CN115806899B - 一株具有良好抗炎、美白效果的表皮葡萄球菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一株表皮葡萄球菌及其应用。该表皮葡萄球菌已于2022年6月1日在中国典型培养物保藏中心保藏，菌株名称为Staphylococcus epidermidis CCSM0322，保藏编号为CCTCC No：M 2022774，该菌株分离于健康人的面部皮肤，该菌株的TSB发酵上清，具有良好的抑制透明质酸酶的能力，透明质酸酶抑制率达58.01％；进一步在细胞层面验证了该菌株的发酵上清能显著降低LPS诱导引起的巨噬细胞RAW264.7产生炎症因子IL‑6的表达水平，下降率为30.14％，显示出良好的抗炎效果。同时该菌株的发酵上清液可显著降低酪氨酸酶活性，酪氨酸酶抑制率为72.73％，显示出良好的美白效果。本发明菌株CCSM0322在对抗炎症因子对皮肤损伤，在抗炎、舒缓和美白护肤品开发方面具有良好的应用前景，本发明为功能性皮肤菌的挖掘打下基础。
Description
技术领域
本发明属于微生物技术领域，尤其是涉及表皮葡萄球菌CCSM0322及其在制备舒缓美白化妆品中的应用。
背景技术
皮肤是人体最大的器官，作为机体的屏障保护机体免受外来微生物、抗原或有毒物质的侵害。在人体皮肤表层或毛囊中栖息着大量的微生物，构成了人体皮肤菌群，其在维持皮肤健康中发挥着重要的作用，被称为皮肤的微生物屏障。皮肤微生物群、宿主皮肤及环境构成皮肤微生态系统，它们之间相互作用、相互制约，保持协调的、生理的、动态的平衡。平衡皮肤微生态，有利于皮肤健康。在日常生活中，化妆品的频繁使用、过度清洁、过度护理、化学品、药品、过度的紫外线暴露、不良生活方式、环境污染等因素可导致皮肤微生态失调。皮肤微生态失调，皮肤生物屏障就会被削弱或者破坏，影响皮肤正常的生理机能，乃至被感染，促进皮肤的老化。
皮肤受到外界光、热或各种损伤因子刺激等，激活皮肤细胞产生炎症因子，给皮肤带来发热、痒或痛等感觉。近年来，由于空气污染、紫外线辐射、化妆品频繁使用、精神压力增大、不良生活习惯、健康护肤意识增强及疫情常戴口罩捂脸等因素影响，皮肤出现敏感、特应性皮炎(AD)和痤疮等的发生率逐年上升。研究已表明，敏感肌肤、特应性皮炎和痤疮等皮肤问题都存在皮肤微生态失调等问题。通过调整皮肤微生态正在成为治疗各种皮肤问题的新途径。
由于“一白遮百丑”的传统观念，人们对于美白的追求从未停止过，人之所以会变黑是因为每个人的皮肤基底层都存在着一种名为黑色素的蛋白质，当受到紫外线的照射时会令黑色素产生变化，生成一种保护皮肤的物质，然后黑色素又经由细胞代谢的层层移动，到了肌肤表皮层，形成了我们所看到的色斑和肤色不匀等皮肤问题。所以美白是一个由内而外的工程，除了日常要做好防晒外还要从内部帮助肌肤抑制和调节黑色素的转移。利用皮肤上的常驻微生物调节机体黑色素的生成与表达已经成为美白的一个新思路。
基于皮肤菌在维护皮肤健康中重要的作用，将来皮肤菌以及代谢产物可能用于皮肤健康的护理中，但目前国内缺乏健康人群来源的皮肤菌以及功能菌株的筛选。
发明内容
本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一株表皮葡萄球菌及其筛选和应用。本发明提供的表皮葡萄球菌对透明质酸酶具有良好的抑制作用，且能降低LPS刺激巨噬细胞产生的IL-6水平，对酪氨酸酶也具有良好的抑制作用。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
本发明是一株分离自健康皮肤上的表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)CCSM0322，该表皮葡萄球菌已于2022年6月1日在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC No：M 2022774。
上述的表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)CCSM0322具有如下微生物学特征：
(1)菌落特征：在TSA平板上划线分离37℃好氧培养16h，菌株生长良好。其菌落为白而小的圆形凸起，菌落直径大约为0.5～1mm，边缘整齐，表面光滑湿润，不透明，挑取能拉丝，不具有溶血圈。
(2)菌体特征：菌体呈球形，直径0.9～1.0μm左右，排列成葡萄状，也有单个排列，无鞭毛，不能运动，不产芽孢，革兰氏染色呈阳性。
(3)培养学特征
最低生长温度为15℃，最高生长温度为45℃，在30～40℃生长温度最佳；最高和最低初始生长pH为9.0和4.0，最适生长初始pH为6.0；菌株CCSM0322的延迟期相对较短，2h进入对数生长期，12h达到稳定期。
本发明还提供了上述表皮葡萄球菌CCSM0322在制备具有抗炎和美白效果的化妆品中的应用。
上述抗炎包括抑制透明质酸酶和显著地降低LPS引起的巨噬细胞RAW264.7产生炎症因子IL-6的表达水平。
上述美白包括抑制酪氨酸酶活性。
本发明还提供了一种化妆品，所述化妆品的原料包含权利要求1所述的表皮葡萄球菌。
上述表皮葡萄球菌指的是其发酵上清液。
上述发酵上清液采用下述方式制成：
将S.epidermidis CCSM0322菌株划线于TSA平板，37℃恒温培养16～20h，活化2次。将活化好的S.epidermidis CCSM0322接种到TSB液体培养基中，37℃摇床振荡培养16～20h，调整菌体OD600在0.9～1.1范围，作为种子液。以1％～3％的接种量将种子液接种到250mL三角瓶中，置于37℃恒温震荡培养箱中，以160r/min的速度培养12h，得到表皮葡萄球菌的发酵液；将上述发酵液以10000r/min离心15min，获得的离心上清液即为表皮葡萄球菌的发酵上清。
表皮葡萄球菌的发酵上清液在化妆品中的应用。
本发明还提供了上述表皮葡萄球菌的发酵上清液在制备舒缓、美白化妆品中的应用
本发明还提供了上述表皮葡萄球菌的发酵上清液具有良好的抗炎和美白功效。
与现有技术相比，本发明提供了一株健康人源(分离自健康人皮肤上)的表皮葡萄球菌，未见有关表皮葡萄球菌筛选的报道。经过试验证明，该表皮葡萄球菌CCSM0322具有良好的抗炎效果，所述表皮葡萄球菌具有高抑制透明质酸酶和降低LPS引起的巨噬细胞炎症因子IL-6的能力，其中，所述表皮葡萄球菌发酵上清对透明质酸酶抑制率达58.01％，IL-6表达方面与阳性对照LPS相比，可显著降低LPS引起的巨噬细胞IL-6表达(下降30.14％)，同时所述表皮葡萄球菌发酵上清对酪氨酸酶抑制率达73.72％。本发明菌株在对抗炎症因子对皮肤损伤，在黑色素的表达方面具有良好抑制效果，在抗炎和美白护肤品开发方面具有良好的应用前景，填充了表皮葡萄球菌在抗炎和美白功效筛选中的空白。
附图说明
图1表皮葡萄球菌CCSM0322的菌落形态及显微镜照片；
图2表皮葡萄球菌CCSM0322的生长曲线；
图3表皮葡萄球菌CCSM0322发酵上清对巨噬细胞RAW264.7细胞毒性；
图4表皮葡萄球菌CCSM0322发酵上清对LPS引起的巨噬细胞RAW264.7表达IL-6的影响；
图5表皮葡萄球菌CCSM0322发酵上清对酪氨酸酶抑制率的效果测定图。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，而不构成对本发明的限制。
以下实施例中所用的菌种培养基如下：
胰酪大豆胨琼脂血培养基(TSA)：胰蛋白胨15.0g/L，大豆胨5.0g/L，氯化钠5.0g/L，琼脂15.0g/L，121℃高压灭菌15min，冷却50℃左右时，加入5％无菌脱纤维羊血，混匀，倒平板。
胰酪大豆胨液体培养基(TSB)：胰蛋白胨17.0g/L，大豆木瓜蛋白酶消化物3.0g/L，氯化钠5.0g/L，磷酸二氢钾2.5g/L，葡萄糖2.5g/L，121℃高压灭菌15min，备用。
保藏培养基：120g脱脂乳粉，880mL蒸馏水，118℃高压灭菌15min，备用。
实施例1、菌株CCSM0322的分离、筛选与纯化
(1)招募完美肌肤志愿者
要求皮肤健康，素颜状态下，皮肤细腻、毛孔小，无痤疮、脓疱、无炎症、无脱屑等情况，有斑者可参加，近3个月未擦拭药膏；年龄18～30岁，性别不限。
(2)样品采集
要求志愿者采样前一晚洗脸后可做基础护肤(涂水、乳等)，第二天早上不能洗脸，一般中午或下午取样。在采样皮肤部位处选取一块大约4cm×4cm区域，将聚合纤维材料的无菌棉签在润湿液(0.9％氯化钠和0.1％吐温-20)中润湿，在选取区域内来回涂擦50次(擦拭棉拭子要有一定的力度)，用无菌镊子将无菌棉签放置在取样管中，并用封口膜封口。将收集的样品放入冰盒里冷藏，带回实验室并放置于4℃冰箱内，尽快进行菌株的分离。
(3)样品预处理
在超净工作台中用无菌剪刀将带有样品的无菌棉签头剪下，放置于5mL离心管(EP管)中，吸取5mL无菌水于离心管中，充分混匀。
(4)平板筛选
取上述样品液0.5mL加入4.5mL无菌水进行梯度稀释，选择合适的稀释度，吸取0.1mL稀释液涂布于TSA固体血平板，每个稀释度涂布2个平板，分别置于37℃培养箱中好氧培养24h，厌氧菌筛选置于厌氧袋中加入厌氧包密闭培养48h。
(5)划线、分纯和保藏
根据凝固酶阴性葡萄球菌菌株在血平板上的菌落特点，不产溶血圈、菌落大小、颜色、湿润、光泽等差异，挑取单菌落分别划线TSA血平板，置于37℃恒温培养箱里培养16h，待多次划线分纯后，采用脱脂乳粉作为保护剂保藏于保存管，冷冻干燥后保藏于-85℃深冷冰箱中。
通过上述筛选方法，筛选获得菌株CCSM0332。
实施例2菌株CCSM0322的微生物学鉴定
将实施例1的CCSM0322进行微生物学鉴定
(1)菌落特征：
菌株在TSA血琼脂平板上划线，37℃培养16h后，观察菌株在平板上的菌落形态特征。结果如图1所示，从图1可以看出，表皮葡萄球菌在TSA血平板上菌落为白而小，形成圆形凸起，边缘整齐，菌落直径大约为0.5～1mm，表面光滑，湿润，不透明，挑取能拉丝，无溶血圈；
(2)菌体特征：
将步骤(1)中得到的表皮葡萄球菌挑取少量菌体于载玻片上进行涂片，进行革兰氏染色，在显微镜下观察菌体形态特征。结果见图1所示，从图1可以看出，革兰氏染色阳性。菌体特征呈球形，直径0.9～1.0μm左右，排列成葡萄状，也有单个排列，无鞭毛，不能运动，不产芽孢。
(3)培养学特征：
将菌株CCSM0322接种到TSB液体培养基中，置于不同温度下培养，研究表明，CCSM0322的最低生长温度为15℃，最高生长温度为45℃，在30～40℃生长温度最佳；接种到不同pH的TSB液体培养基中，37℃恒温培养，CCSM0322菌株的最高生长pH为9.0、最低生长pH为4.0，最适生长pH为6.0。
(4)遗传学特性：
菌株CCSM0322的16S rDNA序列分析
CCSM0322基因组DNA提取方法：挑取纯化的CCSM0322单菌落接种到10mLTSB培养基中，37℃培养14～16h后将菌液离心(8000r/min，15min)收集菌体。
采用基因组DNA抽提试剂盒(生工生物工程(上海)股份有限公司)提取。PCR扩增采用两种合成的通用引物(16s 27F:GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG；16s 1492R：CGGCTACCTTGTTACGACTT)，PCR产物采用柱式PCR产物纯化试剂盒(生工生物工程(上海)股份有限公司)回收，纯化后送美吉生物工程(上海)股份有限公司测序。所得CCSM0322的16SrDNA核苷酸序列见(序列表),序列长度为：1384bp。
送GenBank做Blast分析。菌株CCSM0322同源性最高菌株的是MT585523.1，同源性为100％。
根据Goodfellow和O’Donnell所说的DNA的G+C(mol％)≤10％～12％及16S rRNA的序列同源性≥95％的种可归为一个属，并且Embley和Stackebrangdt认为当16S rRNA的序列同源性≥97％时可以认为是一个种。由此可以推断：菌株CCSM0322与Staphylococcusepidermidis属于同一个种。因此菌株CCSM0322鉴定为表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)。
依据上述的菌落、菌体形态、培养学、生理生化鉴定等微生物学特性及其遗传特性16srDNA对CCSM0322鉴定为表皮葡萄球菌Staphylococcus epidermidis，该菌株已于2022年6月1日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，其保藏编号为CCTCC No：M2022774。
实施例3表皮葡萄球菌Staphylococcus epidermidis CCSM0322的生长曲线的绘制
将活化好的表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)CCSM0322按2％(v/v)接种量接入TSB肉汤液体培养基中，37℃恒温振荡培养24h，每隔2h在600nm处测定培养液的OD值，以OD600值对时间作图得到表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)CCSM0322在TSB肉汤液体培养基中的生长曲线，其结果如图2所示，从图2中可以看出，表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)CCSM0322在TSB肉汤液体培养基中生长迅速，在2h左右进入对数期，12h左右进入稳定期。
实施例4表皮葡萄球菌Staphylococcus epidermidis CCSM0322发酵上清的透明质酸酶抑制率测定
(1)Staphylococcus epidermidis CCSM0322发酵上清的制备
将S.epidermidis CCSM0322菌株划线于TSA平板，置于37，恒温培养16～20h，活化2次。将活化好的S.epidermidis CCSM0335接种到TSB液体培养基中，37℃摇床振荡培养16～20h，调整菌体OD600在0.9～1.1范围，作为种子液。以1％～3％接种量将种子液接种到250mL三角瓶中，置于37℃，以160r/min的速度培养12h，得到表皮葡萄球菌的发酵液；将上述发酵液以10000r/min离心15min，获得的离心上清液即为发酵上清液。
(2)用透明质酸酶抑制法测Staphylococcus epidermidis CCSM0322的代谢产物中的透明质酸酶抑制率，步骤如下：
①用0.1M乙酸缓冲溶液配制12.5mM的氯化钙溶液，4000U/mL的透明质酸酶溶液和2mg/mL的透明质酸钠溶液；
②将1mL乙酰丙酮和10mL 0.5M碳酸钠溶液混合均匀备用，临用现配；
③将二甲氨基苯甲醛1.5g溶于冰醋酸43.75mL中，混合均匀后加10M盐酸6.25mL，临用现配；
(3)取步骤(1)中的发酵上清液作为样品按照下列表格添加步骤(2)中的试剂进行反应
按照公式计算得出Staphylococcus epidermidisCCSM0322发酵上清的透明质酸酶抑制率为58.01±13.62％。
实施例5表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)CCSM0322发酵上清降低LPS刺激巨噬细胞产生IL-6的测试
(1)Staphylococcus epidermidis CCSM0322发酵上清的制备
将S.epidermidis CCSM0322菌株划线于TSA平板，置于37℃恒温培养16～20h，活化2次。将活化好的S.epidermidis CCSM0322接种到TSB液体培养基中，37℃摇床振荡培养16～20h，调整菌体OD600在0.9～1.1范围，作为种子液。以1％～3％接种量将种子液接种到250mL三角瓶中，置于37℃，以160r/min的速度培养12h，得到表皮葡萄球菌的发酵液；将上述发酵液以10000r/min离心15min，获得的离心上清液，将发酵上清浓缩到原体积的1/4，即为表皮葡萄球菌的浓缩发酵上清液。
(2)细胞活力测试
巨噬细胞RAW264.7在5％CO2、37℃的培养条件下，利用含10％胎牛血清的高糖DMEM培养基正常培养。当细胞生长至80-90％汇合时，用胰酶将其消化并按照8x105 cells/mL的密度接种于96孔板。细胞贴壁24h后，分别加入0.1％、0.5％、1％、5％和10％CCSM0322发酵上清浓缩液培养24h，设置对照组，每个实验组设置3个平行孔。处理完成后，按照说明书加入CCK-8试剂孵育1h，在450nm处测量吸光度，计算相对细胞活性。
相对细胞活性％＝(样品组OD值/对照组OD值)x 100％
(3)经LPS诱导的巨噬细胞RAW264.7的IL-6测试
巨噬细胞RAW264.7在含5％CO2、37℃的培养条件下，利用含10％胎牛血清的高糖DMEM培养基正常培养。当细胞生长至80-90％汇合时，用胰酶将其消化并按照8x105 cells/mL的密度接种于96孔板。细胞贴壁24h后，将LPS、LPS和5％CCSM0322发酵上清的浓缩液加入反应孔中，以地塞米松为阳性对照，设置空白对照组，每组设3个平行孔。培养24h后取上清液，用ELISA试剂盒进行IL-6炎症因子的检测。
从图3可以看出，与对照组相比，CCSM0322发酵上清的浓缩液的添加量低于5％时，未显示细胞毒性，而且能显著促进巨噬细胞RAW264.7细胞的生长。在此选择5％CCSM0322发酵上清的浓缩液进行炎症因子的实验。实验结果表明(图4)，正常细胞产生少量的IL-6细胞因子，而LPS处理后，细胞分泌大量的炎症因子IL-6，加入CCSM0322发酵上清浓缩液，可显著降低炎症细胞因子IL-6的量，降低率30.14％。可见，表皮葡萄球菌CCSM0322发酵上清可显著降低LPS引起的炎症细胞因子IL-6的表达，显示出良好的抗炎效果。
实施例6表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)CCSM0322发酵上清降低酪氨酸酶测试
(1)Staphylococcus epidermidis CCSM0322发酵上清的制备
将Staphylococcus epidermidis CCSM0322菌株划线于TSA平板，37℃恒温培养16～20h，活化2次。将活化好的Staphylococcus epidermidis CCSM0322接种到TSB液体培养基中，37℃摇床振荡培养16～20h，调整菌体OD600在0.9～1.1范围，作为种子液。以1％～3％接种量将种子液接种到250mL三角瓶中，置于37℃，以160r/min的速度培养12h，得到表皮葡萄球菌的发酵液；将上述发酵液以10000r/min离心15min，获得的离心上清液即为发酵上清液。
(2)用酪氨酸酶抑制法测Staphylococcus epidermidis CCSM0322的代谢产物中的酪氨酸酶抑制率，步骤如下：
用pH6.8的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液配制100U/mL的酪氨酸酶溶液和1mg/mL的左旋多巴溶液，用5mL试管设立样品管(T)、样品本底(T0)、酶反应管(C)和溶剂本底(C0)，每一样品的每个受试浓度的样品管(T)需设立3支平行管，同时酶反应管(C)也需设立3支平行管。
在样品管(T)和样品本底(T0)中各加入1mL相同浓度的样品溶液，酶反应管(C)和溶剂本底(C0)则分别加入1mL磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液。在样品管(T)和酶反应管(C)中各加入0.5mL酪氨酸酶溶液，样品本底(T0)与溶剂本底(C0)以0.5mL磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液代替，将样品和酪氨酸酶充分混匀，置37℃水浴槽孵育10分钟。
依次在各管中加入2mL的左旋多巴溶液，控制每管反应时间为5分钟，即刻将各管反应溶液移入比色皿中，在475nm处测定吸光值。
根据各管反应的吸光值，利用公式计算得出Staphylococcus epidermidis CCSM0322发酵上清的酪氨酸酶抑制率为72.73±0.0046％。
表1:不同浓度的CCSM0322发酵上清的酪氨酸酶抑制率
CCSM0322菌株的核苷酸序列为：
Claims (8)
1.一株表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)CCSM0322，其特征在于，该表皮葡萄球菌已于2022年6月1日在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC No：M2022774。
2.如权利要求1所述表皮葡萄球菌在制备具有抗炎和美白效果的化妆品中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述抗炎包括抑制透明质酸酶和显著地降低LPS引起的巨噬细胞RAW264.7产生炎症因子IL-6的表达水平。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述美白包括抑制酪氨酸酶活性。
5.一种化妆品，其特征在于：所述化妆品的原料包含权利要求1所述的表皮葡萄球菌或其发酵上清液。
6.根据权利要求5所述的化妆品，其特征在于：所述发酵上清液采用下述方式制成：
将S.epidermidis CCSM0322菌株划线于TSA平板，37℃恒温培养16～20h，活化2次；将活化好的S.epidermidis CCSM0322接种到TSB液体培养基中，37℃摇床振荡培养16～20h，调整菌体OD600在0.9～1.1范围，作为种子液；以1％～3％的接种量将种子液接种到250mL三角瓶中，置于37℃恒温震荡培养箱中，以160r/min的速度培养12h，得到表皮葡萄球菌的发酵液；将上述发酵液以10000r/min离心15min，获得的离心上清液即为表皮葡萄球菌的发酵上清。
7.权利要求1所述表皮葡萄球菌的发酵上清液在化妆品中的应用。
8.权利要求1所述表皮葡萄球菌的发酵上清液在制备舒缓、美白化妆品中的应用。
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| CN115786164B (zh) * | 2022-08-05 | 2023-10-27 | 上海应用技术大学 | 一株山羊葡萄球菌ccsm0244及其应用 |
| CN116286543B (zh) * | 2023-04-14 | 2023-07-21 | 中国医学科学院皮肤病医院(中国医学科学院皮肤病研究所) | 具有良好保湿美白抗炎抗氧化抗衰老功效的表皮葡萄球菌及其应用 |
Citations (4)
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| CN114369553A (zh) * | 2022-01-17 | 2022-04-19 | 梁天晓 | 一株抗炎的表皮葡萄球菌 |
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-
2022
- 2022-08-12 CN CN202210967956.3A patent/CN115806899B/zh active Active
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN115806899A (zh) | 2023-03-17 |
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