CN116286543B - 具有良好保湿美白抗炎抗氧化抗衰老功效的表皮葡萄球菌及其应用 - Google Patents

具有良好保湿美白抗炎抗氧化抗衰老功效的表皮葡萄球菌及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于微生物技术领域，涉及一种具有良好保湿美白抗炎抗氧化抗衰老功效的表皮葡萄球菌及其应用。首先自健康皮肤上分离到表皮葡萄球菌H62‑3，其保藏编号为CGMCC No.26640。实验发现，本发明表皮葡萄球菌的发酵代谢产物提高保湿及屏障修复相关基因的表达，促进透明质酸的合成，抑制病原菌生长，降低LPS诱导巨噬细胞产生的炎症反应，对DPPH、ABTS及羟自由基具有良好的清除活性，同时还降低黑素合成相关基因表达，降低酪氨酸酶活性，抑制β‑半乳糖苷酶活性，因此其在护肤品开发方面具有极大应用潜力。

Description

具有良好保湿美白抗炎抗氧化抗衰老功效的表皮葡萄球菌及 其应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种具有良好保湿美白抗炎抗氧化抗衰老功效的表皮葡萄球菌及其应用。
背景技术
皮肤是人体最大的器官，是抵御外来病原体的重要屏障。皮肤表面定植的细菌、真菌和病毒等组成了皮肤微生物组，又称皮肤菌群。近年来的研究表明，正常人的皮肤菌群与宿主相互作用，健康的皮肤菌群对维持皮肤屏障功能至关重要。当皮肤菌群稳态被破坏时，就可能发生皮肤疾病。
广义的皮肤屏障包括共生菌群组成的菌群屏障；角质层和细胞外基质构成的物理屏障；皮脂、汗液等皮肤分泌物和抗菌肽组成的化学屏障；以及由先天免疫和适应性免疫共同组成的免疫屏障。健康皮肤菌群对广义的皮肤屏障具有多方面的保护作用，皮肤菌群通过共生或共生相互作用与哺乳动物宿主细胞相互作用，防止机会性或致病性生物的定植和感染，维持防御和免疫耐受，促进组织修复和屏障功能。在日常生活中，紫外线辐射、化妆品频繁使用、面部过度清洁、不良饮食习惯、熬夜等因素均可导致皮肤微生态失调，从而导致皮肤屏障受损，促进细胞老化。
健康皮肤表面的致病菌和有益菌之间维持着相对的平衡，一旦平衡打破，便可能引起皮肤发炎、瘙痒甚至疾病。比如，当皮脂腺分泌旺盛、皮脂排出障碍时，毛囊中微生物尤其是痤疮丙酸杆菌会大量繁殖，它分泌脂肪酶、蛋白酶和透明质酸酶，破坏组织并引起感染，形成脓包、痤疮，进而影响了个人外观及生活。同时，在健康的皮肤上也存在大量的有益菌。比如，以表皮葡萄球菌为代表的有益菌，可以分泌抗菌肽、分解皮脂生成短链脂肪酸等代谢物，具有抗菌、免疫调节、促进屏障修复等功能。基于表皮葡萄球菌的重要作用，探究表皮葡萄球菌发酵代谢产物的潜在价值，将其应用于化妆品中具有广阔的应用前景。
但是，目前国内外缺乏来自健康人群且具有多重功效的表皮葡萄球菌的筛选报道。
发明内容
为了克服现有技术的缺陷，本发明提供了一种具有良好保湿美白抗炎抗氧化抗衰老功效的表皮葡萄球菌及其应用。
具体地，通过以下几个方面的技术方案实现了本发明：
在第一个方面中，本发明提供了一种表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis）H62-3，所述表皮葡萄球菌的分类命名为表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis），保藏编号为CGMCC No. 26640，保藏时间为2023年02月21日，保藏地点为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏单位地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
本发明首先收集不同年龄阶段健康人面部皮肤菌群，通过培养组学分离出具有功效的表皮葡萄球菌菌株H62-3。该菌株为革兰氏阳性，在TSA平板上菌落为白而小，形成表面光滑不透明的圆形凸起。显微镜下成球状，无鞭毛，不能运动，不产生芽孢。其最适生长温度为32-38℃，在TSB液体培养基中生长迅速，在2h左右进入对数期，12h左右进入稳定期。
在第二个方面中，本发明提供了一种表皮葡萄球菌H62-3的发酵代谢产物，所述发酵代谢产物由上述第一个方面所述的表皮葡萄球菌发酵获得。
作为可选的方式，所述发酵代谢产物具有一种或多种以下作用：提高保湿及屏障修复相关基因的表达、促进透明质酸的合成、抑制金黄色葡萄球菌生长、降低LPS诱导巨噬细胞产生的炎症反应、对DPPH具有良好的清除活性、对ABTS具有良好的清除活性、对羟自由基具有良好的清除活性、降低黑素合成相关基因的表达、降低酪氨酸酶活性或抑制β-半乳糖苷酶的活性。
作为可选的方式，所述发酵代谢产物具有一种或多种以下功效：保湿、美白、抗炎、抗氧化或抗衰老。
具体地，作为可选的方式，所述表皮葡萄球菌H62-3的发酵代谢产物具有在皮肤保湿方面的应用，包括上调角质形成细胞Hacat保湿及屏障修复相关基因的表达，上调角质形成细胞Hacat三种透明质酸合成酶基因的表达，增加斑马鱼尾部面积。在一些实施例中，所述保湿相关基因包括水通道蛋白3（AQP3）相关基因，屏障修复相关基因包括紧密连接蛋白（CLDN1）、丝聚蛋白（FLG）、兜甲蛋白（LOR）、外皮蛋白（IVL）相关基因，透明质酸合成酶包括HAS-1、HAS-2、HAS-3。
具体地，作为可选的方式，所述表皮葡萄球菌H62-3的发酵代谢产物具有在皮肤美白方面的应用，包括下调人黑色素细胞PIG1黑素合成相关基因的表达，抑制人黑色素细胞PIG1酪氨酸酶活性，减弱斑马鱼头部黑色素信号。在一些实施例中，所述黑素合成相关基因包括小眼畸形相关转录因子（MITF）、酪氨酸酶（TYR）、酪氨酸酶相关蛋白1（TRP-1）、酪氨酸酶相关蛋白2（TRP-2）相关基因。
具体地，作为可选的方式，所述表皮葡萄球菌H62-3的发酵代谢产物具有在皮肤抗炎方面的应用，包括抑制病原菌的生长，降低LPS诱导的炎症反应。在一些实施例中，所述病原菌包括金黄色葡萄球菌、溶血葡萄球菌、人葡萄球菌。在一些实施例中，所述降低LPS诱导的炎症反应包括降低LPS引起的巨噬细胞Raw264.7的IL-6、TNF-α、IL-1α、IL-1β的表达以及NO的释放。
具体地，作为可选的方式，所述表皮葡萄球菌H62-3的发酵代谢产物具有在皮肤抗氧化方面的应用，包括对自由基具有良好的清除活性，降低H2O2引起的人角质形成细胞Hacat的ROS表达，减弱斑马鱼卵黄囊ROS荧光强度。在一些实施例中，所述自由基包括DPPH、ABTS及羟自由基。
具体地，作为可选的方式，所述表皮葡萄球菌H62-3的发酵代谢产物具有在皮肤抗衰老方面的应用，包括抑制β-半乳糖苷酶的活性。一些实施例中，所述抑制β-半乳糖苷酶的活性为降低斑马鱼整体β-半乳糖苷酶染色强度。
在第三方面中，本发明提供了上述第二个方面所述的发酵代谢产物的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：将活化后的表皮葡萄球菌菌株H62-3挑取单菌落接种于TSB液体培养基中，置于32-38℃摇床中，震荡培养14-18h，作为种子液；以体积分数为3%-5%的接种量将种子液接种至TSB液体培养基中，32-38℃摇床中震荡培养14-18h，得到发酵液；将发酵液离心，发酵液上清即为发酵代谢产物。
在第四个方面中，本发明提供了上述第二个所述的发酵代谢产物在制备护肤产品方面的用途。
作为可选的方式，在上述用途中，所述护肤产品具有一种或多种以下作用：提高保湿及屏障修复相关基因的表达，促进透明质酸的合成，抑制金黄色葡萄球菌生长，降低LPS诱导巨噬细胞产生的炎症反应，对DPPH、ABTS和羟自由基具有良好的清除活性，降低黑素合成相关基因的表达，降低酪氨酸酶活性和抑制β-半乳糖苷酶的活性。
作为可选的方式，在上述用途中，所述护肤产品具有一种或多种以下功效：保湿、美白、抗炎、抗氧化和抗衰老。
优选地，所述护肤产品可用于预防或改善无规律色素过度沉着。
更优选地，所述无规律色素过度沉着是老年斑、雀斑、黑斑、黄褐斑、晒斑或蝴蝶斑中的一种或多种。
作为可选的方式，在上述用途中，所述护肤产品为爽肤水、乳液、精华、霜、膏、面膜或冻干粉。
作为可选的方式，在上述用途中，所述发酵代谢产物在所述护肤产品中的添加量以重量百分比计为0.5%-10%。
化妆品领域的技术人员能够根据实际需要在不同的化妆品（例如，但不限于爽肤水、乳液、精华、霜、膏或面膜）中添加表皮葡萄球菌H62-3的发酵代谢产物。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
（1）本发明提供了一株来源于健康人面部的表皮葡萄球菌H62-3，经细菌全基因组鉴定和ANI、SNP、InDel分析发现，表皮葡萄球菌H62-3与表皮葡萄球菌模式菌株CGMCC1.4260相比具有众多碱基发生突变、增加或缺失，从而导致蛋白的改变，进而影响其生物学功能。
（2）经过试验证明，表皮葡萄球菌H62-3具有较好的保湿功效。表皮葡萄球菌H62-3可以上调角质形成细胞Hacat保湿及屏障修复相关基因的表达，上调三种透明质酸合成酶基因的表达，增加斑马鱼尾部面积，该菌株在保湿护肤品开发方面具有良好的应用前景。
（3）经过试验证明，表皮葡萄球菌H62-3具有较好的美白功效。表皮葡萄球菌H62-3可以下调人黑色素细胞PIG1黑素合成相关基因的表达，抑制人黑色素细胞PIG1酪氨酸酶活性，减弱斑马鱼头部黑色素信号。填补了表皮葡萄球菌在美白功效筛选中的空白，该菌株在美白护肤品开发方面具有良好的应用前景。
（4）经过试验证明，表皮葡萄球菌H62-3具有较好的抗炎功效。表皮葡萄球菌H62-3可以抑制病原菌的生长，降低LPS诱导的炎症反应。该菌株在对抗炎症因子对皮肤损伤及抗炎护肤品开发方面具有良好的应用前景。
（5）经过试验证明，表皮葡萄球菌H62-3具有较好的抗氧化功效。表皮葡萄球菌H62-3对自由基具有良好的清除活性，可以降低H2O2引起的人角质形成细胞Hacat的ROS表达，减弱斑马鱼卵黄囊ROS荧光强度，从不同的实验证实该菌株的抗氧化能力，其在抗氧化护肤品开发方面具有良好的应用前景。
（6）经过试验证明，表皮葡萄球菌H62-3具有较好的抗衰老功效。表皮葡萄球菌H62-3可以改善斑马鱼衰老模型，发挥抗衰老功效。该菌株在抗衰老护肤品开发方面具有良好的应用前景。
（7）经过试验证明，表皮葡萄球菌H62-3在TSB液体培养基中生长迅速，在2h左右进入对数期，12h左右进入稳定期，便于后期大规模生产应用。
附图说明
图1为表皮葡萄球菌H62-3的菌落形态。
图2为表皮葡萄球菌H62-3的革兰氏染色。
图3为表皮葡萄球菌H62-3的生长曲线。
图4为表皮葡萄球菌H62-3的ANI分析结果。
图5为表皮葡萄球菌H62-3上调保湿及屏障修复相关基因表达。
其中，图5A为保湿相关基因水通道蛋白3（AQP3）基因的表达，图5B为紧密连接蛋白（CLDN1）基因的表达，图5C为丝聚蛋白（FLG）基因的表达，图5D为兜甲蛋白（LOR）基因的表达，图5E为外皮蛋白（IVL）基因的表达。与TSB对照组比较，采用SPSS 26.0软件对实验结果进行统计分析，组间两两比较采用t检验，p<0.05表明差异具有统计学意义，统计学处理结果采用平均值±SE表示。
图6为表皮葡萄球菌H62-3分泌透明质酸和上调透明质酸合成酶基因表达。其中，图6A为透明质酸的含量，图6B为透明质酸合成酶1（HAS-1）基因的表达，图6C为透明质酸合成酶2（HAS-2）基因的表达，图6D为透明质酸合成酶3（HAS-3）基因的表达。与TSB对照组比较，采用SPSS 26.0软件对实验结果进行统计分析，组间两两比较采用t检验，p<0.05表明差异具有统计学意义，统计学处理结果采用平均值±SE表示。
图7为表皮葡萄球菌H62-3对斑马鱼保湿功效评价。其中，图7A为样品处理后斑马鱼尾部面积典型图，虚线框内为分析区域；图7B为样品处理后斑马鱼尾部面积，与模型对照组比较，采用SPSS 26.0软件进行统计学分析，p<0.05表明差异具有统计学意义，统计学处理结果采用平均值±SE表示。
图8为表皮葡萄球菌H62-3下调黑素合成相关基因表达及抑制酪氨酸酶活性。其中，图8A为黑素合成相关基因小眼畸形相关转录因子（MITF）基因的表达，图8B为酪氨酸酶（TYR）基因的表达，图8C为酪氨酸酶相关蛋白1（TRP-1）基因的表达，图8D为酪氨酸酶相关蛋白2（TRP-2）基因的表达，图8E为酪氨酸酶活性。与TSB对照组比较，采用SPSS 26.0软件对实验结果进行统计分析，组间两两比较采用t检验，p<0.05表明差异具有统计学意义，统计学处理结果采用平均值±SE表示。
图9为表皮葡萄球菌H62-3对斑马鱼美白功效评价。其中，图9A为样品处理后斑马鱼头部黑色素信号强度典型图，虚线框内为分析区域；图9B为样品处理后斑马鱼头部黑色素信号强度，与正常对照组比较，采用SPSS 26.0软件进行统计学分析，p<0.05表明差异具有统计学意义统计学处理结果采用平均值±SE表示。
图10为表皮葡萄球菌H62-3抑制病原菌生长。其中，图10A为样品处理后抑菌圈典型图，图10B为样品处理后对金黄色葡萄球菌、溶血葡萄球菌、人葡萄球菌生长的抑制率。
图11为表皮葡萄球菌H62-3降低LPS诱导的炎症因子表达及NO释放。其中，图11A为IL-1α基因的表达，图11B为IL-1β基因的表达，图11C为IL-6基因的表达，图11D为TNF-α基因的表达，图11E为IL-6蛋白的含量，图11F为TNF-α蛋白的含量，图11G为NO释放量。每个实验组与Control-TSB对照组比较，获得统计学分析数值。此外，LPS-CGMCC 1.4260和LPS-H62-3实验组分别再与LPS-TSB组进行统计学分析，p<0.05表明差异具有统计学意义，结果采用平均值±SE表示。
图12为表皮葡萄球菌H62-3清除自由基能力。其中，图12A为DPPH自由基清除率，图12B为ABTS自由基清除率，图12C为羟自由基清除率。与TSB对照组比较，采用SPSS 26.0软件对实验结果进行统计分析，组间两两比较采用t检验，p<0.05表明差异具有统计学意义，统计学处理结果采用平均值±SE表示。
图13为表皮葡萄球菌H62-3减少ROS表达。
图14为表皮葡萄球菌H62-3对斑马鱼抗氧化功效评价。其中，图14A为样品处理后斑马鱼卵黄囊荧光强度典型图；图14B为样品处理后斑马鱼卵黄囊荧光强度，与模型对照组比较，采用SPSS 26.0软件进行统计学分析，p<0.05表明差异具有统计学意义统计学处理结果采用平均值±SE表示。
图15为表皮葡萄球菌H62-3对斑马鱼抗衰老功效评价。其中，图15A为样品处理后斑马鱼β-半乳糖苷酶染色强度典型图；图15B为样品处理后斑马鱼β-半乳糖苷酶染色强度，与模型对照组比较，采用SPSS 26.0软件进行统计学分析，p<0.05表明差异具有统计学意义统计学处理结果采用平均值±SE表示。
具体实施方式
下面参照具体的实施例对本发明做进一步说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用于解释本发明，并不用于限定本发明的范围。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道购买得到的常规产品。
下面实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为市售产品。
以下实施例中所用的菌种培养基如下：
胰蛋白胨大豆肉汤液体培养基（TSB）：胰蛋白胨17.0 g/L，大豆蛋白胨3.0 g/L，氯化钠5.0 g/L，磷酸氢二钾2.5 g/L，葡萄糖2.5 g/L，121℃高压灭菌15 min，备用。
胰蛋白胨大豆肉汤固体培养基（TSA）：胰蛋白胨17.0 g/L，大豆蛋白胨3.0 g/L，氯化钠5.0 g/L，磷酸氢二钾2.5 g/L，葡萄糖2.5 g/L，琼脂粉15 g/L，121℃高压灭菌15 min，倒平板，备用。
另外，效果实验部分所涉及的附图和表中的H62即为表皮葡萄球菌H62-3。
实施例1、表皮葡萄球菌H62-3的分离、筛选与纯化
（1）样本采集
招募不同年龄阶段（18-90岁）面部皮肤健康的志愿者，要求其无痤疮、脓疱、无炎症、无红斑等情况，近2个月内未口服抗生素制剂且近2周内未外用抗生素制剂。取样12h内未清洁\清洗面部。
取样者带口罩和一次性无菌手套。用无菌生理盐水浸润无菌采样棉拭子，以棉拭子为2 cm，取样处划4 cm长度，来回擦拭50次，时间约30秒，面积约为8 cm2。擦拭完成后，将棉拭子放入甘油保藏管内，盖子盖紧密封，记录编号。
（2）皮肤菌群培养、分离、纯化、保藏
取甘油保藏液0.05 mL加入0.15 mL无菌水稀释，将上述稀释液涂布于TSA固体平板中，置于37℃恒温培养箱中倒置培养24h。根据表皮葡萄球菌的菌落特征，挑取单菌落四区划线分离，置于37℃恒温培养箱中倒置培养24h。进行16S rRNA测序，确定为表皮葡萄球菌的单菌落用甘油保藏于-80℃。
（3）功能菌筛选
提取不同株表皮葡萄球菌的细菌全基因组RNA，进行反转录为cDNA，进行qRT-PCR实验，筛选出高表达与保湿功效密切相关基因的表皮葡萄球菌株H62-3。
实施例2、表皮葡萄球菌H62-3的微生物学鉴定
（1）菌落特征
该菌株在TSA平板上的菌落形态如图1所示，菌落为白而小，形成表面光滑不透明的圆形凸起，无溶血圈。革兰氏染色阳性，如图2所示。菌体呈球形，有的成葡萄状排列，有的单个排列，无鞭毛，不产生芽孢。
（2）培养学特征
该菌株的最适生长温度为32-38℃，最适pH为5.0-8.0。将活化后的菌株挑取单菌落接种于TSB液体培养基中，置于32-38℃摇床中，震荡培养14-18h，作为种子液；以体积分数为3%-5%的接种量将种子液接种至TSB液体培养基中，37℃摇床中震荡培养24h，每隔1h在600 nm处测定培养液的OD值，并以OD600为纵作轴，时间为横作轴，绘制菌株的生长曲线，如图3所示，可以发现表皮葡萄球菌H62-3在TSB液体培养基中生长迅速，2h左右进入对数期，12h左右进入稳定期。
（3）遗传学特征
提取菌株H62-3的基因组DNA，采用Illumina Hiseq 2000测序平台对样本测序得到二代数据，PacBio测序得到三代数据，质控后进行Denovo组装，拼接矫正为完整基因组之后进行基因预测，预测的基因蛋白比对到各数据库如NR库，获得菌种的物种信息，如表1所示，可以确定菌株H62为表皮葡萄球菌。
表1：表皮葡萄球菌H62-3的序列比对结果
依据上述的菌落、培养学、遗传学等特征，确定菌株H62-3为表皮葡萄球菌。由于表皮葡萄球菌H62-3与表皮葡萄球菌模式菌株CGMCC 1.4260的ANI为97.1%，如图4所示，可以确定两者不是同一株菌。经单核苷酸多样性（SNP）和插入和缺失（InDel）分析发现，表皮葡萄球菌H62-3有众多碱基发生突变、增加或缺失，从而导致蛋白的改变，影响其生物学功能。表皮葡萄球菌H62-3的表皮葡萄球菌的分类命名为表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis），保藏编号为CGMCC No. 26640，保藏时间为2023年02月21日，保藏地点为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏单位地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
实施例3、表皮葡萄球菌H62-3上调角质形成细胞Hacat保湿及屏障修复相关基因表达实验
将角质形成细胞Hacat以4.0x105个细胞/mL的密度接种至6孔板中，静置培养24h，待细胞充分贴壁。将表皮葡萄球菌H62-3和表皮葡萄球菌模式菌株CGMCC 1.4260培养至15h，使其处于稳定期，使用1x108cfu/mL的发酵代谢产物处理Hacat 24h，对照组加入相同体积TSB液体培养基。提取各组细胞的RNA，将其反转录成cDNA，然后进行qPCR，检测保湿相关基因和屏障修复相关基因的表达。
结果显示，表皮葡萄球菌H62-3的发酵代谢产物处理Hacat后，保湿相关基因水通道蛋白3（AQP3）上调了7.59倍，而表皮葡萄球菌模式菌株CGMCC 1.4260处理组仅上调了1.24倍，如图5A所示，表明H62-3的发酵代谢产物具有保湿功效。
此外，表皮葡萄球菌H62-3的发酵代谢产物处理Hacat后，屏障修复相关基因，包括紧密连接蛋白（CLDN1）、丝聚蛋白（FLG）、兜甲蛋白（LOR）、外皮蛋白（IVL）相关基因，分别上调了4.02、3.99、8.24、3.20倍，如图5B-图5E所示，表明其具有促进皮肤屏障修复的作用，表皮葡萄球菌模式菌株CGMCC 1.4260的发酵代谢产物不具有该作用。
实施例4、表皮葡萄球菌H62-3可以分泌透明质酸，并上调角质形成细胞Hacat透明质酸合成酶基因表达实验
将表皮葡萄球菌H62-3和表皮葡萄球菌模式菌株CGMCC 1.4260培养至15h，使其处于稳定期，离心获得发酵代谢产物，根据透明质酸ELISA试剂盒（Solarbio，SEKH-0509）说明书进行发酵代谢产物中透明质酸含量检测。
结果显示，表皮葡萄球菌H62-3发酵代谢产物中透明质含量为74.59 ng/mL，而表皮葡萄球菌模式菌株CGMCC 1.4260发酵代谢产物中透明质含量为16.70 ng/mL，如图6A所示，表明表皮葡萄球菌H62-3与模式菌株相比可以分泌更多的透明质酸。
将角质形成细胞Hacat以4.0x105个细胞/mL的密度接种至6孔板中，静置培养24h，待细胞充分贴壁。将表皮葡萄球菌H62-3和表皮葡萄球菌模式菌株CGMCC 1.4260培养至15h，使其处于稳定期，使用1x108cfu/mL的发酵代谢产物处理Hacat 24h，对照组加入相同体积TSB液体培养基。提取各组细胞的RNA，将其反转录成cDNA，然后进行qPCR，检测三种透明质酸合成酶基因的表达。
结果显示，表皮葡萄球菌H62-3的发酵代谢产物处理Hacat后，透明质酸合成酶1（HAS-1）上调了1.93倍，透明质酸合成酶2（HAS-2）上调了2.87倍，透明质酸合成酶3（HAS-3）上调了2.83倍，而表皮葡萄球菌模式菌株CGMCC 1.4260处理组仅分别上调了1.04、1.30、1.39倍，如图6B-图6D所示，表明H62-3的发酵代谢产物可以促进角质形成细胞Hacat透明质酸合成酶基因的表达，从而发挥保湿功效。
实施例5、表皮葡萄球菌H62-3对斑马鱼缺水模型具有保湿功效实验
随机选取年龄为2 dpf（days post fertilization）黑色素等位基因突变型半透明Albino品系斑马鱼于6孔板中，每孔（实验组）均处理30尾斑马鱼。水溶给予TSB、CGMCC1.4260发酵代谢产物、H62-3发酵代谢产物，阳性对照高分子透明质酸钠0.05%浓度，同时设置正常对照组和模型对照组，每孔容量为3 mL。除正常对照组外，其余各实验组均水溶给予氯化钠建立斑马鱼缺水模型。28℃处理22 h后，每个实验组随机选取10尾斑马鱼置于解剖显微镜下拍照，用NIS-Elements D 3.20高级图像处理软件采集数据，分析斑马鱼尾部面积（S），以该指标的统计学分析结果评价样品保湿功效。统计学处理结果采用平均值±SE表示。用SPSS 26.0软件进行统计学分析，p<0.05表明差异具有统计学意义。
保湿功效计算公式如下：
结果如图7A-图7B以及表2所示，虚线区域为尾部面积，正常对照组斑马鱼尾部皮肤光滑，面积正常，而模型对照组斑马鱼尾部发生皱缩出现上翘，与正常对照组（192125±2408像素）相比，模型对照组斑马鱼尾部面积（176205±1332像素）显著减少（p<0.001），表明本次斑马鱼缺水模型建立成功。与模型对照组相比，TSB组、CGMCC 1.4260发酵代谢产物组、H62-3发酵代谢产物组斑马鱼尾部光滑无皱缩，表明TSB、CGMCC 1.4260发酵代谢产物、H62-3发酵代谢产物均可减轻斑马鱼尾部失水皱缩。同时TSB组、CGMCC 1.4260发酵代谢产物组、H62-3发酵代谢产物组斑马鱼尾部面积分别为181472±1524像素、183170±1736像素和183280±1411像素，与模型对照组（176205±1332像素）相比均明显差异（p<0.01）。再者，TSB、CGMCC 1.4260发酵代谢产物、H62-3发酵代谢产物保湿功效分别为33%、44%、44%，结果表明TSB、CGMCC 1.4260发酵代谢产物、H62-3发酵代谢产物均具有保湿功效，CGMCC 1.4260发酵代谢产物和H62-3发酵代谢产物的保湿功效更佳。
表2：样品保湿功效评价实验结果（n=10）
实施例6、表皮葡萄球菌H62-3下调人黑色素细胞PIG1黑素合成相关基因表达，并抑制酪氨酸酶活性实验
将人黑色素细胞PIG1以4.0x105个细胞/mL的密度接种至6孔板中，静置培养24h，待细胞充分贴壁。将表皮葡萄球菌H62-3和表皮葡萄球菌模式菌株CGMCC 1.4260培养至15h，使其处于稳定期，使用1x108cfu/mL的发酵代谢产物处理PIG1 24h，对照组加入相同体积TSB液体培养基。提取各组细胞的RNA，将其反转录成cDNA，然后进行qPCR，检测黑素合成相关基因的表达。
结果显示，相较于TSB处理组，表皮葡萄球菌H62-3的发酵代谢产物处理细胞后，黑素合成相关基因小眼畸形相关转录因子（MITF）、酪氨酸酶（TYR）、酪氨酸酶相关蛋白1（TRP-1）、酪氨酸酶相关蛋白2（TRP-2）分别下调了45%、47%、58%和57%，而表皮葡萄球菌模式菌株CGMCC 1.4260处理细胞后相关基因仅减少了17%、8%、1%和4%，如图8A-图8D所示，表明H62-3的发酵代谢产物可以降低黑素合成相关基因的表达，从而具有美白功效的潜力。
按照如上方法用TSB、表皮葡萄球菌H62-3发酵代谢产物和表皮葡萄球菌模式菌株CGMCC 1.4260代谢产物处理PIG1 24h后收集细胞，按照酪氨酸酶活性检测试剂盒（Solarbio，BC4055）说明书进行酪氨酸酶活性检测。
结果显示，TSB处理组酪氨酸酶活性为60.60 U/mg prot，而表皮葡萄球菌H62-3发酵代谢产物处理组酪氨酸酶活性为43.72 U/mg prot，表皮葡萄球菌模式菌株CGMCC1.4260发酵代谢产物处理组酪氨酸酶活性为52.74 U/mg prot，如图8E所示，表明表皮葡萄球菌H62-3发酵代谢产物可以显著抑制酪氨酸酶活性，从而发挥美白的功效。
实施例7、表皮葡萄球菌H62-3减少斑马鱼黑色素信号，发挥美白功效实验
随机选取6 hpf（hours post fertilization）野生型AB品系斑马鱼于6孔板中，每孔（实验组）均处理30尾斑马鱼。水溶给予TSB、CGMCC 1.4260发酵代谢产物、H62-3发酵代谢产物，阳性对照熊果苷0.5%体积浓度，同时设置正常对照组，每孔容量为3 mL。28℃处理45h后，每个实验组随机选取10尾斑马鱼置于解剖显微镜下拍照，用Image J高级图像处理软件采集数据，分析斑马鱼头部黑色素信号强度（S），以该指标的统计学分析结果评价样品美白功效。统计学处理结果采用平均值±SE表示。用SPSS 26.0软件进行统计学分析，p<0.05表明差异具有统计学意义。美白功效计算公式如下：
结果如图9A-9B以及表3所示，虚线区域为分析区域，正常对照组斑马鱼头部可见大量黑色斑点（69421±2015像素），而阳性对照熊果苷处理组斑马鱼头部仅见少量黑色素（1670±251像素），TSB组、CGMCC 1.4260发酵代谢产物组、H62-3发酵代谢产物组斑马鱼头部黑色素信号强度分别为58431±2219像素、46710±2262像素和38281±2338像素，计算可得熊果苷、TSB、CGMCC 1.4260发酵代谢产物、H62-3发酵代谢产物美白功效分别为98%、16%、33%和45%，由此表明CGMCC 1.4260发酵代谢产物、H62-3发酵代谢产物均具有美白功效，H62-3发酵代谢产物美白功效更佳，TSB不具有美白功效。
表3：样品美白功效评价实验结果（n=10）
实施例8、表皮葡萄球菌H62-3抑制病原菌生长实验
将金黄色葡萄球菌、溶血葡萄球菌和人葡萄球菌接种于TSB液体培养基中，过夜培养。将OD值调至1，然后用无菌棉签蘸取稀释后的菌液，涂布TSA固体培养基。将表皮葡萄球菌H62-3和表皮葡萄球菌模式菌株CGMCC 1.4260培养至15h，使其处于稳定期。将OD值调至1，离心获得发酵代谢产物。在已涂布病原菌的平板中心放置6 mm无菌滤纸片1张，分别向滤纸片中央滴加5μL H62-3或CGMCC 1.4260发酵代谢产物，置于微生物培养箱中培养24h，观察是否有抑菌圈生成。
结果表明，在三种病原菌的平板中加入表皮葡萄球菌H62-3发酵代谢产物后均有抑菌圈产生，而加入表皮葡萄球菌模式菌株CGMCC 1.4260发酵代谢产物组并未形成抑菌圈，如图10A所示，表明H62-3发酵代谢产物可以抑制一部分病原菌的生长。
将金黄色葡萄球菌、溶血葡萄球菌和人葡萄球菌接种于TSB液体培养基中，过夜培养，调整病原菌菌液浓度为1x108 cfu/mL。将表皮葡萄球菌H62-3和表皮葡萄球菌模式菌株CGMCC 1.4260培养至15h，使其处于稳定期，调整其菌液浓度为5x108 cfu/mL，离心，上清即为发酵代谢产物。分别将发酵代谢产物以10%体积分数加入到不同的病原菌中，37℃，200rpm，培养2h，测定OD600。以加入10%体积分数TSB为对照，以菌液浓度OD600降低百分比评价对病原菌生长的影响。
结果表明，表皮葡萄球菌H62-3发酵代谢产物对金黄色葡萄球菌、溶血葡萄球菌和人葡萄球菌的生长均具有抑制作用，抑制率分别为24.83%、19.03%和11.77%，而表皮葡萄球菌模式菌株CGMCC 1.4260发酵代谢产物处理组抑制率仅有4.23%、1.2%和1.27%，如图10B所示，表明H62-3发酵代谢产物可以发挥抑制病原菌生长的作用。
实施例9、表皮葡萄球菌H62-3降低LPS诱导的炎症反应实验
将巨噬细胞Raw264.7以1.0x106个细胞/mL的密度接种至6孔板中，静置培养20h，待细胞充分贴壁。将表皮葡萄球菌H62-3和表皮葡萄球菌模式菌株CGMCC 1.4260培养至15h，使其处于稳定期，使用1x108cfu/mL的发酵代谢产物处理Raw264.74h，对照组加入相同体积TSB液体培养基。细胞贴壁24h后，加入1 μg/mL的LPS，对照组加入相同体积1xPBS，继续培养24h。48h后，分别收集各组的细胞沉淀和培养基上清。
提取各组细胞沉淀的RNA，将其反转录成cDNA，然后进行qPCR，检测IL-1α、IL-1β、IL-6和TNF-α的表达。结果显示，LPS处理组上述炎症因子表达水平均显著提升，表明炎症模型诱导成功。H62-3发酵代谢产物处理可以挽救由于LPS诱导的炎症反应，与对照组相比，H62-3发酵代谢产物处理组IL-1α、IL-1β、IL-6和TNF-α分别下调了54%、72%、63%和82%，如图11A-图11D所示，表明H62-3发酵代谢产物可以降低LPS诱导的炎症反应。
收集各组的培养基上清并离心，根据NO ELISA试剂盒（abcam，ab65328）、IL-6ELISA试剂盒（MULTI SCIENCES，EK206/3）和TNF-α ELISA试剂盒（MULTI SCIENCES，EK282/4）说明书进行发酵代谢产物中NO、IL-6和TNF-α含量检测。结果显示，LPS处理组培养基中IL-6和TNF-α显著上升，NO释放量也上升，进一步证明炎症模型诱导成功。此外，H62-3发酵代谢产物处理可以挽救由于LPS诱导的炎症反应，与对照组相比，H62-3发酵代谢产物处理组培养基中IL-6和TNF-α分别下调了82%和25%，NO释放量下调了42%，如图11E-图11G所示，进一步证实H62-3发酵代谢产物可以降低LPS诱导的炎症反应。
实施例10、表皮葡萄球菌H62-3清除自由基活性实验
将表皮葡萄球菌H62-3和表皮葡萄球菌模式菌株CGMCC 1.4260培养至15h，使其处于稳定期。将OD值调至2，离心获得发酵代谢产物。根据ABTS自由基清除能力检测试剂盒（Solarbio，BC4775）、DPPH自由基清除能力检测试剂盒（Solarbio，BC4755）和羟自由基清除能力检测试剂盒（Solarbio，BC1325）检测以上三种自由基的清除能力。
结果显示，表皮葡萄球菌H62-3和表皮葡萄球菌模式菌株CGMCC 1.4260的发酵代谢产物均具有DPPH、ABTS和羟自由基清除能力，H62-3发酵代谢产物对DPPH、ABTS和羟自由基的清除率分别为97.97%、25.02%和90.15%，而CGMCC 1.4260发酵代谢产物对DPPH、ABTS和羟自由基的清除率仅有24.13%、10.83%和17.85%，如图12A-图12C所示，表明H62-3发酵代谢产物具有较好的自由基清除能力，从而具有抗氧化能力。
实施例11、表皮葡萄球菌H62-3保护Hacat细胞抵抗氧化应激，发挥抗氧化作用实验
将角质形成细胞Hacat以4.0x105个细胞/mL的密度接种至6孔板中，静置培养3-4h，待细胞部分贴壁时加入表皮葡萄球菌H62-3和表皮葡萄球菌模式菌株CGMCC 1.4260稳定期的发酵代谢产物（1x108cfu/mL），对照组加入相同体积TSB液体培养基。24h后弃去原有培养基，加入新鲜配制的900 μmol/L H2O2溶液2 mL构建氧化应激细胞模型，处理细胞3h后按照活性氧检测试剂盒（Solarbio，CA1410）说明书进行活性氧检测。
结果显示，较TSB处理组，表皮葡萄球菌H62-3发酵代谢产物处理Hacat细胞后ROS荧光强度显著减弱，表皮葡萄球菌模式菌株CGMCC 1.4260组细胞荧光强度稍有降低。如图13所示，表明表皮葡萄球菌H62-3发酵代谢产物具有较好的保护角质形成细胞Hacat避免氧化应激，从而发挥抗氧化作用。
实施例12、斑马鱼氧化应激模型佐证表皮葡萄球菌H62-3具有一定抗氧化功效实验
随机选取2 dpf黑色素等位基因突变型半透明Albino品系斑马鱼于6孔板中，每孔（实验组）均处理30尾斑马鱼。水溶给予TSB、CGMCC 1.4260发酵代谢产物、H62-3发酵代谢产物，阳性对照N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC） 0.012%体积浓度，同时设置正常对照组和模型对照组，每孔容量为3 mL。除正常对照组外，其余各实验组均水溶给予甲萘醌建立斑马鱼氧化应激模型。28℃处理22 h后，将斑马鱼转移至24孔板中，用特异性ROS荧光试剂进行染色，染色结束后，每个实验组随机选取10尾斑马鱼置于荧光显微镜下拍照，用NIS-Elements D 3.20高级图像处理软件采集数据，分析斑马鱼卵黄囊荧光强度（S），以该指标的统计学分析结果评价样品抗氧化功效。统计学处理结果采用平均值±SE表示。用SPSS 26.0软件进行统计学分析，p<0.05表明差异具有统计学意义。抗氧化功效计算公式如下：
结果如图14A-图14B以及表4所示，正常对照组斑马鱼卵黄囊发育正常，色素无明显异常，染色后荧光强度弱（497182±5028像素）；模型对照组斑马鱼色素沉着明显，染色后荧光强度较正常对照组明显增强（1146183±14543像素）；阳性对照NAC组斑马鱼色素沉着减少，染色后荧光强度较模型对照组明显减少（577222±8910像素）。相较于模型对照组，TSB组、CGMCC 1.4260发酵代谢产物组、H62-3发酵代谢产物组斑马鱼色素沉着稍减少，染色后荧光强度稍弱，其卵黄囊荧光强度分别为1058724±26617像素、1060966±17037像素和1059198±12320像素。计算可得NAC、TSB、CGMCC 1.4260发酵代谢产物、H62-3发酵代谢产物抗氧化功效分别为88%、13%、13%和13%，由此表明TSB、CGMCC 1.4260发酵代谢产物、H62-3发酵代谢产物均具有一定抗衰老功效。
表4：样品抗氧化功效评价实验结果（n=10）
实施例13、表皮葡萄球菌H62-3改善斑马鱼衰老模型，发挥抗衰老功效实验
随机选取6 hpf野生型AB品系斑马鱼于6孔板中，每孔均处理30尾斑马鱼，水溶给予TSB、CGMCC 1.4260发酵代谢产物、H62-3发酵代谢产物，阳性对照过氧化氢酶0.2%体积浓度，同时设置正常对照组和模型对照组，每孔容量为3 mL。除正常对照组外，其余各组均水溶给予过氧化氢建立斑马鱼衰老模型，期间每天换液。28℃处理5 天后，将各实验组斑马鱼用细胞衰老β-半乳糖苷酶染色试剂盒进行染色，染色结束后，每个实验组随机选取10尾斑马鱼在解剖显微镜下拍照，用NIS-Elements D 3.20高级图像处理软件采集数据，分析斑马鱼体内β-半乳糖苷酶染色强度（S），以该指标的统计学分析结果评价样品抑制β-半乳糖苷酶活性功效。统计学处理结果用平均值±SE表示。用SPSS 26.0软件进行统计学分析，p<0.05表明差异具有统计学意义。抗衰老功效计算公式如下：
结果如图15A-图15B以及表5所示，正常对照组斑马鱼发育正常，染色后整体颜色浅（0.235±0.002像素）；模型对照组斑马鱼发育略微延迟，染色后整体颜色较正常对照组深（0.288±0.004像素）；阳性对照过氧化氢酶组斑马鱼发育略微延迟，染色后整体颜色较模型对照组浅（0.254±0.003像素）。相较于模型对照组，TSB组斑马鱼无明显差异（0.280±0.003像素）；CGMCC 1.4260发酵代谢产物组、H62-3发酵代谢产物组斑马鱼染色后整体颜色更浅，其β-半乳糖苷酶卵黄囊荧光强度分别为0.273±0.004像素、0.260±0.003像素。计算可得过氧化氢酶、TSB、CGMCC 1.4260发酵代谢产物、H62-3发酵代谢产物抗衰老功效分别为64%、15%、28%和53%，由此表明CGMCC 1.4260和H62-3发酵代谢产物均具有一定的抗衰老功效，H62-3发酵代谢产物的抗衰老功效尤其显著，而TSB不具有抗衰老功效。
表5：样品抗衰老功效评价实验结果（n=10）
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

Claims (10)

1.一种表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis）H62-3，其特征在于：所述表皮葡萄球菌的分类命名为表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis），保藏编号为CGMCCNo. 26640，保藏时间为2023年02月21日，保藏地点为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏单位地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
2.一种表皮葡萄球菌H62-3的发酵液上清，其特征在于：所述发酵液上清由权利要求1所述的表皮葡萄球菌发酵获得。
3.根据权利要求2所述的发酵液上清，其特征在于：所述发酵液上清具有一种或多种以下作用：提高保湿及屏障修复相关基因的表达，促进透明质酸的合成，抑制金黄色葡萄球菌生长，降低LPS诱导巨噬细胞产生的炎症反应，对DPPH、ABTS和羟自由基具有良好的清除活性，降低黑素合成相关基因的表达，降低酪氨酸酶活性和抑制β-半乳糖苷酶的活性。
4.根据权利要求2所述的发酵液上清，其特征在于：所述发酵液上清具有一种或多种以下功效：保湿、美白、抗炎、抗氧化和抗衰老。
5.权利要求2至4中任一项所述的发酵液上清的制备方法，其特征在于：所述制备方法包括以下步骤：
将活化后的表皮葡萄球菌菌株H62-3挑取单菌落接种于TSB液体培养基中，置于32-38℃摇床中，震荡培养14-18h，作为种子液；以体积分数为3%-5%的接种量将种子液接种至TSB液体培养基中，32-38℃摇床中震荡培养14-18h，得到发酵液；将发酵液离心，即得发酵液上清。
6.权利要求2至4中任一项所述的发酵液上清在制备护肤产品方面的用途。
7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于：所述护肤产品具有一种或多种以下作用：提高保湿及屏障修复相关基因的表达，促进透明质酸的合成，抑制金黄色葡萄球菌生长，降低LPS诱导巨噬细胞产生的炎症反应，对DPPH、ABTS和羟自由基具有良好的清除活性，降低黑素合成相关基因的表达，降低酪氨酸酶活性和抑制β-半乳糖苷酶的活性。
8.根据权利要求6所述的用途，其特征在于：所述护肤产品具有一种或多种以下功效：保湿、美白、抗炎、抗氧化和抗衰老。
9.根据权利要求6所述的用途，其特征在于：所述护肤产品为爽肤水、乳液、精华、霜、膏、面膜或冻干粉。
10.根据权利要求6所述的用途，其特征在于：所述发酵液上清在所述护肤产品中的添加量以重量百分比计为0.5%-10%。
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