CN111826300A - 动物双歧杆菌乳亚种gfc-b09菌株及包含其的化妆品组合物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种动物双歧杆菌乳亚种GFC‑B09菌株及包含其的化妆品组合物。本发明提供的动物双歧杆菌乳亚种GFC‑B09(Bifidobacterium animalis subsp.Lactis GFC‑B09)菌株(保藏号：KCCM12263P)菌株或其培养液，由于S.epidermidis增多、组胺降解酶能力、过敏抑制能力、DNA修复能力、皱褶改善能力、美白能力、皮肤致密度及皮肤弹力改善能力优秀，因而将其作为有效成分应用于化妆品基料时，作为化妆品组合物的效果优秀。

Description

动物双歧杆菌乳亚种GFC-B09菌株及包含其的化妆品组合物

技术领域

本发明涉及一种动物双歧杆菌乳亚种GFC-B09菌株及包含其的化妆品组合物。

背景技术

皮肤的生态系统为微生物提供了多样形态的栖息地，生活着广泛的微生物。据悉，作为宿主的人与他们构成了共生关系，给宿主带来许多积极影响。皮肤构成了陷入部、经特化的间隙等多样形态的栖息地，帮助分布广泛的微生物能够生存。基本上而言，皮肤形成物理的膜，帮助防御以避免外部潜在危险要素及毒性物质影响。皮肤成为与外部环境的接触地点，也是多样微生物(真菌、细菌、病毒及小幼虫)的聚集地。根据物理及化学功能的选择，微生物适应特化的缝隙而营建栖息地。一般而言，皮肤凉爽并呈现酸性性质，保持干燥的状态。从结构上而言，表皮(epidermis)构成了皮肤壁垒，发挥阻断微生物和毒素侵入、保持水分的重要作用。表皮的最上层由角质层(stratum corneum)构成，与角质细胞(keratinocyte)分化掉落。所述表皮具有又称为“砖块与灰浆结构”的形态。皮肤组织经过持续的自我恢复过程，反复进行经最后分化过程的鳞屑(squames)不断从皮肤组织脱落的过程。

另一方面，使糖发酵而获得能量并生成大量乳酸的细菌被总称为乳酸菌(Lacticacid bacteria)。乳酸菌栖息于肠内并与人体的消化系统共生，担负分解纤维质及复合蛋白质而成为重要营养成分的作用。另外，由于使肠内环境保持酸性，因而抑制有害细菌的生长，发挥改善腹泻及便秘、合成维生素、降低血液胆固醇等作用。乳酸菌具有强力结合于肠粘膜和上皮细胞的特性，对调节肠道菌群带来许多帮助，增进巨噬细胞及脾脏的活性，表现出分泌及促进免疫反应相关物质的效果。另外，还具有免疫调节功能，对特应性及过敏相关疾病有效。

在化妆品领域，乳酸菌培养液自1955年商品化以来，至今仍在使用，主要利用链球菌(Streptococcus)属、乳杆菌(Lactobacillus)属、乳球菌(Lactococcus)属、明串珠菌(Leuconostoc)属、双歧杆菌(Bifidobacterium)属等进行着活跃研究，包括直接在培养液中发酵、过滤或提取等原料形态以及接种于活性材料并发酵后过滤或提取等。

其中，作为利用双歧杆菌(Bifidobacterium)属而应用于多样用途的技术，公开了韩国授权专利公报第10-1958686号《含有动物双歧杆菌乳亚种双歧杆菌hy8002作为有效成分的用于防止及改善微尘导致的皮肤损伤的组合物》、韩国授权专利公报第10-1788544号《含有复合乳酸菌培养物的皮肤壁垒强化用化妆品组合物》、韩国授权专利公报第10-1802963号《利用发酵提取物的化妆品组合物》等。

如果再次考查皮肤生态环境，物理要素与生物学要素充分交融，提供多样的栖息地，进而可以设想人与微生物之间实现美妙的均衡。共生关系的均衡一旦破坏，则同时发生皮肤崩溃和感染。

因此，本发明人发现了分离鉴定的新双歧杆菌属GFC-B09(Bifidobacteriumsp.GFC-B09)菌株(保藏号：KCCM12263P)具有增多作为皮肤-微生物群(skin-microbiome)菌株的表皮葡萄球菌(S.epidermidis)、组胺降解酶能力、过敏抑制能力、DNA修复能力、皱褶改善能力、美白能力、皮肤致密度及皮肤弹力改善能力的事实，从而完成了本发明。

【现有技术文献】

【专利文献】

(专利文献1)韩国授权专利公报第10-1958686号

(专利文献2)韩国授权专利公报第10-1788544号

(专利文献3)韩国授权专利公报第10-1802963号

发明内容

要解决的问题

本发明目的在于提供一种具有作为皮肤-微生物群(skin-microbiome)菌株的表皮葡萄球菌(S.epidermidis)增多、组胺降解酶能力、过敏抑制能力、DNA修复能力、皱褶改善能力、美白能力、皮肤致密度及皮肤弹力改善能力的新菌株。

本发明另一目的在于提供一种培养液的制备方法及由此制备的培养液，其特征在于，包括将新菌株接种于MRS培养基并培养的步骤。

本发明又一目的在于提供一种化妆品组合物，其特征在于，包含新菌株或其培养液作为有效成分。

解决问题的手段

为了达成如上所述目的，本发明提供一种具有作为皮肤-微生物群(skin-microbiome)菌株的S.epidermidis增多、组胺降解酶能力、过敏抑制能力、DNA修复能力,皱褶改善能力、美白能力、皮肤致密度及皮肤弹力改善能力的动物双歧杆菌乳亚种GFC-B09(Bifidobacterium animalis subsp.Lactis GFC-B09)菌株(保藏号：KCCM12263P)。

在本发明中，其特征在于，所述菌株来源于熊蜂。

另外，本发明提供一种培养液的制备方法，其特征在于，包括：将动物双歧杆菌乳亚种GFC-B09(Bifidobacterium animalis subsp.Lactis GFC-B09)菌株(保藏号：KCCM12263P)接种于MRS培养基并培养的步骤。

在本发明中，其特征在于，所述培养在32～37℃下执行90～130小时时间。

另外，本发明提供以动物双歧杆菌乳亚种GFC-B09(Bifidobacterium animalissubsp.Lactis GFC-B09)菌株(保藏号：KCCM12263P)培养的培养液。

另外，本发明提供一种化妆品组合物，其特征在于，包含动物双歧杆菌乳亚种GFC-B09(Bifidobacterium animalis subsp.Lactis GFC-B09)菌株(保藏号：KCCM12263P)或其培养液作为有效成分。

在本发明中，其特征在于，所述化妆品组合物具有S.epidermidis增多、组胺降解酶能力、过敏抑制能力、DNA修复能力、皱褶改善能力、美白能力、皮肤致密度及皮肤弹力改善能力。

发明的效果

本发明提供的动物双歧杆菌乳亚种GFC-B09(Bifidobacterium animalissubsp.Lactis GFC-B09)菌株(保藏号：KCCM12263P)菌株或其培养液，由于S.epidermidis增多、组胺降解酶能力、过敏抑制能力、DNA修复能力、皱褶改善能力、美白能力、皮肤致密度及皮肤弹力改善能力优秀，因而当将其作为有效成分应用于化妆品基料时，作为化妆品组合物的效果优秀。

附图说明

图1显示了本发明的动物双歧杆菌乳亚种GFC-B09(Bifidobacterium animalissubsp.Lactis GFC-B09)菌株(保藏号：KCCM 12263P)的碱基序列。

图2显示了将本发明的动物双歧杆菌乳亚种GFC-B09(Bifidobacterium animalissubsp.Lactis GFC-B09)菌株(保藏号：KCCM 12263P)的培养液对皮肤进行处理时S.epidermidis增多变化。

图3是显示本发明的动物双歧杆菌乳亚种GFC-B09(Bifidobacterium animalissubsp.Lactis GFC-B09)菌株(保藏号：KCCM 12263P)培养液的DAO酶生成增多结果的图表。

图4是显示本发明的动物双歧杆菌乳亚种GFC-B09(Bifidobacterium animalissubsp.Lactis GFC-B09)菌株(保藏号：KCCM 12263P)培养液的β-氨基己糖苷酶抑制效果的图表。

图5是显示本发明的动物双歧杆菌乳亚种GFC-B09(Bifidobacterium animalissubsp.Lactis GFC-B09)菌株(保藏号：KCCM 12263P)培养液的DNA修复(repair)效果的图表。

图6是显示将本发明的动物双歧杆菌乳亚种GFC-B09(Bifidobacterium animalissubsp.Lactis GFC-B09)菌株(保藏号：KCCM 12263P)的培养液对皮肤进行处理后出现的眼角皱纹改善率的图表。

图7是显示将本发明的动物双歧杆菌乳亚种GFC-B09(Bifidobacterium animalissubsp.Lactis GFC-B09)菌株(保藏号：KCCM 12263P)的培养液对皮肤进行处理后出现的皮肤色素改善率的图表。

图8是显示将本发明的动物双歧杆菌乳亚种GFC-B09(Bifidobacterium animalissubsp.Lactis GFC-B09)菌株(保藏号：KCCM 12263P)的培养液对皮肤进行处理后出现的皮肤致密度改善率的图表。

图9是显示将本发明的动物双歧杆菌乳亚种GFC-B09(Bifidobacterium animalissubsp.Lactis GFC-B09)菌株(保藏号：KCCM 12263P)的培养液对皮肤进行处理后出现的表皮弹力改善率的图表。

具体实施方式

因此，在本发明中，从分离自熊蜂的菌株中筛选具有S.epidermidis增多、组胺降解酶能力、过敏抑制能力、DNA修复能力,皱褶改善能力、美白能力、皮肤致密度及皮肤弹力改善能力的菌株，筛选优秀的菌株后，实施16s rRNA碱基序列分析的结果，确认了是属于双歧杆菌(Bifidobacterium)属(genus)的新微生物。因此，命名为双歧杆菌属GFC-B09(Bifidobacterium sp.GFC-B09)菌株，于2018年5月21日，保藏于韩国微生物保存中心(Korean Culture Center of Microorganisms)。

因此，本发明涉及具有S.epidermidis增多、组胺降解酶能力、过敏抑制能力、DNA修复能力、皱褶改善能力、美白能力、皮肤致密度及皮肤弹力改善能力的动物双歧杆菌乳亚种GFC-B09(Bifidobacterium animalis subsp.Lactis GFC-B09)菌株(保藏号：KCCM12263P)(以下简称为“GFC-B09”)。

此时，其特征在于，所述GFC-B09菌株来源于熊蜂。

另外，本发明涉及一种培养液的制备方法，其特征在于，包括将GFC-B09菌株接种于MRS培养基并进行培养的步骤。

所述培养所使用的培养基可以使用通常者。其中，从能够最有效提高培养液收率的角度，优选使用MRS培养基(示蛋白胨No.3 10g、牛肉汁10g、酵母提取物5g、右旋葡萄糖20g、聚氧乙烯山梨醇酐单油酸酯(Polyoxyethylene sorbitan monooleate)1g、柠檬酸铵(ammonium citrate)2g、硫酸镁0.1g、硫酸锰0.05g、磷酸氢二钾2g、乙酸钠5g/L,pH 6.5)进行发酵。

将所述GFC-B09菌株在MRS液体培养基按1～3％水平接种而使得达到1.0×10⁷至1.0×10⁹后进行培养的步骤，其特征在于，在厌氧性条件下，在32～37℃下，执行静置培养90～130小时时间。在培养温度及时间超出所述范围的情况下，发酵菌株的培养条件不对，没有S.epidermidis增多、组胺降解酶能力、过敏抑制能力、DNA修复能力、皱褶改善能力、美白能力、皮肤致密度及皮肤弹力改善能力，或菌株不增殖，因而不推荐。

将如上所述培养的菌株在pH 3.8～4.2条件下过滤，在20～30℃下熟化10～16天时间，可以制备培养液。

另外，本发明涉及一种以动物双歧杆菌乳亚种GFC-B09(Bifidobacteriumanimalis subsp.Lactis GFC-B09)菌株(保藏号：KCCM12263P)培养的培养液。

所述培养液具有S.epidermidis增多、组胺降解酶能力、过敏抑制能力、DNA修复能力、皱褶改善能力、美白能力、皮肤致密度及皮肤弹力改善能力，因而作为化妆品组合物的效果非常优秀。

因此，本发明涉及一种化妆品组合物，其特征在于，包含动物双歧杆菌乳亚种GFC-B09(Bifidobacterium animalis subsp.Lactis GFC-B09)菌株(保藏号：KCCM12263P)或其培养液作为有效成分。

本发明的化妆品组合物可以具有选自由皮肤外用软膏、乳霜、软化化妆水、营养化妆水、面膜、精华素、护发素、洗发水、润丝、修护润发精华素、焗油膏、凝胶、润肤液、柔肤水、护肤水、爽肤水、乳液、牛奶润肤露、保湿乳液、营养乳液、按摩乳霜、营养乳霜、眼霜、保湿霜、护手霜、粉底、营养精华素、防晒霜、肥皂、清洁泡沫、清洁乳液、清洁霜、身体乳液和洁面乳构成的组的剂型，但不限于此。这些各剂型的组合物可以含有该剂型的制剂化所需的适当的各种基质和添加物，这些成分的种类和量可以由从业人员容易地选定。

在本发明的剂型为糊剂、乳霜或凝胶的情况下，作为载体成分，可以利用动物纤维、植物纤维、蜡、石蜡、淀粉、黄蓍胶、纤维素衍生物、聚乙二醇、硅酮、膨润土、二氧化硅、滑石粉、氧化锌等。

在本发明的剂型为粉剂或喷雾剂的情况下，作为载体成分，可以利用乳糖、滑石粉、二氧化硅、氢氧化铝、硅酸钙或聚酰胺粉，特别是在喷雾剂的情况下，可以追加包括诸如氯氟烃、丙烷/丁烷或二甲醚的推进剂。

在本发明的剂型为溶液或悬浮液的情况下，作为载体成分，利用溶剂、增溶剂或乳浊化剂，例如有水、乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苄醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1,3-丁二醇油、甘油脂族酯、聚乙二醇或脱水山梨醇的脂肪酸酯等。

在本发明的剂型为悬浮液的情况下，作为载体成分，可以利用诸如水、乙醇或丙二醇的液态稀释剂，诸如乙氧基化异硬脂醇、聚氧乙烯山梨糖醇酯以及聚氧乙烯脱水山梨糖醇酯的悬浮液，微晶纤维素、偏氢氧化铝、膨润土、琼脂或黄蓍胶等。

在本发明的剂型为含表面-活性剂的卸妆油的情况下，作为载体成分，可以利用脂肪醇硫酸酯、脂肪醇醚硫酸酯、磺基琥珀酸单酯、羟乙基磺酸酯、咪唑鎓衍生物、甲基牛磺酸酯、肌氨酸酯、脂肪酸酰胺醚硫酸酯、烷基酰胺甜菜碱、脂肪醇、脂肪酸甘油酯、脂肪酸二乙醇酰胺、植物油、羊毛脂衍生物或乙氧基化甘油脂肪酸酯等。

在本发明的化妆品组合物中，所述培养液可以以所述组合物的总重量为基准，含有0.01至90重量％，优选地，可以含有3至15重量％，但只要包含能够提供S.epidermidis增多、组胺降解酶能力、过敏抑制能力、DNA修复能力、皱褶改善能力、美白能力、皮肤致密度及皮肤弹力改善能力的有效量，则不限于此。

下面通过实施例，更详细地说明本发明。这些实施例只用于更具体地说明本发明，根据本发明要旨，本发明的范围不限于这些实施例，这是本发明所属技术领域的普通技术人员不言而喻的。

<实施例1>Bifidobacteriumsp.GFC-B09菌株的分离

从熊蜂摘取肠子，在MRS培养基或Bifidobacterium选择培养基中振荡后，将其稀释为10^-4倍(体积)的样本0.1mL涂抹于MRS琼脂培养基(Peptospecial 10g、牛肉汁10g、酵母提取物5g、葡萄糖20g、柠檬酸铵2g\乙酸钠5g、硫酸镁0.2g、硫酸锰0.05g、磷酸氢二钾2g、琼脂15g、聚山梨酯80 1g/L,pH 6.2±0.2,MBcell(Cat.No.MB-M1025))，在厌氧性恒温箱中，在37℃下培养2天。对形成的聚落进行提纯分离培养，在厌氧恒温箱中再次培养24小时时间后，分离形成的单一菌落。筛选所分离菌株中的S.epidermidis增多、组胺降解酶能力、过敏抑制能力、DNA修复能力、皱褶改善能力、美白能力、皮肤致密度及皮肤弹力改善能力优秀的GFC-B09菌株。

<实施例2>筛选菌株16s rRNA碱基序列分析

对最终筛选的GFC-B09菌株的gDNA，利用作为通用引物的序列号1：27F(5'AGA GTTTGA TCM TGG CTC AG 3')与序列号2：1492R(5'TAC GGY TAC CTT GTT ACG ACT T 3')，通过16s DNA碱基序列分析，确认了为双歧杆菌(Bifidobacterium)菌株(序列号3)，命名为动物双歧杆菌乳亚种GFC-B09(Bifidobacterium animalis subsp.Lactis GFC-B09)菌株，于2018年5月21日保藏于作为国际微生物专利保藏机构的韩国微生物保存中心(KCCM)，获得保藏号KCCM12263P。

<实施例3>GFC-B09菌株培养液的制备

将分离的GFC-B09菌株1％接种于MRS培养基，使得达到1.0×10⁹细菌数。接种后，在厌氧状态、37℃下，实施120小时时间静置培养。结束培养后，确认pH是否形成为4.0(误差0.2)，如果目视确认培养液呈深褐色，则结束培养，实施0.2μm过滤(微孔)除菌。过滤完成后，在常温下经过2周时间熟化，制备了GFC-B09菌株的培养液。

<实施例4>受试者与皮肤-微生物群样本采集

本实验中使用的样本在GFC生命科学研究所，以获得事先同意的受试者为对象实施实验。作为试验所使用的原生菌(Probiotics)，使用了GFC-B09菌株的培养液，将培养后去除菌体的培养液应用于受试者的面部皮肤，共72小时时间后，采集皮肤样本用于分析。此时，利用棉签拭子法采集，通过用纱布擦拭来采集皮肤样品。皮肤驻留微生物的采集分为处理前、处理后、未处理(休止期)及再处理组进行。

<实施例5>皮肤驻留微生物的genomic DNA提取及DNA扩增

将从皮肤采集的样本在0.85％NaCl中悬浮，取上清液进行离心分离(17,000rpm/m)，取得菌体，在灭菌的生理盐水中清洗菌体1次后，使用FastDNA SPIN KIT(MPBiomedical,France)提取DNA。为了对提取的DNA的16S ribosomal DNA基因进行扩增，利用了附着有序列号4：GC clamp(5'-CGCCCGGGGCGCGCCCCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGG-3')的序列号5：341F(5'-CCTACGGGAGGCAGCAG-3')和序列号6：518R(5'-ATTACCGCGGCTGCTGG-3')。PCR反应是在含有0.4mM dNTP、0.5单位Taq聚合酶、4mM Mg²⁺的Takara Perfect Premix(Takara公司，日本)10μl中，分别添加DNA模板(20μg/mL)1μl、1.0μM正向引物和1.0μM反向引物，其余添加蒸馏水，使总体积达到20μl。PCR反应利用C1000-Dual(Bio-Rad，美国)，使用在将温度从64℃降低到50℃的同时实施2轮扩增的降落PCR方法，最终在72℃下处理8分钟后，在4℃下保管。利用获得的PCR产物，用于DGGE(Denaturing Gradient GelElectrophoresis)分析。

<实施例6>变性梯度凝胶电泳(Denaturing Gradient Gel Electrop horesis：DGGE)

在DGGE分析中使用了D-code系统(Bio-rad公司，美国)。使用的聚丙烯酰胺凝胶浓度为8％，制作使得40％聚丙烯酰胺双溶液29：1(3.3％C)(Bio-rad公司，美国)竖直地形成40％～60％之间浓度梯度。此时使用的变性剂为7M尿素和40％(w/v)甲酰胺(西格玛公司，美国)。在D-code系统中填充约7l的TAE缓冲液(20mM Tris，10mM乙酸，0.5mM EDTA，pH8.0)，将2×负载染料(0.05％溴酚蓝、0.05％二甲苯蓝、70％甘油)与PCR产物等量混合，在50V下实施电泳800分钟时间。结束电泳的聚丙烯酰胺凝胶在Redsafe(Intron公司，韩国)溶液中染色15分钟后，分析表现出的特定波段。DGGE结果的band intensity利用GelCompar2(Bionumeric公司，比利时)，对图像进行直方图及数值化而分析。

结果，从图2可以确认，有赖于GFC-B09菌株培养液处理，存在作为有益于保湿活性的皮肤驻留菌的S.epidermidis增多效果。即，确认了当将处理前组设置为增减率100％时，GFC-09菌株培养液处理时增多610％，相反，休止期时减小150％左右，再处理时增多327％。

<实施例7>组胺减低效果

为了确认实施例3制备的GFC-B09菌株培养液的组胺减低效果，评价了作为组胺降解酶的DAO(二胺氧化酶)活性。使用基于标记的组胺与未标记的组胺竞争性结合于抗组胺抗体的原理的组胺酶免疫分析试剂盒(Spi bio公司，法国)，利用405～414nm之间的吸光率测量了标记的组胺，确认了减低的组胺。详细方法利用相应试剂盒内协议。

从图3确认了DAO活性随着处理时间而增加，最大呈现2.27U/L(*unitdefinition：1Unit(U)of DAO will catalyze the conversion of 1u mole ofputrescine to pyrroline plus NH₃,and H₂O₂per min at pH 7.5)的DAO活性，因而组胺降解酶能力优秀。

<实施例8>过敏抑制效果：β-氨基己糖苷酶抑制实验

为了确保实施例3制备的GFC-B09菌株发酵物的过敏抑制能力，确认了作为过敏反应指标物质的β-氨基己糖苷酶的释放抑制能力。

这是将作为鼠的肥大细胞株的RBL-2H3细胞，利用含有10％胎牛血清及1％青霉素/链霉素的DMEM培养基，在37℃、5％CO₂环境的培养器中培养并用于试验。将如此培养的RBL-2H3细胞分注于24孔板，每孔为2.25×10⁵个细胞，然后利用200ng/ml IgE导敏，在CO₂培养器中隔夜(overnight)培养。之后利用siraganian缓冲液实施细胞清洗后，处理siraganian缓冲液中溶解的试料，在CO₂培养器中培养1小时时间。然后，处理使得DNP-HSA最终达到50ng/ml，在CO₂培养器中培养1小时30分钟后，收集上清液。将收集的上清液50μl和5mM对硝基苯基-N-乙酰基-b-D-氨基葡萄糖50μl在37℃下培养1小时30分钟后，利用0.2M柠檬酸盐缓冲液终结反应，在405nm下测量吸光率，根据下列数学式1导出结果。

[数学式1]

β-氨基己糖苷酶抑制率(％)＝(试验物质处理组吸光率值/试验物质无处理组吸光率值)×100

从图4确认了当GFC-B09菌株发酵物4％处理时，相比无处理组，作为过敏反应指标物质的β-氨基己糖苷酶的释放最大抑制30％，过敏抑制能力优秀。

<实施例9>DNA修复效果

在细胞染色后，利用荧光显微镜确认了实施例3制备的GFC-B09菌株发酵物的DNA修复能力。

将作为人来源成纤维细胞的hFF(human foreskin fibroblast：人包皮成纤维细胞)细胞，利用含有10％胎牛血清(FBS)及1％青霉素/链霉素的DMEM培养基，在37℃、5％CO₂环境的培养器中培养。将所述培养的hFF细胞适量分注于60mm板，在37℃、5％CO₂环境的培养器中培养，附着于板。24小时后，更换为不含FBS的无血清培养基并培养24小时，照射UV40mJ而使DNA损伤，对试料进行处理，将试料处理后的DNA修复程度与UV照射+无处理组进行比较。

为了DAPI(4',6-二脒基-2-苯基吲哚)染色及结果分析，将细胞利用4％福尔马林固定10分钟后，利用TBS-T充分冲洗，利用DAPI染色剂将细胞染色后，通过荧光显微镜确认了DNA修复能力。

从图5确认了当GFC-B09菌株发酵物处理时，损伤的DNA最大减少50％，因而确认了损伤的DNA的修复能力。

<实施例10>临床试验

本临床试验委托大韩皮肤科学研究所实施，试验号KDRI-2019-062、IRB批准号KDRI-IRB-19062，根据大韩皮肤科学研究所的自身实验规程及临床试验实施基准(GoodClinical Practice)，诚实地实施及履行。

在为期4周的试验期间，以11名受试者为对象试验的结果，使用了试料的试验部位，自试料使用4周后起，相比使用之前达到统计学上显著的水平(p<0.05)，眼角皱纹指数、皮肤色素指数(M-value)减小，皮肤致密度及表皮弹力增加，确认了试验试料可以有助于改善眼角皱纹、皮肤美白(改善色素过量沉积症)、皮肤致密度及表皮弹力。另外，在试验期间未发生特别的异常症状，确认了是安全的物质。

详细临床试验方法如下。

1.试验物质应用方法

为了与实际使用方法一致，向受试者培训了试验委托人提供的使用方法。委托人提供的使用方法如下：早晨、晚上取适量轻轻涂于整个面部。

2.试验顺序

1)首次访问

-自访问日12小时前起，禁止使用基础产品。

-受试者对试验方法、日程及危险性和可能的异常反应等听取说明，编写基础信息，签署同意书。

-利用试验者提供的基准洗面剂洗脸后，利用纸巾轻轻拍打去除水气后，在恒温恒湿条件(20～24℃,40～60％RH)下稳定30分钟。

-利用

CR拍摄面部照片。

-为了每当评价时，可以在相同部位进行测量，如下所示划分测量部位后，实施设备测量。

A)Antera 3D拍摄试验部位

：包括两侧眼窝整体及一侧眼角的6cm×6cm大小的正方形区域

B)Mexameter(黑色素皮肤检测仪)测量试验部位

：面部两侧色素过量沉积症病变的各一处

C)超声测量试验部位

：从两侧外眼角(Lateral canthus)向水平外侧距离1cm地点

D)Cutometer(皮肤弹性测试仪)测量试验部位

：连接两侧嘴角和同侧耳珠(tragus)的虚拟线的1/2地点

-由皮肤科专业医生目视评价色素过量沉积症试验部位。

-培训受试者注意事项与试料用法后分发试料。

-试验期间每日通过电话等方法检查试料使用的适应度。

2)第二次访问(第2周)/第三次访问(第4周)

以与首次访问日相同的方法，在相同部位，拍摄面部照片并实施设备评价。

-由皮肤科专业医生目视评价色素过量沉积症试验部位。

-实施受试者对色素过量沉积症试验部位的主观评价。

-皮肤科专业医生评价有无异常反应。

-在最后访问日收取试料，向受试者支付受试费。

-为了减小测量误差，Antera 3D-Winkle index分析在完成所有图像拍摄的最后访问日实施。

-评价及分析方法

1)利用Antera 3D的眼角皱纹改善效果评价

-在试验前、试验2周后、试验4周后测量了眼角皱纹指数。

-如下所示将眼角皱纹改善程度导出为％值。

眼角皱纹改善率(％)＝试验前测量值-试验后测量值/试验前测量值×100

2)利用Mexameter的皮肤美白(改善色素过量沉积症)效果评价

-在试验前、试验2周后、试验4周后测量了皮肤色素数值。

-如下所示，将皮肤美白(改善色素过量沉积症)程度导出为％值。

皮肤美白(色素过量沉积症)改善率(％)＝试验前测量值-试验后测量值/试验前测量值×100

3)利用超声的皮肤致密度改善效果评价

-分析及检验了测量部位的试验前、试验2周后、试验4周后测量的皮肤致密度间的统计学显著性。

-皮肤致密度改善程度如下所示导出为％值。

皮肤致密度改善率(％)＝试验前测量值-试验后测量值/试验前测量值×100

4)利用Cutometer的弹力改善效果评价

-在试验前、试验2周后、试验4周后利用Cutometer测量了表皮弹力。

-如下所示，将改善程度导出为％值。

弹力改善率(％)＝试验前测量值-试验后测量值/试验前测量值X 100

5)由皮肤科专业医生进行的安全性评价

-评价了试验期间中是否发生使用试料导致的副作用(红斑、浮肿、鳞屑、发痒、刺痛、灼热感、僵硬、扎痛及其他异常症状)。

3.统计分析方法

1)利用Minitab 18(

18.1,Minitab公司)程序确认了显著性。

-结果值通过正态性检验(Ryan-Joiner Normality Test)推定为正态分布时，通过下面的参数统计法确认了显著性。

-同一组内前后结果值比较：试验前、后测量值的比较利用paired t-检验，反复测量3次以上时，通过反复测量方差分析(Repeated measure ANOVA)，在显著水平p<0.05中确认了显著性。

-2个以上不同组间结果值比较：两组间结果值的比较利用Welch's t-检验，3个以上组间结果值比较通过单因素方差分析(one-way ANOVA)，在显著水平p<0.05中确认了显著性。

-反复测量的2个以上不同组的结果值比较：通过反复测量方差分析(Repeatedmeasure ANOVA)，在显著水平p<0.05中确认了显著性，组间初始测量值显著不同时，通过将初始测量值当作协变量的协方差分析(Analysis of Covariance)，确认了组间结果值的差异。

-在正态性检验(Ryan-Joiner Normality Test)中，正态性被否定时，通过以下非参数统计法确认了显著性。

-同一组内前后结果值比较：试验前、后测量值的比较利用威尔科克森符号秩(Wilcoxon signed rank)检验，当反复测量3次以上时，通过Friedman检验，在显著水平p<0.05中确认了显著性。

-2个以上不同组间结果值比较：两组间结果值的比较利用曼-惠特尼U检验，3个以上组间结果值比较通过Kruskal-Wallis检验，在显著水平p<0.05中确认了显著性。

-反复测量的2个以上不同组的结果值比较：通过弗里德曼(Friedman)检验，在显著水平p<0.05中确认了组间结果值的差异。

-针对所有资料，连续型变数概括为平均与标准偏差，范围型变数概括为频度和百分率。

4.试验结果

[1]改善眼角皱纹

如图6所示，使用试料的试验部位自试验4周后，与试验前相比达到统计上显著的水平(p<0.05)，显现出眼角皱纹指数减小的样态，相反，使用对照试料的对照部位相比试验前，未显现出统计上显著水平(p<0.05)的变化。

试验部位的眼角皱纹指数利用了Antera 3D的压痕指数(Indentation index)分析值。确认了试验部位和对照部位在试验2周后，改善率分别为5.08％、-0.23％，在试验4周后为12.44％、2.61％，显示出试验部位的眼角皱纹得到改善。

[2]皮肤美白

如图7所示，使用试料的试验部位自试验2周后，相比试验前达到统计上显著的水平(p<0.05)，显现出皮肤色素指数(M-value)减小的样态，相反，使用对照试料的对照部位相比试验前，未显现出统计上显著水平(p<0.05)的变化。另外，通过组间比较对照统计确认的结果，可以确认试验部位与对照部位间统计上显著水平(p<0.05)的差异。

试验部位的美白(改善色素过量沉积症)通过设备评价、目视评价、受试者主观评价来进行。

设备评价利用Mexameter的M-value测量而进行，为了提高评价可靠性，每个部位共实施5次反复测量。评价结果，确认了试验部位和对照部位在试验2周后，改善率分别为10.38％、5.09％，在试验4周后为17.45％、1.92％，显示出试验部位的皮肤色素指数减小。

目视评价利用直观类比标度[0-9]，由包括皮肤科专业医生在内的熟练专家2人同时实施，评价彼此不同时，采纳更高的数值。评价结果，试验部位及对照部位均在试验前后未显现出显著差异，即使在组间比较中，也未显现出显著的差异。

受试者主观评价在第2周和第4周试验日进行，将试验部位及对照部位的好转程度分为三级进行评价。判断为使用试验试料的试验部位在第2周好转的人为11名，判断为在第四周试验部位好转的人为9名，判断为使用对照试料的对照部位在第2周好转的人为7名，判断为在第四周好转的人为10名。

[3]改善皮肤致密度

如图8所示，使用试料的试验部位与使用对照试料的对照部位自试验2周后，皮肤致密度相比试验前增加了统计上显著水平(p<0.05)，通过组间比较对照统计确认的结果，可以确认试验部位与对照部位间统计上显著水平(p<0.05)的差异。

确认了与试料使用前相比，使用2周后，试验部位和对照部位的致密度(Dermaldensity)改善率分别为16.20％,4.50％，使用4周后，试验部位和对照部位的致密度(Dermal density)改善率分别为25.18％,9.17％。这说明试验部位的皮肤致密度在试验试料使用后出现统计上显著水平(p<0.05)的增加，结果确认了试验试料具有皮肤致密度改善效果。

[4]改善皮肤弹力

如图9所示，使用试验试料的试验部位和使用对照试料的对照部位自试验4周后，皮肤弹力与试验前相比实现统计上显著水平(p<0.05)的增加，通过组间比较对照统计确认的结果，可以确认试验部位与对照部位间统计上显著水平(p<0.05)的差异。

在试验部位和对照部位，代表皮肤弹力的R7(Ur/Uf)值的改善率在试验2周后分别显示为7.51％、3.11％，试验4周后，分别确认为19.55％、7.23％，显示出试验部位的表皮弹力得到改善。

<制备例1>制备含有GFC-B09菌株培养液的化妆品

(1)化妆水制备

根据下表1记载的组成，根据通常方法制备了化妆水。

【表1】

成分	含量(重量％)
		实施例3(GFC-B09菌株培养液)	3.00
羟亚乙基纤维素(2％水溶液)	12.00
		黄原胶(2％水溶液)	2.00
1,3-丁二醇	6.00
		甘油	4.00
透明质酸钠(1％水溶液)	5.00
		净化水	68.00
合计	100.00

(2)乳液制备

根据下表2记载的组成，根据通常方法制备了化乳液。

【表2】

成分	含量(重量％)
		实施例3(GFC-B09菌株培养液)	3.00
抗坏血酸-2-磷酸镁盐	1.00
		水溶性胶原(1％水溶液)	1.00
柠檬酸钠	0.01
		柠檬酸	0.05
1,3-丁二醇	3.00
		净化水	91.94
合计	100.0

以上详细记述了本发明内容的特定的部分，这种具体记述只是优选的实施形态，并非由此限制本发明的范围，这是本行业的技术人员不言而喻的。因此，本发明的实质性范围由附带的权利要求项及其等价物所定义。

【保藏号】

保藏机构名：韩国微生物保存中心(KCCM)

保藏号：KCCM12263P；保藏日期：20180521

<110> 株式会社GFC生命科学

<120> 动物双歧杆菌乳亚种GFC-B09菌株及包含其的化妆品组合物

<130> OPP20010

<150> KR 19/0036785

<151> 2019-03-29

<160> 6

<170> KoPatentIn 3.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 通用引物 27F

<400> 1

agagtttgat cmtggctcag 20

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 通用引物 1492R

<400> 2

tacggytacc ttgttacgac tt 22

<210> 3

<211> 1481

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Bifidobacterium sp. GFC B09

<400> 3

gggcgtgggg gtcgtgctta ccatgcagtc gaacgggatc cctggcagct tgctgtcggg 60

gtgagagtgg cgaacgggtg agtaatgcgt gaccaacctg ccctgtgcac cggaatagct 120

cctggaaacg ggtggtaata ccggatgctc cgctccatcg catggtgggg tgggaaatgc 180

ttttgcggca tgggatgggg tcgcgtccta tcagcttgtt ggcggggtga tggcccacca 240

aggcgttgac gggtagccgg cctgagaggg tgaccggcca cattgggact gagatacggc 300

ccagactcct acgggaggcc agccagtggg ggaattattg ccacaatggg gcgccaagcc 360

ctgaatgcaa gcgaccgccg gcgtgccggg gatggaaggc ctttcggggt tgtaaacccg 420

cttttggttc aagggccaag gccacggttt tcggcccgtg ttgaattgga ttgtttcgaa 480

ttagcacccg gctaactacg tgccagcagc cgcggtaata cgtaggggtg cgagcgttat 540

cccggattta ttgggcgtaa aggggctcgt aggcggttcg tcgcgtcccg gtgtgaaagt 600

ccatcgccta acggtggatc tgcgccgggt acgggcgggc tggagtgcgg taggggagac 660

tggaattccc ggtgtaacgg tggaatgtgt agatatcggg aagaacacca atggcgaagg 720

caggtctctg ggccgtcact gacgctgagg agcgaaagcg tggggagcga acaggattag 780

ataccctggt agtccacgcc gtaaacggtg gatgctggat gtggggccct ttccacgggt 840

cccgtgtcgg agccaacgcg ttaagcatcc cgcctgggga gtacggccgc aaggctaaaa 900

ctcaaagaaa ttgacggggg cccgcacaag cggcggagca tgcggattaa ttcgatgcaa 960

cgcgaagaac cttacctggg cttgacatgt gccggatcgc cgtggagaca cggtttccct 1020

tcggggccgg ttcacaggtg gtgcatggtc gtcgtcagct cgtgtcgtga gatgttgggt 1080

taagtcccgc aacgagcgca accctcgccg catgttgcca gcgggtgatg ccgggaactc 1140

atgtgggacc gccggggtca actcggagga aggtggggat gacgtcagat catcatgccc 1200

cttacgtcca gggcttcacg catgctacaa tggccggtac aacgcggtgc gacacggtga 1260

cgtggggcgg atcgctgaaa accggtctca gttcggatcg cagtctgcaa ctcgactgcg 1320

tgaaggcgga gtcgctagta atcgcggatc agcaacgccg cggtgaatgc gttcccgggc 1380

cttgtacaca ccgcccgtca agtcatgaaa gtgggtagca cccgaagccg gtggcccgac 1440

ccttgtgggg ggagccgtct aatgatagat ctccgaggtc t 1481

<210> 4

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> GC clamp

<400> 4

cgcccggggc gcgccccggg cggggcgggg gcacgggggg 40

<210> 5

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 341F

<400> 5

cctacgggag gcagcag 17

<210> 6

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 518R

<400> 6

attaccgcgg ctgctgg 17

Claims (7)

1.一种具有表皮葡萄球菌(S.epidermidis)增多、组胺降解酶能力、过敏抑制能力、DNA修复能力、皱褶改善能力、美白能力、皮肤致密度及皮肤弹力改善能力的、保藏号为KCCM12263P的动物双歧杆菌乳亚种GFC-B09(Bifidobacterium animalis subsp.LactisGFC-B09)菌株。

2.根据权利要求1所述的保藏号为KCCM12263P的动物双歧杆菌乳亚种GFC-B09菌株，其特征在于，

所述菌株来源于熊蜂。

3.一种培养液的制备方法，其特征在于，包括：

将保藏号为KCCM12263P的动物双歧杆菌乳亚种GFC-B09(Bifidobacterium animalissubsp.Lactis GFC-B09)菌株接种于MRS培养基并培养的步骤。

4.根据权利要求3所述的培养液的制备方法，其特征在于，所述培养在32～37℃下执行90～130小时时间。

5.一种培养液，其特征在于，所述培养液以保藏号为KCCM12263P的动物双歧杆菌乳亚种GFC-B09(Bifidobacterium animalis subsp.Lactis GFC-B09)菌株培养。

6.一种化妆品组合物，其特征在于，包含保藏号为KCCM12263P的动物双歧杆菌乳亚种GFC-B09(Bifidobacterium animalis subsp.Lactis GFC-B09)菌株或其培养液作为有效成分。

7.根据权利要求6所述的化妆品组合物，其特征在于，

所述化妆品组合物具有S.epidermidis增多、组胺降解酶能力、过敏抑制能力、DNA修复能力、皱褶改善能力、美白能力、皮肤致密度及皮肤弹力改善能力。

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