CN117625444A - 一种犊牛用益生菌及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明的犊牛用益生菌涉及犊牛养殖技术领域，一种犊牛用益生菌为双歧杆菌（bifidobacterium crudilactis P4），已于2023年4月26保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号：CCTCC NO：M 2023640。本发明的犊牛用益生菌经过耐药基因检测、氨基酸脱羧酶活性及靛基质检测(有毒代谢产物检测)、致病性试验、溶血活性检测等安全性评价以及耐酸试验、耐胆盐试验、人工胃肠液耐受性试验、体外抑菌试验、表面性质测定、细胞粘附试验等相关试验后，结果均符合微生物饲料添加剂的要求。
Description
技术领域
本发明涉及犊牛养殖技术领域，尤其涉及一种犊牛用益生菌及其用途。
背景技术
犊牛消化不良是哺乳期犊牛胃肠消化机能障碍的总称，又称消化不良性腹泻，其主要临床特征是明显的消化机能障碍和不同程度的腹泻。根据临床表现和发病经过，可将犊牛消化不良分为单纯性消化不良和中毒性消化不良。单纯性消化不良多发生于15日龄内的新生犊牛，主要表现为消化和营养的急性障碍和轻微的全身症状。新生犊牛神经系统的调节机能较弱，消化系统发育尚不完善，在饲养管理不当、初乳或常乳饲喂不及时或过量、常乳或代乳品质量差、营养不良、畜舍卫生差、应激等因素的作用下，极易造成胃肠功能和肠道菌群紊乱，出现单纯性消化不良。如果单纯性消化不良得不到有效救治就会进一步发展为中毒性消化不良，呈现出严重的消化障碍、明显的自体中毒和重剧腹泻等全身症状。消化不良严重影响新生犊牛对营养物质的吸收，导致犊牛发育迟缓，抵抗力下降，易于继发大肠杆菌、轮状病毒、冠状病毒、隐孢子虫等病原的感染，发生感染性腹泻；消化不良的新生犊牛还易于继发瘤胃臌气、皱胃炎、皱胃阻塞和扭转、呼吸道感染等，严重的甚至发生死亡，每年给奶牛和肉牛养殖业带来严重的经济损失。
目前，规模化牧场主要通过加强犊牛新生期饲养管理、应用抗菌药物和中草药等来预防和治疗新生犊牛消化不良及腹泻。但预防性应用抗菌药物会带来潜在的抗生素滥用和细菌耐药性问题，此外，长期使用抗菌药物会扰乱新生犊牛肠道菌群和消化系统的发育，可能对其生长发育和生产性能的发挥产生长期的负面影响。近年研究表明，胃肠道菌群在人和动物胃肠道健康的维持、营养物质的消化和代谢、宿主免疫机能的调节等方面发挥着重要作用。基于肠道菌群开发的具有精准治疗或预防作用的新型微生物制剂已经成为人和动物疾病预防和治疗的新途径，具有广阔的市场前景。在犊牛出生后的早期阶段，肠道菌群能够促进消化系统和免疫系统的发育、成熟，并对成年后的健康及生产性能产生长远影响。
另有研究表明，肠道菌群组成与犊牛的健康和日增重紧密相关，发生腹泻、肺炎或日增重低的犊牛，其肠道菌群多样性也较低，双歧杆菌等具有益生作用的细菌显著减少。Giovana S.Slanzon等分析了肠道疾病腹泻犊牛肠道菌群的多样性变化，结果显示长双歧杆菌丰度降低，大肠杆菌丰度上升。上述研究表明，双歧杆菌等益生菌在犊牛肠道健康的维护中发挥着重要作用。近年来，不同来源和类型的益生菌被逐步应用到犊牛腹泻和消化不良的预防中，其中包括长双歧杆菌、屎肠球菌、乳酸片球菌、枯草芽孢杆菌等。临床应用研究表明，上述益生菌均能不同程度的降低犊牛腹泻发病率，改善腹泻症状。
犊牛消化不良的临床表现是食欲不振至厌食；粪便减少或增多以及粪便干燥、黏稠或腹泻。现阶段治疗犊牛消化不良的药物主要为西药和一部分中药，而长期使用西药会造成肝脏等脏器的损伤，虽然中药的使用副作用较小，但是中药的炮制以及制备过程复杂繁琐，且具有较好药物疗效的中药需要道地药材，费用昂贵。在早期饲料添加剂的生产中，存在着滥用抗生素与激素的问题。长期使用抗生素或磺胺类药物来防止畜禽的疾病或消化不良等消化系统疾病，会导致家畜肠道中病原菌产生耐药性，破坏机体胃肠道稳态。虽然犊牛的肠道中存在一定量的有益菌，但是不能直接将分离到的益生菌培育后作为犊牛的饲料添加剂。养殖用含可遗传耐药基因的益生菌大规模的使用将导致耐药基因向病原体转移，将造成患病动物对药物产生耐药性，降低患病动物的治愈率。
目前，我国农业农村部已规定了饲料添加剂中可添加的有益微生物菌种有34种，根据有益菌的不同生理生化特性，它们会以不同方式被应用于动物。近年来，随着微生物组学、培养组学技术的不断发展，越来越多的新的功能益生菌逐步被用于人类和动物疾病的预防和治疗中。根据联合国粮农组织/世界卫生组织(FAO/WHO)关于食品益生菌评价指南的联合报告中指出，可用于商品化的益生菌菌株需要经过胃酸耐受试验、胆汁酸耐受试验、粘附试验或/和人上皮细胞粘附试验、对条件致病菌的拮抗活性试验、降低致病菌对消化道粘膜的粘附能力试验、胆汁盐水解酶活性试验和对杀精子剂的耐药性试验(适用于阴道用益生菌)等体外和在体试验来评估其益生特性。同时，还要对候选菌株进行溶血活性、有毒代谢产物、耐药基因及其药物敏感性及有无致病性、细胞和动物实验等来评价其安全性。
目前，用作防治犊牛消化不良的微生物制剂的益生菌还很有限，不能满足市场需求。
发明内容
有鉴于此，有必要提供一种符合食品益生菌要求的犊牛用益生菌。
一种犊牛用益生菌为双歧杆菌(bifidobacterium crudilactis P4)，已于2023年4月26日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号：CCTCC NO：M 2023640。
上述犊牛用益生菌应用于犊牛的微生物制剂。
上述犊牛用益生菌应用于防治犊牛消化不良的微生物药物制剂。
上述犊牛用益生菌应用于犊牛的微生物饲料添加剂。
有益效果：本发明的犊牛用益生菌经过耐药基因检测、氨基酸脱羧酶活性及靛基质检测(有毒代谢产物检测)、致病性试验、溶血活性检测等安全性评价以及耐酸试验、耐胆盐试验、人工胃肠液耐受性试验、体外抑菌试验、表面性质测定、细胞粘附试验等相关试验后，结果均符合微生物饲料添加剂的要求。
附图说明
图1为本发明的基于本试验双歧杆菌P4 rRNA基因序列构建的系统发育进化树。图2为本发明的双歧杆菌P4溶血性试验对照图，其中A为本试验菌株菌落周围未出现溶血环，没有发生溶血现象。B为肠球菌ATCC29212菌落周围出现了溶血环，发生溶血现象的阳性对照。
图3为本发明的试验菌株急性口毒性脏器病理切片结果；其中；A、B、C、D分别为无菌生理盐水灌胃空白对照组小鼠心肝脾肾脏的病理切片结果；E、F、G、H分别为本试验菌株高浓度菌悬液灌胃小鼠心肝脾肾脏病理切片结果。
图4为P4黏附在人结直肠癌细胞(Caco-2)周围的图。
具体实施方式
以下将结合具体实施例对本发明的方案进行详细说明。实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法。
本发明中出现的各英文缩写表示的中英文含义如表1所示，后续为了便于统计及叙述，试验中的有关词汇将通过英文缩写代替。
本发明的菌种双歧杆菌(bifidobacterium crudilactis)P4是从健康荷斯坦母牛乳汁以及哺乳期荷斯坦健康犊牛新鲜粪便中分离出的。从健康荷斯坦母牛乳汁以及哺乳期荷斯坦健康犊牛新鲜粪便中分离出的益生菌，除了双歧杆菌P4，还有其它菌种，但是其它菌种在进行食品益生菌评价过程中不符合标准，已被淘汰。并且由于是被淘汰的菌种，没有利用价值，不需要花费时间和金钱去进行基因序列检测，并且由于这些菌种的基因序列上存在差异，很可能在其它牛体中并不存在。本发明的菌种与这些被淘汰的菌种进行对比实验已无意义。后续实验数据皆是本发明的双歧杆菌P4实验数据。这些实验数据用于证明本发明的双歧杆菌P4符合食品益生菌的产品要求。本发明的双歧杆菌P4已于2023.4.26在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)进行了保藏，保藏编号为CCTCC M2023640。
除此之外，文中涉及到的菌种ATCC15707是长双歧杆菌购自北京北纳联创生物科技有限公司。试验中所用到的埃希氏大肠杆菌ATCC8739(Escherichia coli)、金黄色葡萄球菌ATCC33591(Sta phylococcus a ureus)、鼠伤沙门氏菌ATCC14028(Salmonellatyphimurium)购自中国药品生物制品鉴定所。人结直肠腺癌细胞(Caco-2细胞)来源于宁夏大学生命科学学院。
试验中所需主要培养基见表2。
表2：培养基及其来源
| MRS培养基 | 青岛高科园海博生物技术有限公司 |
| ISO-SENSITESTBROTH | 上海创赛科技有限公司 |
| 鸟氨酸脱羧酶肉汤试验管 | 青岛高科园海博生物技术有限公司 |
| 赖氨酸脱羧酶肉汤试验管 | 青岛高科园海博生物技术有限公司 |
| 精氨酸脱羧酶肉汤试验管 | 青岛高科园海博生物技术有限公司 |
| 蛋白胨(色氨酸肉汤)试验管 | 青岛高科园海博生物技术有限公司 |
| 哥伦比亚培养基 | 青岛高科园海博生物技术有限公司 |
本发明试验中用到的双歧杆菌通过以下方式获得。将筛选后的双歧杆菌接种于改良MRS琼脂平板中，并在37℃下，厌氧培养48h后挑取单菌落接种至新鲜无菌的MRS肉汤培养基中厌氧培养获得。
改良MRS肉汤培养基采用以下方式制备。蛋白胨10.0g、牛肉浸粉5.0g、酵母浸粉4.0g、葡萄糖20.0g、磷酸氢二钾2.0g、柠檬酸三铵2.0g、醋酸钠5.0g、硫酸镁0.2g、硫酸锰0.05g、琼脂15.0g、吐温80 1.0g，将上述成分加入蒸馏水中，定容至1000mL，调节pH为6.2±0.2，于121℃高压灭菌15～20min，在MRS琼脂培养基的基础上添加滤菌马血清(50mL/L)、0.5g/L半胱氨酸盐酸盐溶液、莫匹罗星(50mg/L)。
以下为双歧杆菌P4的安全性检测的具体实施过程。
双歧杆菌P4的可转移的耐药基因检测：
双歧杆菌的耐药基因主要有四环素耐药基因tet(W)、tet(M)、tet(S)、tet(Q)、tet(O)、tet(W)、tet(L)、tet(P)，环丙沙星耐药基因gyrA，古霉素耐药基因vanX，卡那霉素耐药基因aph(3“)-III.，甲氧苄啶耐药基因dfrD，利福平耐药基因rpoB，克林霉素耐药基因lsa，氨基糖苷耐药基因aac(3)、aph(3)、aph(3′)-III，aadA，aadE、ant(6)、ant(9)，氯霉素耐药基因cat、cmlA和红霉素抗性基因erm(B)、mef、mef(E)、mef(B)，β内酰胺类耐药基因blaCTX-M、blaSHV、blaTEM、blaZ、blaOXA-1、blaOXA-48。
其中目前能确定可转移的耐药基因有tet(W)、tet(M)、aphA-1、aphA-2、aadA、addE、gyrA、aac6'-lb-cr、aac(6′)-aph(2″)、erm(B)、str(A)、str(B)、sul2、sul3耐药基因，对本发明的双歧杆菌P4进行检测后，未发现上述可转移的耐药基因。
同时，四环素耐药基因将通过性信息素介导的偶联系统进行广泛传播，本发明对菌株P4的性信息素毒力基因cpd、cob、ccf进行检测，结果不含有性信息素毒力基因，即不存在四环素耐药基因的传播途径。
最小抑菌浓度(MIC)检测
通过微量肉汤稀释法测定双歧杆菌P4的药物敏感性质控菌株长双歧杆菌ATCC15707对13种抗菌药物的MIC值均在质控范围内，试验结果可信。青霉素(100mg)、氨苄西林(Ampicillin，100mg)、头孢噻呋(100mg)、庆大霉素(100mg)、卡那霉素(100mg)、新霉素(100mg)、链霉素(150mg)、盐酸四环素(Tetracycline，100mg)、红霉素(Erythromycin，200mg)、林可霉素(100mg)、氟苯尼考(100mg)环丙沙星(Ciprofloxacin，100mg)、磺胺甲噁唑(100mg)以上药品均购自中国兽医药品检察所。
双歧杆菌P4对13种药物均敏感。
双歧杆菌P4溶血性试验。
挑取活化后的双歧杆菌P4菌悬液划线接种于哥伦比亚培养基，置37℃厌氧培养72h后观察平板中菌落周围是否产生α-溶血或β-溶血。用粪肠球菌ATCC29212作为阳性对照。
如图2所示，双歧杆菌P4不溶血。
双歧杆菌P4的有毒代谢产物检测，即氨基酸脱羧酶活性及靛基质检测
a，氨基酸脱羧酶活性检测
挑取改良MRS琼脂培养基培养72h的单个菌落分别接种于鸟氨酸、精氨酸、赖氨酸氨脱羧酶肉汤试验管和对照管中，并在培养基表面覆盖无菌液体石蜡，置37℃厌氧培养18～24h。对照管为黄色，若试管为紫色，则为阳性，若试管为黄色，则为阴性。
b，靛基质检测
将单菌落接种蛋白胨(色氨酸肉汤)试验管中，置37℃培养24～48h，先在培养基中滴加适量二甲苯振荡混匀，萃取培养基中菌株生长代谢产生的吲哚，再滴加Kovacs靛基质试剂2～3滴静置。若液体分层后，上层出现红色则为阳性，否则为阴性。
如表3所示，氨基酸脱羧酶活性检测和靛基质检测试验结果表明双歧杆菌P4不具有鸟氨酸、赖氨酸、精氨酸氨基脱羧酶活性，不会产生有毒物质吲哚。
表3双歧杆菌P4试验氨基酸脱羧酶活性检测和靛基质检测结果
致病性试验
购买SPF级ICR健康成年小鼠，雌雄各半，体重18.0g～22.0g分别通过腹腔注射和经口灌胃两种途径，给予小鼠双歧杆菌P4培养液，以评价不同受试物暴露途径对动物的致病性。方法及计量均参考《保健食品原料用菌种安全性检验与评价技术指导原则(2020年版)》。
其中，腹腔注射的实施过程如下：
S1：菌株活化及菌悬液制备
将纯化后的双歧杆菌P4单菌落与无菌生理盐水充分混匀，制备成菌悬液，用适量无菌生理盐水调节菌悬液浓度，使最终菌浓度达5.0×107CFU/mL用于小鼠腹腔注射。
S2：腹腔注射
取小鼠32只，雌雄各半，随机分成4组，两组雌鼠，两组雄鼠，每组8只小鼠，经一周适应性饲养后，每只小鼠注射0.2mL菌悬液或生理盐水。4组小鼠分别为雌性小鼠无菌生理盐水对照组、雄性小鼠无菌生理盐水对照组、P4雌性小鼠菌悬液组、P4雄性小鼠菌悬液组，P4雌性小鼠菌悬液组、P4雄性小鼠菌悬液组的每只小鼠注射菌量不少于1.0×107CFU。
S3：观察
动物腹腔注射后每天观察1次，连续观察21d。观察并记录小鼠皮肤和被毛、眼睛和黏膜、呼吸情况、肢体活动、行为方式等有无异常。观察小鼠是否出现震颤、抽搐、腹泻、嗜睡、流涎和昏迷等现象。试验前称量并记录所有小鼠的体重，试验结束后称量并记录所有存活小鼠的体重。对于试验期间死亡的小鼠，尽可能精确记录小鼠的死亡时间，同时称重并记录。
腹腔注射对小鼠体重的影响见表4和表5所示。
表4：腹腔注射对雌鼠体重的影响
表5：腹腔注射对雄鼠体重的影响
试验期间，小鼠初始体重及终末体重在菌悬液组和生理盐水对照组组间比较均无显著差异(P＞0.05)，未观察到实验小鼠明显的活动或行为变化、疾病或死亡。
S4：小鼠血样的采集及检测
试验结束后，菌悬液组和生理盐水对照组随机取两只小鼠采样。将样品的编号标记在装有EDTA-2K的PCR管上备用。采用尾静脉取血的方法将血液采集到加有抗凝剂(EDTA-2Na)的PCR管中。将收集好的血液放入冰盒中保存，带回实验室后用血常规仪器检测血常规。结果如表6所示。
表6腹腔注射小鼠血常规
菌悬液组和生理盐水对照组中小鼠的各项血常规组间差异不显著(P＞0.05)。
通过体重和血常规检测实验可以说明，腹腔注射双歧杆菌P4，不具有致病性。
经口灌胃的实施过程如下：
S1：菌株活化及菌悬液制备
将纯化后的双歧杆菌单菌落与无菌生理盐水充分混匀，用适量无菌生理盐水调节菌悬液浓度，使最终菌浓度达到1×1010CFU/mL、1×108CFU/mL用于小鼠经口灌胃。
取48只小鼠，雌性各半，随机分为6组，3组雌鼠，3组雄鼠，每组8只，经一周适应性饲养后，6组小鼠分别灌胃生理盐水、高浓度菌悬液(1×1010CFU/mL)、低浓度菌悬液(1×108CFU/mL)，灌胃剂量为0.2mL/只，每天1次，连续灌胃14d。6组小鼠分别为雌性小鼠无菌生理盐水对照组、雄性小鼠无菌生理盐水对照组、P4雌性小鼠低剂量菌悬液组、P4雌性小鼠高剂量菌悬液组、P4雄性小鼠低剂量菌悬液组、P4雄性小鼠高剂量菌悬液组。每天观察小鼠的活动状态，中毒表现，记录体重变化。
S3：观察
动物经口灌胃后每天观察1次，连续观察21d，观察并记录小鼠皮肤和被毛、眼睛和黏膜、呼吸情况、肢体活动、行为方式等有无异常。观察小鼠是否出现震颤、抽搐、腹泻、嗜睡、流涎和昏迷等现象。试验前称量并记录所有小鼠的体重，试验结束后称量并记录所有存活小鼠的体重。对于试验期间死亡的小鼠，尽可能精确记录小鼠的死亡时间，同时称重并记录。
灌服对小鼠体重影响见表7和表8所示。
表7：灌服对雌鼠体重的影响
表8双歧杆菌P4培养物灌服对雄鼠体重的影响
试验期间，雌性小鼠初始体重在菌悬液组和生理盐水对照组组间比较无显著差异(P＞0.05)；终末体重在菌悬液组和生理盐水对照组组间比较，P4雌性小鼠高剂量和低剂量菌悬液组体重增加，差异极显著(P＜0.01)。试验期间，雄性小鼠初始体重在菌悬液组和生理盐水对照组组间比较无显著差异(P＞0.05)；终末体重在菌悬液组和生理盐水对照组组间比较，P4雄性小鼠高剂量菌悬液组体重显著增加(P＜0.05)。未观察到实验小鼠明显的活动或行为变化、疾病或死亡。
S4：血常规指标检测
采用尾静脉采血的方法收集小鼠血液到装有抗凝剂的PCR管中，放入冰盒保存并带回实验室，使用自动血细胞分析仪检测血液学参数。器官样本的收集，用无菌镊子迅速摘取菌悬液组和生理盐水对照组小鼠的心、肝、脾、肾放入50mL的无菌离心管中用多聚甲醛溶液(4％PFA)固定，室温保存。将收集好的脏器样品送至切片公司制作病理切片，如图3所示。检测结果如表9所示。
表9双歧杆菌P4培养物灌胃小鼠血常规
P4菌悬液组和无菌生理盐水对照组中小鼠的各项血常规组间差异不显著(P＞0.05)。
通过体重和血常规检测实验可以说明，灌胃双歧杆菌P4，不具有致病性。
综上腹腔注射和灌胃实验可以说明，本发明的双歧杆菌P4不具有致病性。
细菌移位能力评价
分析小鼠血和脏器组织(心、肝、脾、肺、肾)的细菌移位情况。将50μL小鼠血液涂布于改良MRS平板，于37℃下分别厌氧72h，计数平板菌落数。取组织样品，以1g/mL置于无菌生理盐水中，匀浆后取100μL涂布于改良MRS平板，37℃下厌氧72h，计数平板上的菌落数，有菌落生长即记为阳性。
P4菌悬液组和无菌生理盐水对照组小鼠的血和脏器组织经过培养后，培养基上都没有菌落生长，表明双歧杆菌P4都没有从肠道转移到血和脏器组织，未发生移位现象。
进一步的，本发明还通过试验一、试验二、试验三对动物双歧杆菌P4进行耐受性试验。
试验一、耐酸性试验
采用平板菌落计数法测定双歧杆菌对酸的耐受性。以普通改良MRS培养基作为对照，用1mol/L盐酸调节改良MRS液体培养基pH，使其pH分别为2.0、3.0、4.0、5.0。将菌液调OD600nm为1±0.05后按2％接种量分别接种于不同pH的改良MRS液体培养基中，37℃培养，分别在0h、2h、4h测定各组培养基中双歧杆菌活菌数，每组设置3个平行重复。试验结果如表10所示，表明菌株在pH3时仍然具有生长活性，说明本发明的P4耐酸性良好。
表10：双歧杆菌P4耐酸试验结果
试验二：耐胆盐试验
采用平板菌落计数法测定双歧杆菌对胆盐的耐受性。以普通改良MRS培养基作为对照，在改良MRS液体培养基中分别加入0.1g/L、0.2g/L和0.3g/L牛胆盐，将菌液调OD600nm为1±0.05后按2％接种量分别接种于0.1％、0.2％和0.3％胆盐改良MRS液体培养基中，37℃培养，分别在0h、2h和4h测定各组培养基中双歧杆菌活菌数，每组设置3个平行重复。存活率＝N1/N0×100％。N1：胆盐处理2h或4h后的活菌数；N0：0h的活菌数。菌株P4耐胆盐试验结果见表11，试验结果表明菌株P4在胆盐浓度为0.1％、0.2％、0.3％胆盐的培养基中均可以生长繁殖，且存活率均较高。
表11：菌株P4胆盐耐受性检测
试验三：人工胃肠液耐受性检测
人工胃液的制备：在100mL模拟胃液中，胃蛋白酶0.32g，NaCl 0.2g，HCl调pH至2.5，用0.22μm无菌滤膜过滤。
人工肠液的制备：在100mL模拟肠液中，胰蛋白酶1.0g，磷酸二氢钾0.68g，NaOH调pH至7.5±0.1，用0.22μm无菌滤膜过滤。
人工胃液耐受性测定：采用平板菌落计数法测定双歧杆菌对人工胃液的耐受性。活化后的菌液5000r/min，4℃离心5min，弃掉上清液，用无菌PBS重悬双歧杆菌重复3次，将菌液调OD600nm为1±0.05后按2％接种量分别接种于人工胃液并混匀，37℃培养，分别在0h、2h和4h测定各组培养基中双歧杆菌活菌数，每组设置3个平行重复。存活率＝N1/N0×100％N1：人工胃液处理2h或4h后的活菌数；N0：0h的活菌数。
人工肠液耐受性测定：采用平板菌落计数法测定双歧杆菌对人工肠液的耐受性。活化后的菌液5000r/min，4℃离心5min，弃掉上清液，用无菌PBS重悬双歧杆菌重复3次，将菌液调OD600nm为1±0.05后按2％接种量分别接种于人工胃液并混匀，37℃培养，分别在0h、2h和4h测定各组培养基中双歧杆菌活菌数，每组设置3个平行重复。存活率＝N1/N0×100％。N1：人工肠液处理2h或4h后的活菌数；N0：0h的活菌数。
菌株P4胃肠道耐受性结果见表12，经过模拟胃液处理2h、4h后菌株P4存活率为0，模拟肠液处理4后，存活率为111.30±1.30％，可知该菌能耐受一定的胃肠道环境。
表12：菌株P4胃肠道耐受性检测
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通过胃肠道耐受性检测说明本发明的菌株64-N1不耐受，符合要求。
进一步的，本发明还进行了达到微生物饲料添加剂要求的其它项试验。
体外抑菌试验
发酵上清的制备：挑取单菌落接种于改良MRS液体培养基培养72h，菌液12000r/min离心1min后取上清，用0.22μm无菌滤膜过滤后备用。
抑菌试验：直径10cm的平皿中倒入高压灭菌好的TSA培养基20mL，将过夜培养的大肠杆菌ATCC8739、金黄色葡萄球菌ATCC33591、鼠伤沙门氏菌ATCC14028稀释到106CFU/mL，用棉签菌液涂布于琼脂表面，待完全吸收后，每皿摆放3个牛津杯，牛津杯内加入200μL待检双歧杆菌上清液，置4℃冰箱2h后，转入37℃温箱孵育24h后用游标卡尺对抑菌圈直径进行测量。
表:13菌株P4体外抑菌试验结果
表面活性测定
疏水性测定：将过夜培养的菌液离心，用PBS洗涤2次，调节OD600nm为1±0.02，记录为A0；分别将2mL氯仿加入到同等体积的菌悬液中，涡旋混匀1min；37℃静置孵育2h；待两相分层后取水相，测定其OD600nm波长处的吸光值并记录为A2；进行三次重复试验，计算三次试验各菌株疏水率，最后计算三次试验疏水率的平均值±标准差。菌株疏水率(％)表示为：(A0-A2)/A0×100％。结果如表14所示。
自聚率测定：将过夜培养的菌液离心，用PBS洗涤两次，调节OD600nm为1±0.02，记录为A0；取4mL菌悬液于37℃静置放置24h；取培养基上清液于OD600nm波长处测定吸光度，记录为A1；进行三次重复试验，计算各菌株自聚率，最后计算三次试验自聚率的平均值±标准差。菌株自聚率(％)表示为：(A0-A1)/A0×100％。结果如表14所示。
表14：双歧杆菌P4表面性质测定结果
| 菌株编号 | 疏水性氯仿(％) | 自聚率(％) |
| P4 | 37.16±0.96％ | 25.86±1.86％ |
细胞粘附试验
细胞培养：Caco-2细胞复苏后，用10％胎牛血清培养基重悬细胞并接种于细胞培养瓶中，置于37℃，5％CO2细胞培养箱中，待细胞生长至铺满培养瓶底部，进行1：3传代，待细胞传代至5代以上进行下列试验。
菌悬液的制备：待测双歧杆菌活化后，取200μL接种改良MRS液体培养基的离心管中静置培养12h，4000r/min离心10min收集菌体，用PBS洗涤3次。用不含双抗和血清DMEM完全培养液重悬细菌，调节菌液浓度在108CFU/mL，进行黏附试验。
细胞黏附及观察试验：倾去细胞培养基，将贴壁细胞与菌悬液共培养4h后倾去菌悬液，用PBS缓冲液洗去未粘附的双歧杆菌，将细胞爬片取出，用细胞固定液固定15min，再次用PBS冲洗2～3遍后对细胞进行革兰氏染色，用油镜观察并拍摄照片，在镜下随机选取20个视野，数每个细胞周围黏附的双歧杆菌数并记录，结果用平均值±标准差表示。
表:15双歧杆菌P4的黏附率
| 菌株编号 | 黏附率(％) |
| P4 | 47.2±15.95％ |
以上试验结果表明，本发明的双歧杆菌P4可作为犊牛的微生物饲料添加剂。
为了验证双歧杆菌P4在防治犊牛消化不良中的效果，本发明将双歧杆菌P4与实验室分离的动物双歧杆菌64-N1的冻干粉按质量比1:1的比例配伍成复合微生态制剂，应用于犊牛消化不良的防治。动物双歧杆菌64-N1已于2023年4月26日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号：CCTCC M2023641。结果如表16所示，分别饲喂宁夏地区某规模化奶牛场中12～28日龄健康犊牛15头，消化不良犊牛15头，连续饲喂7天，每头犊牛每餐掺喂1.75～2.25克复合微生态制剂，饲喂后连续观察21天。观察并记录犊牛皮肤和毛、眼睛和粘膜、呼吸情况、肢体活动、行为方式等有无异常。特别注意观察是否出现振颤、抽搐、腹泻、嗜睡、流涎和昏迷等现象。消化不良犊牛饲喂第二天，消化不良症状(厌食、粪便呈黏稠黄色或透明、腹泻)明显缓解，连续饲喂3-5天后，病畜基本痊愈，饲喂期间无动物死亡发生，食欲大增，粪便正常，无腹泻，且出现抢食现象，动物治愈率达99％，其中有一头犊牛因脱水严重而死亡。健康犊牛无消化不良现象发生，且犊牛皮肤和毛、眼睛和粘膜、呼吸情况、肢体活动、行为方式等无异常，没有出现振颤、抽搐、腹泻、嗜睡、流涎和昏迷等现象。上述饲喂试验中，益生菌制剂在对犊牛消化不良治愈中效果显著，且未出现康复动物病情复发等现象。此外，将上述复合微生态制剂初步应用于腹泻犊牛中，均有缓解并治愈腹泻的效果。因此，本发明双歧杆菌P4可作为复合微生态制剂复配菌株应用于犊牛消化不良病的防治。
表16双歧杆菌P4在防治犊牛消化不良中的效果。
以上所揭露的仅为本发明较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，本领域普通技术人员可以理解实现上述实施例的全部或部分流程，并依本发明权利要求所作的等同变化，仍属于发明所涵盖的范围。
Claims (4)
1. 一种犊牛用益生菌为双歧杆菌（bifidobacterium crudilactis P4），保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号：CCTCC NO：M 2023640。
2.如权利要求1所述的犊牛用益生菌，其特征在于：应用于犊牛的微生物制剂。
3.如权利要求1所述的犊牛用益生菌，其特征在于：应用于防治犊牛消化不良的微生物药物制剂。
4.如权利要求1所述的犊牛用益生菌，其特征在于：应用于犊牛的微生物饲料添加剂。
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| CN202311498730.4A CN117625444A (zh) | 2023-11-10 | 2023-11-10 | 一种犊牛用益生菌及其用途 |
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| CN116948876A (zh) * | 2023-06-13 | 2023-10-27 | 宁夏大学 | 一种动物双歧杆菌及其用途 |
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- 2023-11-10 CN CN202311498730.4A patent/CN117625444A/zh active Pending
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