CN111763630A - 表皮葡萄球菌及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及皮肤护理技术领域,具体涉及一种能够分解皮肤表层甘油三酯的表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis),其菌种保藏号为GDMCC No:60607。本发明所涉及的表皮葡萄球菌具有原料来源广泛、生产成本低廉、副作用低且具有较强的油脂分解能力的优点,可用于皮肤护理产品。
Description
技术领域
本发明涉及皮肤护理技术领域,具体涉及一种用于分解皮肤表层甘油三酯的表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)及其用于制备护肤品或者化妆品的用途。
背景技术
皮肤覆盖于人体表面,保护着体内各种器官和组织免受外界有害因素的损伤。皮脂是皮肤重要的组成成分之一,在维护皮肤的屏障功能、防止透皮水丢失和外界环境物质的侵入方面发挥了至关重要的作用。当皮脂成分或含量发生变化时,皮肤正常的生理功能—尤其是皮肤的屏障功能会受到影响。
人体皮脂总量一般占皮肤总重量的3.5%-6.0%,但含量最低的情况可仅为0.3%,最高可达10.0%。皮脂为油状半流态混合物,含有多种脂类,主要成分为甘油三酯、脂肪酸、磷脂和酰化胆固醇等。皮脂腺是附属于皮肤的一个重要腺体,是产生皮脂的主要部位,其遍及身体以及手和脚掌中,在面部的密度可高达400-900个腺体/cm2。
临床上根据皮肤表面脂质量的多少,将人类皮肤粗略地分为:油性皮肤、组合性皮肤、干性皮肤和中性皮肤等类型。
1)油性皮肤。油性皮肤是由皮脂腺过多的功能引起的。当皮肤中存在过多的皮脂时,皮肤表现为较厚的质地、油腻和光亮的外观,以及存在扩张的孔和皮肤缺陷。
2)组合性皮肤。其特征在于同时存在干燥和油腻的区域,通常,油性区域位于前额、鼻子和下巴上(称为T区)。T区外面的部分通常是干燥区域,这归因于该区域的皮肤较薄,因此有较多的脱屑。
3)干性皮肤。皮脂缺乏意味着不能够保持足够的水合作用,这使得脆弱的皮肤具有较高的脱屑和细皱纹的倾向。由于显示出不可察觉的毛孔,所以屏障功能的能力降低意味着对有害外部因素例如UV(紫外线)、寒冷和风等的敏感性更高。
4)中性皮肤。由于适量的皮脂能够保持良好的水分平衡,所以这种皮肤呈现出良好的弹性和抗性,几乎没有可见的毛孔,但具有均匀的肤色。
用Sebumeter测量发现油性皮肤的人平均皮脂分泌率(mean of sebum excretionrate,MSER)明显高于干性皮肤的人,该差异具有统计学意义。油性皮肤的人,皮脂腺的分泌功能比较旺盛,容易出现一些相应的皮肤疾病,如寻常痤疮、脂溢性皮炎等。因此,控制皮脂腺分泌、适时恰当的分解过多的油脂是使这类皮肤保持健康、美观的关键。
控制皮肤表层油脂的现有技术包括:
1.利用天然矿物粉末处理,常用的矿物粉末有:钛白粉、二氧化硅、硅藻土、高岭土、滑石粉、绿石泥、深海泥以及火山灰等。优点:颗粒的微观内部具有无数细小的空隙,附着在皮肤上后能吸收大量的油脂,有利于通透被皮脂堵塞的毛孔,使有效成分得以直接作用在皮脂腺体上。缺点:原料难采集,价格较高。
2.利用硫酸铝钾、氯化铝、硫酸铝和硫酸锌等处理。优点:收紧扩张毛孔的收敛剂类添加剂能使表皮绷紧,毛孔缩小,呈现出细腻外观。缺点:较短时间内呈现效果,使用一段时间后对皮肤有损。
3.利用植物提取物:例如绣线菊提取物来处理。优点:可抑制皮脂合成催化剂—5α-还原酶的合成,减少皮脂分泌。缺点:制作工序复杂,成本较高。
近年来,将微生物应用于面部皮肤的护理及保养已有人在研究。利普泰公司(Lipotec,S.A.U)所组织的实验表示,安替卡尔盐单细胞菌(Halomonas anticariensis)的外泌多糖具有脂解作用,可用于解除皮肤表层的脂质堆积。但具体效果还不是很清楚。
发明内容
为解决上述问题,本发明实施例提供一种表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis),菌种保藏号为GDMCC No:60607。
本发明实施例还提供一种皮肤护理产品,该皮肤护理产品包括上述表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)。
本发明实施例提供的表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)及其相关产品具有以下优点:1.原料来源广泛,生产成本低廉:表皮葡萄球菌WHG2019031201来源于健康儿童的面部皮肤表层,且采集的9名儿童均具有该菌株。该菌株以无性二分裂方式繁殖,具有较强的繁殖能力,较短时间内能产生大量菌体。2.副作用低,可长期使用:以表皮葡萄球菌WHG2019031201菌株分泌物、提取物或代谢物为主要成分的护肤品、化妆品相较以化学物质为主要成分的产品,具有较低的副作用及致敏性,可应用于敏感或非敏感性肌肤,具有较大的应用范围。3.具有较强的油脂分解能力:据相关实验结果可得出,150μL OD值为0.5的菌体对浓度为5‰的油脂降解率为49.25%,具有较强的油脂分解能力。4.产业应用前景广阔:2018年对中国女性皮肤问题的问卷调查结果显示,组合性皮肤的女性比例为40%,油性皮肤的女性比例位居其次,达到23%。随着大气污染,电波辐射的不断增强,皮肤所处的环境越来越恶劣,各种不同的肌肤问题不断出现,每年有超过90%的女性被皮肤问题所困扰。本发明所涉及的表皮葡萄球菌具有原料来源广泛、生产成本低廉、副作用低且具有较强的油脂分解能力的优点,可用于皮肤护理产品。
附图说明
图1为本发明提供的表皮葡萄球菌Staphylococcus epidermidis WHG2019031201显微形态图;
图2为本发明的表皮葡萄球菌Staphylococcus epidermidis WHG2019031201在血琼脂平板培养基的菌落形态图;
图3为本发明的表皮葡萄球菌Staphylococcus epidermidis WHG2019031201基于16S rDNA序列的系统发育树;
图4为本发明的表皮葡萄球菌Staphylococcus epidermidis WHG2019031201分解油脂使中性红指示剂变红的结果;和
图5为本发明实施例中分解油脂实验中阴性对照和阳性对照的结果。
具体实施方式
为了使本发明要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白,以下结合附图及实施例,对本发明进行进一步详细说明。应当理解,此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明,并不用于限定本发明。
本发明实施例提供一种表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)WHG2019031201,于2019年3月13日送至广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)进行保藏,微生物保藏号:GDMCC No.60607。
本发明提供的菌株是从健康儿童面部皮肤表层分离筛选获得,该菌株分泌物能将皮肤表层皮脂中的甘油三酯分解为甘油和脂肪酸,由此使皮肤表层呈现弱酸性,起到保护皮肤、控制面部表层过多皮脂的作用。同时可预防某些由于面部皮脂过多而出现的皮肤疾病,如寻常痤疮、脂溢性皮炎等。
本发明的表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)的生物学指标如下:
1.Staphylococcus epidermidis WHG2019031201细菌菌株的形态特征
表皮葡萄球菌Staphylococcus epidermidis WHG2019031201为革兰氏阳性球形菌,直径为1.0μm左右,无荚膜,无芽孢,无鞭毛,不能运动,图1显示了本发明提供的表皮葡萄球菌Staphylococcus epidermidis WHG2019031201显微形态。菌体在血琼脂培养基上呈灰白色,不透明,表面湿润光滑,边缘整齐,图2显示了本发明的表皮葡萄球菌Staphylococcus epidermidis WHG2019031201在血琼脂平板培养基的菌落形态图。
2.Staphylococcus epidermidis WHG2019031201细菌菌株的生理生化特性
1)精氨酸双水解酶、磷酸酶、尿素酶实验呈阳性;
2)能够利用D-半乳糖、D-麦芽糖、乳糖、蔗糖发酵产酸;
3)6.5%NaCl耐受生长、O/129耐受、奥普托欣耐受。
3.细菌菌株的16S鉴定及系统发育分析
基于系统发育树分析,本发明的菌株表皮葡萄球菌Staphylococcus epidermidisWHG2019031201与已知的Staphylococcus epidermidis strain Fussel(NR036904.1,表面葡萄球菌)、Staphylococcus epidermidis strain NBRC 100911(NR113957.1,表面葡萄球菌)相聚在一个大的分支中,且进化距离小于1,结果证明该菌株为表面葡萄球菌。图3为本发明的表皮葡萄球菌Staphylococcus epidermidis WHG2019031201基于16S rDNA序列的系统发育树,其中拉丁名后为相应菌株在Genbank的编号。
4.根据《常见细菌鉴定手册》,对照菌株WHG2019031201的形态特征、生理生化特性以及系统发育分析,鉴定WHG2019031201为表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)。
以下通过具体实施例对本发明进行进一步阐述。
1.表皮葡萄球菌Staphylococcus epidermidis WHG2019031201的分离、筛选及鉴定
分离:
(1)选择具有健康皮肤的儿童9名,取无菌植绒拭子在装有1.5ml菌群保存液的离心管内沾湿植绒拭子,在儿童额头5cm×5cm面积内采样,横竖往返均匀涂擦各20次,并随之转动植绒拭子,随后折断植绒拭子头,将植绒拭子头投入离心管内,放入4℃冰箱内保存,随后送往实验室。
(2)于实验室通风橱中点燃酒精灯,在酒精灯旁操作,防止其他细菌污染。
(3)左手打开平板皿约30°,将涂擦皮肤的拭子用无菌镊子夹起,然后分别在血琼脂平板培养基上用Z字划线法接种,放入35℃恒温培养箱培养24h,24h后观察生长情况。该步骤共分离得到细菌单株共55株。
其中血琼脂平板培养基组分为:蛋白胨10.0g、牛肉膏3.0g、氯化钠5.0g、脱纤维羊血50mL、琼脂15.0g、蒸馏水1L、1M NaOH、1M HCL。
第一次筛选:
(1)用记号笔在上述血琼脂平板底部划五部分,并标上需要接种的菌的编号。
(2)用一次性接种环取少量菌(分离得到的55株细菌单株)在平板对应菌编号位置用Z字法划线接种。
(3)将接种完的平板倒置于37℃恒温箱中培养24h。(阴性对照:大肠杆菌;阳性对照:金黄色葡萄球菌)
筛选结果:图4为筛选得到的表皮葡萄球菌Staphylococcus epidermidisWHG2019031201分解油脂使中性红指示剂变红的图片;图5为上述油脂实验中阴性对照和阳性对照的结果图片,其中阴性对照钟大肠杆菌-中性红指示剂无变色;阳性对照中金黄色葡萄球菌-中性红指示剂变红。观察结果时,注意观察平板上,如菌苔出现红色斑点,即说明油脂已被水解,此为阳性,未出现红色斑点则为阴性。该步骤筛选得到具有脂解能力的菌株共38株。
油脂平板培养基(花生油)组分为:蛋白胨10.0g、牛肉膏5.0g、氯化钠5.0g、花生油10.0g、1.6%中性红水溶液1mL、琼脂15.0-20.0g、蒸馏水1000mL、PH值7.2。
花生油主要成分:油脂、不饱和脂肪酸(油酸、亚油酸)、饱和脂肪酸(软脂酸、硬脂酸、花生酸)等。花生油常用于具有脂解能力细菌的筛选和测定。
第二次筛选:
(1)用记号笔在上述花生油油脂平板底部划五部分,并标上需要接种的菌的编号。
(2)用一次性接种环取少量菌(分离得到的55株细菌单株)在平板(油脂平板培养基(猪油))对应菌编号位置用Z字法划线接种;
(3)将接种完的平板倒置于37℃恒温箱中培养24h。(阴性对照:大肠杆菌;阳性对照:金黄色葡萄球菌)
结果:观察结果时,注意观察平板上,如菌苔出现红色斑点,即说明油脂已被水解,此为阳性,未出现红色斑点则为阴性。该步骤筛选得到具有脂解能力的菌株共40株。
油脂平板培养基(猪油)组分为:蛋白胨10.0g、牛肉膏5.0g、氯化钠5.0g、猪油10.0g、1.6%中性红水溶液1mL、琼脂15.0-20.0g、蒸馏水1000mL、PH值7.2。
猪油主要成分:甘油三酯(与人体皮肤皮脂中的甘油三酯相近)、饱和脂肪酸(硬脂酸、软脂酸)、胆固醇等。
将第一次及第二次筛选得到的菌株进行统计,共有36株对2种油脂均具有分解能力的菌株,其中7株为具有相同分解能力且16S序列组成相近的表面葡萄球菌,编号为WHG2019031201。
菌株种属常规鉴定
参照东秀珠等人编著的《常见细菌系统鉴定手册》(北京:科学出版社,2001:349-398)中介绍的方法对WHG2019031201菌株的形态及生理生化特性进行测定,测定结果如下:
(1)WHG2019031201菌株在血琼脂平板培养基上生长24h后,菌落呈灰白色,不透明,表面湿润光滑,边缘整齐,如图2所示。
(2)通过显微镜观察表明:WHG2019031201菌株为球状,直径为1.0μm左右,无荚膜,无芽孢,无鞭毛,不能运动,革兰氏染色为阳性,如图1所示。
(3)WHG2019031201菌株的生理生化特征见表1。
注:“+”表示阳性,“-”表示阴性。
(4)WHG2019031201菌株的16S rDNA鉴定
以菌株WHG2019031201的材料,使用Omega D3350Bacterial DNA Kit进行DNA提取,并以产物为扩增模板,采用以下引物对:
正向引物(Forward primer)27F:5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’
反向引物(Reverse primer)1492R:5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’
进行PCR扩增反应,其中PCR扩增反应体系为:2×PCR Mix 25μL、正反向引物(10mM)各2.0μL、DNA模板3.0μL,去离子灭菌超纯水18.0μL,总体积为50.0μL。PCR反应条件:95℃预变性,3min;95℃变性,30s;55℃退火,30s;延伸72℃,45s;72℃总体延伸,5min(共30个循环)。
PCR扩增产物由ABI-3730xl测序仪进行测序。测得的read1、read2序列用软件ChromasPro(Version 2.1.8)编辑得到一条完整的序列。登录NCBI基因库对该序列进行同源比对,使用MEGA7.0的最大简约法(Maximum-parsimony;MP)对该序列以及具有同源性的24序列一起构建系统发育树。基于系统发育树分析,发现该菌株表皮葡萄球菌Staphylococcus epidermidis WHG2019031201与Staphylococcus epidermidis strainFussel(NR036904.1,表面葡萄球菌)、Staphylococcus epidermidis strain NBRC 100911(NR113957.1,表面葡萄球菌)相聚在一个大的分支中,且进化距离小于1,结果证明该菌株为表面葡萄球菌。(图3)
结合《常见细菌鉴定手册》,对照菌株WHG2019031201的形态特征及生理生化特性及系统发育分析,确认该菌株为表面葡萄球菌StaphylococcusepidermidisWHG2019031201。
本发明的表面葡萄球菌Staphylococcus epidermidisWHG2019031201菌株已于2019年3月13日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC),保藏培养基为血琼脂培养基(哥伦比亚血琼脂:胰酪蛋白胨12.0g、牛肉蛋白胨15.0g、氯化钠5.0g、玉米淀粉1.0g、琼脂12.0g、粘菌素10.0mg、萘啶酸15.0mg、去离子水1L、脱纤维羊50mL、1M NaOH、1M HCL),培养温度35℃。
2.表皮葡萄球菌Staphylococcus epidermidis WHG2019031201菌株的油脂降解率的测定
(1)挑取一菌环活化后的表皮葡萄球菌Staphylococcus epidermidisWHG2019031201菌株菌苔,接种于装有10mL NB培养基的玻璃管中,37℃培养24h,获得菌悬液。其中NB培养基成分:蛋白胨10.0g,牛肉膏3.0g,NaCl 5.0g,蒸馏水1L,PH7.0-7.2。
(2)将150μL菌悬液转接至含有50mL不同浓度油脂培养基(液体)的离心管中,37℃,200rpm,振荡20h,进行油脂降解。不同浓度的油脂培养基分别为:5.0‰、8.0‰、10.0‰、15.0‰、20.0‰。其中该油脂培养基成分:蛋白胨10.0g、牛肉膏5.0g、氯化钠5.0g、辛癸酸甘油三酯(人类皮肤中甘油三酯的一种)(5.0、8.0、10.0、15.0、20.0)g、蒸馏水1000mL,PH值7.2。
(3)将振荡分解20h后的液体培养基进行高速离心处理(12000rpm,10min),去除菌体,获得上清液。
(4)将上清液中加入15mL正己烷进行萃取,重复两次。
(5)在萃取液中加入适量无水MgSO4以充分吸收水分,再放于离心机中进行中速离心(6000rpm,5min),吸取上清液至蒸馏瓶中。
(6)将温度计放于蒸馏瓶上方,点燃酒精灯进行加热,将正己烷(沸点:69℃)与剩余辛癸酸甘油三酯(沸点:456℃)进行分离。
(7)将分离完成的剩余液体置于60℃恒温箱中烘干,称取质量。
(8)油脂降解率的计算:降解率(%)=(A-B)÷A×100%。式中:A为未接菌对照管的残余油质量;B为接种管的残油质量。降解率测定结果见表2,显示了表皮葡萄球菌Staphylococcus epidermidis WHG2019031201同一浓度菌液对不同浓度油脂的降解率实验结果。
表2降解率实验结果比较
由表2的数据可以看出,油脂降解率在5‰浓度时降解率最高。
另有实验证明,上述筛选的表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)的分泌物能将皮肤表层皮脂中的甘油三酯分解为甘油和脂肪酸,使皮肤表层呈现弱酸性,起到保护皮肤,控制面部表层过多皮脂的作用。同时该分泌物可用于预防某些由于面部皮脂过多而出现的皮肤疾病,如寻常痤疮、脂溢性皮炎等。
因此,本发明筛选得到的表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)的分泌物可以用于化妆品和护肤品领域,以及用于制备由油脂分泌过多引起的皮肤病的药物,尤其是外用药物。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 深圳微健康基因科技有限公司
<120> 表皮葡萄球菌及其用途
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
agagtttgat cctggctcag 20
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ggttaccttg ttacgactt 19
Claims (4)
1.一种表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis),菌种保藏号为GDMCC No:60607。
2.如权利要求1所述的表皮葡萄球菌用于制备化妆品或者护肤品的用途。
3.一种皮肤护理产品,其特征在于,包括如权利要求1所述的表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)。
4.如权利要求3所述的皮肤护理产品,其特征在于,所述皮肤护理产品为护肤品、化妆品或者皮肤外用药物。
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