CN115737687A - 普拉梭菌在制备预防或/和治疗冠心病药物或/和保健品中的应用 - Google Patents

普拉梭菌在制备预防或/和治疗冠心病药物或/和保健品中的应用 Download PDF

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杨海涛
谢翔
刘倞坤
郑颖颖
杨毅
吴婷婷
侯宪庚
宁怡
姜智慧
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Abstract

本发明涉及预防和治疗冠心病药物技术领域，是一种普拉梭菌在制备预防或/和治疗冠心病药物或/和保健品中的应用。本发明通过在易患动脉粥样硬化的小鼠中进行研究，首次发现了普拉梭菌可以单独预测冠心病并作为有助于预防和治疗冠心病的药物和保健品。

Description

普拉梭菌在制备预防或/和治疗冠心病药物或/和保健品中的 应用
技术领域
本发明涉及预防和治疗冠心病药物技术领域，是一种普拉梭菌在制备预防或/和治疗冠心病药物或/和保健品中的应用。
背景技术
由于不健康饮食、缺乏锻炼、吸烟等不良生活方式的危险因素增多，冠心病的患病率处于持续上升阶段。尽管检查手段和治疗技术的更新,但冠心病致死率的居高不下。一项12695例样本的横断面研究显示，急性心肌梗死患者的1年病死率为28%，而复发心肌梗死患者的病死率高达32.1%。寻找新的治疗方向，探索新的治疗靶点对冠心病的诊治至关重要。
随着测序技术的不断提高，肠道微生物的作用和功能逐渐被认识。除双歧杆菌、乳酸菌以外，目前以普拉梭菌（Faecalibacteriumprausnitzii）、嗜黏蛋白阿克曼菌（Akkermansiamuciniphila）为主的新一代益生菌越来越被关注。其中普拉梭菌是健康成人肠道菌群中含量最丰富的细菌，占总细菌群的5%以上。研究表明，普拉梭菌可以改善肠道屏障功能，降低慢性低度炎症对肠道的损坏。众所周知，慢性炎症是冠心病发生、发展的重要原因之一。
此外，在高脂血症、冠心病合并糖尿病的患者中普拉梭菌的丰度降低。这些报道似乎表明普拉梭菌与冠心病之间的关系。然而，普拉梭菌可以单独预测冠心病的发生、发展中发挥哪种作用尚不得知。
发明内容
本发明提供了一种普拉梭菌在制备预防或/和治疗冠心病药物或/和保健品中的应用，克服了上述现有技术之不足，其首次发现了普拉梭菌可以单独预测冠心病并作为有助于预防和治疗冠心病的药物。
本发明的技术方案之一是通过以下措施来实现的：一种普拉梭菌在制备预防冠心病药物中的应用。
下面是对上述发明技术方案之一的进一步优化或/和改进：
上述普拉梭菌按照下述方法培养和制备：第一步，将LYHBHI培养基、1g/L麦芽糖、1g/L纤维二糖和0.5g/L半胱氨酸，加入双蒸水混匀配置细菌溶液，其中，LYHBHI培养基包括以下成分：37g/L脑心浸液，5g/L酵母提取物，5mg/L血晶质；第二步，将细菌溶液置于厌氧操作箱，经培养24小时，其中，厌氧操作箱中环境条件为90%氮气、5%氢气和5%二氧化碳；第三步，细菌溶液于厌氧操作箱中离心PBS稀释后，装入厌氧试管中，现用现配，其中，PBS稀释浓度为2.5×109cfu/100μL。
本发明的技术方案之二是通过以下措施来实现的：一种普拉梭菌在制备治疗冠心病药物中的应用。
下面是对上述发明技术方案之二的进一步优化或/和改进：
上述普拉梭菌按照下述方法培养和制备：第一步，将LYHBHI培养基、1g/L麦芽糖、1g/L纤维二糖和0.5g/L半胱氨酸，加入双蒸水混匀配置细菌溶液，其中，LYHBHI培养基包括以下成分：37g/L脑心浸液，5g/L酵母提取物，5mg/L血晶质；第二步，将细菌溶液置于厌氧操作箱，经培养24小时，其中，厌氧操作箱中环境条件为90%氮气、5%氢气和5%二氧化碳；第三步，细菌溶液于厌氧操作箱中离心PBS稀释后，装入厌氧试管中，现用现配，其中，PBS稀释浓度为2.5×109cfu/100μL。
本发明的技术方案之三是通过以下措施来实现的：一种普拉梭菌在制备预防冠心病保健品中的应用。
下面是对上述发明技术方案之三的进一步优化或/和改进：
上述普拉梭菌按照下述方法培养和制备：第一步，将LYHBHI培养基、1g/L麦芽糖、1g/L纤维二糖和0.5g/L半胱氨酸，加入双蒸水混匀配置细菌溶液，其中，LYHBHI培养基包括以下成分：37g/L脑心浸液，5g/L酵母提取物，5mg/L血晶质；第二步，将细菌溶液置于厌氧操作箱，经培养24小时，其中，厌氧操作箱中环境条件为90%氮气、5%氢气和5%二氧化碳；第三步，细菌溶液于厌氧操作箱中离心PBS稀释后，装入厌氧试管中，现用现配，其中，PBS稀释浓度为2.5×109cfu/100μL。
本发明的技术方案之四是通过以下措施来实现的：一种普拉梭菌在制备治疗冠心病保健品中的应用。
下面是对上述发明技术方案之四的进一步优化或/和改进：
上述普拉梭菌按照下述方法培养和制备：第一步，将LYHBHI培养基、1g/L麦芽糖、1g/L纤维二糖和0.5g/L半胱氨酸，加入双蒸水混匀配置细菌溶液，其中，LYHBHI培养基包括以下成分：37g/L脑心浸液，5g/L酵母提取物，5mg/L血晶质；第二步，将细菌溶液置于厌氧操作箱，经培养24小时，其中，厌氧操作箱中环境条件为90%氮气、5%氢气和5%二氧化碳；第三步，细菌溶液于厌氧操作箱中离心PBS稀释后，装入厌氧试管中，现用现配，其中，PBS稀释浓度为2.5×109cfu/100μL。
本发明通过在易患动脉粥样硬化的小鼠中进行研究，首次发现了普拉梭菌可以单独预测冠心病并作为有助于预防和治疗冠心病的药物和保健品。
附图说明
附图1为本发明中冠心病组与对照组之间肠道微生物多样性比较图。
附图2为本发明中冠心病组与对照组之间的系统发育特征和肠道微生物差异图。
附图3为本发明中研究人群优势菌种聚类及比较图。
附图4为本发明中不同程度冠心病与对照组之间重要性细菌分析及诊断预测图。
附图5为本发明中实验组及对照组体重及肝肾功能变化图。
附图6为本发明中小鼠动脉粥样硬化病变评估图。
附图7为本发明中实验组及对照组小鼠主动脉炎症指标评估图。
具体实施方式
本发明不受下述实施例的限制，可根据本发明的技术方案与实际情况来确定具体的实施方式。
下面结合实施例对本发明作进一步描述：
实施例1：该普拉梭菌在制备预防冠心病药物中的应用。
实施例2：该普拉梭菌在制备治疗冠心病药物中的应用。
实施例3：该普拉梭菌在制备预防冠心病保健品中的应用。
实施例4：该普拉梭菌在制备治疗冠心病保健品中的应用。
实施例5：作为上述实施例的优化，普拉梭菌按照下述方法培养和制备：第一步，将LYHBHI培养基、1g/L麦芽糖、1g/L纤维二糖和0.5g/L半胱氨酸，加入双蒸水混匀配置细菌溶液，其中，LYHBHI培养基包括以下成分：37g/L脑心浸液，5g/L酵母提取物，5mg/L血晶质；第二步，将细菌溶液置于厌氧操作箱，经培养24小时，其中，厌氧操作箱中环境条件为90%氮气、5%氢气和5%二氧化碳；第三步，细菌溶液于厌氧操作箱中离心PBS稀释后，装入厌氧试管中，现用现配，其中，PBS稀释浓度为2.5×109cfu/100μL。
通过人群肠道微生物宏基因组学分析发现，普拉梭菌在对照组中分布较多，以普拉梭菌为主的人群冠心病发生率较低，而且普拉梭菌可以很好的预测冠心病的发生。本发明通过在小鼠实验中验证普拉梭菌抗动脉粥样硬化及探索可能的机制。其中，实验组给予小鼠普拉梭菌灌胃，对照组给予PBS灌胃。
冠心病人群研究
在2019年12月至2020年6月，纳入就诊某医院住院冠心病患者215例,其中包括稳定型心绞痛患者56例,不稳定型心绞痛患者106例,心肌梗死患者53例,健康对照组人群156例。在本研究招募的冠心病患者均行冠状动脉造影检查,并根据冠状动脉造影结果显示至少一条冠状动脉血管主干狭窄≥50%者诊断冠心病.对于对照组有冠心病危险因素的非冠心病患者，受试者在冠状动脉CT或冠状动脉造影检查中显示阴性结果。
研究排除:1.患有胃肠道疾病、结构性心肌病、肺源性心脏病及高动力性心脏病的患者；2.未控制的高血压及两周内有心源性休克病史的患者；3.严重的肝肾功能障碍。纳入人群后又将上一年有胃肠道手术史、前3个月服用抗生素超过3天及存在腹泻、大便干燥等大便形态异常患者排除。糖尿病定义为糖化血红蛋白水平>6.5%，使用口服降糖药或胰岛素治疗。高血压定义为血压>为140/90mmHg或使用抗高血压药物。每例患者禁食12小时后取外周静脉血5ml。检测实验室数据包括血常规检测参数、血液生化分析结果、包括肾功能参数和肝功能参数、血脂分析结果。
人群宏基因组学测序
为每位参与者提供一个一次性无菌袋收集粪便，并提供一个带有勺子的粪便取样器进行样本收集。所有参与者都接受了收集样本的培训，并被指示在保留粪便之前排空尿液，在采集粪便样本之前充分洗手并戴上一次性手套。从每位参与者新采集的粪便样本被分成五等份200 mg，立即运送至实验室，并在-80℃下冷冻。对每位参与者粪便进行宏基因组学测序。细菌基因组DNA是使用QIAamp DNA大便迷你试剂盒提取的。在检查DNA的完整性和浓度后，使用MGIEasy DNA文库制备试剂盒构建单个文库，将其加载到BGISEQ-500 RS平台，并使用2 × 100 bp配对端读协议。如前所述，执行质量过滤、微调和多路分离过程。
人群宏基因组学分析
本研究人群总纳入371例,冠心病组共纳入215例,其中包括稳定型心绞痛人群56例、不稳定型心绞痛人群106例、心肌梗死人群53例,健康对照组共纳入156例。总样本的基线特征资料如表1-1、表1-2所示。随后，对纳入样本粪便进行肠道微生物宏基因组学测序分析，粪便种属水平和种水平的肠道微生物Alpha多样性及Beta多样性均提示四组之间存在明显差异（如图1所示)。在图1中，组间α-多样性和β-多样性分别用Shannon（A，E）、Simpson（B，F）、Pielou（C，G）和Bray-Curtis相似性指数（D，H）在属水平和种水平上进行估算。采用Wilcoxon秩和检验分析指标，*，p<0.05；**，p<0.01；***P<0.001；****，p<0.0001。A：心梗组，B组：不稳定心绞痛组，C组：稳定心绞痛组，D组：对照组。图1可知，不同程度冠心病组与对照组之间肠道菌群结构不同，存在明显差异。
为了进一步研究四组之间差异性细菌，使用LEfSe分析探索组间差异性细菌，在对照组中差异性最大为普拉梭菌(如图2所示)。其中，图2中A为肠道微生物组的分枝图，B为LEfSe方法鉴定了差异最丰富的分类单元，C为不同细菌与临床指标之间的相关性热图。
随后将差异性细菌与样本的临床指标进行相关性分析，发现包括普拉梭菌在内差异性细菌与血脂、血糖等冠心病危险因素密切相关(如图2-C所示)。
图2中，为分析不同组间存在的差异的种水平细菌，发现对照组中普拉梭菌差异明显。图2-C将组间差异细菌与纳入人群临床指标进行相关性分析发现，差异细菌与临床指标关系密切，具有相关性。
为了分析研究参与者的肠道微生物特征，利用属水平丰度中进行优势细菌聚类分析。基于样品间的Jensen-Shannon距离，利用围绕中心点划分算法进行聚类，最佳分类数目通过Calinski-Harabasz指数确定，结果提示纳入的总样本人群可以聚类为三类，分别为拟杆菌属、普氏菌属、巨单胞菌属。聚类后三组之间确诊冠心病样本量之间无明显统计学差异（如图3-A和图3-C所示）。为了进一步研究，使用种水平进行聚类，将其聚类5组，分别为Faecalibacterium_prausnitzii，Prevotellacopri，Megamonasunclassified，Escherichia coli，Bacteroides fragilis(如图3-B所示)，随后对聚类后的每组分别统计心肌梗死，不稳定型心绞痛，稳定型心绞痛及对照组，发现普拉梭菌聚类的组中，没有冠心病的对照组明显高于其他四组（如图3-D所示）。将注释后的属水平细菌和种水平细菌通过韦恩图进行展示（如图3-E和3-F所示）。其中，本发明中，Faecalibacterium_prausnitzii为普拉梭菌，Prevotella copri为普氏菌，Megamonas unclassified为无法归类的巨单胞菌，Escherichia coli为大肠埃希氏杆菌，Bacteroides fragilis为脆弱拟杆菌。
为了更好的探索四组之间重要的标志物，随机抽取冠心病人群50例,健康对照组50例,作为验证队列,余下为训练集.验证集中SCAD患者15例,UA患者28例,MI患者7例。对种水平细菌进行了 10 倍交叉检查，在训练集中以通过机械学习模型中的随机森林找到更多重要的特征物种，并在验证集中进行验证。通过ROC曲线发现，肠道菌群可以很好的预测不同类型的冠心病，分别的两组比较中我们发普拉梭菌在不同组间重要性都很高（如图4-A至4-C所示）。为了查明何种物质影响冠心病的发生、发展最为重要，我们对重要性细菌进行逐个诊断效能的评估，发现普拉梭菌在不同程度的冠心病与对照组之间比较中均能表现出较好的诊断效能（如表2-1、表2-2所示）。
普拉梭菌的培养和制备
普拉梭菌(ATCC27766)培养基为LYHBHI培养基（包含37g/L脑心浸液，5g/L酵母提取物，5mg/L血晶质）外加1g/L麦芽糖，1g/L纤维二糖和0.5g/L半胱氨酸，加入双蒸水混匀配置溶液。将细菌置于厌氧操作箱（90%氮气，5%氢气，5%二氧化碳），经培养24小时，菌液于厌氧操作箱中离心PBS稀释，稀释浓度为2.5×109cfu/100μL，装入厌氧试管中，现用现配。
小鼠模型
12周龄的ApoE缺陷小鼠均处于C57BL/6背景。所有小鼠都被安置在新疆医科大学的一个特定的无病原体动物设施中。在严格的12小时光照/黑暗循环下，给动物喂食正常食物和随意饮水。12周龄小鼠给予同等剂量高脂饮食（XT108C，江苏协同医药生物公司，中国）随机分为2组：对照组给予PBS0.5L灌胃，实验组给予普拉梭菌灌胃。每周5次，每次均于同一时间灌胃处理。
小鼠体重、肝肾功能评估
12周龄的APOE-/-雄性小鼠给予同等剂量高脂饮食后随机为了两组，将普拉梭菌培养24小时离心取沉淀，使用PBS将其稀释到2.5×109cfu/100μL。实验组给予菌液灌胃，而对照组给予PBS灌胃，每周5次，持续12周。在此期间，每两周检测体重，共检测5次，通过对比发现两组之间体重无明显差异（如图5-A所示）。12周后给予小鼠安乐死，取肝脏和脾脏进行器官指数比较，实验组并未造成肝脾肿大（如图5-B和5-C所示）。与此同时，取血浆进行肝肾功能检测，发现给予普拉梭菌的实验组与对照组相比并未造成肝肾功能异常（如图5-D和5-F所示），其中，5-A：体重在实验期间发生变化（每组15个样本）；5-B：脾指数比较（每组12个样本）；5-C：活指数比较（每组12个样本）；5-D：血清肌酐水平的比较（每组12个样本）；5-E：血清ALT水平的比较（每组9至10个样本）；5-F：血清AST水平比较（每组11至12个样本）；ALT：丙氨酸氨基转移酶，AST：丙酸氨基转移酶。
图5-A为两组之间灌胃3个月期间体重变化，结果显示两组之间体重无明显差异；此细菌灌胃并未影响体重。图5-B和图5-C为两组之间肝脏指数及脾脏指数比较，发现灌胃后小鼠与对照组相比并未出现肝脾肿大。图5-D、图5-E及图5-F分析两组小鼠肝肾功能情况，发现灌胃后两组小鼠肝肾功能并未发现差异。因此可知，普拉梭菌灌胃后并未造成体重变化、肝脾肿大及肝肾功能改变。
小鼠动脉粥样硬化病变评估
小鼠麻醉后，在体视显微镜下，剥离完整主动脉,使用弹簧剪将其剖开。将剖开的主动脉置于生理盐水中漂洗，以去除管腔内的残留血液，随后置于4%多聚甲醛中室温固定10分钟，生理盐水漂洗后于显微镜下摘除黏附于主动脉管腔外的残余油脂。将主动脉浸45℃的0.3%油红O工作液中，密闭孵育10min，随后置于75％酒精中分化，直至正常主动脉壁恢复成乳白色，经生理盐水漂洗后将主动脉充分铺展于黑色吸水纸上拍照。取小鼠心脏，4%多聚甲醛充分固定，移入25%蔗糖PBS溶液中脱水48小时以上。取出心脏向其中加入OCT将组织完全浸没。每只小鼠连续收集5个切片(10μm厚)，跨越550μm的主动脉窦，用油红O染色和苏木素染色，如附图6所示。染色切片使用一体化荧光显微镜进行数字捕获。使用ImageJ软件进行测量。图6为比较两组小鼠动脉粥样硬化情况，图6-A将小鼠整根主动脉剖开，比较两组小鼠大体主动脉动脉粥样硬化严重程度。图6-B将小鼠主动脉根部进行切片，比较两组小鼠动脉粥样硬化厚度。图6-A和图6-B比较发现，给小鼠灌胃普拉梭菌后可以减轻动脉粥样硬化，此结果与人群结果相一致。图6-C为两组小鼠血脂情况比较（此处实验为探索普拉梭菌造成动脉粥样硬化降低的机制），两组小鼠血脂四项并未发生明显差异，由此结果可知，降低动脉粥样硬化并未改变血脂。
抗动脉粥样硬化作用治疗主动脉局部炎症和全身炎症
为了寻找普拉梭菌抗动脉粥样硬化的原因，免疫荧光分析主动脉根部进行定量评估发现，巨噬细胞标记物和巨噬细胞趋化因子存在明显差异，P值分别为0.047和0.011（如图7-A、图7-B所示）。随后，进行了定量逆转录聚合酶链反应测定，以评估小鼠动脉粥样硬化主动脉中免疫细胞标志物、趋化因子和趋化因子受体的 mRNA 表达。发现与对照组相比，实验组动脉粥样硬化中巨噬细胞、趋化因子和趋化因子受体表达降低（如图7-C所示）。主动脉局部炎症反应是加速动脉粥样硬化的主要原因，普拉梭菌抗动脉粥样硬化应是降低炎症反应来实现。为了进一步验证假设，通过对血浆炎症因子检测，评估两组全身炎症反应。与对照组相比，实验组血浆中的促动脉粥样硬化细胞因子水平明显降低（如图7-D和7-E所示）。总之，这些数据表明，普拉梭菌通过降低全身炎症反应，抑制主动脉巨噬细胞为主的局部炎症发挥抗动脉粥样硬化作用。
综上所述，本发明通过在易患动脉粥样硬化的小鼠中进行研究，首次发现了普拉梭菌可以单独预测冠心病并作为有助于预防和治疗冠心病的药物和保健品。
以上技术特征构成了本发明的实施例，其具有较强的适应性和实施效果，可根据实际需要增减非必要的技术特征，来满足不同情况的需求。
Figure 50686DEST_PATH_IMAGE001
Figure DEST_PATH_IMAGE002
Figure 233406DEST_PATH_IMAGE003
Figure DEST_PATH_IMAGE004

Claims (8)

1.一种普拉梭菌在制备预防冠心病药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的一种普拉梭菌在制备预防冠心病药物中的应用，其特征在于普拉梭菌按照下述方法培养和制备：第一步，将LYHBHI培养基、1g/L麦芽糖、1g/L纤维二糖和0.5g/L半胱氨酸，加入双蒸水混匀配置细菌溶液，其中，LYHBHI培养基包括以下成分：37g/L脑心浸液，5g/L酵母提取物，5mg/L血晶质；第二步，将细菌溶液置于厌氧操作箱，经培养24小时，其中，厌氧操作箱中环境条件为90%氮气、5%氢气和5%二氧化碳；第三步，细菌溶液于厌氧操作箱中离心PBS稀释后，装入厌氧试管中，现用现配，其中，PBS稀释浓度为2.5×109cfu/100μL。
3.一种普拉梭菌在制备治疗冠心病药物中的应用。
4.根据权利要求3所述的一种普拉梭菌在制备治疗冠心病药物中的应用，其特征在于普拉梭菌按照下述方法培养和制备：第一步，将LYHBHI培养基、1g/L麦芽糖、1g/L纤维二糖和0.5g/L半胱氨酸，加入双蒸水混匀配置细菌溶液，其中，LYHBHI培养基包括以下成分：37g/L脑心浸液，5g/L酵母提取物，5mg/L血晶质；第二步，将细菌溶液置于厌氧操作箱，经培养24小时，其中，厌氧操作箱中环境条件为90%氮气、5%氢气和5%二氧化碳；第三步，细菌溶液于厌氧操作箱中离心PBS稀释后，装入厌氧试管中，现用现配，其中，PBS稀释浓度为2.5×109cfu/100μL。
5.一种普拉梭菌在制备预防冠心病保健品中的应用。
6.根据权利要求5所述的一种普拉梭菌在制备预防冠心病保健品中的应用，其特征在于普拉梭菌按照下述方法培养和制备：第一步，将LYHBHI培养基、1g/L麦芽糖、1g/L纤维二糖和0.5g/L半胱氨酸，加入双蒸水混匀配置细菌溶液，其中，LYHBHI培养基包括以下成分：37g/L脑心浸液，5g/L酵母提取物，5mg/L血晶质；第二步，将细菌溶液置于厌氧操作箱，经培养24小时，其中，厌氧操作箱中环境条件为90%氮气、5%氢气和5%二氧化碳；第三步，细菌溶液于厌氧操作箱中离心PBS稀释后，装入厌氧试管中，现用现配，其中，PBS稀释浓度为2.5×109cfu/100μL。
7.一种普拉梭菌在制备治疗冠心病保健品中的应用。
8.根据权利要求7所述的一种普拉梭菌在制备治疗冠心病保健品中的应用，其特征在于普拉梭菌按照下述方法培养和制备：第一步，将LYHBHI培养基、1g/L麦芽糖、1g/L纤维二糖和0.5g/L半胱氨酸，加入双蒸水混匀配置细菌溶液，其中，LYHBHI培养基包括以下成分：37g/L脑心浸液，5g/L酵母提取物，5mg/L血晶质；第二步，将细菌溶液置于厌氧操作箱，经培养24小时，其中，厌氧操作箱中环境条件为90%氮气、5%氢气和5%二氧化碳；第三步，细菌溶液于厌氧操作箱中离心PBS稀释后，装入厌氧试管中，现用现配，其中，PBS稀释浓度为2.5×109cfu/100μL。
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