KR20170056143A - 항생제 내성 황색포도상구균에 대한 길항균 스타필로코코스 에피더미디스 r0002 - Google Patents

항생제 내성 황색포도상구균에 대한 길항균 스타필로코코스 에피더미디스 r0002 Download PDF

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Abstract

본 발명에 따른 스타필로코코스 에피더미디스(Staphylococcus epidermidis ) R0002는 황색포도상구균을 포함해 식중독의 원인이 되는 다양한 병원성균에 대해 항균 활성을 보이며, 더욱이 항생제 내성균에 대해서도 길항력을 가지며, 해당 균주 유래의 길항물질은 광범위한 온도 및 pH에서 안정성이 우수한바, 본 발명에 따른 균주, 이의 배양물, 또는 이에서 유래된 길항물질은 항균 조성물, 사료 조성물, 식품 조성물, 약학 조성물, 의약외품 조성물 또는/및 천연 방부제 조성물 등의 유효성분으로 다양하게 활용될 수 있다.

Description

항생제 내성 황색포도상구균에 대한 길항균 스타필로코코스 에피더미디스 R0002{Antagonistic Staphylococcus epidermidis R0002 against antibiotics-resistant Staphylococcus aureus}
본 발명은 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)을 포함해 그람양성 식중독균에 대해 광범위한 길항력을 보이는 스타필로코코스 속에 속하는 균주 및 상기 균주에서 유래된 길항물질에 관한 것이다.
최근 국민 소득수준 상승에 따라 식품소비 패턴의 다양화, 대형화 및 고급화가 진행되면서 식품위생 및 안전과 이에 대한 예방 및 대책은 매우 주요한 이슈로 부각되며, 이에 다양한 위생 관리기술이 개발되었음에도 불구하고 국내 식중독 환자 수는 연간 약 1,800만명에 이르며, 경제적 손실비용이 약 1조 3,000억원인 것으로 추산되고 있다(Shin et al., 2010).
따라서, 가열하지 않고 섭취하는 신선 채소 및 편이 식품에 존재하는 식중독균을 적은 비용으로 친환경적으로 해결함으로써, 농산물 신선 편이식품에 의한 식중독의 잠재적인 위험을 차단할 필요가 있다. 또한, 인체에 무해한 제어법을 이용하여 물리 화학적인 처리 없이 상품성을 해치지 않으면서도 유기농 농산물의 안전성 확보함으로써, 농산물 안전 확립으로 인한 농가 소득 증대에 기여하는 동시에, 화합물 항생제 대체재를 통해 의학 분야 이외에 축산업, 어류양식업 등에 화합물 항생제 대안을 제공하여 화합물 항생제 사용 절감을 유도할 필요성이 계속 제기되고 있다.
본 발명이 해결하고자 하는 과제는, 항생제 대체제로서, 황색포도상구균을 포함해 식중독의 원인이 되는 다양한 병원성균에 대해 항균 활성을 보이며, 항생제 내성균에 대해서도 길항력을 갖는 신규한 균주를 제공하는데 그 목적이 있다.
또한, 상기 신규한 균주 유래의 길항물질로서 광범위한 온도 및 pH에서 안정성이 우수한 단백질(박테리오신)을 제공하는데 그 목적이 있다.
또한, 상기 균주에서 상기 단백질(박테리오신)을 분리, 정제하는 방법을 제공하는데 그 목적이 있다.
또한, 상기 신규한 균주, 이의 배양물, 또는 이에서 유래된 길항물질을 함유하는 항균 조성물, 사료 조성물, 식품 조성물, 생균제 조성물, 또는/및 천연 방부제 조성물을 제공하는 그 목적이 있다.
이에, 상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 다음 중 하나 이상의 특징을 갖는 스타필로코코스 에피더미디스(Staphylococcus epidermidis) R0002를 제공한다:
(a) 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)에 대한 항균 활성;
(b) 그람양성 식중독균에 대한 항균 활성;
(c) 잔토모나스 알빌리니언스(Xanthomonas albilineans)에 대한 항균 활성; 또는
(d) Epidermin structural gene (epiA), Pep5 structural gene (pepA), Epicidin 280 structural gene (eciA), Epilancin k7 structural gene (elkA), Aureocin A53 structural gene (aucA), Aureocin A70 structural gene (aurABCD), Nukacin ISK-1 structural gene (nukA), Nukacin ISK-1 modification enzyme gene (nukM), epidermicin NI01 structual gene (edcA), BacCH-91 structural gene (bacCH91), 및 Aureocyclicin 4185 structual gene (aclA) 으로 이루어진 박테리오신 유전자 군 중 어느 유전자도 포함하지 않음.
또한, 상기 그람양성 식중독균은 바실러스 세레우스(Bacillus cereus ), 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes ), 리스테리아 이바노비(Listeria ivanovii ), 락토바실러스 보발리우스(Lactobacillus bobalius ), 및 스트렙토코코스(Streptococcus) 속으로 이루어진 군에서 하나 이상의 균인 것을 특징으로 하는 스타필로코코스 에피더미디스 R0002를 제공한다.
또한, 상기 스타필로코코스 에피더미디스 R0002는 기탁번호 KACC 92094P로 기탁된 균주인 것을 특징으로 하는 스타필로코코스 에피더미디스 R0002를 제공한다.
또한, 상기 스타필로코코스 에피더미디스 R0002의 배양액에서 얻어지고, 다음 중 하나 이상의 특징을 갖는 정제된 단백질을 제공한다:
(a) 70℃ 이하의 온도에서 안정;
(b) pH 2 - 10에서 안정; 또는
(c) SDS-PAGE 특정 분자량 10kDa.
또한, 상기 스타필로코코스 에피더미디스 R0002에서 상기 단백질을 제조하는 방법을 제공한다:
(S1) 상기 스타필로코코스 에피더미디스 R0002의 배양액으로부터 황산암모늄 침전법 또는 소수성 수지 상호작용에 의해 단백질을 침전시키는 단계;
(S2) 단백질 침전물을 역상 HPLC 하는 단계; 및
(S3) SDS-PAGE를 통해 전기영동하는 단계.
또한, 상기 스타필로코코스 에피더미디스 R0002, 이의 배양물, 이의 유래 단백질, 또는 이들의 혼합물을 유효성분으로 포함하는 항균 조성물을 제공한다.
또한, 상기 스타필로코코스 에피더미디스 R0002, 이의 배양물, 이의 유래 단백질, 또는 이들의 혼합물을 유효성분으로 포함하는 식품 조성물을 제공한다.
또한, 상기 스타필로코코스 에피더미디스 R0002, 이의 배양물, 이의 유래 단백질, 또는 이들의 혼합물을 유효성분으로 포함하는 천연 방부제 조성물을 제공한다.
또한, 상기 스타필로코코스 에피더미디스 R0002, 이의 배양물, 이의 유래 단백질, 또는 이들의 혼합물을 유효성분으로 포함하는 사료 조성물을 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
스타필로코코스 에피더미디스( Staphylococcus epidermidis ) R0002
본 발명은 스타필로코코스 에피더미디스(Staphylococcus epidermidis ) R0002에 관한 것으로, 다음 중 하나 이상의 특징을 갖는다.
(a) 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)에 대한 항균 활성;
(b) 그람양성 식중독균에 대한 항균 활성;
(c) 잔토모나스 알빌리니언스(Xanthomonas albilineans)에 대한 항균 활성; 또는
(d) Epidermin structural gene (epiA), Pep5 structural gene (pepA), Epicidin 280 structural gene (eciA), Epilancin k7 structural gene (elkA), Aureocin A53 structural gene (aucA), Aureocin A70 structural gene (aurABCD), Nukacin ISK-1 structural gene (nukA), Nukacin ISK-1 modification enzyme gene (nukM), epidermicin NI01 structual gene (edcA), BacCH-91 structural gene (bacCH91), 및 Aureocyclicin 4185 structual gene (aclA) 으로 이루어진 박테리오신 유전자 군 중 어느 유전자도 포함하지 않음.
본 발명자들은 박테리오신을 분비하는 균주들 중에서 황색포도상구균, 특히 항생제 내성 황색포도상구균에 대해 길항력을 갖는 균주를 분리 동정하였고, 이를 스타필로코코스 에피더미디스 R0002라 칭하고, 농업생명공학연구원에 2015년 10월 29일 KACC92094P로 기탁하였다.
본 발명에 따른 명세서에 있어서, 용어 "항균 활성"과 "길항력"은 동일한 의미로 상호간에 혼용되어 사용되며, 대상 균의 생존, 생장 또는 번식을 억제, 차단, 내지 제어하는 것을 의미한다.
본 발명에 따른 스타필로코코스 에피더미디스 R0002는 황색포도상구균, 특히 항생제 내성 황색포도상구균에 대해 우수한 항균 활성을 갖는다.
또한, 본 발명에 따른 스타필로코코스 에피더미디스 R0002는 그람양성 식중독균과 그람음성 식중독균인 잔토모나스 알빌리니언스(Xanthomonas albilineans)에 대해서도 길항력을 가진다. 보다 구체적으로, 상기 그람양성 식중독균에는 바실러스 세레우스(Bacillus cereus ), 리스테리아 모노사이토제네스( Listeria monocytogenes), 리스테리아 이바노비(Listeria ivanovii ), 락토바실러스 보발리우스(Lactobacillus bobalius), 및 스트렙토코코스(Streptococcus) 속으로 이루어진 군에서 하나 이상의 균이 포함된다. 보다 더 구체적으로, 상기 스타필로코코스 속에는 스타필로코코스 아우리쿨라리스(Staphylococcus auricularis), 스타필로코코스 캐피티스(Staphylococcus capitis ), 스타필로코코스 카프래(Staphylococcus caprae), 스타필로코코스 코흐니(Staphylococcus cohnii ), 스타필로코코스 해몰리티쿠스(Staphylococcus haemolyticus), 스타필로코코스 호미니스(Staphylococcus hominis ), 스타필로코코스 렌투스(Staphylococcus lentus ), 스타필로코코스 사프로피티쿠스(Staphylococcus saprophyticus ), 스타필로코코스 시뮬란스(Staphylococcus simulans ), 스타필로코코스 와르너리(Staphylococcus warneri ), 및 스타필로코코스 자일로서스(taphylococcus xylosus)가 포함된다.
또한, 상기 스타필로코코스 에피더미디스 R0002가 보이는 길항력은 기존에 알려진 박테리오신 유전자에서 비롯된 것이 아닌바, 보다 구체적으로 스타필로코코스 에피더미디스 R0002는 Epidermin structural gene (epiA), Pep5 structural gene (pepA), Epicidin 280 structural gene (eciA), Epilancin k7 structural gene (elkA), Aureocin A53 structural gene (aucA), Aureocin A70 structural gene (aurABCD), Nukacin ISK-1 structural gene (nukA), Nukacin ISK-1 modification enzyme gene (nukM), 및 epidermicin NI01 structual gene (edcA), BacCH-91 structural gene (bacCH91), 및 Aureocyclicin 4185 structual gene (aclA) 중 어느 박테리오신 유전자도 갖지 않는다.
본 발명에 따른 스타필로코코스 에피더미디스 R0002는 통상적인 스타필로코코스 에피더미디스 배양법에 따라 배양할 수 있다. 배양배지로는 탄소원, 질소원, 비타민 및 미네랄로 구성된 배지를 사용할 수 있다. 예를 들어, NB(nutrient broth), TSB(tryptic soy broth) 액체 배지, 또는 TSA(tryptic soy agar) 고체배지 등을 사용할 수 있다. 배양은 통상의 배양조건으로 수행할 수 있다. 배양액 중의 배양배지를 제거하고 농축된 균체만을 회수하기 위해 원심분리 또는 여과과정을 거칠 수 있으며 이러한 단계는 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자의 필요에 따라 수행할 수 있다. 농축된 균체는 통상적인 방법에 따라 냉동하거나 냉동 건조하여 그 활성을 잃지 않도록 보존할 수 있다.
스타필로코코스 에피더미디스 R0002 유래의 길항물질
본 발명은 상기 스타필로코코스 에피더미디스 R0002의 배양액에서 얻어지고, 다음 중 하나 이상의 특징을 갖는 정제된 단백질에 관한 것이다:
(a) 70℃ 이하의 온도에서 안정;
(b) pH 2 - 10에서 안정; 또는
(c) SDS-PAGE 특정 분자량 10kDa.
본 발명에 따른 상기 스타필로코코스 에피더미디스 R0002 유래의 길항물질은 70℃ 이하의 온도에서 안정하고 더욱 바람직하게 4 - 70℃ 온도에서 안정하며, 특히 70℃ 이하의 온도에서 30분 동안 항균 활성을 유지하고, 25℃ 이하의 온도에서는 3일 동안 항균 활성을 유지한다. 또한, pH 2 - 10 범위 내에서도 항균 활성을 유지하여, 매우 안정적이다. 또한, 단백질 분해 효소에 대해서는 민감성을 나타내는바, 단백질성 물질이다. 따라서, 다양한 산업에서 활용가능하고, 강산에 대해서도 안정성을 보이므로 체내 투여가 가능할 것이며, 단백질 분해 효소에 대해서는 민감성을 가지므로 항생제와 달리 인체에 안전하다는 장점을 갖는다.
본 발명에 따른 길항물질은 본 발명에 따른 스타필로코코스 에피더미디스 R0002가 갖는 항균 활성을 동일하게 갖는다.
본 발명에 따른 길항물질은 스타필로코코스 에피더미디스 R0002가 생산한 항생물질로 동종인 스타필로코코스 속에 대한 길항력을 보이는 단백질이라는 점에서 박테리오신(bacteriocin)으로 분류될 수 있다.
스타필로코코스 에피더미디스 R0002에서 길항물질의 제조방법
본 발명은 상기 스타필로코코스 에피더미디스 R0002에서 상기 단백질을 제조하는 방법에 관한 것이다:
(S1) 상기 스타필로코코스 에피더미디스 R0002의 배양액으로부터 황산암모늄 침전법 또는 소수성 수지 상호작용에 의해 단백질을 침전시키는 단계;
(S2) 단백질 침전물을 역상 HPLC 하는 단계; 및
(S3) SDS-PAGE를 통해 전기영동하는 단계.
각 단계 별로 설명한다.
(S1) 단계는 스타필로코코스 에피더미디스 R0002의 배양액으로부터 단백질을 침전시키는 단계이다.
바람직하게, 황산암모늄 침전법 또는 소수성 수지 상호작용에 따를 수 있다.
황산암모늄 침전법은 황산암모늄을 단백질 용액에 첨가하면 단백질의 용해도가 낮아져 단백질이 침전하는 원리에 근거한다. 약 55 - 65% 농도의 황산암모늄을 첨가하는 것이 가장 바람직하다.
또한, 소수성 수지 상호작용은 흡착 수지에 단백질을 흡착 후 용출시키는 방법에 의한다. 상기 흡착 수지로 예를 들어 XAD-16 흡착 수지 등이 이용될 수 있으나, 이제 제한되지 않는다. 소수성 상호 작용에 의하여 단백질을 침전시키기 위해, 바람직하게 흡착 수지에 단백질 용액을 흡착시키는 단계, 흡착 수지에 증류수 또는/및 20 - 40% (v/v) EtOH로 세정하여 비흡착 성분을 제거하는 단계, 및 50 - 80 %(v/v) 이소프로판올로 흡착 수지 컬럼에 흡착되어 있는 단백질을 용출하는 단계를 거칠 수 있다.
(S2) 단계는 단백질 침전물을 역상 HPLC 하는 단계이다.
바람직하게, 이동상으로 물과 0.1% trifluoroacetic acid (TFA) 및 아세토나이크릴과 0.1% trifluoroacetic (TFA) acid를 녹인 2개 이동상을 이용할 수 있다. 바람직하게, 고정상으로 예를 들어, C18, 페닐, CN, C3, Aq 또는 C8, 바람직하게 C18, 가장 바람직하게 Zorbax SB-C18을 이용할 수 있다. 또한, 바람직하게 30 - 50 ℃, 더욱 바람직하게 35 - 45 ℃의 온도에서 실시할 수 있다.
(S3) 단계는 SDS-PAGE를 통해 전기영동하는 단계이다.
Running gel (바람직하게, 1 M Tris-HCl, 30% acrylamide, 0.8% bisacrylamide, 20% SDS, glycerol 0.6g, 10% Ammonium persulfate,TEMED)와 stacking gel (바람직하게, 0.25 M Tris-HCl, 30% acrylamide, 1.5% bisacrylamide, 20% SDS, 10% ammonium persulfate, TEMED)을 조제하고, 이들을 전기영동조에 설치한 다음, 전개 완충용액 (바람직하게, abode buffer : 0.2 M Tris, cathode buffer : 100mM Tris, 100mM Tricine, 0.1% SDS)을 붓고, 시료를 loading하고 전기영동한다. Dye에 전기영동한 gel을 담그고 염색하며, Dye로 예를 들어 coomassie brilliant blue R 250를 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않고 당업계에서 사용되는 다양한 Dye를 사용할 수 있다. 시료와 결합하지 않은 여분의 Dye를 탈색한 다음 검출한다.
스타필로코코스 에피더미디스 R0002, 이의 배양물, 이로부터 분리된 길항물질 , 또는 이들의 혼합물을 포함하는 조성물
본 발명의 조성물에 포함되는 성분으로서 "스타필로코코스 에피더미디스 R0002"는 균주의 영양세포 또는 포자, 또는 이들의 혼합 상태로 구성될 수 있다.
본 발명에 따른 명세서에 있어서, 용어 "배양물"은 균체를 포함한 배양원액일 수 있으며, 균체를 제거한 배양 상등액일 수도 있고, 또한 상기 배양원액 또는 배양 상등액의 희석액일 수도 있다.
스타필로코코스 에피더미디스 R0002, 이의 배양물, 이로부터 분리된 길항물질, 또는 이들의 혼합물은 이의 항균 활성을 토대로 하여 다양한 분야에서 활용될 수 있다. 더욱이, 길항물질은 광범위한 온도 및 pH에서 안정성을 보이는 단백질이므로 이를 유효성분으로 하여 다양한 용도로 사용될 수 있다. 예컨대, 식품 조성물, 항균 조성물, 천연 방부제 조성물, 사료 조성물, 약학 조성물, 의약외품 조성물 등으로 사용될 수 있다.
본 발명은 스타필로코코스 에피더미디스 R0002, 이의 배양물, 이로부터 분리된 길항물질, 또는 이들의 혼합물을 유효성분으로 포함하는, 황색포도상구균, 그람양성 식중독균, 또는 잔토모나스 알빌리니언스 증식, 생장 또는 생존 억제 내지 차단용 조성물에 관한 것이다. 또는, 스타필로코코스 에피더미디스 R0002, 이의 배양물, 이로부터 분리된 길항물질, 또는 이들의 혼합물을 처리하여 황색포도상구균, 그람양성 식중독균, 또는 잔토모나스 알빌리니언스 증식, 생장 또는 생존을 억제 내지 차단하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 스타필로코코스 에피더미디스 R0002, 이의 배양물, 이로부터 분리된 길항물질, 또는 이들의 혼합물은 식중독균에 대해서만 특이적으로 길항력을 보이므로, 익균은 죽이지 않으므로 부작용이 없고, 항생제 내성균도 사멸시킬 수 있어 그 효과가 탁월할 뿐만 아니라, 병원균의 내성 내지 저항성을 유도하지 않으므로 기존의 것에 비해 제품수명이 길다.
본 발명에 따른 스타필로코코스 에피더미디스 R0002, 이의 배양물, 이로부터 분리된 길항물질, 또는 이들의 혼합물을 유효성분으로 포함하는 조성물은 용액, 현탁액, 유화액과 같은 액상으로 제조될 수 있으나, 분말제, 과립제, 정제, 또는 캅셀제와 같은 고상으로도 제조될 수 있다. 또한, 허용가능한 담체를 추가로 포함할 수 있으며, 담체와 함께 제제화될 수 있다. 상기 허용가능한 담체란 생물체를 자극하지 않고 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체를 말한다. 실제 포장에 사용하기 적합한 안정적인 제제화를 목적으로 계면활성제 또는 증량제 등을 사용하여 수화제, 입상수화제, 액상수화제, 액제, 수용제, 수용성입제 또는 캡슐화제의 형태로 제조될 수 있다. 상기 계면활성제의 일예로 알킬(C8~C12)아릴설포네이트, 디알킬(C3~C6)아릴설포네이트, 디알킬(C8~C12)설포숙시네이트, 리그닌설포네이트, 나프탈렌설포네이트축합물, 나프탈렌설포네이트포르말린축합물, 알킬(C8~C12)나프탈렌설포네이트포르말린축합물, 폴리옥시에틸렌알킬(C8~C12)페닐설포네이트와 같은 설포네이트 화합물의 나트륨염 또는 칼슘염, 알킬(C8~C12)설페이트, 알킬(C8~C12)아릴설페이트, 폴리옥시에틸렌알킬(C8~C12)설페이트, 폴리옥시에틸렌알킬(C8~C12)페닐설페이트와 같은 설페이트 화합물의 나트륨염 또는 칼슘염, 폴리옥시알킬렌숙시네이트와 같은 숙시네이트화합물의 나트륨염 또는 칼슘염, 나트륨 벤조에이트, 알킬카르복실레이트 등의 음이온성 계면활성제, 폴리옥시에틸렌알킬(C12~C18)에테르, 폴리옥시에틸렌알킬(C8~C12)페닐에테르, 폴리옥시에틸렌알킬(C8~C12)페닐폴리머, 에틸렌옥사이드 프로필렌옥사이드 코폴리머와 같은 비이온성 계면활성제, 폴리카복실레이트, 트리톤 100 및 트윈 80으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 또는 둘 이상이 혼합되어 사용될 수 있으며, 이들 이외의 다른 계면활성제들도 사용될 수 있음은 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게는 용이하게 이해될 수 있을 것이다. 증량제로는 벤토나이트(bentonite), 활석, 클레이, 카올린, 탄산칼슘, 규사, 경석, 규조토, 산성 백토, 제올라이트, 펄라이트, 화이트 카본, 암모늄 설페이트, 요소, 포도당, 덱스트린(dextrin), 콩가루, 쌀, 밀, 황토, 포도당 및 전분, 물 등이 단독으로 또는 2종 이상 혼합되어 사용될 수 있으며, 이들 이외의 다른 증량제들도 사용될 수 있음은 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게는 용이하게 이해될 수 있을 것이다.
상기 조성물에서의 스타필로코코스 에피더미디스 R0002, 이의 배양물, 이로부터 분리된 길항물질, 또는 이들의 혼합물의 농도 내지 함량은 사용 목적에 맞게 임의로 조정될 수 있음은 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게는 용이하게 이해될 수 있을 것이다. 예를 들어, 조성물의 제제화 방법 또는 투여 방법과 같은 요인들에 의해 다양하게 조정될 수 있다.
상기 조성물에는 스타필로코코스 에피더미디스 R0002, 이의 배양물, 이로부터 분리된 길항물질, 또는 이들의 혼합물 외에 유효 균주가 추가로 포함될 수 있으며, 상기 유효 균주는 바람직하게는 식중독균에 대한 용균 활성을 가진 것일 수 있다. 또한, 상기 조성물을 처리하는 경우, 황색포도상구균 등의 억제 또는 차단을 위해 종래 통용되던 방법과 병용할 수 있다.
본 발명에 따른 스타필로코코스 에피더미디스(Staphylococcus epidermidis ) R0002는 황색포도상구균을 포함해 식중독의 원인이 되는 다양한 병원성균에 대해 항균 활성을 보이며, 더욱이 항생제 내성균에 대해서도 길항력을 가지며, 해당 균주 유래의 길항물질은 광범위한 온도 및 pH에서 안정성이 우수한바, 본 발명에 따른 균주, 이의 배양물, 또는 이에서 유래된 길항물질은 항균 조성물, 사료 조성물, 식품 조성물, 생균제 조성물, 약학 조성물, 의약외품 조성물 또는/및 천연 방부제 조성물 등의 유효성분으로 다양하게 활용될 수 있다.
도 1은 S. epidermidis 유래 박테리오신의 스타필로코코스 에피더미디스 R0002 (Staphylococcus aureus R0002)을 대상으로 하여 테스트한 결과를 도시한 것이다.
도 2는 스타필로코코스 에피더미디스 R0002가 기존에 보고된 박테리오신 유전자(epiA, pepA, eciA, elkA, aucA, aurABCD, nukA, nukM, edcA, bacCH91, 및 aclA)를 가지고 있는지 확인하고자 PCR한 결과를 도시한 것이다.
도 3은 단백질(길항물질) 침전을 위한 소수성 수지 상호작용(좌측) 및 황산암모늄 침전법(우측)의 모식도에 관한 것이다.
도 4는 단백질(길항물질) 분리 및 정제를 위한 역상 HPLC 및 SDS-PAGE 분석 결과를 도시한 것이다.
도 5는 길항물질의 온도, pH 및 분해효소에 대한 안정성 검정 결과를 도시한 것이다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[실시예 1. 황색포도상구균에 대해 길항력을 가지는 스타필로코코스 에피더미디스( Staphylococcus epidermidis) R0002 선발]
검체에 펩톤수를 섞고 균질기를 이용하여, 신선 농산물(쌈채소, 새싹채소) 포함 식품, 동물, 사람에서 분리한 394 Staphylococcus 속 균주를 확보하였다. 이들 균주를 대상으로 박테리오신을 생성하는 균주를 탐색하기 위해, 포도상구균 선별용 배지(Baird parker agar, Mannitol salt agar)를 이용하여 박테리오신을 생산하는 139 Staphylococcus 속 균주를 확보하였고, 이들 균주 중 16s rDNA 서열 분석과 생화학 분석을 통해 스타필로코코스 에피더미디스(Staphylococcus epidermidis ) 에 속하는 균주 4종을 선별하였다. 16s rDNA 서열 분석은 프라이머 쌍(forward primer(785F) : GGA TTA GAT ACC CTG GTA, reverse primer(907R) : CCG TCA ATT CCT TTR AGT TT)을 이용한 PCR 결과를 기존의 서열 Database와 비교하여 유사성이 높은 종으로 동정함으로써 실시하였다. 또한, 생화학 분석은 API Staph ID test를 이용하여 동정함으로써 실시하였다. 이들 선별된 균주 4종을 대상으로 agar diffusion assay 법에 의해 황색포도상구균(Staphylococcus aureus ) (항생제 내성 황색포도상구균 포함)에 대한 생장 억제 활성능을 분석하였는바, 90mm plate에 박테리오신 생산 균주를 미리 접종하여 37℃, 16시간 동안 배양 후, 클로로포름 500μl을 첨가한 후 5분 동안 셀 라이시스시킨 후 10분 동안 건조하고, 소프트 아가(0.7%, 5ml) 와 섞은 대상 균주(106 CFU/ml)를 도포하여 생장 억제력을 확인하였다. 그 결과, 생장 억제 활성능을 가지는 균주를 스타필로코코스 에피더미디스(Staphylococcus epidermidis ) R0002 로 칭하였다. 그 결과는 도 1 및 표 1에 도시하였다.
Figure pat00001
[ 실시예 2. 스타필로코코스 에피더미디스 ( Staphylococcus epidermidis ) R0002의 박테리오신]
스타필로코코스 에피더미디스 R0002가 기존에 보고된 박테리오신 유전자(epiA, pepA, eciA, elkA, aucA, aurABCD, nukA, nukM, edcA, bacCH91, 및 aclA)를 가지고 있는지 확인하는 실험을 하였다. 하기 표 2에 기재된 프라이머 세트를 이용해 중합효소연쇄반응(PCR)을 실시하였고(94℃ 3분, (94℃ 30초, 42 56℃ 30초, 72℃ 30초; 30 회), 72℃ 5분), 그 결과 기존에 보고된 어느 유전자에 대해서도 증폭산물을 확인할 수가 없었다.
이로써, 스타필로코코스 에피더미디스 R0002에는 기존에 보고된 박테리오신 유전자(epiA, pepA, eciA, elkA, aucA, aurABCD, nukA, nukM, edcA, bacCH91, 및 aclA)는 포함하고 있지 않음을 확인할 수 있었다(도 2).
Figure pat00002
[ 실시예 3. 스타필로코코스 에피더미디스 ( Staphylococcus epidermidis ) R0002의 길항력 ]
선발된 스타필로코코스 에피더미디스 R0002가 황색포도상구균(Staphylococcus aureus ) 뿐만 아니라 그람양성 식중독 세균에 대해서도 길항력을 가지는지 확인하기 위해, 다음과 같은 실험을 진행하였다. 90mm의 TSA 배지에 109 CFU/ml 농도의 박테리오신 생산균주를 3ul 점적하고 37℃, 16시간 배양 후, 덮개에 클로로포름 500μl을 첨가한 후 15분 동안 셀 라이시스시키고 UV에서 15분 동안 건조하였다. 소프트 아가(0.7%, 5ml) 에 섞은 대상 균주(106 CFU/ml)를 도포 후 37℃, 16시간 배양하여 생장 억제력을 확인하였다.
그 결과, 하기 표 3에 도시한 바와 같이, 바실러스 세레우스(Bacillus cereus ), 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes ), 리스테리아 이바노비(Listeria ivanovii ), 락토바실러스 보발리우스(Lactobacillus bobalius ), 및 스트렙토코코스(Streptococcus) 속의 그람양성 식중독 세균에 대해 길항력을 가짐을 확인할 수 있었다. 또한, 그람음성 식중독 세균 중 잔토모나스 알빌리니언스(Xanthomonas albilineans)에 대해서도 억제 활성을 보임을 확인할 수 있었다.
Figure pat00003
[ 실시예 4. 스타필로코코스 에피더미디스 ( Staphylococcus epidermidis ) R0002의 길항물질 분리 및 정제]
스타필로코코스 에피더미디스(Staphylococcus epidermidis ) R0002 배양액으로부터 다음 2가지 방법으로 길항물질을 분리 농축하였다.
스타필로코코스 에피더미디스(Staphylococcus epidermidis ) R0002 배양액을 4000 rpm으로 30 분간 원심분리하여 얻어진 배양 상등액을 다음과 같이 단백질을 침전하였다(도 3).
(1) 황산암모늄 침전법
배양 상등액에 황산암모늄을 가하여 40% 농도의 황산암모늄 용액을 만들고 4000 rpm으로 30 분간 원심분리하여 침전된 단백질을 분리한 후, 상등액만을 취해 황산암모늄 용액의 농도가 60%가 되도록 가한 다음, 다시 4000 rpm으로 30 분간 원심분리하여 침전된 단백질을 분리하고, 상등액만을 취해 황산암모늄 용액의 최종 농도가 80%가 되도록 가한 후 원심분리하여 침전 단백질을 회수하였다. 각 농도 단계에서 분리된 단백질 침전물을 20mM Tris-Cl buffer (pH 8.0)에 현탁하고 투석막(cut-off, 1kDa)에 넣어 투석시켜 단백질 침전물 내에 다량 함유된 황산암모늄을 제거하였다.
(2) 소수성 수지 상호작용(hydrophobic resin interaction)
배양 상등액을 XAD-16 흡착 수지(20%)에 28℃, 16시간 동안 흡착시키고, 상등액을 제거하였다. 배양액과 동일 양의 증류수, 30% EtOH를 이용해 비흡착 성분을 세정하였다. 배양액과 동일양의 70% isopropanol을 이용해 용출시키고, 흡착 수지가 제거된 상등액을 회전증발농축기 55℃에서 증발시킨 후, 탈 이온수에 현탁시켰다. 현탁액을 투석막(cut-off, 1kDa)에 넣어 투석시켜 단백질 침전물내에 함유된 염 성분을 제거하였다.
(3) 역상 HPLC
상술한 (1)의 방법으로, 배양 상등액을 60% 농도의 황산암모늄 침전 후, 20mM Sodium phosphate buffer 에 현탁한 현탁물로부터 도 4에 기재한 조건에 따라 역상 HPLC를 실시해 길항물질을 분리하였다.
(4) Tris-tricine SDS-PAGE
정제한 길항물질(박테리오신) 함유 용액 50 μL와 sample buffer 50 μL을 혼합하고 가볍게 원심분리하여 준비하였다. Running gel (1 M Tris-HCl, 30% acrylamide, 0.8% bisacrylamide, 20% SDS, glycerol 0.6g, 10% Ammonium persulfate,TEMED)와 stacking gel (0.25 M Tris-HCl, 30% acrylamide, 1.5% bisacrylamide, 20% SDS, 10% ammonium persulfate, TEMED) 각각을 조제한 후 전기영동 장치에 장착한 다음 전개 완충용액 (abode buffer : 0.2 M Tris, cathode buffer : 100mM Tris, 100mM Tricine, 0.1% SDS)을 붓고, gel의 well에 protein marker와 준비된 시료 20 μL을 loading 한 뒤 80 V의 일정한 전압에서 3시간 전개시켰다. 전기영동 종료 후 영동판으로부터 gel을 분리하여 coomassie brilliant blue R 250으로 2시간 염색하고 나서 2시간 탈색시켰다. 전기영동한 gel을 20% (vol/vol) iso-propanol과10% (vol/vol) glacial acetic acid solution에 담군 후 상온에서 2시간 고정시키고 나서 증류수로 30분마다 교체하면서 2시간 동안 세척하였다. 세척한 gel은 TSA 평판배지 위에 올려 놓고 106 CFU/mL를 5ml soft agar(0.7%)에 섞어 도포한 후 37℃에서 24시간 동안 배양하여 항균 활성을 확인하였다. 그 결과 10kDa의 분자량을 갖는 것으로 확인하였다(도 4).
[ 실시예 5. 스타필로코코스 에피더미디스 ( Staphylococcus epidermidis ) R0002의 길항물질의 분석]
분리 정제된 스타필로코코스 에피더미디스(Staphylococcus epidermidis ) R0002의 길항물질의 다양한 온도 및 pH 조건에서의 안정성을 분석하고, 단백질 분해 효소에의 민감성을 확인하는 실험을 하였다.
그 결과, 도 5에서 확인할 수 있는 바와 같이, 4 - 70℃ 온도에서 활성을 유지하였고, 특히 70℃ 이하의 온도에서 30분 동안 활성을 유지하였고, 25℃ 이하의 온도에서 3일 동안 활성을 유지하였으며, pH 2 - 10에서 활성을 유지하여, 매우 안정성이 우수한 물질임을 확인할 수 있었다. 아울러, 단백질 분해 효소(트립신, 프로나제 E, 펩신, 프로티나제 K)에 대해 민감성을 보여, 해당 물질이 단백질성 물질임을 알 수 있었다.
농업생명공학연구원 KACC92094 20151029

Claims (9)

  1. 다음 중 하나 이상의 특징을 갖는 스타필로코코스 에피더미디스(Staphylococcus epidermidis ) R0002:
    (a) 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)에 대한 항균 활성;
    (b) 그람양성 식중독균에 대한 항균 활성;
    (c) 잔토모나스 알빌리니언스(Xanthomonas albilineans)에 대한 항균 활성; 또는
    (d) Epidermin structural gene (epiA), Pep5 structural gene (pepA), Epicidin 280 structural gene (eciA), Epilancin k7 structural gene (elkA), Aureocin A53 structural gene (aucA), Aureocin A70 structural gene (aurABCD), Nukacin ISK-1 structural gene (nukA), Nukacin ISK-1 modification enzyme gene (nukM), epidermicin NI01 structual gene (edcA), BacCH-91 structural gene (bacCH91), 및 Aureocyclicin 4185 structual gene (aclA) 으로 이루어진 박테리오신 유전자 군 중 어느 유전자도 포함하지 않음.
  2. 제1항에 있어서, 상기 그람양성 식중독균은 바실러스 세레우스(Bacillus cereus ), 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes ), 리스테리아 이바노비(Listeria ivanovii ), 락토바실러스 보발리우스(Lactobacillus bobalius ), 및 스트렙토코코스(Streptococcus) 속으로 이루어진 군에서 하나 이상의 균인 것을 특징으로 하는 스타필로코코스 에피더미디스 R0002.
  3. 제1항에 있어서, 상기 스타필로코코스 에피더미디스 R0002는 기탁번호 KACC 92094P로 기탁된 균주인 것을 특징으로 하는 스타필로코코스 에피더미디스 R0002.
  4. 제1항에 따른 스타필로코코스 에피더미디스 R0002의 배양액에서 얻어지고, 다음 중 하나 이상의 특징을 갖는 정제된 단백질:
    (a) 70°C 이하의 온도에서 안정;
    (b) pH 2 - 10에서 안정; 또는
    (c) SDS-PAGE 특정 분자량 10kDa.
  5. 제1항에 따른 스타필로코코스 에피더미디스 R0002에서 제4항에 따른 단백질을 제조하는 방법:
    (S1) 제1항에 따른 스타필로코코스 에피더미디스 R0002의 배양액으로부터 황산암모늄 침전법 또는 소수성 수지 상호작용에 의해 단백질을 침전시키는 단계;
    (S2) 단백질 침전물을 역상 HPLC 하는 단계; 및
    (S3) SDS-PAGE를 통해 전기영동하는 단계.
  6. 제1항에 따른 스타필로코코스 에피더미디스 R0002, 이의 배양물, 제4항에 따른 단백질, 또는 이들의 혼합물을 유효성분으로 포함하는 항균 조성물.
  7. 제1항에 따른 스타필로코코스 에피더미디스 R0002, 이의 배양물, 제4항에 따른 단백질, 또는 이들의 혼합물을 유효성분으로 포함하는 식품 조성물.
  8. 제1항에 따른 스타필로코코스 에피더미디스 R0002, 이의 배양물, 제4항에 따른 단백질, 또는 이들의 혼합물을 유효성분으로 포함하는 천연 방부제 조성물.
  9. 제1항에 따른 스타필로코코스 에피더미디스 R0002, 이의 배양물, 제4항에 따른 단백질, 또는 이들의 혼합물을 유효성분으로 포함하는 사료 조성물.
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