KR101998067B1

KR101998067B1 - 비피도박테리움 속 gfc-b09 균주 및 이를 이용하여 제조된 발효물

Info

Publication number: KR101998067B1
Application number: KR1020190036785A
Authority: KR
Inventors: 강희철; 차미연; 정연선; 허정란; 안미
Original assignee: (주)지에프씨생명과학
Priority date: 2019-03-29
Filing date: 2019-03-29
Publication date: 2019-09-27
Also published as: US20230193196A1; CN111826300B; CN111826300A; US20200308662A1

Abstract

본 발명은 비피도박테리움 속 GFC-B09 균주, 이를 이용하여 제조된 발효물에 관한 것이다.
본 발명으로부터 제공되는 신규한 비피도박테리움 속 GFC-B09 균주(Bifidobacterium sp. GFC-B09) 균주(기탁번호: KCCM 12263P) 배양액의 피부-마이크로바이옴(skin-microbiome) 변화유도(S. epidermidis 증대), 히스타민 분해효소능 증대, 알러지 저해효과, DNA 회복능, 주름 개선, 미백, 피부 치밀도 및 피부 탄력 개선 효과가 우수하기 때문에, 이를 유효 성분으로 화장료 베이스에 적용하였을 때 화장료 조성물로서의 효과가 우수하다.

Description

비피도박테리움 속 GFC-B09 균주 및 이를 이용하여 제조된 발효물 {BIFIDOBACTERIUM SP. GFC-B09 and Fermented Product Manufactured Using Thereof}

본 발명은 비피도박테리움 속 GFC-B09 균주 및 이를 이용하여 제조된 발효물에 관한 것이다.

피부의 생태계는 미생물에게 다양한 형태의 서식처를 제공하며, 광범위한 미생물들이 살고 있다. 숙주인 사람은 이들과 공생관계를 이루고 있으며, 숙주에 많은 긍정적인 영향을 미친다고 알려져 있다. 피부는 함입부, 특화되어있는 틈새 등 다양한 형태의 서식처를 구성하고 있으며, 넓은 분포의 미생물이 자랄 수 있도록 돕는다. 기본적으로 피부는 물리적인 막을 형성하며, 외부로부터 잠재적인 위험요소 및 독성 물질들로부터 방어를 하도록 도와준다. 피부는 외부환경과의 접속지점이 되며, 다양한 미생물들(진균, 세균, 바이러스 및 작은 유충)의 집합소이기도 하다. 물리적 및 화학적 기능의 선택에 맞게 미생물들은 특화된 틈새에 적응하여 서식처를 마련한다. 일반적으로 피부는 차갑고, 산성 성질을 나타내며, 건조된 상태로 유지된다. 구조적으로 표피(epidermis)는 피부장벽을 이루고 있으며, 미생물과 독소가 침투하는 것을 차단하고, 수분을 유지하는 중요한 역할을 한다. 표피의 최상위층은 각질층(stratum corneum)으로 구성되어 있고, 각질세포(keratinocyte)와는 분화하여 떨어져 있다. 상기 표피는, 일명 "벽돌과 몰탈 구조"라고 불리는 형태를 띄고 있다. 피부 조직은 계속적인 자가회복과정을 거치는데, 분화과정의 마지막을 거친 인설(squames)은 끊임없이 피부조직에서 탈락되는 과정을 반복하게 된다.

한편, 당류를 발효하여 에너지를 획득하고 다량의 락트산을 생성하는 세균을 총칭하여 유산균(Lactic acid bacteria)이라고 한다. 유산균은 장내에 서식하면서 인체의 소화계와 공생을 하며 섬유질 및 복합 단백질을 분해하여 중요한 영양성분으로 만드는 역할을 담당한다. 또한, 장내 환경을 산성으로 유지시킴으로 유해세균의 성장을 억제하고 설사 및 변비 개선, 비타민 합성, 혈중 콜레스테롤 저해 등의 역할을 한다. 유산균은 장의 점막과 상피세포에 강하게 결합할 수 있는 특성이 있어 정장작용에 많은 도움을 주며, 대식세포 및 비장의 활성을 증진하여 면역반응에 관여하는 물질을 분비 및 촉진하는 효과를 나타낸다. 또한, 면역 조절 기능도 가지고 있어 아토피 및 알러지 관련 질환에 효과가 있다.

화장품 분야에서는 유산균 배양액이 1955년 상품화된 이후 현재까지 사용되고 있는데 주로 스트랩토코커스(Streptococcus) 속, 락토바실러스(Lactobacillus) 속, 락토코커스(Lactococcus) 속, 류코노스톡(Leuconostoc) 속, 비피도박테리움(Bifidobacterium) 속 등을 이용하여 직접 배양액에 발효하여 여과하거나 추출하는 등의 원료 형태 및 활성 소재에 접종하여 발효한 후 여과하거나 추출하는 등의 연구가 활발하게 이루어지고 있다.

그 중에서도 비피도박테리움(Bifidobacterium) 속을 이용하여 다양한 용도에 적용되고 있는 기술로는, 대한민국 등록특허공보 제10-1958686호「비피도박테리움 애니멀리스 서브스페시스 락티스 hy8002를 유효성분으로 함유하는 미세먼지에 의한 피부의 손상 방지 및 개선을 위한 조성물」, 대한민국 등록특허공보 제10-1788544호「복합 유산균 배양물을 함유하는 피부장벽 강화용 화장료 조성물」, 대한민국 등록특허공보 제10-1802963호「발효 추출물을 이용한 화장료 조성물」등이 개시되어 있다.

피부 생태환경을 다시 살펴보면, 물리적인 요소들과 생물학적인 요소들이 잘 어우러져 다양한 서식처를 제공하며, 더 나아가 사람과 미생물 사이의 미묘한 균형에 대해 생각해 볼 수 있을 것이다. 공생관계의 균형이 무너지게 되면 그와 동시에 피부의 붕괴와 감염이 발생하게 된다.

이에, 본 발명자들은 비피도박테리움 속 GFC-B09(Bifidobacterium sp. GFC-B09) 균주(기탁번호:KCCM12263P)를 분리 동정하였고, 이를 이용하여 MRS 배지에 접종하고, 배양하는 단계를 통해 발효물을 제조할 경우, 피부-마이크로바이옴(skin-microbiome) 변화유도(S. epidermidis 증대), 히스타민 분해효소능 증대, 알러지 저해효과, DNA 회복능, 주름 개선, 미백, 피부 치밀도, 피부 탄력 개선 효과를 부여할 수 있다는 사실을 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다.

대한민국 등록특허공보 제10-1958686호 대한민국 등록특허공보 제10-1788544호 대한민국 등록특허공보 제10-1802963호

본 발명의 목적은 피부-마이크로바이옴(skin-microbiome) 변화유도(S. epidermidis 증대), 히스타민 분해효소능 증대, 알러지 저해효과, DNA 회복능, 주름 개선, 미백, 피부 치밀도, 피부 탄력 개선 효과를 갖는 신규한 균주를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 신규한 균주를 MRS 배지에 접종하고, 배양하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 발효물의 제조방법 및 이로부터 제조된 발효물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 신규한 균주의 발효물을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물을 제공하는 데 있다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 피부-마이크로바이옴(skin-microbiome) 변화유도(S. epidermidis 증대), 히스타민 분해효소능 증대, 알러지 저해능, DNA 회복능, 주름 개선, 미백, 피부 치밀도 및 피부 탄력 개선능을 갖는 비피도박테리움 속 GFC-B09(Bifidobacterium sp. GFC-B09) 균주(기탁번호:KCCM12263P)를 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 균주는 뒤엉벌 유래인 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 비피도박테리움 속 GFC-B09(Bifidobacterium sp. GFC-B09) 균주(기탁번호:KCCM12263P)를 MRS 배지에 접종하고, 배양하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 발효물의 제조방법을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 배양은 32 ~ 37℃에서 90 ~ 130시간 동안 수행되는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 비피도박테리움 속 GFC-B09(Bifidobacterium sp. GFC-B09) 균주(기탁번호:KCCM12263P)로 발효된 발효물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 발효물을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 화장료 조성물은 피부-마이크로바이옴(skin-microbiome) 변화유도(S. epidermidis 증대), 히스타민 분해효소능 증대, 알러지 저해능, DNA 회복능, 주름 개선, 미백, 피부 치밀도 및 피부 탄력 개선용으로 구성된 군으로부터 선택되는 용도인 것을 특징으로 한다.

본 발명으로부터 제공되는 신규한 비피도박테리움 속 GFC-B09 균주(Bifidobacterium sp. GFC-B09) 균주(기탁번호: KCCM 12263P) 배양액의 피부-마이크로바이옴(skin-microbiome) 변화유도(S. epidermidis 증대), 히스타민 분해효소능 증대, 알러지 저해효과, DNA 회복능, 주름 개선, 미백, 피부 치밀도 및 피부 탄력 개선 효과가 우수하기 때문에, 이를 유효 성분으로 화장료 베이스에 적용하였을 때 화장료 조성물로서의 효과가 우수하다.

도 1은 본 발명에 따른 비피도박테리움 속 GFC-B09 균주(기탁번호: KCCM 12263P)의 염기서열을 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명에 따른 비피도박테리움 속 GFC-B09 균주(기탁번호: KCCM 12263P)의 발효물을 피부에 처리하였을 시 S. epidermidis 증대 변화를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명에 따른 비피도박테리움 속 GFC-B09 균주(기탁번호: KCCM 12263P) 발효물의 DAO 효소 생성증대 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 본 발명에 따른 비피도박테리움 속 GFC-B09 균주(기탁번호: KCCM 12263P) 발효물의 β-Hexosaminidase 억제 효과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 본 발명에 따른 비피도박테리움 속 GFC-B09 균주(기탁번호: KCCM 12263P) 발효물의 DNA repair 효과를 나타낸 그래프이다.
도 6은 본 발명에 따른 비피도박테리움 속 GFC-B09 균주(기탁번호: KCCM 12263P)의 발효물을 피부에 처리 후, 나타나는 눈가 주름개선율을 나타낸 그래프이다.
도 7은 본 발명에 따른 비피도박테리움 속 GFC-B09 균주(기탁번호: KCCM 12263P)의 발효물을 피부에 처리 후, 나타나는 피부 색소 개선율을 나타낸 그래프이다.
도 8은 본 발명에 따른 비피도박테리움 속 GFC-B09 균주(기탁번호: KCCM 12263P)의 발효물을 피부에 처리 후, 나타나는 피부 치밀도 개선율을 나타낸 그래프이다.
도 9는 본 발명에 따른 비피도박테리움 속 GFC-B09 균주(기탁번호: KCCM 12263P)의 발효물을 피부에 처리 후, 나타나는 표피 탄력 개선율을 나타낸 그래프이다.

이에, 본 발명에서는 뒤엉벌로부터 분리된 미생물로부터 피부-마이크로바이옴(skin-microbiome) 변화유도(S. epidermidis 증대), 히스타민 분해효소능 증대, 알러지 저해효과, DNA 회복능, 주름 개선, 미백, 피부 치밀도 및 피부 탄력 개선 효과를 갖는 균주를 스크리닝하여 우수한 균주를 선발하고, 16s rRNA 염기서열 분석을 실시한 결과, 비피도박테리움(Bifidobacterium) 속(genus)에 속하는 신규 미생물임을 확인하였다. 이에, 비피도박테리움 속 GFC-B09(Bifidobacterium sp. GFC-B09) 균주로 명명하고 2018년 5월 21일자로 한국미생물보존센터(Korean Culture Center of Microorganisms)에 기탁하였다.

따라서, 본 발명은 비피도박테리움 속 GFC-B09(Bifidobacterium sp. GFC-B09) 균주(기탁번호:KCCM12263P)(이하 'GFC-B09'로 약칭함)에 관한 것이다.

이때, 상기 GFC-B09 균주는 뒤엉벌 유래인 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 GFC-B09 균주를 MRS 배지에 접종하고, 배양하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 발효물의 제조방법에 관한 것이다.

상기 배양에 사용되는 배지는 통상적인 것을 사용할 수 있다. 그 중에서도 MRS 배지(proteose peptone No.3 10g, beef extract 10g, yeast extract 5g, dextrose 20g, Polyoxyethylene sorbitan monooleate 1g, ammonium citrate 2g, maganessium sulfate 0.1g, manganesse selfate 0.05g, dipotassium phosphate 2g, sodium acetate 5g/L, pH 6.5)를 사용하여 발효된 것이 발효물의 수율을 가장 효과적으로 향상시킬 수 있는 측면에서 바람직하다.

상기 GFC-B09 균주를 MRS 액체배지에 1.0x10⁷내지1.0x10⁹의 세균수가 되도록 하여 1~3% 수준으로 접종하고, 배양하는 단계는 혐기성 조건에서 정치 배양을 32 ~ 37℃에서 90 ~ 130시간 동안 수행되는 것을 특징으로 한다. 만일, 배양 온도 및 시간이 상기 범위를 벗어날 경우에는 발효균주의 배양조건이 맞지 않아 충분한 피부-마이크로바이옴(skin-microbiome) 변화유도(S. epidermidis 증대), 히스타민 분해효소능 증대, 알러지 저해효과, DNA 회복능, 주름 개선, 미백, 피부 치밀도 및 피부 탄력 개선 효과를 나타낼 수 없을 뿐만 아니라, 균주 증식이 되지 않기 때문에 바람직하지 않다.

상기와 같이, 배양된 균주를 pH 3.8~4.2 조건에서 여과한 다음, 상기 여과된 균주를 20~30℃에서 10~16일 동안 숙성하여 발효물을 제조할 수 있다.

또한, 본 발명은 비피도박테리움 속 GFC-B09(Bifidobacterium sp. GFC-B09) 균주(기탁번호:KCCM12263P)로 발효된 발효물에 관한 것이다.

상기 발효물은 피부-마이크로바이옴(skin-microbiome) 변화유도(S. epidermidis 증대), 히스타민 분해효소능 증대, 알러지 저해효과, DNA 회복능, 주름 개선, 미백, 피부 치밀도 및 피부 탄력 개선 효과가 있어 화장료 조성물로서의 효과가 매우 우수하다.

따라서, 본 발명은 비피도박테리움 속 GFC-B09(Bifidobacterium sp. GFC-B09) 균주(기탁번호:KCCM12263P)로 발효된 발효물을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물에 관한 것이다.

상기 화장료 조성물은 피부-마이크로바이옴(skin-microbiome) 변화유도(S. epidermidis 증대), 히스타민 분해효소능 증대, 알러지 저해효과, DNA 회복능, 주름 개선, 미백, 피부 치밀도 및 피부 탄력 개선 효과용으로 구성된 군으로부터 선택되는 용도인 것일 수 있다.

본 발명의 피부-마이크로바이옴(skin-microbiome) 변화유도(S. epidermidis 증대), 히스타민 분해효소능 증대, 알러지 저해효과, DNA 회복능, 주름 개선, 미백, 피부 치밀도 및 피부 탄력 개선 효과용 화장료 조성물은 피부외용연고, 크림, 유연화장수, 영양화장수, 팩, 에센스, 헤어토닉, 샴푸, 린스, 헤어 컨디셔너, 헤어 트리트먼트, 젤, 스킨로션, 스킨소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스처 로션, 영양로션, 마사지 크림, 영양크림, 아이크림, 모이스처 크림, 핸드 크림, 파운데이션, 영양에센스, 선스크린, 비누, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디 로션 및 바디 클렌저로 이루어지는 군으로부터 선택된 제형을 가질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 이들 각 제형의 조성물은 그 제형의 제제화에 필요하고 적절한 각종의 기제와 첨가물을 함유할 수 있으며, 이들 성분의 종류와 양은 당업자에 의해 용이하게 선정될 수 있다.

본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물섬유, 식물섬유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액의 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용매화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르 등이 있다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클렌징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 리놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 피부-마이크로바이옴(skin-microbiome) 변화유도(S. epidermidis 증대), 히스타민 분해효소능 증대, 알러지 저해효과, DNA 회복능, 주름 개선, 미백, 피부 치밀도 및 피부 탄력 개선 효과용 화장료 조성물에서, 상기 발효물은 상기 조성물의 총 중량을 기준으로 0.01 내지 90 중량% 함유되어 있을 수 있고, 바람직하게는 3 내지 15 중량% 함유되어 있을 수 있으나, 바람직한 피부-마이크로바이옴(skin-microbiome) 변화유도(S. epidermidis 증대), 히스타민 분해효소능 증대, 알러지 저해효과, DNA 회복능, 주름 개선, 미백, 피부 치밀도, 피부 탄력 개선 효과를 제공할 수 있는 유효량을 포함한다면 이에 제한되지 않는다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명 하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

<실시예 1> Bifidobacterium sp. GFC-B09 균주의 분리

뒤엉벌로부터 장을 적출하여 MRS 배지 또는 Bifidobacterium 선택배지에 진탕한 후 이를 10^-4배(부피)로 희석한 샘플 0.1mL을 MRS 한천배지(Peptospecial 10 g, beef extract 10g, yeast extract 5g, Glucose 20g, Triammonium Citrate 2g, sodium acetate 5g, maganessium sulfate 0.2g, manganesse selfate 0.05g, dipotassium phosphate 2g, Agar 15g, Tween80 1g/L, pH 6.2±0.2, MBcell(Cat.No. MB-M1025))에 도말하여 혐기성 인큐베이터에서 37℃에서 2일간 배양하였다. 형성된 집락을 순수 분리 배양하여, 24 시간 동안 혐기 인큐베이터에서 재배양한 후 형성된 단일 colony를 분리하였다. 분리된 균주들 중 피부-마이크로바이옴(skin-microbiome) 변화유도(S. epidermidis 증대), 히스타민 분해효소능 증대, 알러지 저해효과, DNA 회복능, 주름 개선, 미백, 피부 치밀도 및 표피 탄력 개선 효과가 우수한 GFC-B09 균주를 선발하였다.

<실시예 2> 선발균주 16s rRNA 염기서열 분석

최종 선발된 GFC-B09 균주의 gDNA와 Universal primer인 서열번호 1: 27F(5' AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG 3')와 서열번호 2: 1492R(5' TAC GGY TAC CTT GTT ACG ACT T 3')를 이용하여 16s DNA 염기서열 분석을 통하여 비피도박테리움(Bifidobacterium) 균주(서열번호 3)인 것으로 확인하였으며, 비피도박테리움 속 GFC-B09 균주(Bifidobacterium sp. GFC-B09) 균주로 명명하였고, 국제미생물특허 기탁기관인 한국미생물보존센터(KCCM)에 2018년 5월 21일자로 기탁하고, 수탁번호 KCCM12263P를 부여받았다.

<실시예 3> GFC-B09 균주의 배양액 제조

분리된 GFC-B09 균주의 배양액을 제조하기 위해 MRS 배지를 121℃에서 15분 동안 고압멸균을 실시한 뒤 37℃ 냉각이 완료되면, 1.0x10⁹의 세균수가 되도록 하여 1% 접종하였다. 접종 후 혐기상태가 유지되도록 산소공급은 없으며, 정치배양을 37℃에서 120시간 동안 실시하였다. 배양을 마치고 pH가 4.0(오차 0.2)으로 형성되는지 확인한 뒤, 육안상으로 배양액이 짙은 갈색인 것이 확인되면 배양을 마치고 0.2㎛ 필터(밀리포어) 제균을 실시하였다. 필터가 완료되면 상온에서 2주간 숙성기간을 거쳐 GFC-B09 균주의 배양액을 제조하였다.

<실시예 4> 피험자와 Skin-Microbiome 샘플채집

본 실험에 사용된 샘플은 지에프씨생명과학 연구소에서 사전동의를 얻은 피험자를 대상으로 실험을 실시하였다. 시험에 사용된 프로바이오틱스(Probiotics)로는 GFC-B09 균주의 발효물을 사용하였으며, 배양 후 균체를 제거한 배양액을 피험자의 얼굴 피부에 적용시켜 총 72시간 동안 피부샘플을 채집하여 분석에 사용하였으며 채집방법은 코튼스왑 방법을 이용하였으며, 거즈를 이용하여 스크럽하여 피부샘플을 채취하였다. 피부상재 미생물을 채취는 처리 전, 처리 후, 미처리(휴지기) 및 재처리 그룹으로 이루어졌다.

피부 샘플 채집은 참고문헌을 바탕으로 멸균수와 스크래퍼를 이용하여 채집하였으며, 모든 작업은 clean bench 내에서 실시되었다. 본 연구는 IRB 심의기준에서 면제사유에 해당되는 것으로 확인하였다.

<실시예 5> 피부 상재 미생물의 genomic DNA 추출 및 DNA 증폭

피부로부터 채집된 샘플을 0.85% NaCl에 현탁한 상등액을 원심분리(17,000 rpm/m)하여 균체를 취하고 멸균된 생리식염수에 균체를 1회 세척한 후, FastDNA SPIN KIT(MP Biomedical, France)를 사용하여 DNA를 추출하였다. 추출된 DNA의 16S ribosomal DNA gene 증폭을 위하여 서열번호4: GC clamp(5'-CGCCCGGGGCGCGCCCCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGG-3')가 부착된 서열변호 5: 341F(5'-CCTACGGGAGGCAGCAG-3')와 서열번호 6: 518R(5'-ATTACCGCGGCTGCTGG-3')를 이용하였다. PCR 반응은 0.4 mM dNTP, 0.5 units Taq polymerase, 4 mM Mg²⁺이 함유된 Takara Perfect Premix(Takara, Japan) 10㎕에 DNA template(20 μg/mL) 1㎕, 1.0μM forward primer와 1.0μM reverse primer를 각각 1㎕씩 넣고 나머지는 증류수를 첨가하여 총 부피가 20㎕가 되도록 제조하였다. PCR 반응은 C1000-Dual (Bio-Rad, USA)를 이용하여 64℃에서 50℃까지 온도를 낮추면서 2 cycle씩 증폭을 실시하는 touch down PCR 방법을 사용하였으며, 최종적으로 72℃에서 8분 처리 후, 4℃에서 보관하였다. 얻어진 PCR 산물을 이용하여 DGGE(Denaturing Gradient Gel Electrophoresis) 분석에 사용하였다.

<실시예 6> Denaturing Gradient Gel Electrophoresis(DGGE)

DGGE 분석에는 D-code system(Bio-rad, USA)을 사용하였다. 사용한 polyacrylamide gel 농도는 8%였고, 40% polyacrylamide bis-solution 29:1(3.3% C)(Bio-Rad, USA)이 40%~60% 사이의 농도 구배가 수직으로 형성되도록 제작하였다. 이때 사용된 변성제는 7M urea와 40%(w/v) formamide(Sigma, USA)였다. D-code system에 약 7ℓ의 TAE buffer(20 mM Tris, 10 mM acetic acid, 0.5 mM EDTA, pH 8.0)를 채우고, 2Xloading dye(0.05% bromophenol blue, 0.05% xylene cyanol, 70% glycerol)와 PCR 산물을 동량 혼합해 50V에서 800 분간 전기영동을 실시하였다. 전기영동을 마친 polyacrylamide gel은 Redsafe(Intron, Korea) 용액에서 15분간 염색 후 나타난 특정 밴드를 분석하였다. DGGE 결과의 band intensity는 GelCompar2 (Bionumeric, Belgium)를 이용하여 이미지를 히스토그램하고 수치화하여 분석하였다.

그 결과, 도 2에서 확인할 수 있듯이, GFC-B09 균주 발효물 처리에 의존하여 보습활성에 유익한 피부상재균인 S. epidermidis의 증대 효과를 확인하였다. 처리 전 그룹을 증감률 100%로 설정할 경우, GFC-09 균주 발효물 처리 시 610% 증대되었고, 반면 휴지기 시 150% 대로 감소하였다가 재처리 하였을 시 다시 327% 증대되는 것을 확인하였다. 따라서, GFC-B09 균주 발효물 처리에 의존하여 유익한 피부상재균의 증대를 확인하였다.

<실시예 7> 히스타민 저감 효과 : DAO(Diamine oxidase or Histaminase)

실시예 3으로부터 제조된 GFC-B09 균주 발효물의 히스타민 저감효과를 확인하기 위해 DAO 증대능을 확인하였다. 이는 경쟁적 저해의 원리로 히스타민을 유도체화 하여 표시된 히스타민과 표식되지 않은 히스타민이 항히스타민 항체에 경쟁적으로 결합하는 원리로 분석하였다. Histamine Enzyme Immunoassay kit(Spi bio, France)를 사용하여 표식된 히스타민을 405-414nm 사이의 흡광도로 측정하여 저감된 히스타민을 확인하였다. 상세한 방법은 해당 kit 내 프로토콜을 활용하였다.

그 결과, 도 3에서 확인할 수 있듯이, 처리 시간에 따라 DAO의 생성능이 증가되었으며, 최대 2.27U/L(*unit definition : 1 Unit(U) of DAO will catalyze the conversion of 1umole of putrescine to pyrroline plus NH₃, and H₂O₂ per min at pH 7.5)의 DAO 생성능을 보임에 따라 히스타민 저해능을 확인하였다.

삭제

<실시예 10> 임상 시험

본 임상시험은 대한피부과학연구소에 의뢰하여 시험번호 KDRI-2019-062, IRB 승인번호 KDRI-IRB-19062로 실시되었으며, 대한피부과학연구소의 자체 실험 규정 및 임상시험 실시 기준(Good Clinical Practice)에 따라 성실히 실시 및 이행되었다.

총 4주간의 시험 기간 동안 11명의 피험자를 대상으로 시험한 결과, 시료를 사용한 시험부위는 시료 사용 4주 후부터 사용 전에 비해 통계적으로 유의한 수준(p<0.05)으로 눈가 주름지수, 피부색소지수(M-value)가 감소하고, 피부 치밀도 및 표피 탄력이 증가하여 시험 시료가 눈가 주름, 피부미백(과색소침착증 개선), 피부 치밀도 및 표피 탄력 개선에 도움을 줄 수 있는 것으로 확인되었다. 또한 시험기간 동안 특별한 이상 증상이 발생하지 않아 안전한 물질임을 확인하였다.

상세한 임상시험 방법은 아래와 같다.

1. 시험물질 적용 방법

실제 사용법과 동일하게 하기 위해 시험의뢰자가 제공한 사용방법을 피험자에게 교육하였다. 의뢰자가 제공한 사용방법은 다음과 같다: 아침, 저녁 적당량을 취하여 얼굴 전체에 부드럽게 발라준다.

2. 시험 순서

1) 첫 번째 방문

- 방문일 12시간 전부터 기초제품의 사용을 금지한다.

-피험자는 시험방법과 일정 및 위험성과 가능한 이상반응 등에 대해 설명을 듣고 기초정보를 작성하고 동의서에 서명한다.

- 시험자가 제공하는 기준 세안제를 이용하여 세안 후 페이퍼 타올로 가볍게 두드려 물기를 제거한 뒤 30분간 항온항습 조건(20~24℃, 40~60%RH)에서 안정을 취한다.

- VISIA^ⓡ CR 을 이용하여 안면 사진 촬영을 실시한다.

- 평가 시마다 동일한 부위에서 측정이 이루어질 수 있도록 다음과 같이 측정부위를 구획한 후, 기기측정을 시행한다.

가) Antera 3D 촬영 시험부위

: 양측 안와 전체 및 일측 눈가를 포함하는 6cm X 6cm 크기의 정방형 구역

나) Mexameter 측정 시험부위

: 안면부 양측 과색소침착증 병변의 각각 한 곳

다) Ultrasound 측정 시험부위

: 양측 눈꼬리 (Lateral canthus)로부터 수평 외측으로 1cm 떨어진 지점

라) Cutometer 측정 시험부위

: 양측 입꼬리와 동측 이주 (tragus)를 연결한 가상선의 1/2지점

-피부과 전문의에 의해 과색소침착증 시험부위를 육안 평가한다.

-피험자 주의사항과 시료 사용법을 교육한 후 시료를 배포한다.

-시험기간 동안 매일 전화 등의 방법으로 시료사용의 순응도를 체크한다.

2) 두 번째 방문 (2주차) / 세 번째 방문 (4주차)

첫 방문일과 동일한 방법으로 동일한 부위에서 안면부 사진촬영 및 기기평가를 시행한다.

- 피부과 전문의에 의해 과색소 침착증 시험부위를 육안 평가한다.

- 과색소 침착증 시험부위에 대한 피험자 주관적 평가를 실시한다.

- 피부과 전문의가 이상반응 유무를 평가한다.

- 마지막 방문일에는 시료를 수거하고, 피험자에게 피험비를 지급한다.

- Antera 3D-Winkle index 분석은 측정 오차를 줄이기 위해 모든 이미지 촬영이 완료된 마지막 방문일에 실시한다.

- 평가 및 분석 방법

1) Antera 3D를 이용한 눈가주름 개선 효과 평가

- 시험 전, 시험 2주 후, 시험 4주 후에 눈가 주름 지수를 기기적으로 측정하였다.

- 눈가주름 개선 정도를 다음과 같이 %값으로 도출하였다.

눈가 주름 개선율(%) = 시험 전 측정치 - 시험 후 측정치 / 시험 전 측정치 X 100

2) Mexameter를 이용한 피부 미백(과색소침착증 개선) 효과 평가

- 시험 전, 시험 2주 후, 시험 4주 후에 피부 색소 수치를 기기적으로 측정하였다.

- 피부 미백(과색소침착증 개선) 정도를 다음과 같이 %값으로 도출하였다.

피부 미백(과색소침착증) 개선율(%) = 시험 전 측정치 - 시험 후 측정치 / 시험 전 측정치 X 100

3) Ultrasound를 이용한 피부 치밀도 개선 효과 평가

- 측정 부위의 시험 전, 시험 2주 후, 시험 4주 후에 측정된 피부 치밀도 간의 통계학적 유의성을 분석 및 검증하였다.

- 피부 치밀도 개선 정도는 다음과 같이 %값으로 도출하였다.

피부 치밀도 개선율(%) = 시험 전 측정치 - 시험 후 측정치 / 시험 전 측정치 X 100

4) Cutometer를 이용한 탄력 개선 효과 평가

- 시험 전, 시험 2주 후, 시험 4주 후에 Cutometer를 이용하여 표피 탄력을 측정하였다.

- 개선 정도를 다음과 같이 %값으로 도출하였다.

탄력 개선율(%) = 시험 전 측정치 - 시험 후 측정치 / 시험 전 측정치 X 100

5) 피부과 전문의에 의한 안전성 평가

- 시험기간 중 시료 사용에 의한 부작용 (홍반, 부종, 인설, 가려움, 자통, 작열감, 뻣뻣함, 따끔거림 및 기타 이상증) 발생 여부를 평가하였다.

3. 통계 분석 방법

1) Minitab 18 (Minitab^ⓡ 18.1, Minitab Inc.) 프로그램을 이용해 유의성을 확인 하였다.

- 결과 값은 정규성 검정(Ryan-Joiner Normality Test)을 통해 정규 분포로 추정되는 경우, 아래의 모수적인 통계법을 통해 유의성을 확인하였다.

- 동일 그룹 내 전후 결과값 비교: 시험 전, 후 측정한 값의 비교는 paired t-검정을 이용하며, 3회 이상 반복 측정한 경우, 반복측정분산분석(Repeated measure ANOVA)을 통해 유의수준 p < 0.05 수준에서 유의성을 확인하였다.

- 2이상의 상이한 그룹간 결과값 비교: 두 그룹간 결과값의 비교는 Welch's t-검정을 이용하며, 3이상의 그룹간 결과값 비교는 일원분산분석(one-way ANOVA)을 통해 유의수준 p < 0.05 수준에서 유의성을 확인하였다.

- 반복 측정한 2이상의 상이한 그룹의 결과값 비교: 반복측정분산분석(Repeated measure ANOVA)을 통해 유의수준 p < 0.05 수준에서 유의성을 확인하며, 그룹간 초기 측정 값이 유의하게 다른 경우 초기 측정값을 공변량으로 한 공분산분석(Analysis of Covariance)을 통해 그룹간 결과값의 차이를 확인하였다.

- 정규성 검정(Ryan-Joiner Normality Test)에서 정규성이 기각되는 경우, 아래의 비모수적인 통계법을 통해 유의성을 확인하였다.

- 동일 그룹 내 전후 결과값 비교: 시험 전, 후 측정한 값의 비교는 Wilcoxon signed rank 검정을 이용하며, 3회 이상 반복 측정한 경우, Friedman 검정을 통해 유의수준 p < 0.05 수준에서 유의성을 확인하였다.

-2이상의 상이한 그룹간 결과값 비교: 두 그룹간 결과값의 비교는 Mann-Whitney U 검정을 이용하며, 3이상의 그룹간 결과값 비교는 Kruskal-Wallis 검정을 통해 유의수준 p < 0.05 수준에서 유의성을 확인하였다.

-반복 측정한 2이상의 상이한 그룹의 결과값 비교: Friedman 검정을 통해 유의수준 p < 0.05 수준에서 그룹간 결과값의 차이를 확인하였다.

-모든 자료는 연속형 변수는 평균과 표준편차로, 범주형 변수는 빈도와 백분율로 요약하였다.

4. 시험 결과

[1] 눈가 주름 개선

도 6에서 확인할 수 있듯이, 시료를 사용한 시험부위는 시험 4주 후부터 시험전에 비해 통계적으로 유의한 수준(p<0.05)으로 눈가 주름지수가 감소하는 양상을 보인 반면, 대조시료를 사용한 대조 부위는 시험 전에 비해 통계적으로 유의한 수준(p<0.05)의 변화를 보이지 않았다. 하지만, 그룹 간 비교 대조 통계를 통해서 확인한 결과, 시험부위와 대조부위 간의 통계적으로 유의한 수준(p<0.05)의 차이는 확인할 수 없었다.

시험부위의 눈가 주름 지수는 Antera 3D의 Indentation index 분석값을 활용하였다. 개선율은 시험부위와 대조부위 각각 시험 2주후에 5.08%, -0.23%, 시험 4주후에는 12.44%, 2.61%로 확인되어, 시험부위의 눈가주름이 개선됨을 나타내었다.

[2] 피부 미백

도 7에서 확인할 수 있듯이, 시료를 사용한 시험 부위는 시험 2주후부터 시험 전에 비해 통계적으로 유의한 수준 (p<0.05)으로 피부 색소 지수(M-value)가 감소하는 양상을 보인 반면, 대조 시료를 사용한 대조부위는 시험 전에 비해 통계적으로 유의한 수준(p<0.05)의 변화를 보이지 않았다. 또한, 그룹 간 비교 대조 통계를 통해서 확인한 결과, 시험부위와 대조 부위 간의 통계적으로 유의한 수준(p<0.05)의 차이를 확인할 수 있었다.

시험부위의 미백(과색소 침착증 개선)은 기기평가, 육안평가, 피험자 주관적평가를 통해 평가하였다.

기기평가는 Mexameter의 M-value 측정을 이용하여 이루어졌으며 평가의 신뢰성을 높이기 위해 부위 당 총 5회 반복 측정을 실시하였다. 평가 결과 개선율은 시험부위와 대조부위 각각 시험 2주 후에 10.38%, 5.09%, 시험 4주 후에 17.45%, 1.92%로 확인되어, 시험부위의 피부 색소 지수가 감소함을 나타내었다.

육안평가는 Visual analog scale[0-9]을 이용하여 피부과 전문의를 포함한 숙련된 전문가 2인이 동시에 실시하였으며 평가가 서로 다를 경우 더 높은 수치를 채택하였다. 평가결과 시험부위 및 대조부위는 모두 시험 전 후 유의한 차이를 보이지 않았으며, 그룹간 비교에서도 역시 유의한 차이를 보이지 않았다.

피험자의 주관적 평가는 2주차와 4주차 시험일에 이루어졌으며 시험부위 및 대조부위의 호전정도를 세 단계로 나누어 평가하였다. 시험시료를 사용한 시험부위는 2주차에 호전되었다고 판단한 사람이 11명, 4주차에 시험부위가 호전되었다고 판단한 사람이 9명 이였으며, 대조시료를 사용한 대조부위는 2주차에 호전되었다고 판단한 사람이 7명, 4주차에 호전되었다고 판단한 사람이 10명이였다.

[3] 피부 치밀도 개선

도 8에서 확인할 수 있듯이, 시료를 사용한 시험부위와 대조 시료를 사용한 대조부위는 시험 2주 후부터 시험 전에 비해 통계적으로 유의한 수준 (p<0.05)으로 피부치밀도가 증가하였으며, 그룹 간 비교대조통계를 통해서 확인한 결과, 시험부위와 대조 부위 간의 통계적으로 유의한 수준 (p<0.05)의 차이를 확인할 수 있었다.

치밀도(Dermal density) 개선율은 시료 사용 전 과 비교하여 2주 사용 후 시험부위와 대조부위 각각 16.20%, 4.50%, 4주 사용 후 시험부위와 대조부위 각각 25.18%, 9.17%로 확인되었다. 이는 시험부위의 피부치밀도가 시험 시료 사용 후 통계적으로 유의한 수준으로(p<0.05) 증가한 결과로, 시험시료가 피부치밀도 개선 효과를 가지고 있는 것으로 확인되었다.

[4] 피부 탄력 개선

도 9에서 확인할 수 있듯이, 시험시료를 사용한 시험부위와 대조시료를 사용한 대조부위는 시험 4주 후부터 시험 전에 비해 통계적으로 유의한 수준 (p<0.05)으로 표피탄력이 증가하였으며, 그룹 간 비교 대조 통계를 통해서 확인한 결과, 시험부위와 대조부위간의 통계적으로 유의한 수준(p<0.05)의 차이를 확인할 수 있었다.

피부의 탄력을 나타내는 R7 (Ur/Uf) 값의 개선율이 시험부위와 대조부위에서 시험 2주 후에 각각 7.51%, 3.11%로 나타났으며, 시험 4주 후에는 각각 19.55%, 7.23%로 확인되어, 시험부위의 표피탄력이 개선됨을 나타내었다.

<제조예 1> GFC-B09 균주의 발효물을 함유하는 화장료 제조

(1) 화장수 제조

하기 표 1에 기재된 조성으로부터 통상의 방법에 의하여 화장수를 제조하였다.

성분	함량(중량%)
실시예 3 (GFC-B09 균주의 발효물)	3.00
히드록시에틸렌셀룰로오스(2% 수용액)	12.00
잔탄검(2% 수용액)	2.00
1,3-부틸렌글라이콜	6.00
글리세린	4.00
히알루론산나트륨(1% 수용액)	5.00
정제수	68.00
합계	100.00

(2) 로션 제조

하기 표 2에 기재된 조성으로부터 통상의 방법에 의하여 로션을 제조하였다.

성분	함량(중량%)
실시예 3 (GFC-B09 균주의 발효물)	3.00
아스코르빈산-2-인산마그네슘염	1.00
수용성 콜라겐 (1% 수용액)	1.00
시트르산나트륨	0.01
시트르산	0.05
1,3-부틸렌글리콜	3.00
정제수	91.94
합계	100.0

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

한국미생물보존센터(KCCM)

KCCM12263P

20180521

<110> GFC Life Science CO., Ltd. <120> BIFIDOBACTERIUM SP. GFC-B09 and Fermented Product Manufactured Using Thereof <130> P19037 <160> 6 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Universal primer 27F <400> 1 agagtttgat cmtggctcag 20 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Universal primer 1492R <400> 2 tacggytacc ttgttacgac tt 22 <210> 3 <211> 1481 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Bifidobacterium sp. GFC B09 <400> 3 gggcgtgggg gtcgtgctta ccatgcagtc gaacgggatc cctggcagct tgctgtcggg 60 gtgagagtgg cgaacgggtg agtaatgcgt gaccaacctg ccctgtgcac cggaatagct 120 cctggaaacg ggtggtaata ccggatgctc cgctccatcg catggtgggg tgggaaatgc 180 ttttgcggca tgggatgggg tcgcgtccta tcagcttgtt ggcggggtga tggcccacca 240 aggcgttgac gggtagccgg cctgagaggg tgaccggcca cattgggact gagatacggc 300 ccagactcct acgggaggcc agccagtggg ggaattattg ccacaatggg gcgccaagcc 360 ctgaatgcaa gcgaccgccg gcgtgccggg gatggaaggc ctttcggggt tgtaaacccg 420 cttttggttc aagggccaag gccacggttt tcggcccgtg ttgaattgga ttgtttcgaa 480 ttagcacccg gctaactacg tgccagcagc cgcggtaata cgtaggggtg cgagcgttat 540 cccggattta ttgggcgtaa aggggctcgt aggcggttcg tcgcgtcccg gtgtgaaagt 600 ccatcgccta acggtggatc tgcgccgggt acgggcgggc tggagtgcgg taggggagac 660 tggaattccc ggtgtaacgg tggaatgtgt agatatcggg aagaacacca atggcgaagg 720 caggtctctg ggccgtcact gacgctgagg agcgaaagcg tggggagcga acaggattag 780 ataccctggt agtccacgcc gtaaacggtg gatgctggat gtggggccct ttccacgggt 840 cccgtgtcgg agccaacgcg ttaagcatcc cgcctgggga gtacggccgc aaggctaaaa 900 ctcaaagaaa ttgacggggg cccgcacaag cggcggagca tgcggattaa ttcgatgcaa 960 cgcgaagaac cttacctggg cttgacatgt gccggatcgc cgtggagaca cggtttccct 1020 tcggggccgg ttcacaggtg gtgcatggtc gtcgtcagct cgtgtcgtga gatgttgggt 1080 taagtcccgc aacgagcgca accctcgccg catgttgcca gcgggtgatg ccgggaactc 1140 atgtgggacc gccggggtca actcggagga aggtggggat gacgtcagat catcatgccc 1200 cttacgtcca gggcttcacg catgctacaa tggccggtac aacgcggtgc gacacggtga 1260 cgtggggcgg atcgctgaaa accggtctca gttcggatcg cagtctgcaa ctcgactgcg 1320 tgaaggcgga gtcgctagta atcgcggatc agcaacgccg cggtgaatgc gttcccgggc 1380 cttgtacaca ccgcccgtca agtcatgaaa gtgggtagca cccgaagccg gtggcccgac 1440 ccttgtgggg ggagccgtct aatgatagat ctccgaggtc t 1481 <210> 4 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GC clamp <400> 4 cgcccggggc gcgccccggg cggggcgggg gcacgggggg 40 <210> 5 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 341F <400> 5 cctacgggag gcagcag 17 <210> 6 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 518R <400> 6 attaccgcgg ctgctgg 17

Claims

S. epidermidis 증대, 히스타민 분해효소능 증대, 주름 개선, 미백, 피부 치밀도 및 피부 탄력 개선능을 갖는 비피도박테리움 애니말리스 아종 락티스 GFC-B09(Bifidobacterium animalis subsp. Lactis GFC-B09) 균주(기탁번호:KCCM12263P).
제1항에 있어서, 상기 균주는 뒤엉벌 유래인 것을 특징으로 하는 비피도박테리움 애니말리스 아종 락티스 GFC-B09(Bifidobacterium animalis subsp. Lactis GFC-B09) 균주(기탁번호:KCCM12263P).
비피도박테리움 애니말리스 아종 락티스 GFC-B09(Bifidobacterium animalis subsp. Lactis GFC-B09) 균주(기탁번호:KCCM12263P)를 MRS 배지에 접종하고, 배양하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 배양액의 제조방법.
제3항에 있어서, 상기 배양은 32 ~ 37℃에서 90 ~ 130시간 동안 수행되는 것을 특징으로 하는 배양액의 제조방법.
비피도박테리움 애니말리스 아종 락티스 GFC-B09(Bifidobacterium animalis subsp. Lactis GFC-B09) 균주(기탁번호:KCCM12263P)로 배양된 배양액.
제5항의 배양액을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제6항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 S. epidermidis 증대, 히스타민 분해효소능 증대, 주름 개선, 미백, 피부 치밀도 및 피부 탄력 개선 효과용으로 구성된 군으로부터 선택되는 용도인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.