/mL，共培养24 h。按照试剂盒说明提取细胞总RNA并进行逆转录反应。之后通过RT-PCR检测MMP-1 mRNA的表达水平。按照 95℃、30s，95℃、5s，60℃、30s，95℃、15s，60℃、1min，95℃、15s的条件进行实时定量PCR反应，共45个循环。每组 3个重复，取平均Ct值，以β-actin内参基因，采用相对定量法，目的基因的相对表达含量 = 2^-△△Ct。

4 实验结果

4.1 精油对细胞存活率的影响

用CCK8检测芳樟醇型樟叶精油对HSF细胞刺激24 h后细胞存活率的影响。结果显示见表10，水上蒸馏和水中蒸馏提取芳樟醇型樟叶精油在浓度为10-100μg/mL时均对细胞活力没有影响（P>0.05），无细胞毒性；在浓度为250μg/mL浓度显著抑制细胞活力（P<0.05），细胞毒性明显。

表10精油对HSF细胞存活率的影响

备注：与空白组相比，^***P<0.001。

4.2 精油对成纤维细胞MMP-1基因表达的影响

人体内的基质金属蛋白酶(Matrix MetaLLoproteinase，MMPs) 是一类高度保守的锌依赖性蛋白水解酶类，细胞外基质的降解主要依赖这类蛋白水解酶。其中MMP-1是降解I型和III型胶原蛋白最主要的酶。当MMP-1过度表达时，特异性降解细胞外基质，破坏胶原纤维和弹性纤维正常结构，造成皮肤胶原蛋白流失，导致皮肤出现皱纹。RT-PCR结果见表11，与空白组相比较，水上蒸馏提取芳樟醇型樟叶精油可以显著抑制MMP-1基因表达（P<0.01），进而抑制异常的胶原降解，起到抗皱的作用；水中蒸馏提取芳樟醇型樟叶精油反而促进MMP-1基因表达（P<0.01），增加了胶原降解。相同浓度下，水上蒸馏提取芳樟醇型樟叶精油对胶原降解的抑制作用强于水中蒸馏提取芳樟醇型樟叶精油。

表11精油对MMP-1基因表达的影响

备注：与空白组相比，^**P<0.01

樟树叶提取物的抗炎作用评价实验

实施例6

1、测试内容

1.1 Raw264.7细胞活力检测

1.2细胞炎症因子NO检测

2、实验材料

2.1 细胞系

小鼠单核巨噬细胞系Raw264.7细胞。

2.2 试剂与耗材

脂多糖LPS、RPMI1640培养基、胰酶、胎牛血清、PBS缓冲液、CCK8检测试剂盒、一氧化氮（NO）检测试剂盒。6孔、96孔细胞培养板，一次性细胞刮刀，一次性吸管，1000μL、200μL、10μL移液枪及Tip头，50mL、15 mL、2 mL离心管等耗材。

2.3 仪器与设备

生物安全柜、细胞培养箱、倒置显微镜、全自动酶标仪、离心机、水浴锅、-80度冰箱、-20度冰箱、4度冰箱。

3、实验方法

3.1 Raw264.7细胞活力检测

选择对数生长期的Raw264.7细胞，利用细胞刮刀将细胞刮下，1000 g离心3 min收集细胞，重悬后细胞计数，调整细胞密度为1.0×10⁵ceLLs/mL，铺96孔板，每孔100μL，培养24 h贴壁后移除原培养基，加入含有精油的培养基，精油的浓度梯度为10μg/mL、25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、250μg/mL，每组设4个复孔，共孵育时间为24 h。之后将培养基更换为含10% CCK8的培养基，放入细胞培养箱中孵育1 h，利用酶标仪测OD450值，计算细胞存活率。细胞存活率（%）=(精油组OD值-PBS孔OD值)/(未处理空白组OD值-PBS孔OD值)×100%。计算不同浓度的精油对Raw264.7细胞活力的影响。该实验用于确定精油对Raw264.7细胞的无毒性浓度，后续测试将根据本实验的结果选择合适的测试浓度。

3.2 Raw264.7细胞炎症模型的NO检测

选择对数生长期的Raw264.7细胞，收集细胞，按照1.0×10⁵ceLLs/mL的密度接种于24孔板，每孔0.5mL，继续培养24h贴壁。移除原培养基，加入含有精油、LPS（1.0μg/mL）的培养基，精油浓度分别为25μg/mL和50μg/mL，继续培养24h，收集上清液，具体步骤按照NO试剂盒说明书操作。于波长540 nm处测OD值，并计算NO的含量及抑制率。公式：NO含量代入标准品公式进行计算。NO抑制率（%）=(模型组NO平均含量-精油组NO平均含量)/模型组NO平均含量×100%。

4、实验结果

4.1精油对巨噬细胞存活率的影响

用CCK8检测芳樟醇型樟叶精油对Raw264.7细胞刺激24h后细胞存活率的影响。结果见表12，水上蒸馏提取芳樟醇型樟叶精油在浓度为10-250μg/mL时对细胞活力没有影响（P>0.05），无细胞毒性，而且与空白组相比，25μg/mL可以显著提高细胞存活率，有促进细胞增殖趋势；水中蒸馏提取芳樟醇型樟叶精油在浓度为10μg/mL-250μg/mL均可以显著促进细胞活力（P<0.05，P<0.01，P<0.001），有显著促细胞增殖作用。结果显示芳樟醇型樟叶精油安全浓度范围10-250μg/mL。

表12精油对巨噬细胞存活率的影响

备注：与空白组相比，^*P<0.05，^**P<0.01，^***P<0.001。

4.2 NO检测结果

4.2.1标准曲线制备

根据试剂盒操作步骤，建立NO浓度与OD值之间的线性关系，结果如下图3所示，线性方程：y=0.0081x+0.0678，R²=0.9997。

4.2.2 NO含量检测

巨噬细胞是机体内一种重要的免疫细胞，在抗炎方面发挥重要作用。大量研究表明多种炎症的发生与发展与巨噬细胞及其释放的炎性介质有密切联系。一氧化氮（NO）就是一种炎性介质。结果见表13，空白组Raw264.7细胞中NO释放量较低，加入LPS作用后，细胞培养上清液中NO含量显著增加；芳樟醇型樟叶精油和LPS共同作用后，可以显著抑制LPS诱导引起的NO释放。水上蒸馏提取芳樟醇型樟叶精油在25μg/mL和50μg/mL浓度对NO抑制率分别为26%和28%；水中蒸馏提取芳樟醇型樟叶精油在25μg/mL和50μg/mL浓度对NO抑制率分别为35%和57%。以上结果提示精油具有一定抗炎作用，并且水中蒸馏提取芳樟醇型樟叶精油在50μg/mL对NO抑制率可达50%以上。

表13精油对LPS诱导巨噬细胞NO含量的影响

樟树叶提取物的抑菌作用评价实验

实施例7

1、测试内容

1.1 精油对痤疮丙酸杆菌的抑制作用

1.2精油对金黄色葡萄球菌的抑制作用

2、实验材料

2.1 实验菌株

痤疮丙酸杆菌菌株、金黄色葡萄球菌菌株

2.2 试剂与耗材

厌氧指示剂、胰酪大豆胨琼脂 (Tryptic Soy Agar, TSA) 琼脂平板、营养肉汤（Nutrient Broth, NB）培养基、脑心浸出液肉汤（Brain Heart Infusion Broth, BHI）培养基、BHI琼脂平板、10cm培养皿、灭菌接种环、96孔板、厌氧发生袋2.3 仪器与设备摇床、酶标仪

3、实验方法

3.1菌株的制备：

3.1.1在实验期间，菌株痤疮丙酸杆菌和金黄色葡萄球菌在脱脂牛奶菌种保存管中长期保藏于-80℃。

3.1.2金黄色葡萄球菌的培养：培养前，取出冻存的菌株，复苏后用接种环借助划线法将细菌接种至TSA琼脂平板上，37℃培养24 h-48 h至有明显菌落，将其作为工作板。工作板每20天更换一次以保证菌落活性，4℃保存。为获得对数生长期后的金黄色葡萄球菌菌液，每次挑取工作板上的小块圆形菌落，置于1mL NB液体培养基中，在转速250rpm、温度37℃的条件下摇菌过夜，第二天收获菌株用于实验。

3.1.3痤疮丙酸杆菌的培养：痤疮丙酸杆菌为厌氧菌，需置于厌氧环境中培养，于厌氧培养袋中放置打开的厌氧发生袋以营造厌氧环境，并利用厌氧指示剂观察培养袋中含氧情况。培养前，取出冻存的菌株，复苏后用接种环借助划线法将细菌接种至BHI琼脂平板上，并放入厌氧环境中37℃培养48-72h至有明显菌落作为工作板，工作板每20天更换一次以保证菌落活性，4℃保存。为获得对数生长期后的痤疮丙酸杆菌菌液，每次挑取工作板上的小块圆形菌落，置于1mL BHI液体培养基中，于厌氧环境、转速250 rpm、温度37℃的条件下摇菌过夜，第二天收获菌株用于实验。

3.2对金黄色葡萄球菌、痤疮丙酸杆菌抑菌率的测定：微量二倍稀释法用于测试精油对金黄色葡萄球菌和痤疮丙酸杆菌的抑菌率。

3.2.1在96孔板每个孔加入100µL培养基（NB-金黄色葡萄球菌；BHI-痤疮丙酸杆菌）。

3.2.2在第1排中加入精油100µL，然后对药物进行二倍稀释。即，第一孔加入精油后用移液枪充分吹打混匀，然后吸取100µL加入第二孔再充分吹打混匀，照此重复至最后一孔，最后一孔吸出100µL扔掉，每个药物浓度重复3次。此时每测试孔应含100µL溶液。

3.2.3每孔中加入稀释好的金黄色葡萄球菌或痤疮丙酸杆菌菌液100µL（稀释好的菌液浓度均为2×10⁶CFU/mL），加入每孔后菌液最终浓度为1×10⁶CFU/mL，第一孔的精油最终稀释倍数为4倍，精油浓度为250mg/mL；依次稀释倍数为8倍、16倍、32倍、64倍、128倍、256倍、512倍、1024倍、2048倍、4096倍、8192倍。

3.2.4在同一块板上设置阴性对照（含不同稀释倍数的精油及培养基，去除药物背景OD₆₃₀）和阳性对照（100µL培养基+100µL菌液，菌液终浓度为1×10⁶CFU/mL）。

3.2.5金黄色葡萄球菌以50rpm在培养条件下孵育24小时，痤疮丙酸杆菌则以50rpm在培养条件下孵育48小时，随后用酶标仪测定每个孔的OD₆₃₀，计算细菌活力。抑菌率(%) = 100%-[OD₆₃₀(测试)-OD₆₃₀(阴性)]/[OD₆₃₀(阳性)-OD₆₃₀(阴性)]。

3.3抑菌作用评估及抑菌作用曲线，每组精油每个稀释浓度3个重复实验，数据以抑菌率(%)±标准差(%)表示，抑菌率≥50%，则认为精油在该稀释倍数下存在抑菌作用；抑菌率≥90%，精油在该稀释倍数下有较强抑菌作用。以稀释倍数为X轴，抑菌率为Y轴，绘制精油抑菌作用曲线。

4、实验结果

4.1精油对痤疮丙酸杆菌的抑菌作用

结果如图4所示，水上蒸馏提取芳樟醇型樟叶精油在4096倍稀释浓度内（>0.24mg/mL）具有对痤疮丙酸杆菌的强效抑菌作用（>90%抑菌率）；水中蒸馏提取芳樟醇型樟叶精油在2048倍稀释浓度内（>0.48mg/mL）具有对痤疮丙酸杆菌的强效抑菌作用（>90%抑菌率），在4096倍稀释浓度内（>0.24mg/mL）具有抑菌作用（>50%抑菌率）。水上蒸馏提取芳樟醇型樟叶精油对痤疮丙酸杆菌的抑菌作用优于水中蒸馏提取芳樟醇型樟叶精油。

4.2精油对金黄色葡萄球菌的抑菌作用

结果如图5所示，水上蒸馏提取芳樟醇型樟叶精油在1024倍稀释浓度内（>0.97mg/mL）具有对痤疮丙酸杆菌的强效抑菌作用（>90%抑菌率），在2048倍稀释浓度内（>0.48mg/mL）具有抑菌作用（>50%抑菌率）；水中蒸馏提取芳樟醇型樟叶精油在512倍稀释浓度内（>1.95mg/mL）具有对痤疮丙酸杆菌的强效抑菌作用（>90%抑菌率），在1024倍稀释浓度内（>0.97mg/mL）具有抑菌作用（>50%抑菌率）。水上蒸馏提取芳樟醇型樟叶精油对金黄色葡萄球菌的抑菌作用优于水中蒸馏提取芳樟醇型樟叶精油。

樟树叶提取物的美白祛斑作用评价实验

实施例8

1、测试内容

1.1 体外酪氨酸酶活性抑制实验

1.2黑色素细胞的黑色素合成抑制实验

2、实验材料

2.1 细胞系

小鼠黑色素瘤细胞系B16F10细胞。

2.2 试剂与耗材

植物精油，RPMI1640培养基，胰酶，胎牛血清，PBS缓冲液，蘑菇酪氨酸酶，Ｌ-酪氨酸，氢氧化钠等试剂。

2.3 仪器与设备

生物安全柜、细胞恒温培养箱、倒置显微镜、全自动酶标仪、离心机、水浴锅、-80度冰箱、-20度冰箱、4度冰箱。细胞培养瓶，6孔板，96孔板，一次性吸管，1000 μL、200 μL、10 μL移液枪及枪头，50 mL、15 mL、2 mL离心管等耗材。

3 实验方法

3.1 酪氨酸酶活性检测

通过测定混合体系中蘑菇酪氨酸酶的活性，来评价精油对酪氨酸酶活性的直接影响。将L-酪氨酸配成500μg/mL溶液，蘑菇酪氨酸配置成100U/mL，精油测试浓度为50和100μg/mL。测试体系为：①L-酪氨酸120μL，②蘑菇酪氨酸酶 40μL，③精油 40μL。设置A孔将测试体系中的③换为PBS缓冲液 40μL，其余不变，作为阳性对照；设置B孔将测试体系中的②和③均换为PBS缓冲液，作为A的阴性对照；设置C孔为样品测试孔，按测试体系配置；设置D孔将测试体系中的②更改为PBS缓冲液，作为样品的阴性对照孔。配置好各孔后将96孔板37℃恒温孵育20min，之然后用酶标仪迅速测定反应混合液在 475nm 处的吸光度值，对酪氨酸酶活性抑制率的计算式为R＝100%-(C孔OD值 – D孔OD值)／(A孔OD值 – B孔OD值)×100%。

3.2 B16F10细胞的黑色素合成抑制检测

取对数生长期的B16F10细胞，每孔1.5×10⁵个接种于6孔板，培养约12h贴壁后，干预组更换为含有植物精油的培养基，精油的浓度分别为50μg/mL、100μg/mL。继续培养48 h后，弃培养液，PBS洗涤，消化、离心获取细胞沉淀；加入400μL含有1 moL/L的氢氧化钠吹打均匀，80℃水浴30 min，移入96孔板，每个浓度3个复孔，测定各孔405nm波长下OD值，以对照组黑色素含量为100%计，根据公式计算实验组黑色素含量：

黑色素抑制率（%）对照组OD值-精油组OD值）/对照组OD值×100％

4 实验结果

4.1 酪氨酸酶活性检测结果

酪氨酸在酪氨酸酶的作用下产生黑色素，酪氨酸酶是酪氨酸转变为黑色素的主要限速酶。抑制酪氨酸酶活性、减少酪氨酸酶产生或加速酪氨酸酶分解均可达到美白效果。检测芳樟醇型樟叶精油对酪氨酸酶活性的抑制率，其结果见表14，水上蒸馏提取芳樟醇型樟叶精油在10μg/mL浓度对酪氨酸酶抑制率可达20%，在10μg/mL-100μg/mL浓度范围内随着精油浓度的增加其对酪氨酸酶活性抑制率也在逐渐增加。水中蒸馏提取芳樟醇型樟叶精油在10μg/mL-100μg/mL浓度范围内对酪氨酸酶活性产生不同程度抑制作用。相同浓度下，水上蒸馏提取芳樟醇型樟叶精油对酪氨酸酶抑制作用强于水中蒸馏提取芳樟醇型樟叶精油。

表14精油对酪氨酸酶活性的的影响

4.2 B16F10细胞的黑色素合成抑制检测结果

黑色素过度沉着是导致皮肤出现色斑的主要原因，抑制黑色素沉着可以达到美白的作用。采用NaOH裂解法检测芳樟醇型樟叶精油干预后B16F10细胞黑色素含量变化，其结果见表15，与空白组相比较，水上蒸馏提取芳樟醇型樟叶精油在浓度为50μg/mL和100μg/mL时对细胞内黑色素合成的抑制率为6%和7%，表现出抑制黑色素生成的作用。而水中蒸馏提取芳樟醇型樟叶精油不仅不能抑制黑色素合成，还表现出呈浓度依赖性促进黑色素合成现象。相同浓度下，水上蒸馏提取芳樟醇型樟叶精油对黑色素抑制作用强于水中蒸馏提取芳樟醇型樟叶精油。

表15精油对B16F10细胞的黑色素合成的影响

实施例9

本申请实施例还提供一种用于改善修复皮肤的樟树叶提取物，樟树叶提取物根据前述的第一实施例中的樟树叶提取物的提取方法获得。

本申请实施例提供的樟树叶提取物，其中水上蒸馏提取的樟树叶提取物在10μg/mL-100μg/mL浓度范围时，能够显著促进HaCaT细胞增殖，同时还可以显著促进ZO-1基因表达，说明樟树叶提取物适于制备具有屏障修复作用的药物组合物或护肤品。

实施例10

本申请实施例提供的樟树叶提取物，当浓度为25μg/mL时，对透明质酸酶活力的抑制率达到79.59%（水上蒸馏）和76.30%（水中蒸馏），可以显著促进FLG mRNA表达和HA表达，说明樟树叶提取物适于制备具有保湿作用的药物组合物或护肤品。

实施例11

本申请实施例提供的樟树叶提取物，当其浓度为0-100μg/mL时，对细胞活力没有明显影响，水上蒸馏提取樟树叶提取物能够显著抑制MMP-1基因表达，说明樟树叶提取物适于制备具有抗皱作用的药物组合物或护肤品。

实施例12

本申请实施例提供的樟树叶提取物，当浓度为25μg/mL和50μg/mL时，能够显著抑制LPS诱导Raw264.7细胞NO的释放，说明樟树叶提取物能够适于制备具有抗炎的药物组合物或护肤品。

实施例13

本申请实施例提供的樟树叶提取物，明显抑制痤疮丙酸杆菌和金黄色葡萄球菌，说明樟树叶提取物能够适于制备具有抑菌药物组合物或护肤品。

实施例14

本申请实施例提供的水上蒸馏提取樟树叶提取物，当浓度在50μg/mL-100μg/mL时，对黑色素的抑制率达到6%-7%，说明樟树叶提取物能够适于制备具有美白祛斑药物组合物或护肤品。

实施例15

本申请实施例提供的樟树叶提取物，在同一浓度下，例如25μg/mL或50μg/mL，能够同时体现出其具有保湿、屏障修复、抗炎、抗皱抗衰、美白祛斑、抑菌作用中的两种或两种以上，说明樟树叶提取物能够适于制备同时具有保湿、屏障修复、抗炎、抗皱抗衰、美白祛斑、抑菌中两种或两种以上作用，说明樟树叶提取物能够适于制备同时具有保湿、屏障修复、抗炎、抗皱抗衰、美白祛斑、抑菌中两种或两种以上作用的药物组合物或护肤品。

实施例16

本申请实施例还提供一种药物组合物，包含第一实施例中提取得到的樟树叶提取物，该药物组合物具有良好的保湿、屏障修复、抗炎、抗皱抗衰、美白祛斑、抑菌等作用。

示例性地，本申请实施例所述的药物组合物可以是软膏、药霜中的任意一种。

实施例17

本申请实施例还提供一种护肤品，包含第一实施例中提取得到的樟树叶提取物，该护肤品具有良好的保湿、屏障修复、抗炎、抗皱抗衰、美白祛斑、抑菌等作用。

护肤品可以理解为液态的外用皮肤制剂。示例性地，本申请实施例所述的护肤品可以是化妆水、精华液、喷雾、乳液、面霜、面膜、凝胶、防晒、隔离中的任意一种。

其中，樟树叶提取物在护肤品中的浓度为10μg/mL～500μg/mL。

在一些实施例中，当所述樟树叶提取物的浓度为10μg/mL～500μg/mL，该护肤品对皮肤具有良好的保湿、屏障修复、抗炎、抗皱抗衰、美白祛斑、抑菌等作用。

尽管本发明的描述已经相当详尽且特别对几个所述实施例进行了描述，但其并非旨在局限于任何这些细节或实施例或任何特殊实施例，而是应当将其视作是通过参考所附权利要求考虑到现有技术为这些权利要求提供广义的可能性解释，从而有效地涵盖本发明的预定范围。此外，上文以发明人可预见的实施例对本发明进行描述，其目的是为了提供有用的描述，而那些目前尚未预见的对本发明的非实质性改动仍可代表本发明的等效改动。

Claims

1.一种用于改善修复皮肤的樟树叶提取物在制备具有屏障修复作用或抗皱作用的药物组合物或护肤品中的用途，所述樟树叶提取物采用水上蒸馏的方式提取得到，其特征在于，采用水上蒸馏得到的樟树叶提取物中的组分按质量百分比计包括芳樟醇97.47%、α-松油醇0.28%、石竹烯0.74%、蛇麻烯0.22%、橙花叔醇0.63%、桉油精0.12%、顺式芳樟醇氧化物0.07%、樟脑0.13%、橙花醇0.09%；

所述用于改善修复皮肤的樟树叶提取物的提取过程为：

于6-9月期间，从江西省九江市永修县种植的芳樟醇型樟树中摘取新鲜樟树叶，该芳樟醇型樟树的拉丁学名为“Camphora officinarum”，樟科樟属，将采集的新鲜樟树叶，洗净，置于不锈钢精油提取器上部筛板上，在蒸馏器底部加入适量的水，将底部水电加热至沸腾，所产生的蒸汽通过筛板由下而上加热料层，油水混合蒸汽通过冷凝管进入油水分离器，蒸馏2h，蒸馏完成后将油水分离器中液体混合物静置分层，取上层油相，即得到樟树叶提取物。

2.如权利要求1所述一种用于改善修复皮肤的樟树叶提取物在制备具有屏障修复作用或抗皱作用的药物组合物或护肤品中的用途，其特征在于，所述药物组合物包含：

生理上或药学上可接受的辅料制剂；

和如权利要求1所述的樟树叶提取物；

其中，所述樟树叶提取物在药物组合物中的浓度为10μg/mL～500μg/mL。

3.如权利要求1所述一种用于改善修复皮肤的樟树叶提取物在制备具有屏障修复作用或抗皱作用的药物组合物或护肤品中的用途，其特征在于，所述护肤品包含：

化妆品基质溶剂；

和如权利要求1所述的樟树叶提取物；

其中，所述樟树叶提取物在护肤品中的浓度为10μg/mL～500μg/mL。