KR102063940B1 - 녹나무 성분을 함유하는 기능성 화장료 조성물 및 이의 제조 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 녹나무 추출물이 갖는 뛰어난 활성산소 억제 효과를 통해 얼굴 주름 등의 노화 방지 및 피부 탄력에 도움을 줄 수 있는 녹나무 성분을 함유하는 기능성 화장료 조성물 및 이의 제조 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 화장료 조성물로서, 녹나무 추출물, 및 화장품 원료를 포함하는 것을 특징으로 하는 녹나무 성분을 함유하는 기능성 화장료 조성물이 제공되며, 녹나무 추출물 및 화장품 원료를 마련하는 조성원료 마련 단계; 및 상기 마련된 녹나무 추출물 0.5중량부 내지 1중량부, 및 화장품 원료를 잔부로 하여 혼합하는 조성원료 혼합 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물 제조 방법이 제공된다.

Description

녹나무 성분을 함유하는 기능성 화장료 조성물 및 이의 제조 방법{FUNCTIONAL COSMETIC COMPOSITION CONTAINING C.camphora COMPONENT AND MANUFACTURING METHOD THEREOF}

본 발명은 녹나무 성분을 함유하는 기능성 화장료 조성물 및 이의 제조 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 녹나무 추출물이 갖는 뛰어난 활성산소 억제 효과를 통해 얼굴 주름 등의 노화 방지 및 피부 탄력에 도움을 줄 수 있는 녹나무 성분을 함유하는 기능성 화장료 조성물 및 이의 제조 방법에 관한 것이다.

피부는 외부 환경과 직접 접하면서 인체를 보호하며 생화학적이고 물리적인 기능을 나타내는 중요한 조직이다.

피부 조직은 크게 3가지 즉, 표피(epidermids), 진피(dermis) 및 피하조직(hgypodermis)으로 구성되어 있으며, 주로 인체를 보호하는 장벽 역할을 한다.

멜라닌은 자연계에 널리 분포하는 페놀류의 고분자 물질이며 피부의 색을 결정하는 중요한 색소로서 피부의 표피층에 존재한다. 주로 흑색이나 갈색을 나타내는 유멜라닌(eumelanin)과 노란색이나 붉은색을 나타내는 페오멜라닌(pheomelanin)이 있다. 멜라닌은 표피의 기저층에 존재하는 멜라노사이트(melanocyte)로부터 만들어진다. 합성된 멜라닌은 인접한 케라티노사이트(keratinocyte)라는 표피 세포로 이동하면서 케라티노사이트의 각화과정을 통해 제거된다.

사람의 피부색을 결정짓는 멜라닌(Melanin)은 동물, 식물 및 미생물 등에 존재하는 페놀류의 고분자 물질로 자외선, 건조 및 극한의 온도 등과 같은 외부환경에 대한 방어기능을 갖는 색소의 일종이며 멜라닌은 표피 기저층에 존재하는 멜라노사이트(melanocyte)의 세포내 멜라노좀(melanosome)에서 타이로시나제(Tyrosinase)효소의 연속적 산화반응에 의하여 생합성 된다.

그러나 태양광선에 노출된 피부에서는 자외선에 의한 광노화의 진행과 함께 피부내의 세포나 조직들이 자외선에 의해 손상되는 것을 막기 위해 타이로시나제에 의해 멜라닌생성반응이 촉진되어 과도한 멜라닌이 생성되고 인체에 기미, 주근깨, 검버섯 등을 형성하게 된다.

이러한 멜라닌은 주로 타이로신(Tyrosine)이 타이로시나제에 의하여 L-DOPA 및 도파퀴논(DOPAquinone)으로 산화되고 다시 5,6-다이하이드록시인돌(5,6-dihydroxyindole), 인돌-5,6-퀴논(indol-5,6-quinone)등으로 산화되어 최종적으로 중합되는 과정에 의해 생합성된다(Pawelk J M and Korner A M, Am Sci, 70, p136, 1982 ; Butt V S, Recent Adv phytochemistry, 12, p433, 1979 ; Lopez J N R, J Tudela, R Varon, F G Carmona, F G Canovas, J Biol Chem, 267, p3901-3910, 1992) 즉, 멜라닌의 생합성은 피부의 자외선 노출방지, 타이로시나제의 활성억제, 생성된 멜라닌의 환원과 탈색 및 피부 외부로의 배출촉진, 멜라노사이트의 물질대사 및 증식억제 등의 방법을 통해 억제될 수 있다.

그리고 이러한 피부미백과 관련하여 새로운 멜라닌생합성경로가 존재한다는 사실이 밝혀졌고 타이로시나제 이외에 TRP-1, TRP-2, MSH 등의 몇 가지 새로운 조절인자들도 발견 되었으나 그 정확한 대사가 규명되지 못한 상태이기 때문에 아직까지는 타이로시나제의 활성조절을 통한 미백효과에 대한 연구가 가장 활발히 이뤄지고 있다(Slominski A, Tobin DJ, Shibahara S, Wortsman J, Physiol Rev, 84(4), p1155-1228, 2004 ; Land EJ, Ramsden CA, Riley PA, Mthods Enzymol, 378, p88-109, 2004 ; Kameyama K, Jimenez M, Muller J, Ishida Y, Hearing VJ, Differentiation, 42(12), p28-36, 1989 ; Sturm RA, Melanoma Res, 12(5), p405-416, 2002)

이와 같이 멜라닌 색소의 형성에는 유전적 요인, 호르몬 분비, 스트레스 등과 관련된 생리적 요인 및 자외선 조사 등과 같은 환경적요인이 영향을 미치는데, 멜라닌은 피부의 외각인 표피층에 존재하여 자외선 등으로부터 진피 이하의 피부기관을 보호해 주는 동시에 피부 생체 내에 생겨난 자유라디칼 등을 잡아주는 역할을 하여 피부 내 단백질과 유전자 들을 보호해주는 중요한 기능을 가지고 있지만 멜라닌이 과잉 생산 됨으로써 기미, 주근깨 등을 형성할 뿐 아니라 피부노화를 촉진하며 피부암 유발에도 중요한 작용을 하는 것으로 알려져 있다.

따라서 최근에는 이러한 문제점을 예방 및 개선하기 위한 여러 미백용 화장품, 의약품 등이 개발되어 시판되고 있으나, 보다 확실한 실험과 검증을 통화여 피부 노화 방지 및 피부 탄력에 도움을 줄 수 있는 탁월한 기능을 갖는 화장료 조성물에 대한 연구가 필요한 실정이다.

대한민국 등록특허공보 10-0706134(2007.04.12. 공고) 대한민국 등록특허공보 10-0623972(2006.09.18. 공고)

따라서, 상기한 종래의 문제점을 해결하기 위한 것으로, 본 발명의 발명자(들)은 과산화수소(H2O2)를 처리하여 산화스트레스를 가한 뒤 과산화수소에 의해 산화적 손상이 유도된 근육세포에서 형태학적으로 산화적 손상된 것을 녹나무 추출물을 통해 억제되었고, 세포내 활성산소(ROS)를 억제하였음을 확인하여 녹나무 추출물이 근육세포의 분화과정 중 산화적 손상으로부터 세포보호 효과가 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 녹나무 추출물이 갖는 뛰어난 활성산소 억제 효과를 통해 얼굴 주름 등의 노화 방지 및 피부 탄력에 도움을 줄 수 있는 녹나무 성분을 함유하는 기능성 화장료 조성물 및 이의 제조 방법을 제공하는데 그 목적이 있다.

본 발명의 해결과제는 이상에서 언급한 것들에 한정되지 않으며, 언급되지 아니한 다른 해결과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기 본 발명의 목적들 및 다른 특징들을 달성하기 위한 본 발명의 일 관점에 따르면, 화장료 조성물로서, 녹나무 추출물, 및 화장품 원료를 포함하는 것을 특징으로 하는 녹나무 성분을 함유하는 기능성 화장료 조성물이 제공된다.

본 발명의 일 관점에 있어서, 상기 녹나무 추출물은 녹나무 잎 추출물이며, 상기 화장품 원료는 정제수, 유지성분, 보습제, 에몰리엔트제, 계면활성제, 킬레이팅제, 안료, 자외선흡수제, 방부제, 살균제, 산화방지제, pH조절제, 알코올, 및 향료로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는 것이 바람직하다.

본 발명의 일 관점에 있어서, 상기 녹나무 추출물은 녹나무 잎을 70% 에탄올로 추출한 것으로 이루어지며, 상기 녹나무 추출물 0.5중량부 내지 1중량부와 상기 화장품 원료 99중량부 내지 99.5중량부이 혼합되어 이루어질 수 있다.

본 발명의 일 관점에 있어서, 상기 화장료 조성물은 로션, 스킨소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 크림, 파운데이션, 에센스, 팩, 비누, 클렌징폼, 및 바디클린저로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나의 제형으로 이루어질 수 있다.

본 발명의 다른 관점에 따르면, 화장료 조성물의 제조 방법으로서, 녹나무 추출물 및 화장품 원료를 마련하는 조성원료 마련 단계; 및 상기 마련된 녹나무 추출물 0.5중량부 내지 1중량부, 및 화장품 원료를 잔부로 하여 혼합하는 조성원료 혼합 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물 제조 방법이 제공된다.

본 발명의 다른 관점에 있어서, 상기 조성원료 마련 단계에서 마련되는 녹나무 추출물은 녹나무 잎을 70% 에탄올로 추출한 것으로 이루어지고, 상기 조성원료 마련 단계에서 마련되는 화장품 원료는 정제수, 유지성분, 보습제, 에몰리엔트제, 계면활성제, 킬레이팅제, 안료, 자외선흡수제, 방부제, 살균제, 산화방지제, pH조절제, 알코올, 및 향료로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함하며, 상기 조성원료 혼합 단계는 상기 녹나무 추출물 0.5중량부 내지 1중량부와 상기 화장품 원료 99중량부 내지 99.5중량부를 혼합하는 것으로 이루어지는 것이 바람직하다.

본 발명에 따른 녹나무 성분을 함유하는 기능성 화장료 조성물 및 이의 제조 방법에 의하면, 녹나무 추출물이 갖는 뛰어난 활성산소 억제 효과를 통해 얼굴 주름 등의 노화 방지 및 피부 탄력에 도움을 줄 수 있는 효과가 있다.

본 발명의 효과는 이상에서 언급된 것들에 한정되지 않으며, 언급되지 아니한 다른 해결과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해되어 질 수 있을 것이다.

도 1은 본 발명에 따른 녹나무 성분을 함유하는 기능성 화장료 조성물의 제조 과정을 나타내는 플로차트이다.
도 2는 C2C12 myoblast 세포를 전자현미경으로 촬영한 사진이다.
도 3은 녹나무 추출물의 C1C12 세포에서의 세포 독성 실험 결과를 나타내는 그래프로서, (A)는 24시간이고 (B)는 48시간을 나타내는 그래프이다.
도 4는 C2C12세포 성장조건에서의 ROS억제효과를 확인하는 그래프로서, (A)는 24시간이고 (B)는 48시간을 나타내는 그래프이다.
도 5는 C2C12세포 성장조건에서의 ROS억제 효과 확인을 위하여 ROS생성을 형광현미경 하에서 관찰한 사진이다.
도 6은 H₂O₂로 유도한 세포 내 녹나무 추출물에 의한 ROS 생성 소거 활성 개념과 결과를 나타내는 그래프이다.
도 7은 추출물을 이용한 세포분화 유도 배지조건에서 C2C12세포의 분화유도 모양 관찰에 대한 세포분화 모식도이다.
도 8 내지 도 11은 각 추출물을 이용한 세포분화 유도 배지조건에서 C2C12세포의 분화유도 모양 관찰을 위하여 전자현미경으로 촬영한 사진들이다.
도 12 내지 도 14는 녹나무 추출물의 세포분화 유도 시 산화적 손상 유도 조건에서 세포모양변화 관찰 위하여 전자현미경으로 촬영한 사진들이다.

본 발명의 추가적인 목적들, 특징들 및 장점들은 다음의 상세한 설명 및 첨부도면으로부터 보다 명료하게 이해될 수 있다.

본 발명의 상세한 설명에 앞서, 본 발명은 다양한 변경을 도모할 수 있고, 여러 가지 실시 예를 가질 수 있는바, 아래에서 설명되고 도면에 도시된 예시들은 본 발명을 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변경, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

어떤 구성요소가 다른 구성요소에 "연결되어" 있다거나 "접속되어" 있다고 언급된 때에는, 그 다른 구성요소에 직접적으로 연결되어 있거나 또는 접속되어 있을 수도 있지만, 중간에 다른 구성요소가 존재할 수도 있다고 이해되어야 할 것이다. 반면에, 어떤 구성요소가 다른 구성요소에 "직접 연결되어" 있다거나 "직접 접속되어" 있다고 언급된 때에는, 중간에 다른 구성요소가 존재하지 않는 것으로 이해되어야 할 것이다.

본 명세서에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시 예를 설명하기 위해 사용된 것으로, 본 발명을 한정하려는 의도는 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 명세서에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.

이하, 본 발명의 바람직한 실시 예에 따른 녹나무 성분을 함유하는 기능성 화장료 조성물 및 이의 제조 방법에 대하여 설명한다.

먼저, 본 발명에 따른 녹나무 성분을 함유하는 기능성 화장료 조성물을 상세히 설명한다.

본 발명에 따른 녹나무 성분을 함유하는 기능성 화장료 조성물은, 녹나무 추출물 및 화장품 원료를 포함하는 것을 특징으로 한다.

상기 녹나무 추출물은 녹나무 잎 추출물인 것이 바람직하며, 이에 한정되는 것은 아니다.

바람직하게, 본 발명에 따른 녹나무 성분을 함유하는 기능성 화장료 조성물은, 녹나무 잎 추출물 약 0.5 중량부 내지 약 1 중량부이며, 화장품 원료를 잔부(약 99 중량부 내지 약 99.5 중량부)로 하는 조성 비율로 이루어지는 것을 특징으로 한다.

상기 녹나무 잎 추출물은 70% 에탄올로 추출한 것을 특징으로 한다.

구체적으로, 본 발명의 녹나무 잎 추출물은 녹나무의 전초(全草)를 건초시켜서 분쇄하고, 건조시킨 녹나무 잎 분쇄물 1kg에 70중량% 에탄올 수용액을 10리터 첨가하여 실온에서 7 일간 침지한 다음, 추출액을 여과하여 회수하고 용매를 제거한 후 녹나무 잎 추출물을 얻을 수 있다.

또한, 상기 녹나무 잎 추출물은 초음파 추출 방법 또는 초임계 추출 방법을 이용하여 추출할 수도 있다. 다시 말해서, 녹나무 잎 추출물은 건조 분쇄한 녹나무 잎을 초음파 추출 방법을 이용하여 추출할 수 있으며, 또한 건조 파쇄한 녹나무 잎과 보조용매로 에탄올(99.5%) 500~700mL를 초임계 유체 추출 반응기(Natex, Autstria)에 넣고 반응기 내의 온도가 65℃, 압력이 450bar, S/F 비(supercritical fluid ㎏/Feed ㎏) 35가 되는 조건하에서 추출하여 얻을 수 있다.

녹나무(Cinnamomum camphora)는 장뇌목(樟腦木)이라고도 하는 것으로, 상록의 교목으로서 잎은 달걀 모양의 타원형이며 윤이 나고 향기가 있다. 꽃은 양성화인데, 5월경에 황백색의 작은 꽃들이 잎겨드랑이에서 원추꽃차례를 이루면서 핀다. 우리나라에서는 제주도에서만 자생하는 나무이다(Lee, N H et al, Kor J Pharmacogn, 32(3), pp175 -180, 2001).

이러한 녹나무 추출물(녹나무 잎 추출물)에 대하여 활성산소 제거와 세포분화 활성에 대한 실험과 검증에 대해서는 아래에서 상세히 설명한다.

다음으로, 상기 화장품 원료는 정제수, 유지성분, 보습제, 에몰리엔트제, 계면활성제, 킬레이팅제, 안료, 자외선흡수제, 방부제, 살균제, 산화방지제, pH조절제, 알코올, 및 향료로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

상기한 본 발명에 따른 녹나무 잎 추출물을 함유하는 화장료 조성물은 로션, 스킨소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 크림, 파운데이션, 에센스, 팩, 비누, 클렌징폼, 및 바디클린저로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나의 제형으로 이루어질 수 있다.

다음으로, 본 발명에 따른 녹나무 성분을 함유하는 기능성 화장료 조성물의 제조 방법에 대하여 도 1을 참조하여 상세히 설명한다. 도 1은 본 발명에 따른 녹나무 성분을 함유하는 기능성 화장료 조성물의 제조 과정을 나타내는 플로차트이다.

본 발명에 따른 녹나무 성분을 함유하는 기능성 화장료 조성물의 제조 방법은, 도 1에 나타낸 바와 같이, 녹나무 추출물 및 화장품 원료를 마련하는 조성원료 마련 단계(S110, S120); 및 상기 마련된 녹나무 추출물 약 0.5중량부 내지 약 1중량부, 및 화장품 원료를 잔부(약 99 중량부 내지 약 99.5 중량부)로 하여 혼합하는 조성원료 혼합 단계(S200);를 포함한다.

상기 조성원료 마련 단계(S110, S120)에서 마련되는 녹나무 추출물은 녹나무 잎 추출물인 것이 바람직하며, 이러한 녹나무 잎 추출물은 70% 에탄올로 추출한 것을 특징으로 한다.

즉, 상기 녹나무 잎 추출물은 녹나무의 전초(全草)를 건초시켜서 분쇄하고, 건조시킨 녹나무 잎 분쇄물 1kg에 70중량% 에탄올 수용액을 10리터 첨가하여 실온에서 7일간 침지한 다음, 추출액을 여과하여 회수하고 용매를 제거한 후 얻은 녹나무 잎 추출물로 마련되는 것이 바람직하다.

또한, 상기 녹나무 잎 추출물은 초음파 추출 방법 또는 초임계 추출 방법을 이용하여 추출된 것으로 마련될 수도 있다.

계속해서, 상기 조성원료 마련 단계(S110, S120)에서 마련되는 화장품 원료는 정제수, 유지성분, 보습제, 에몰리엔트제, 계면활성제, 킬레이팅제, 안료, 자외선흡수제, 방부제, 살균제, 산화방지제, pH조절제, 알코올, 및 향료로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

다음으로, 상기 조성원료 혼합 단계(S200)는 녹나무 추출물(녹나무 잎 추출물) 약 0.5중량부 내지 약 1중량부, 및 화장품 원료를 잔부(약 99 중량부 내지 약 99.5 중량부)로 하여 혼합하게 된다.

한편, 본 발명의 발명자(들)은 녹나무 (잎) 추출물이 C₂C₁₂ 근육세포에서 활성산소(ROS) 소거와 세포분화 활성에 효과에 있음을 실험을 통해 확인하였으며, 이하 이에 대하여 설명한다.

실험 재료 및 방법

- 세포 생존능(Cell viability) 측정

C₂C₁₂ cells을 well당 약 4×10³ 세포수가 되도록 96 well에 각각 접종한 후에 16시간 동안 37℃, 5% CO2 배양기에서 배양하여 세포가 잘 붙도록 하였다. 그리고 난 후에 시료 추출물을 여러 가지 농도로 처리한 후 37℃, 5% CO2 배양기에서 배양하였다. 반응기에서 well을 꺼내어 MTT 시약(stock 2 mg/ml)을 50㎕씩 가한 후 37℃, 5% CO2 배양기에서 4시간 배양하였다. 상층액을 조심스럽게 버린 후 DMSO(다이메틸설폭시화물(dimethyl sulfoxide))를 150㎕씩 가하여 잘 녹인 후, 540 nm에서 측정하여 세포 생존율을 구하였다.

- Cell 상에서의 활성산소(ROS) 소거 활성

C₂C₁₂ cells을 well당 약 2×10⁴ 세포수가 되도록 96 well에 각각 접종한 후에16시간 동안 37℃, 5% CO2 배양기에서 배양하여 세포가 잘 붙도록 하였다. 그리고 난 후에 시료 추출물을 여러 가지 농도로 처리한 후 37℃, 5% CO2 배양기에서 배양하였다. 반응기에서 well을 꺼내어 DCF-DA(stock 500μM)를 20㎕씩 가한 후spectrofluoremeter(excitation 485 nm, emission 535 nm)로 측정하였다. 시료를 넣지 않고 활성 산소종 형성만을 측정한 것을 대조군으로 정하고, 시료를 넣어 과산화수소(hydrogen peroxide)를 소거시키는 시료 처리군과 비교하여 과산화수소의 소거율을 구하였다.

- 세포 분화 유도(differentiation)

분화유도 촉진 효과 관련 세포 실험은 세포를 분화 배지로 분화를 유도시켜 실험을 진행하였다. C2C12 세포는 Fetal Bovin Serum(FBS)이 함유된 DMEM 배지를 이용하여 배양하고, 70~80% confluent가 되었을 때 well-plate에 씨딩(seeding) 하였다. 48 시간 후, 분화 유도 배지인 2% Horse Serum(HS)이 함유된 DMEM 배지로 교체하였다. 이때 추출물의 효과는 세포에 시료를 처리한 후 실험을 진행하였다.

- 웨스턴 블롯(Western blot) 분석

세포를 100mm 배양용기에 2×10⁶ 개의 세포를 부착시키고, 50μg, 100μg, 200μg/mL로 처리하고 배양하였다. 배양된 세포를 모두 수거하여 세포침전물을 세포용해액(Nonidet P-40, Sodium dodecyl sulfate(SDS), 0.1 M Tris-HCl(pH 7.2), 100mM PMSF, 10㎍/㎖ aprotinin, 10㎍/㎖leupeptin)에 용해시킨 후 13,000rpm에서 20분간 원심분리하여 상등액을 취하였다. 총 단백질량은 BCA Protein assay kit 용액을 이용하여 정량하였고, 30㎍ 단백질과 6X sample buffer(1㎖ of glycerol, 0.5㎖ of β-mercaptoethanol, 3㎖ of 10% SDS(sodium dodecyl sulfate), 1.25㎖ of 1M Tris-HCl, 1~2㎍ of bromophenol blue)를 혼합한 후 12% SDS 폴리아크릴아미드 겔(polyacrylamidegel)에서 전기영동 하였다. PVDF(Polyvinylidene Difluoride)에 전이시키고 5% non-fat skim milk로 blocking 시킨 후, 각각의 일차항체를 희석하여 실온에서 3시간 반응시켰다. TBST로 3회 세척한 후, 2차 antibody를 1:5000으로 희석하여 실온에서 30분 반응시켰다. TBST로 세척한 후, ECL solution으로 발광 후 band를 얻었다.

실험 결과

건강한 상태의 체내에서는 반응성 산소종들(·OH, ·OOR, O2-, ONOO- 등)이 끊임없이 생산되고 항산화성 방어기전(산화성물질 분해 효소계 또는 비타민 및 아미노산 등의 산화성물질 소거능을 가진 저분자 물질 등)이 충분히 생산되어 세포나 조직의 손상을 방어한다. 하지만 이러한 체내 균형이 깨지면 반응성 산소종들이 체내에 축적되어 세포나 조직의 손상이 초래된다. 본 실험에서는 근육세포주로 잘 알려진 C2C12 myoblast 세포(도 2 참조)를 이용하여 근육세포 분화과정 동안 H2O2로 산화적 손상을 유도하면서 추출물을 처리하여 근육세포의 의 morphology, cell viability 및 근육세포 분화 관련단백질 발현 수준 양상을 비교하여 녹나무(C.camphora) 추출물의 근육세포 보효효과를 통한 산화적 손상 억제 효능을 살펴보았다. 도 2는 C2C12 myoblast 세포를 전자현미경으로 촬영한 사진이다.

1. 세포보호 효과 확인

녹나무(C.camphora) 추출물을 각각 25, 50, 75, 100 및 200㎍/㎖를 처리 후 각각의 시간 24시간(도 3의 (A)) 및 48시간(도 3의 (B) 참조) 동안 처리한 마우스 myofibroblast 세포인 C2C12의 세포 생존능을 MTT assay를 이용하여 측정하였다. 그 결과, 추출물 처리 세포는 세포 생존 능력이 80% 이상으로 녹나무(C.camphora) 추출물이 세포독성을 나타내지는 않았음을 확인하였다. 도 3은 녹나무 추출물의 C1C12 세포에서의 세포 독성 실험 결과를 나타내는 그래프로서, (A)는 24시간이고 (B)는 48시간을 나타내는 그래프이다.

2. 추출물의 항산화 활성 확인

녹나무(C. camphora) 추출액을 이용하여 마우스 myofibroblast세포인 C2C12 세포 성장조건에서 세포 내 산화적 스트레스를 인위적으로 유도 한 뒤, 세포내 활성산소(ROS)가 억제되는지를 DCFDA assay방법을 이용하여 확인보았다. C2C12세포의 세포성장 조건에서 추출물 처리 시 세포내 ROS 생성을 시간별로 측정하였다. 세포성장 24시간(도 4의 (A)) 후와 48시간 후(도 4의 (B))의 C2C12세포 내의 세포내 ROS가 유의성 있게 감소되지는 않았음을 확인하였다(도 4 참조). ROS생성을 형광현미경 하에서 관찰하였으며, ROS 생성관련 양성 대조군에는 H2O2를 처리하여 관찰하였다(도 5 참조). 도 4는 C2C12세포 성장조건에서의 ROS억제효과를 확인하는 그래프로서, (A)는 24시간이고 (B)는 48시간을 나타내는 그래프이며, 도 5는 C2C12세포 성장조건에서의 ROS억제 효과 확인을 위하여 ROS생성을 형광현미경 하에서 관찰한 사진이다.

3. 녹나무 추출물의 세포분화유도시 산화적 손상 억제 효과

C2C12 세포의 분화유도를 위하여 /근육세포 분화조건인 2% horse serum을 함유한 배지에 녹나무 추출물을 처리한 조건에서 근육세포의 분화 중 세포 내 산화적 스트레스가 억제되는지 알아보기 위하여 C2C12세포에 추출물 처 후 세포 분화기간동안 세포내 ROS생성을 DCFDA assay방법을 이용하여 측정하였다(도 6 참조). 도 6은 H₂O₂로 유도한 세포 내 녹나무 추출물에 의한 ROS 생성 소거 활성 개념과 결과를 나타내는 그래프이다.

먼저 C2C12 세포에 H2O2를 가하여 산화적 스트레스를 유도한 뒤 산화적 세포손상을 주었다. C2C12 세포에 추출물을 1시간 전처리 한 후 H₂O₂를 처리하여 48시간 동안 배양한 뒤 ROS를 확인하였다(도 4 및 도 5 참조). DCF-DA 방법을 이용하여 세포내 ROS 생성율을 측정하였을 때 추출물 처리 군에서 유의하게 ROS생성이 감소했음을 확인하였다. 이는 추출물 처리에 의해 근육 세포분화 시 유도되는 산화적 손상으로부터 보호 효과를 나타내었으며 이는 세포 내 항산화 효소의 유전자 변화를 증가시켜 세포내 활성산소종을 감소시키는 것으로 비롯된 것이다.

4. 녹나무 추출물의 세포분화 유도 시 세포모양 변화 관찰

근육세포에 추출물을 처리하여 근육세포의 형태학적 변화를 평가하였다. 본 실험에서 사용한 양성대조군(Positive control)로서의 옥타코사놀은 밀의 씨눈, 사탕수수, 사과껍질, 포도껍질 및 굴에 함유되어 있으며, 긴 탄소사슬에 알콜기를 가진 왁스류(CH3[CH2]26CH2OH)의 물질이다. 옥타코사놀(Octacosanol)은 알려진 부작용이 없고, 옥타코사놀을 원료로 수행한 인체적용시험 결과에서도 유의한 부작용이 관찰되지 않았으며, 옥타코사놀은 지구력증진의 기능성이 인정되었다. 옥타코사놀은 근육내의 글리코겐 소모와 항산화 능력을 증진 시킨다고 한다.

2% HS이 포함된 세포배양배지를 이용하여 세포분화를 유도하여 시간별로 그 모양변화를 관찰하였다. 세포성장 배지 및 분화배지 하에서 처리 된 세포에서 뚜렷한 모양변화를 관찰할 수 있었다. 성장배지 중의 세포는 각각의 근육 아세포 전구세포를 나타내고, 분화배지의 세포는 근세포 형성을 나타낸다. 세포를 분화 배지로 분화를 유도시켜 실험을 진행하였다.

C2C12 세포는 Fetal Bovin Serum(FBS)이 함유된 DMEM 배지를 이용하여 배양하고, 세포가 70~80% 정도 되었을 때 세포를 6well-plate에 씨딩(seeding)하였다. 48시간 후, 분화 유도 배지인 Horse Serum(HS)이 함유된 DMEM 배지로 교환하고 분화가 유도되는지를 현미경하에서 관찰하였다.

근세포 분화조건에서 세포모양 변화를 측정하였을 때 세포모양 변화, 즉 다핵세포의 형성을 관찰 할 수 있었다(도 7 및 도 8 내지 도 11 참조). 도 7은 추출물을 이용한 세포분화 유도 배지조건에서 C2C12세포의 분화유도 모양 관찰에 대한 세포분화 모식도이며, 도 8 내지 도 11은 각 추출물을 이용한 세포분화 유도 배지조건에서 C2C12세포의 분화유도 모양 관찰을 위하여 전자현미경으로 촬영한 사진들이다.

5. 녹나무 추출물의 세포분화 유도 시 산화적 손상 유도 조건에서 세포모양변화 관찰

추출물을 함유한 배지에서 성장한 세포의 경우, H2O2에 의해 산화적 스트레스 유도 시 세포 내 ROS가 추출물의 농도가 증가함에 따라 점차 감소하는 것으로 나타났다(도 5의 (B) 참조). 이들 결과로 비추어 볼 때 추출물은 근육세포의 산화적 손상으로부터 근육세포에 대한 보호 효과를 나타내었으며, 형태학적 이론(morphology)을 통해 확인해 보았다.

근원 세포(Myoblast)는 여러 자극에 의해 활성화(activation) 되어 각각의 세포들이 서로 상호작용하고 융합하여 다핵의 근관세포(Myotube)를 형성한다. 이러한 근관세포들이 모여 근육 다발을 형성하게 된다(도 5의 (A) 참조).

근육분화조건에서 근육세포에 H2O2로 산화적 스트레스를 가한 뒤, 추출물을 48시간동안 처리하여 근육세포의 형태학적인 변화를 평가하였다. 그 결과 근육분화조건에서 산화적 스트레스에 의한 세포의 형태는 H2O2 단독처리 세포에서는 근육세포 분화의 특징인 다핵 세포가 형성되지 않았지만, H2O2와 추출물 처리조건에서는 농도 의존적으로 세포모양의 변화와 다핵세포가 증가됨을 확인하였다(도 12 내지 도 14 참조). 또한, H2O2처리에 의한 산화적 스트레스조건에서 추출물처리에 의한 세포분화의 증가는 DAPI염색을 통해서도 H2O2와 추출물처리 조건에서 다핵세포의 증가를 확인하였다(도 14 참조). 도 12 내지 도 14는 녹나무 추출물의 세포분화 유도 시 산화적 손상 유도 조건에서 세포모양변화 관찰 위하여 전자현미경으로 촬영한 사진들이다.

C₂C₁₂ myoblast는 분화가 진행됨에 따라 여러 가지 Myogenic regulatory factors(MRFs)가 발현된다. 분화 초기에 분화의 정도를 보여주는 Bio-Marker로는 대표적으로 MyoD가 있다. MyoD의 발현은 cell cycle withdraw를 유도하여 증식을 억제하고, 분화를 촉진하며, 분화 후기에 발현되는 Myogenin, Myosin Heavy Chain(MHC)등을 발현 시킨다(도 12 및 도 13 참조). 따라서 분화 초기 생물학적 마커인 MyoD와 분화 후기의 생물학적 마커 myogenin, MHC의 발현을 실험을 통해 확인 하였다.

C2C12 세포의 분화 조건에서 추출물 처리 48시간 후에 분화초기의 생물학적 마커인 MyoD 와 Myogenin의 발현은 추출물처리에 대해 농도 의존적으로 감소하였으며, 분화 후기 마커인 MHC의 발현은 농도 의존적으로 증가시킴을 확인하였다(도 14 참조).

6. 세포분화유도 조건에서 녹나무 추출물의 영향

C2C12 myoblast 세포는 분화가 진행됨에 따라 여러 가지 분화에 필요한 전사조절인자(transcription factors)가 점진적으로 발현된다. 이러한 Transcription factors는 cell cycle withdraw를 유도하여 증식(proliferation)을 정지시키고 분화를 더욱 촉진, 발달시키는 것으로 잘 알려져 있다.

근원 조절 단백질은 myogenic 전사 인자 MyoD, myoblast 세포의 형성, 증식 및 생존을 나타내는 지표로 근육 세포로 발전한다. myogenin (MyoG)은 근육분화(myogenesis)의 후기 단계에서 발현되는 근원 전구 세포의 섬유로의 융합을 나타내는 지표이며, 근육의 두꺼운 필라멘트에서 발견되는 주요 조절 모터 단백질 인 Myosin Heavy Chain (MHC); cyclin D1, C-myc 및 Dv12의 발현을 상향 조절함으로써 세포분화를 조절한다.

추출물의 근육 강화 활성을 탐색하기 위하여 근육 세포의 분화하는 정도를 확인하기 위해 C2C12 세포를 분화 유도 한 후 추출물을 농도별로 처리하여 세포 내 근육 성장 관련 인자를 확인하였다. Myotube 분화에 따라 MyoD 발현양과 Myogenin발현 양에 변화가 생기므로 MyoD 발현과 Myogenin발현 정도를 확인하였다.

C2C12 근원세포의 분화조건에서 추출물 처리 48시간 후에 근원 조절단백질의 발현수준을 웨스턴 봇트(western blot)방법을 이용하여 확인한 결과, 분화초기 근육분화조절단백질인 MyoD와 myogenin (MyoG)의 발현은 추출물에 대해 농도 의존적으로 감소하였다. 하지만 근육분화 후기 조절단백질인 MHC는 추출물 처리 조건에서 증가된 것을 확인하였다.

C2C12 근원세포의 분화조건에서 추출물 처리 48시간 후에 세포증식 관련 단백질인 cyclin E와 D의 발현 정도를 확인해 본 결과, 추출물에 대한 농도에 의존적으로 감소했음을 알 수 있었다. 이는 세포분화를 유도하는 과정에서 세포의 분화를 유도하기 위하여 세포의 증식(proliferation)을 정지시키고 분화를 촉진시키는 과정에 대한 시너지 효과를 나타낸 것임을 알 수 있었다.

또한, SIRT1(시르트1)은 부분적으로 Wnt 신호 전달 경로의 활성화를 담당하여 세포 증식을 유도한다고 알려져 있다. 추출물 처리 결과 추출물 처리에 군에서 대조군보다 농도 의존적으로 Sirt1의 발현이 감소 된 것을 확인하였으며, 이는 세포증식을 유도하는 단백질인 cyclin E와 D의 발현 감소에 대한 영향인 것으로 추측되었다.

이상의 결과로부터 확인한 바와 같이, 녹나무 추출물은 C2C12 세포의 분화를 촉진시키는 결과를 초래하였으며, 이는 일반적인 분화유도 조건에서도 분화유도 촉진효과를 나타냈지만, H2O2를 처리하여 산화스트레스를 가한 뒤 H2O2에 의해 산화적 손상이 유도된 근육세포에서 형태학적으로 산화적 손상이 억제되었음을 확인하였으며, 세포 내 ROS를 억제하는 것으로 볼 때 추출물은 근육세포의 분화과정 중 산화적 손상으로부터 세포보호 효과를 나타내는 것임을 확인할 수 있었다.

이상에서 설명한 바와 같은 본 발명에 따른 녹나무 성분을 함유하는 기능성 화장료 조성물 및 이의 제조 방법에 의하면, 녹나무 추출물이 갖는 뛰어난 활성산소 억제 효과를 통해 얼굴 주름 등의 노화 방지 및 피부 탄력에 도움을 줄 수 있는 이점이 있다.

본 명세서에서 설명되는 실시 예와 첨부된 도면은 본 발명에 포함되는 기술적 사상의 일부를 예시적으로 설명하는 것에 불과하다. 따라서, 본 명세서에 개시된 실시 예는 본 발명의 기술적 사상을 한정하기 위한 것이 아니라 설명하기 위한 것이므로, 이러한 실시 예에 의하여 본 발명의 기술 사상의 범위가 한정되는 것은 아님은 자명하다. 본 발명의 명세서 및 도면에 포함된 기술적 사상의 범위 내에서 당업자가 용이하게 유추할 수 있는 변형 예와 구체적인 실시 예는 모두 본 발명의 권리범위에 포함되는 것으로 해석되어야 할 것이다.

S110: 녹나무 추출물 마련 단계
S120: 화장품 원료 마련
S200: 조성원료 혼합 단계

Claims (6)

1. 삭제
2. 삭제
3. 삭제
4. 삭제
5. 화장료 조성물의 제조 방법으로서,
   녹나무 추출물 및 화장품 원료를 마련하는 조성원료 마련 단계; 및
   상기 마련된 녹나무 추출물 및 화장품 원료를 혼합하는 조성원료 혼합 단계;를 포함하고,
   상기 조성원료 마련 단계에서 마련되는 녹나무 추출물은 녹나무 잎을 70% 에탄올로 추출한 것으로 이루어지고,
   상기 조성원료 마련 단계에서 마련되는 화장품 원료는 정제수, 유지성분, 보습제, 에몰리엔트제, 계면활성제, 킬레이팅제, 안료, 자외선흡수제, 방부제, 살균제, 산화방지제, pH조절제, 알코올, 및 향료를 포함하며,
   상기 조성원료 혼합 단계는 상기 녹나무 추출물 0.5중량부 내지 1중량부와 상기 화장품 원료 99중량부 내지 99.5중량부를 혼합하는 것으로 이루어지는 것을 특징으로 하는
   화장료 조성물 제조 방법.
6. 삭제

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