KR102551065B1 - 김치로부터 유래된 LAB(lactic acid bacteria)을 유효성분으로 포함하는 항-바이오필름 조성물 - Google Patents

김치로부터 유래된 LAB(lactic acid bacteria)을 유효성분으로 포함하는 항-바이오필름 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 김치 유래 LAB를 유효성분으로 포함하는 항-바이오필름 조성물 및 항균 조성물, 이를 이용한 바이오필름 억제 방법에 관한 것으로, 본 발명의 김치 유래 LAB 균주인 Lactobacillus plantarum(기탁 번호: KCTC 14955BP) 및 Leuconostoc mesenteroides(기탁 번호: KCTC 14956BP)는 식품 매개 병원성 미생물에 대한 강력한 항균 활성을 가질 뿐만 아니라, 해산물 및 해산물 가공 표면에서 상기 식품 매개 병원성 미생물에 의한 바이오필름 형성을 억제하는 효과를 가지며, 바이오필름 형성과 관련된 QS 관련 유전자 및 독성 관련 유전자의 발현을 억제하는 효과를 가진다.

Description

김치로부터 유래된 LAB(lactic acid bacteria)을 유효성분으로 포함하는 항-바이오필름 조성물{Composition Comprising LAB Derived from Kimchi for Preventing Formation of Biofilm}
본 발명은 김치 유래 젖산 박테리아(lactic acid bacteria)를 유효성분으로 포함하는 항-바이오필름 조성물 및 이를 이용한 바이오필름 억제 방법에 관한 것이다.
지난 60년간 해산물 소비량은 전세계적으로 상승해왔다. 오징어, 게, 새우와 같은 다양한 해산물은 날 것, 양념된 것, 또는 말린 것으로 소비되고 있으며, 반찬, 즉석조리식품, 과자 등의 형태로 생산되고 있다.
하지만, 해산물은 생산과 유통의 어느 단계에서나 오염될 수 있으므로, 소비자는 해산물로 인한 질병에 특히 주의해야한다. 또한, 해산물은 포획된 후 음식-부패(food-spoilage) 병원체 및 생화학적 분해 때문에 다른 식품보다 훨씬 빠르게 부패하는 경향이 있다.
또한, 다른 식품과 달리, 해산물은 대부분 열 처리 없이 가공된다. 이에, 유통기한을 늘리고 해산물 매개 병원균을 억제하고 자체 수명을 연장하여 해산물의 부패를 감소할 수 있는 병원균에 대한 항균력이 있어야 할 뿐 아니라 이들 병원성 미생물이 군집을 이루어 바이오필름을 형성하는 것을 억제하여야 한다.
해산물을 부패시키는 병원성 미생물의 종류로는 Yersinia spp., Shigella spp., Vibrio spp., Salmonella spp., Klebsiella spp., Aeromonas hydrophila, Escherichia coli, Streptococcus iniae, 및 Edwardsiella tarda이 있다. 상기 병원성 미생물은 오염된 해양 환경에서 해산물을 오염시키고, 해산물의 표면(즉, 식품 표면), 해산물의 내부 장기, 또는 해산물 가공 시설(즉, 식품 가공 표면)에 부착하여 자라나면서 서로 군집을 이루어 바이오필름을 형성할 수 있다. 바이오필름은 부유 상태의 미생물보다 항생제에 대한 저항성이 1000배 이상 높고, 바이오필름을 형성하는 미생물의 종류에 따라 구조가 변화하기 때문에, 더욱 제거가 어렵다. 자연에서 대부분의 박테리아는 영양소의 접근성, 전단 변형력, 생리학적 환경과 같은 몇 가지 환경 요인에 의존하는 집적 공동체 내에서 산다. 생물막은 표면에 부착되고 외고분자 기질로 둘러싸인 하나 또는 여러 종류의 박테리아로 구성된 공동체이다. 이러한 형태의 존재는 항균성 요인, 특히 살균제와 면역계의 부작용으로부터 박테리아를 보호한다. 생물막을 형성한 박테리아는 표준 치료용 항생제보다 훨씬 높은 농도의 항생제가 존재해도 생존할 수 있는 능력이 있다고 알려져 있다. 생물막에서 미생물이 장기간 생존할 수 있는 가능성은 배양되지 않은 상태에서 이형성과 L형 형성에 기인한다. 다양한 종의 생물막 발달에 영향을 미치는 조건으로는 온도, pH, O2 수준, 유체역학, 삼투압, 특정 이온의 존재, 영양소, 생물 환경에서 유래한 요소 등이 있다.
또한, 바이오필름은 QS(quorum sensing)에 기반한 미생물들의 대표적인 집단 행동으로 형성되기 때문에, QS와 관련된 유전자 발현이 높게 나타난다는 특징이 있다. 또한, QS 관련 유전자는 독성 관련 유전자의 발현을 유도하며, QS는 박테리아가 세포 밀도에 대한 정보를 공유하고 그에 따라 유전자 발현을 조정할 수 있도록 하는 세포간 통신 과정이다. QS는 생물막의 형성 및 개발에 필수적인 역할을 한다. 생물막에 있는 병원성 박테리아는 QS 메커니즘을 이용하여 독성을 활성화하고 항생제 내성을 발달시킨다. 정족수 감지 박테리아는 병원균의 생발광(biofluorescence), 산란, 능력, 항생제 생산, 생체막 형성, 독성 인자 분비를 유도하는 자가 유도제라고 불리는 화학 신호 분자를 생성하고 방출한다. 따라서, QS 관련 유전자 또는 독성 관련 유전자의 발현을 억제하는 것은 바이오필름의 형성을 억제하는 데 큰 도움이 된다.
현재까지 식품 산업에 영향을 미치는 병원성 미생물 바이오필름의 형성을 억제하기 위해 여러 생물학적 작용제가 적용되어왔다. 그 중에서 젖산 박테리아(lactic acid bacteria; 이하 LAB라고 함) 및 LAB 유래 박테리오신(bacteriocin)은 '친환경물질'로 인식되고 있으며, 식품 자체 또는 식품 첨가물로 사용될 수 있다.
LAB를 사용한 종래의 기술로는 Hossain et al. (LWT, Inhibitory effects of probiotic potential lactic acid bacteria isolated from kimchi against Listeria monocytogenes biofilm on lettuce, stainless-steel surfaces, and MBEC™ biofilm device, (2020) Vol. 118, 108864) 또한 김치 유래 LAB를 이용하여 상추 표면에서 Listeria monocytogenes에 의한 바이오필름 형성 억제 효과를 개시하고 있으나, 해산물 표면 또는 해산물에서 많이 발견되는 Vibrio parahaemolyticus, Pseudomonas aeruginosa, 또는 E. coli와 같은 병원체에 의한 바이오필름 형성 억제에 대한 연구는 부족한 상황이다.
이에, 본 발명자들은 한국 발효식품 중 김치 유래 LAB 균주 중 2 가지 종류(J.27, M.21)를 분리하였고, 상기 LAB 분리균주들이 해산물에서 자주 발생하는 식품 매개 병원성 미생물인 V. parahaemolyticus, P. aeruginosa, 및 E. coli를 대상으로, 해산물 자체 및 해산물 접촉 표면에서 강력한 항균 활성을 가질 뿐만 아니라, 상기 식품 매개 병원성 미생물에 의한 바이오필름 형성을 억제하는 효과를 발견하여, 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 김치 유래 LAB(lactic acid bacteria)를 유효성분으로 포함하는 항-바이오필름(biofilm) 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명은 상기 항바이오필름 조성물을 이용한 바이오필름 형성 억제방법을 제공하는 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위한 본 발명의 일 측면은, 김치 유래 LAB을 유효성분으로 포함하는 항-바이오필름(biofilm) 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명에서 상기 “김치 유래 LAB”는 Lactobacillus plantarum 또는 Leuconostoc mesenteroides이다.
또한, 본 발명의 다른 측면은, 상기 김치 유래 LAB를 유효성분으로 포함하는 항-바이오필름 조성물을 바이오필름이 형성되었거나 바이오필름 형성이 예상되는 표면에 처리하는 단계;를 포함하는 바이오필름 형성 억제방법을 제공한다.
본 발명은 김치 유래 LAB를 유효성분으로 포함하는 항-바이오필름 조성물을 이용하여, 식품 중에서도 해산물에 많이 발견되는 V. parahaemolyticus, P. aeruginosa, 및 E. coli에 대하여 식품 표면 및 식품 접촉 표면에서 바이오필름의 형성을 억제하는 효과를 확인했을 뿐만 아니라, 상기의 조성물이 바이오필름 형성과 관련된 있는 QS 관련 유전자 및 독성 관련 유전자의 발현을 억제하는 효과가 있음을 확인하였다.
도 1은 16S rRNA 유전자 염기서열에 기초하여, 김치 유래 LAB 분리균주(J.27, M.21)의 계통수를 분석하여 나타낸 것이다.
도 2는 LAB 분리균주와 식품 매개 병원체(V. parahaemolyticus, P. aeruginosa, 및 E. coli)와 공배양 후, 식품 매개 병원체의 부유성 박테리아 성장 억제를 나타낸 것이다.
도 3은 LAB 분리균주와 식품 매개 병원체(V. parahaemolyticus, P. aeruginosa, 및 E. coli)와 공배 양 후, 25 ℃에서 식품(오징어) 표면에서 바이오필름의 형성 억제를 나타낸 것이다.
도 4는 LAB 분리균주와 식품 매개 병원체(V. parahaemolyticus, P. aeruginosa, 및 E. coli)와 공배양 후, 식품 접촉 표면에서 바이오필름의 형성 억제를 나타낸 것으로 (A)는 30℃의 고무(RB) 표면, (B)는 30℃의 HDPE 표면이다.
도 5는 3 가지 식품 매개 병원체인 (A) V. parahaemolyticus ATCC 27969, (B) P. aeruginosa ATCC 10145, 및 (C) E. coli ATCC 43894에서 QS 또는 독성(virulence) 관련 발현 레벨을 나타낸 것으로 LAB 처리 후 독성 및 바이오필름 형성의 하향 조절(down-regulation)을 나타낸 것이다.
도 6은 오징어 표면에서 (A) LAB 분리균주 J.27, (B) 세 가지 병원체 (V. parahaemolyticus ATCC 27969, P. aeruginosa ATCC 10145, 및 E. coli ATCC 43894), 및 (C) LAB 분리균주(J. 27)와 세 가지 병원체를 공배양한 후의 바이오필름 형성을 FE-SEM 이미지로 나타낸 것이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명의 일 측면은 김치 유래 LAB(lactic acid bacteria)를 유효성분으로 포함하는 항-바이오필름(biofilm) 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 측면에서, 김치 유래 LAB(lactic acid bacteria)를 유효성분으로 포함하는 균주의 생장을 억제하는 항균 조성물을 제공하는 것이다.
상기 김치 유래 LAB는 Lactobacillus plantarum(기탁 번호: KCTC 14955BP, 이하 M.21로 표기) 또는 Leuconostoc mesenteroides(기탁 번호: KCTC 14956BP, 이하 J.21로 표기)이다.
또한, 상기 김치 유래 LAB 분리균주는 L. plantarum 또는 L. mesenteroides를 단독으로 또는 L. plantarum 및 L. mesenteroides를 혼합하여 항-바이오필름 조성물의 유효성분으로 사용될 수 있다.
상기 바이오필름은 V. parahaemolyticus, P. aeruginosa, 및 E. coli로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 병원성 미생물에 의해 생성된 것이다.
또한, 상기 바이오필름은 식품 또는 식품과 접촉한 표면에 생성된 것일 수 있다. 특히, 가열 조리하지 않은 날 것 상태의 식품을 가공하고 조리할 때, 사용되는 기구들의 표면에 부착하여 바이오필름을 형성할 수 있다. 통상적으로 식품 가공을 위해 사용되는 기구는 유리, 스테인레스강, 고무, 또는 다양한 소재의 플라스틱 등이 있다.
또한, 상기 항-바이오필름 조성물은 QS(quorum sensing) 관련 유전자 또는 독성(virulence) 관련 유전자의 발현을 억제할 수 있다. 상기 QS 관련 유전자는 luxS, lasB, rhlR, 또는 pfs을 포함하고, 상기 독성 관련 유전자는 flaA, vp0962, phzA2, 또는 rpoS을 포함한다.
본 발명의 또 다른 측면에서, 상기 김치 유래 LAB를 유효성분으로 포함하는 항-바이오필름(biofilm) 조성물을 바이오필름이 형성되었거나 바이오필름 형성이 예상되는 표면에 처리하는 단계;를 포함하는 바이오필름 형성 억제방법을 제공한다.
본 발명의 구체적인 실시예 및 실험예에서, 먼저 김치에서 두 종류의 LAB를 분리하여 계통수를 분석하였다. 두 종류의 LAB 중 하나인 J.27은 Leuconostoc mesenteroides로 확인되었고, 다른 하나인 M.21은 Lactiplantibacillus plantarum으로 확인되었다(도 1 및 표 1).
본 발명의 김치 유래 LAB 분리균주의 항생(antibiotic) 민감성을 분석하였다. 식품 또는 식품 접촉 표면에 사용되기 위해서, 항생 민감성을 갖는 것은 중요하며 이는 식품의 안전성과 관련되어 있다. 유럽식품안전청(EFSA)의 지침에 따르면 미생물 균주는 설정된 임계값보다 높은 농도의 항균제에 의해 억제되지 않으면 “내성(resistant)”으로 간주되며 해당 임계값보다 낮은 농도에 의해 억제될 때 “민감한(sensitive)” 것으로 간주된다. 특정 항생제에 대한 LAB균주의 선천적 내성은 세포벽 구조와 유출 내성 시스템 때문인 것으로 추정되며, 이러한 특성은 오히려 사람의 위장염 치료에 도움이 될 수 있다고 알려져 있다. 22가지 항생제에 대한 본 발명의 김치 유래 LAB 분리균주의 항균 민감성 및 항생 민감성을 분석한 결과(표 2), 분리균주 별로 항생제에 대한 민감성 정도는 달랐으나, 분리균주 J.27 및 M.21은 각각 13개의 항생제에 대해 "내성”을 나타냈고, 5개의 항생제에 “적당히 민감함”을 나타내었으며, 4개의 항생제에 “민감함”을 나타내었다.
LAB의 항생제 민감도는 세균 종과 균주의 특이성뿐만 아니라 지리적 기원과 분리 물질에 따라 달라진다. 특정 항생제에 대한 LAB 균주의 선천적 내성은 세포벽 구조와 유출 내성 시스템 때문인 것으로 추정된다. 이러한 특성은 사람의 위장염 치료에 도움이 될 수 있다. 예를 들어 항생제와 함께 투여하더라도 결장 감염을 예방하고 통제하기 위해 항생제 내성 프로바이오틱스 LAB 균주가 사용될 수 있어 장내 미생물상의 회복을 도울 수 있다.
또한, 본 발명의 김치 유래 LAB를 유효성분으로 포함하는 항-바이오필름 조성물을 이용하여, LAB 분리균주의 자가응집(autoaggregate) 및 병원성 박테리아와의 공동응집(coautoaggregate) 능력을 분석하였다. 미생물 간의 세균 응집(자가응집, 공동응집)은 여러 생태학적 차원에서 중요한 역할을 한다. 특히 LAB의 자가응집력은 숙주 방어 매커니즘에 기여하는 장벽을 장에 형성하여 음식 매개 병원체의 침입과 군집을 막을 수 있다. 자가응집 및 공동응집 효율성은 균주마다 다르며 시간에 따라 달라지는 것으로 보고되며, 주어진 표면에 부착하고 바이오필름을 개발하는 박테리아 균주의 능력에 대한 주요 결정 요인이다. 이에, 본 발명의 김치 유래 LAB 분리균주의 자가응집 능력을 분석할 결과, 대조군과 비교하여 우수한 자가응집 계수를 나타내었으며, 병원성 박테리아와의 공동응집 능력 역시, 4 시간 및 24 시간 모두에서 우수하였다 (표 3)
또한, 본 발명의 김치 유래 LAB 분리균주를 이용하여 부유 상태의 박테리아의 성장 억제를 확인한 결과, V. parahaemolyticus, P. aeruginosa, E. coli 모두에서 성장 억제 효과를 확인하였으며, 특히 혼합 LAB 균주를 사용하였을 때 단독 균주를 사용한 경우보다 우수한 박테리아 성장 억제효과를 나타났다(도 2).
또한, 본 발명의 김치 유래 LAB를 유효성분으로 포함하는 항-바이오필름 조성물을 이용하여, 식품 표면(오징어)에서 세 가지 병원성 미생물의 바이오필름 형성 억제 효과를 분석한 결과, 대조군과 비교하여 김치 유래 LAB 분리균주를 처리했을 때 바이오필름 형성 억제 효과가 우수하였으며, 특히 혼합 LAB 균주(J.27+M.21)를 사용하였을 때 단독 균주를 사용한 경우보다 우수하였다. 또한, V. parahaemolyticus에 의한 바이오필름에서 혼합 LAB 분리균주를 사용하였을 때 가장 우수한 바이오필름 형성 억제 효과가 나타났다(도 3).
또한, 본 발명의 김치 유래 LAB를 유효성분으로 포함하는 항-바이오필름 조성물을 이용하여, 식품 접촉 표면(RB 및 HDPE)에서 세 가지 병원성 미생물의 바이오필름 형성 억제 효과를 분석한 결과, 식품 표면에서 바이오필름 형성 억제 효과와 유사하게, 모든 종류의 표면에 있어서 대조군과 비교하여 김치 유래 LAB 분리균주를 처리했을 때 바이오필름 형성 억제 효과가 더 우수하였으며, 특히 혼합 LAB 균주(J.27+M.21)를 사용하였을 때 단독 균주를 사용한 경우보다 우수하였다. 또한, P. aeruginosa에 의한 바이오필름에 혼합 LAB 분리균주를 사용하였을 때 가장 우수한 바이오필름 형성 억제 효과가 나타났다(도 4).
또한, 본 발명의 김치 유래 LAB를 유효성분으로 포함하는 항-바이오필름 조성물을 이용하여 QS(quorum sensing) 관련 유전자 또는 독성 관련 유전자의 발현 억제를 분석하였다. QS는 세균이 개체군 밀도를 모니터링하고 자가유도물질로 불리는 신호분자를 방출해 서로 통신하는 것을 지칭하는 것으로, QS는 세균 내의 여러 표현형을 조절하고 독성인자(독성 관련 유전자) 발현 및 바이오필름 형성 등과 같은 다양한 생리학적 과정을 제어할 수 있다. 본 발명의 세 가지 병원성 미생물과 관련된 QS관련 유전자 또는 독성 관련 유전자를 살펴보면, V. parahaemolyticus와 관련된 유전자로는 flaA, vp0962, 및 luxS 등이 있고, P. aeruginosa와 관련된 유전자로는 lasB, rhlR, 및 phzA2 등이 있고, Escherichia coli와 관련된 유전자로는 luxS, pfs, 및 rpoS 등이 있다(표 5). 특히, rpoS 는 바이오필름의 생성을 촉진하는 세포외 기질(extracellular factor)을 생성하고, luxS 는 AI-2분자 합성과 관련하여 QS와 관련이 있으며, 녹아웃 돌연변이를 생성하여 바이오필름을 형성하는 것으로 알려져 있다. flaA 유전자는 박테리아가 액체를 통해 이동할 수 있게 하기 때문에, 편모 운동성 관련 유전자의 하향 조절은 세균의 움직임과 주어진 표면에 대한 초기 부착을 방해할 수 있다. 따라서, 상기와 같은 QS 관련 유전자 또는 독성 관련 유전자의 발현을 하향 조절하면, 세포와 세포 간 통신을 방해하고 식품 병원성의 성장을 감소시키고, 나아가 바이오필름의 형성을 억제시킬 수 있다.
이에, 김치 유래 LAB 분리균주의 QS 관련 유전자 또는 독성 관련 유전자의 발현 억제 효과를 분석한 결과, 대조군과 대비하여 유의적으로 독성 유전자의 발현이 낮아짐을 확인하였으며, 특히 혼합 LAB 분리균주에서 우수한 감소 효과를 확인하였다(도 5). 특히 혼합 LAB 균주(J.27+M.21)를 사용하였을 때 단독 균주를 사용한 경우보다 우수하였다.
또한, 본 발명의 김치 유래 LAB를 유효성분으로 포함하는 항-바이오필름 조성물 처리에 따른 바이오필름 구조 및 형태를 관찰하였다. 전계방사주사전자현미경법(FE-SEM)을 이용하여 오징어 표면에서 바이오필름 형태 관찰한 결과, 병원성 박테리아(V. parahaemolyticus, P. aeruginosa, 및 E. coli)와 LAB 분리균주를 공배양한 경우, 세 가지 병원성 박테리아 모두에 대해 바이오필름의 형성이 억제됨을 확인하였다(도 6).
이하, 본 발명은 하기 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것이 아니다.
<실시예 1> 식품 매개 병원성 미생물 배양
본 발명에서는 3 가지 종류의 식품 매개 병원성 박테리아 균주인 ATCC(American Type Culture Collection)의 V. parahaemolyticus ATCC 27969 (VP 27969), P. aeruginosa ATCC 10145 (PA 10145), 및 E. coli ATCC 43894 (EC 43894)를 사용하였다. VP 27969는 CHROMagar Vibrio [CHROMagar, Paris, France], PA 10145는 세팔로리딘 푸시딘 세트리미드(cephaloridine fucidin cetrimide) [CFC, Becton, Dickinson and Company (BD), Sparks, MD, USA], EC 43894는 에오신 메틸렌 블루(eosin methylene blue) [EMB, BD]의 한천(agar) 플레이트에서 성장하였다. 작업을 위한 배양물(working culture)의 준비를 위해서, 박테리아 세포는 2개의 하위 배양(10 mL 배지에 배양액 100 μL 접종 [105 -106 CFU/mL])을 통해 저장 조건 ( 80 ℃)에서 재활성화 되었고, 18시간 동안 37 ℃에서 Tryptic Soy Broth (TSB, BD GmbH, Heidelberg, Germany)에서 성장하였다.
부유성 박테리아(planktonic) 및 바이오필름 실험을 위해서, 박테리아성 세포는 원심분리 (10분동안 4 ℃에서 10,000×g)로 채취한 다음, 두 번 세척하고, PBS(phosphate-buffered saline)로 재부유하였다. 그 다음, 병원성 박테리아는 세포 농도 (CFU/mL)를 한천 플레이트에서 평가되었다. 작업(working) 병원성 배양액 (105 CFU/mL)은 0.1% 멸균 PW (peptone water, Oxoid, UK)에서 밤새 배양한 것을 연속적으로 희석하여(1:10) 얻어졌다.
<실시예 2> LAB 분리균주의 분리 및 배양
식품 매개 병원체(pathogen)을 억제하기 위해 사용된 LAB균주는 김치에서 분리하였다. 분리된 균주는 J.27 및 M.21이며, 혐기성 조건에서 48시간 동안 30 ℃에서 배양하였다. 농촌진층청 국립농업과학원 미생물은행(KACC)의 프로바이오틱스 박테리아인 Lactobacillus casei KACC 12413가 LAB 균주의 대조군으로 사용되었으며, LAB과 동일한 배양 조건에서 배양되었다.
LAB 분리균주는 저장 상태에서 재활성화 되었고 상기에서 언급한 배양 조건과 동일한 조건에서 MRS 배지(broth)에서 밤새 성장하였다. 박테리아 세포는 실시예 1과 동일한 방법으로 원심분리로 채취한 후, PBS에 재부유하였다. 그 다음. LAB 세포 농도 (CFU/mL)는 MRS 한천 플레이트에서 측정되었다. 작업 LAB 배양액 (107 CFU/mL)은 실시예 1과 동일한 방법으로 PW에서 연속적인 희석을 통해 얻어졌다.
하기 표 1은 LAB 분리균수와 이의 계통수 및 기탁 번호를 나타낸 것이다.
LAB 분리균주 계통수 기탁 번호
M.21 Lactobacillus plantarum KCTC 14955BP
J.21 Leuconostoc mesenteroides KCTC 14956BP
<실시예 3> LAB 분리균주의 유전자 염기서열 분석
김치 유래 LAB 분리균주는 16S rRNA 유전자 염기서열 분석을 통해 확인하였다. 두 개의 LAB 분리균주에서 게놈 DNA를 추출한 후, PCR(polymerase chain reaction) 분석을 SolGent Analysis Services(SAS, Daejeon, Republic of Korea)로 수행하였다. 하기의 프라이머가 PCR 분석에 사용되었다: 27F (5′ -AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3′) 및 1492R (5′ -TAC GGY TAC CTT GTT ACG ACT T-3′). 그 다음, 미국 국립생명공학정보센터(NCBI) 데이터베이스에서 상동 뉴클레오타이드 서열을 찾기 위해 BlastN search (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)가 이용되었고, MEGA6.0 프로그램을 사용하여 계통수(phylogenetic tree)를 구성하였다.
그 결과, 도 1에 나타나있는 것과 같이, 김치 유래 LAB 분리균주 J.27 및 M.21은 두 개의 주요 LAB 속인 Leuconostoc 및 Lactobacillus인 것으로 분석되었다. 상동 서열에 기반하여, LAB 분리균주 J.27는 Leuconostoc mesenteroides로 확인되었고, LAB 분리균주 M.21은 Lactobacillus plantarum로 확인되었다.
<실험예 1> LAB 분리균주의 항생(antibiotic) 민감성 스크리닝
유럽식품안전청(EFSA)의 지침에 따르면 설정된 임계치 이상의 농도로 주어진 항균제에 의해 억제되지 않는 경우 박테리아 균주는 "내성"이 있는 것으로 간주되며 해당 임계값과 같거나 그보다 낮은 농도에 의해 억제되는 경우 "민감" 또는 "예민" 한 것으로 간주된다(EFSA, 2012).
일반적으로 락토바실리는 반코마이신, 바시트라신, 세폭시틴, 메트로니다졸, 니트로푸란토인, 설파디아진, 클라인다시신, 클라인다시신, 클라인다시신, 클라인다시신 등에 대한 내성이 있다. LAB에 항생물질 제거 부위가 없다는 것은 특정 물질에 대한 내성을 일으키는 원인일 수 있다. 다양한 종류의 항생제에 대한 자연적인 내성은 세포벽 구조와 막 투과성과 관련이 있을 수 있다. 그러나 이 속성은 경쟁 우위를 나타낼 수 있다. LAB 프로바이오틱스의 내재 항생제 내성은 장내 감염의 치료와 통제, 특히 항생제와 함께 투여할 때 장내 미생물상 회복이 강화되기 때문에 치료 및 예방 목적으로 사용할 수 있음을 시사한다.
22가지 항생제에 대한 다양한 내성이 관찰되었다. J.27과 M.21 모두 항생제의 아미노글리코사이드 종류(예: 스트렙토마이신, 토브라마이신)에 대한 내성을 보였으며, 같은 부류의 아미카신과 젠타마이신 항생제에 대해서는 적당히 민감했다. LAB의 항생물계는 일반적으로 박테리아 종과 균주의 특이성에 의존한다. 본 연구에서 LAB J.27은 겐타마이신에 내성을 가졌고, M.21은 중간정도로 민감했다. 그러나 두 가지 LAB들은 클로로암페니콜, 미노시클린, 메로펜엠에 매우 민감했다. 또한, M.21은 카바페넴 계열 항생제인 이미페넴에 대한 민감성을 보인 반면, J.27은 이 화합물에 대한 내성을 보였다. 두 가지 LAB 균주는 프로바이오틱스 잠재력을 가지고 있으며, 보호 생물막 형성체로서 좋은 후보로 간주되며 세포질 막을 둘러싸고 있는 동종다당류 또는 이질다당류를 포함한 특정 구조적 구성 요소의 존재로 구별할 수 있다. 본 연구에서 두 개의 LAB 사이의 강력한 자가집합 계수를 관찰했으며 두 개의 LAB의 자가집합 능력은 장 상피세포에 대한 부착과 관련이 있으며 병원성 박테리아 군집화와 감염을 예방할 수 있다.
두 가지 LAB 분리균주의 항생 민감성은 Kirby-Bauer 디스크 확산(disk diffusion) 방법론을 이용하여 측정하였다. 각기 다른 22 종류의 항생제를 BD에서 (Becton, Dickinson and Company (BD), Sparks, MD, USA) 구매한 후, 제조사의 방법에 따라 보관하였다. 항생제를 포함한 디스크는 LAB 박테리아 접종물 (107 CFU/mL)이 심어진 MRS 한천 플레이트에 놓아졌다. 30 ℃에서 밤새 배양 후, 평가된 균주의 억제 지름이 측정되었으며, Clinical and Laboratory Standard Institute (CLSI) 가이드라인에 따라 “민감함(sensitive)”, “적당히 민감함(moderately sensitive)”, 또는 “내성(resistant)”로 분류하였다.
또한, LAB 분리균주 간의 길항 관계는 각자에 대한 민감성을 관찰하여 평가하였다. 각각의 상호작용은 한천 웰 확산(agar well diffusion) 방법을 약간 수정하여 특징지어졌다. 두 개의 MRS 한천 플레이트는 LAB 분리균주 J.27 및 M.21의 박테리아 부유액(107 CFU/mL)이 심어졌고, 5 mm 지름의 웰은 무균 코크-끌(cork-borer)을 사용하여 각각의 한천 플레이트로 잘렸다. 무세포 배양 상청액(cell-free culture supernatant; CFCS)는 원심분리로 남아있는 LAB 분리 박테리아 부유액으로부터 수집되었다(실시예 1과 동일한 원심분리 방법 사용). J.27 및 M.21 배양 플레이트의 각각의 웰은 J.27 및 M.21 CFCS 분액 70 μL로 채워졌다. 각자에 대한 LAB 분리균주의 민감성은 배양 후 각각의 배양 플에이트 (J.27 또는 M.21)의 억제 구역을 스크린하여 결정되었다.
그 결과를, 하기 표 2에 LAB 분리균주 (J.27, M.21)에 대한 22 가지 항생(antibiotic) 반응성을 분류하여 나타내었다.
Antibiotics LAB J.27 LAB M.21
Streptomycin Ra R
Tobramycin R R
Cefepime R R
Ceftazidime R R
Ceftriaxone R R
Ciprofloxacin R R
Nalidixic acid R R
Levofloxacin R R
Penicillin R R
Ticarcillin-Clavulanic acid R R
Polymyxin B R R
Vancomycin R R
Cefotaxime MS R
Gentamicin MS MS
Amikacin MS MS
Doxycycline MS MS
Tetracyclin MS MS
Piperacillin-Tazobactam S MS
Imipenem R S
Chloramphenicol S S
Minocycline S S
Meropenem S S
a R: 내성, resistant (≤15 mm); MS: 적당히 민감함, moderately sensitive (16-20 mm); S: 민감함, sensitive (≥21 mm).
LAB 분리균주는 아미노글리코사이드(aminoglycoside) 계열 항생제(예를 들어, 스트렙토마이신(streptomycin) 및 토브라마이신(tobramycin))에 대해서는 내성을 보였으나, 동일한 종류의 아미카신(amikacin) 및 젠타마이신(gentamicin)에 대해서는 적당히 민감함을 나타내었다. 즉, LAB의 항균제 감수성(antibiogram)은 박테리아의 종 및 균주에 따라 달라졌다. J.27은 젠타마이신에 내성을 보였으나, M.21은 적당히 민감함을 보였다.
다만, 모든 LAB 분리균주는 클로람페니콜(chloramphenicol), 미노싸이클린(minocycline), 및 메로페넴(meropenem)에 민감하였다. 또한, M.21은 카바페넴(carbapenem) 계열 항생제인 이미페넴(imipenem)에 민감하였으나, J.27은 내성을 나타내었다.
또한, 공배양 실험동안 상기의 두 개의 LAB 분리균주 사이의 박테리아 상호작용 및 민감성을 분석하였으나, 두 LAB 분리균주 사이의 길항작용은 관찰되지 않았다.
<실험예 2> 응집 분석
LAB 분리균주의 자가응집(autoaggregation) 능력 및 병원성 박테리아와 공동응집(coaggregation) 능력이 평가되었다. LAB 및 병원성 박테리아 세포는 원심분리로 밤샘 배양액으로부터 수집되었고, 두 번 세척 후, PBS(pH 7.2)로 재부유되었다(실시예 1과 동일한 방법). 최종 세포 밀도는 생존 박테리아 세포수(107-108 CFU/mL) 기준으로 OD600nm 0.3 ± 0.1로 조절되었다.
자가응집 분석을 위해서, 각각의 LAB 분리균주 부유액 1000 μL 은 1.6-mL 큐벳 (Q-VETTES 2712120, Ratiolab, Dreieich, Germany)으로 옮겨졌다. 공동응집 분석을 위해서, LAB 분리균주와 각각의 병원성 박테리아의 혼합물(LAB 부유액 500 μL + 병원성 박테리아 부유액 500 μL)은 1.6-mL 큐벳으로 옮겨졌다. 부유액을 포함하는 큐벳은 30 ℃ 배양되었다. 4시간 및 24시간에, OD600nm는 세포 자가응집 및 공동응집을 모니터링하여 기록되었다. 자가응집 또는 공동응집 계수는 하기와 같이 계산되어 퍼센트(%)로 표시되었다:
[(OD i - OD f )/ODi] Х 100
OD i 는 박테리아 부유액의 초기 OD600nm 값이고, OD f 는 박테리아 부유액의 최종 OD600nm 값이다.
LAB의 자가응집 및 LAB와 식품 매개 병원체의 공동응집 능력을 하기 표 3에 나타내었으며, 대조군으로 Lactobacillus casei KACC 12413를 사용하였다.
LAB strains 자가응집 계수 (%) 공동응집 계수(%)
식품 매개 병원체
VP 27969 PA 10145 EC 43894
Time 4 h 24 h 4 h 24 h 4 h 24 h 4 h 24 h
J.27 21.6 ± 1.3* 57.9 ± 1.0* 15.2 ± 0.4** 51.5 ± 0.8* 19.5 ± 0.7** 45.9 ± 0.8* 11.7 ± 1.1* 43.8 ± 0.9*
M.21 26.4 ± 0.9* 60.7 ± 0.9** 14.1 ± 0.9* 44.4 ± 0.6** 19.7 ± 0.8** 51.5 ± 0.8*** 16.2 ± 0.4** 47.3 ± 0.8**
대조군 11.7 ± 1.1* 37.3 ± 0.9* 12.3 ± 0.4* 31.1 ± 0.9* 11.0 ± 0.4* 29.5 ± 0.6* 10.6 ± 0.7* 27.0 ± 0.8***
VP, Vibrio parahaemolyticus; PA, Pseudomonas aeruginosa; EC, Escherichia coli.같은 열에 있는 값은 서로 다른 균주 간의 유의한 차이(*p < 0.05; **p < 0.005; ***p < 0.001)를 나타냄.
LAB의 자가응집 계수(autoaggregation coefficient) 및 LAB와 식품 매개 병원체의 공동응집 계수(coaggregation coefficient)는 모두 24시간 배양 후 증가하였다. 또한, J.27 및 M.21의 공동응집 계수 모두 4 내지 24시간 동안 상승하였다 (p < 0.05-0.005). LAB 분리균주 M.21은 24시간 기준으로 모든 LAB 분리균주 중에서 가장 높은 자가응집 잠재력(60.7%)을 나타내었다.
또한, J. 27, M.21 및 대조군 모두 세 개의 병원성 균주에 대하여 공동응집 능력을 나타내었다. 공동응집 능력 분석에서, 24시간 기준으로 J.27는 VP 27969와 가장 높은 공동응집 효율(51.5 %)을 나타내었으며, M.21은 PA 10145(51.5%) 및 EC 43894 (47.3%)와 가장 높은 공동응집 능력을 나타내었다.
<실험예 3> 부유 상태의 박테리아에 대한 LAB 분리균주의 성장 억제 분석
부유 상태의 박테리아 성장 억제를 평가하기 위해서, 1% (v/v) LAB 분리균주(단독 및 혼합) (107 CFU/mL) 및 각각의 병원성 박테리아 밤샘 배양액(105 CFU/mL)은 TSB 배지 10 mL를 포함하는 50-mL Falcon 튜브에서 동시에 배양되었다. 모든 공배양 시료는 24시간 동안 쉐이킹 인큐베이터(120 rpm)에서 배양되었다. 단독 또는 혼합 LAB 분리균주에 의한 부유 병원성 박테리아 세포의 감소는 멸균 PW로 연속적인 희석을 통해 결정되었고 배양 후 병원체별 한천 플레이트에 펼쳐졌다. LAB 부유성 세포의 수는 배양 후 MRS 한천 플레이트에 세포 부유액을 펼쳐서 수행하였다.
그 결과, 단일 또는 혼합 LAB 분리균주와 공배양하는 동안 세 가지 병원성 박테리아의 성장이 모두 유의미하게 감소하였다(p < 0.05-0.001). 특히, 혼합 LAB 분리균주와 공배양하는 경우, 단일 LAB 분리균주와 공배양한 것과 비교하여 더 강력한 병원성 박테리아 성장 억제 효율을 나타내었다. 24 시간에서, VP 27969의 부유성 박테리아 수는 4.0 log CFU/mL로 감소하였고, PA 10145는 2.4 log CFU/mL로 감소하였으며, EC 43894는 2.7 log CFU/mL로 감소하였다. 또한, 대조군으로 상기의 병원성 박테리아를 KACC 12413와 공배양하였으나, 본 발명의 LAB 균주가 더 많은 감소효과를 가졌다(도 2).
<실험예 4> 식품 표면에서 LAB 분리균주의 바이오필름 성장 억제 분석
오징어는 날개, 껍질, 촉수, 내체(예를 들어, 부리, 깃, 내장) 등을 제거한 후, 몸의 본체 부분만 분리하였다. 오징어 필렛 시료는 클린벤치에서 준비하였고, 멸균 알루미늄 호일 시트에 두고 멸균 칼을 사용하여 4 g의 직육면체(2cm × 2 cm × 0.2cm) 로 잘랐다. 오징어 필렛 시료는 탈이온수(DW)로 두 번 헹구고 UV-C(Sankyo Ultraviolet Co., Ltd., Seoul, Republic of Korea) 빛으로 30분 동안 처리하였다.
바이오필름을 형성하기 전, UV 처리한 오징어 샘플에 남아있는 마이크로플로라(microflora)의 존재를 확인하였다. UV-C 처리한 시료는 상온에서 4분 동안 BagMixer400 Stomacher (Interscience, Saint Nom, France)를 사용하여 PW 20 mL로 불렸다. 결과 데이터는, 총 미생물 세포 수가 검출 수준(<102 CFU/cm2) 보다 낮다는 것을 보여주었다.
바이오필름 형성을 위해서, 단일 또는 혼합 분리균주(107 CFU/mL) 배양액 100 μL 및 각각의 병원성 박테리아(105 CFU/mL) 배양액은 오징어 필렛에 점착시켰고, 오징어 표면에 박테리아를 부착하기 위해서 클린벤치(laminar flow hood)에서 30분 동안 건조하였다. LAB 배양액 또는 병원성 박테리아 배양액을 접종한 오징어 필렛은 대조군으로 사용되었다. 모든 시료는 오징어 표면에 바이오필름이 형성되도록 하기 위해서 흔들림 없이 24시간 동안 25 ℃에서 배양되었다. 배양 후, 시료는 부착되지 않은 박테리아 세포를 제거하기 위해 DW로 두 번 헹구었고, PW 20 mL을 포함하는 Whirl-Pak 균질화 블렌더 필터 백(Nasco, WI, USA)으로 옮겼다. 모든 접종된 필렛 시료는 바이오필름을 형성하는 박테리아 세포의 분리를 확인하기 위해서 불려졌다. LAB 및 병원성 바이오필름 세포는 PW로 연속적인 희석을 통해 배양 후 열거되었고 MRS 및 병원체별 한천 플레이트에 펼쳐졌다.
그 결과, 오징어 표면에서 병원성 바이오필름의 성장에 대한 단일 LAB 분리균주의 효과를 먼저 살펴보면, VP 27969 바이오필름 및 PA 10145 바이오필름의 억제 효과는 J.27이 M.21 보다 더욱 우수하였으며, 각각 1.7 log CFU/cm2 및 1.5 log CFU/cm2까지 억제됨을 확인하였다. EC 43894 바이오필름에서는 M.21가 1.7 log CFU/cm2까지 억제하면서 J.27보다 더 우수한 효과를 보였다(도 3).
단일 LAB 분리균주를 사용한 경우보다 혼합균주 사용시 전체적으로 더욱 우수한 효과를 나타내었다. 특히, VP 27969에서 가장 높은 민감성을 보였으며 2.0 log CFU/cm2까지 감소하였다. PA 10145 및 EC 43894 바이오필름 형성에서는 1.8 log CFU/cm2까지 감소하였다(도 3).
<실험예 5> 식품 접촉 표면에서 LAB 분리균주의 바이오필름 성장 억제 분석
본 발명의 LAB 분리균주의 식품 접촉 표면에 대한 항바이오필름 효과를 분석하기 위해서, 고무(RB, Komax Industrial Co., Goyang, Republic of Korea) 및 HDPE (High Density Polyethylene; Green Industrial Co., Gyeongsangnam, Republic of Korea)를 선택하였다. RB(2 cm × 2 cm × 0.1 cm) 및 HDPE (2 cm × 2 cm × 0.6 cm) 쿠폰은 멸균되된 후, 50-mL Falcon 튜브에 TSB 배지 10 mL에 완전히 담가 두었다. 그 후, 1% (v/v) 단일 및 혼합 LAB 배양액 (107 CFU/mL)을 각각의 병원성 박테리아(105 CFU/mL)와 함께 쿠폰 위에 접종하였다. LAB 배양액 또는 병원성 박테리아 배양액을 접종한 쿠폰은 대조군으로 사용되었다. 바이오필름을 형성하기 위해서, 24시간 동안 30 ℃에서 쉐이킹 없이 배양한 후, 바이오필름 세포는 세척하고 쿠폰으로부터 분리되었다. 그 다음, LAB 및 병원성 바이오필름 세포수는 연속적인 희석 및 한천 플레이팅을 통해서 열거되었다.
그 결과 RB 표면에서 바이오필름 형성 억제 효과는 도 4a에 나타내었으며, HDPE 표면에서 바이오필름 형성 억제 효과는 도 4b에 나타내었다. 상기 실험예 4의 식품 표면에서의 효과와 유사하게, 단일 LAB 분리 균주 처리 시, RB 표면 및 HDPE 표면에서 J.27는 VP 27969 및 PA 10145 바이오필름의 형성을 유의미하게 억제하였고, M.21은 EC 43894 바이오필름의 형성을 유의미하게 억제하였다. 또한, 혼합 LAB 분리균주로 처리 시, RB 표면 및 HDPE 표면 모두에서 세 가지 병원성 박테리아에 의한 바이오필름의 형성이 가장 크게 억제되었다(~2.2 log CFU/cm2).
<실험예 6> 독성-관련 유전자 발현에 대한 LAB 배양의 효과 분석
24시간 동안 단일 및 혼합 LAB 분리균주와 함께 각각의 병원성 박테리아의 공동-배양 후, 결과 박테리아 배양액은 세포 펠릿을 수집하기 위해서 원심분리하였으며, 그 다음 PBS로 두 번 헹구었다. 총 RNA는 RNeasy 미니 키트(Qiagen Inc., Valencia, CA, USA)를 사용하여 박테리아 세포 펠릿으로부터 추출되었다. cDNA는 Maxime RT PreMix Kit (iNtRONBiotechnology, Gyeonggi, Republic of Korea)을 사용하여 역-전사 PCR에 의해 총 RNA 500ng으로부터 합성되었다. 쿼럼 센싱(quorum sensing; QS) 및 독성 관련 유전자의 상대 발현 레벨은 7500 Fast Real-Time PCR system (Applied Biosystems, Alameda, CA, USA)으로 정량화 하였다. 박테리아 종류로부터 16S rRNA가 세포유지유전자(housekeeping gene)로 사용되었다. 모든 반응은 Power SYBRGreen PCR Master Mix (Life Technologies, Warrington, UK) 10 μL, 전사 및 역전사 프라이머(0.8 μL) 10 pmol, 및 DW 7.2 μL을 포함하는 총 20 μL 부피에서 수행되었다. 각각 유전자의 상대 mRNA 발현 레벨은 2 (ΔCt sample ΔCt control) 방법을 사용하여 분석하였다. 쿼럼 센싱 및 독성 관련 유전자는 하기 표 4에 나타내었다.
Target species Gene Function Primer Sequence (5'-3')
V. parahaemolyticus flaA Flagella regulation flaA-F
flaA-R		 CGGACTAAACCGTATCGCTGAAA
GGCTGCCCATAGAAAGCATTACA
vp0962 Biofilm formation vp0962-F
vp0962-R		 GACCAAGACCCAGTGAGA
GGTAAAGCCAGCAAAGTT
luxS QS response regulator luxS-F
luxS-R		 GGATTTTGTTCTGGCTTTCCACTT
GGGATGTCGCACTGGTTTTTAC
16S rRNA housekeeping gene 16S-F
16S-R		 TATCCTTGTTTGCCAGCGAG
CTACGACGCACTTTTTGGGA
P. aeruginosa lasB QS response regulator lasB-F
lasB-R		 CCGCAAGACCGAGAATGACA
CTTCCCACTGATCGAGCACT
rhlR QS response regulator rhlR-F
rhlR-R		 TTACTACGCCTATGGCGTGC
TCGCTCCAGACCACCATTTC
phzA2 Antibiotic tolerance regulator phzA2-F
phzA2-R		 AACCACTTCTGGGTCGAGTG
TCGAGTTCGAAGGAATGGAT
16S rRNA housekeeping gene 16S-F
16S-R		 CTTACGGCCAGGGCTACACA
GTACAAGGCCCGGGAACGTA
E. coli luxS QS response regulator luxS-F
luxS-R		 ACGCCATTACCGTTAAGATG
AGTGATGCCAGAAAGAGGGA
pfs QS response regulator pfs-F
pfs-R		 CGGCAACAGCCAGGAACTCA
GCGAAAATCCGCCACAACTT
rpoS Stress survival regulator rpoS-F
rpoS-R		 CTCAACATACGCAACCTG
GTCATCAACTGGCTTATCC
16S rRNA housekeeping gene 16S-F
16S-R		 CACACTGGAACTGAGACAC
CTTCTTCTGCGGGTAACG
상기 결과, LAB 분리균주와 공배양한 후, VP 27969의 쿼럼 센싱 및 독성 관련 유전자인 flaA, vp0962, 및 luxS의 mRNA 발현 레벨이 유의미하게 감소하였고(도 5a), PA 10145의 쿼럼 센싱 및 독성 관련 유전자인 lasB, rhlR, 및 phzA2의 mRNA 발현 레벨 또한 유의미하게 감소하였으며(도 5b), EC 43894의 쿼럼 센싱 및 독성 관련 유전자인 luxS, pfs, 및 rpoS의 mRNA 발현 레벨이 유의미하게 감소하였다(도 5c). 또한, 혼합 LAB 분리 균주로 처리시, 세 개의 병원성 박테리아의 쿼럼 센싱 및 독성 관련 유전자의 발현이 더욱 감소함을 확인하였다.
식품과 식품 접촉 표면에 생물막이 형성되는 것은 세균의 표면 부착과 성숙한 생물막 형성의 여러 단계에서 중요한 역할을 하고 살균제로부터 세균 세포를 보호하는 생물막 관련 유전자에 크게 의존한다. 식품 매개 병원체에 의한 생물막 형성은 운동성, 세포와 세포 간 통신을 위한 QS 신호 분자와 스트레스 조건에서의 생존을 위한 스트레스 조절자에 의존한다. 따라서 식품 매개 병원체 내 생물막 관련 유전자의 발현을 연구하고 그 약물에 대한 내성과 생존 메커니즘을 특성화하는 것이 중요하다. LAB 분리체에 의한 생물막 관련 유전자 발현 억제는 박테리아 세포를 죽이기 보다는 음식과 음식 접촉 표면에 병원성 생물막 형성을 억제할 수 있다.
<실험예 7> FE-SEM을 바이오필름 형성 분석
오징어 표면에서 LAB 분리균주 J.27 및 병원체 박테리아에 의해 형성되 바이오필름은 FE-SEM을 통해서 시각화 되었다. 모든 시료들은 상온에서 4시간동안 25% (v/v)의 글루타르알데하이드(glutaraldehyde)을 포함하는 PBS 용액에서 고정되었고, 각각 15분 동안 에탄올 용액 (50, 60, 70, 80, 90, 및 100%)으로 처리되었다. 시료들은 각각 15분 동안 에탄올을 함유하는 헥사메틸다이실라잔(hexamethyldisilazane) 용액(33, 50, 66, 및 100%)으로 연이어 처리한 후, 공기 건조되었다. 공기 건조 시료는 현미경(S-4700, Hitachi, Tokyo, Japan)의 시각화를 강화하기 위해서 백금 (MED 020, Bal-Tec, Balzers, Switzerland)으로 코팅하였다.
그 결과, LAB 분리균주 J.27은 세 가지 병원성 박테리아와 결합하여 바이오필름을 형성하는 것으로 확인되었으며, 오징어 표면에서 LAB 분리균주 J.27과 배양한 경우, 세 가지 병원성 박테리아의 바이오필름 세포수가 감소함을 확인하였다(도 6).

Claims (10)

  1. 2종의 김치 유래 LAB(lactic acid bacteria)를 혼합한 조성물을 유효성분으로 포함하고,
    상기 김치 유래 LAB는 Lactobacillus plantarum(기탁 번호: KCTC 14955BP) 및 Leuconostoc mesenteroides(기탁 번호: KCTC 14956BP)인 것을 특징으로 하는, 항-바이오필름(biofilm) 조성물.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서,
    상기 바이오필름은 Vibrio parahaemolyticus, Pseudomonas aeruginosa, 또는 Escherichia coli로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 병원성 미생물에 의해 생성된 것을 특징으로 하는, 항-바이오필름 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 바이오필름은 식품 또는 식품과 접촉한 표면에 생성된 것을 특징으로 하는, 항-바이오필름 조성물.
  5. 삭제
  6. 제1항에 있어서,
    상기 항-바이오필름 조성물은 QS(quorum sensing) 관련 유전자 또는 독성 관련 유전자의 발현을 억제하는 것을 특징으로 하는, 항-바이오필름 조성물.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 QS(quorum sensing) 관련 유전자는 luxS, lasB, rhlR, 또는 pfs을 포함하는, 항-바이오필름 조성물.
  8. 제6항에 있어서,
    상기 독성(virulence) 관련 유전자는 flaA, vp0962, phzA2, 또는 rpoS을 포함하는, 항-바이오필름 조성물.
  9. 제1항의 조성물을 바이오필름이 형성되었거나 바이오필름 형성이 예상되는 표면에 처리하는 단계;를 포함하는 바이오필름 형성 억제방법.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 바이오필름은 Vibrio parahaemolyticus, Pseudomonas aeruginosa, 및 Escherichia coli로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 병원성 미생물에 의해 생성된 것을 특징으로 하는,
    바이오필름 형성 억제방법.
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