CN102131927B

CN102131927B - 可调型基因自杀机制组合物和方法

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Publication number: CN102131927B
Application number: CN200980133155.XA
Authority: CN
Inventors: 马修·J·贾卡洛内; 斯坦利·马洛伊; 辻晋吾
Original assignee: Watt Jinx Treats Co Ltd
Current assignee: Watt Jinx Treats Co Ltd
Priority date: 2008-06-25
Filing date: 2009-06-23
Publication date: 2015-11-25
Anticipated expiration: 2029-06-23
Also published as: CN102131927A; HK1160173A1; JP2017127331A; ES2569909T3; EP3020811A1; KR20180013993A; CA2729545C; US20100112670A1; US9574196B2; KR20110048510A; JP5754648B2; EP2310502B1; HK1222680A1; KR20160062197A; US9045761B2; AU2015243054A1; KR101813824B1; JP2015146824A; US20170224625A1; CA2729545A1

Abstract

本发明的实施方案涉及可调型基因自杀机制在用于在改进的生物学纯化中引入和用途，包括在各种真细菌小细胞的产生和纯化方法中的辅助用途。本文描述了具有遗传修饰的包含可调型基因自杀机制的高产量的产生小细胞的真细菌菌株，所述基因自杀机制不可修复地破坏亲代细胞的染色体，从而使得可以在小细胞产生和纯化过程的运行期间，在任何时间，功能性地消除培养中的活亲代细胞。本发明的实施方案还描述了用于在其他基于细胞的生物学产生期间消除活亲代细胞的方法。

Description

可调型基因自杀机制组合物和方法

相关技术的描述

提供下列说明以辅助理解本发明公开内容，但是并非承认描述或构成针对本公开的现有技术。本申请中所提及或引用的文章、专利和专利申请和所有其他文献以及电子化可利用信息的内容，都通过引用的方式全文并入本文，其并入的程度，如同每篇单独的出版物被特别且单独指出通过引用的方式并入一样。本申请人保留将任何和所有来源于任何此类文章、专利、专利申请或其他的文献的材料和信息在物理上并入本申请的权利。

小细胞是非染色体的、被膜包裹的生物纳米粒子(＜400nm)，该纳米粒子在细菌细胞的正常分裂器破坏后，由细菌形成。本质上，小细胞是正常细菌细胞的小的、新陈代谢活跃的复制品，但是它们不含有染色体DNA并因此为非分裂的和无存活力的。尽管小细胞不含有染色体DNA、质粒DNA分子、RNA分子，但已证明天然和/或重组表达蛋白和其他的代谢物都可分离出小细胞。

在整个上世纪中，研究科学家已利用小细胞作为研究细胞分裂、质粒复制、质粒分离、RNA产生、蛋白产生、质粒隔离、质粒表征和原核生物中质粒源性毒力因子产生的工具。

作为微生物学、微生物遗传学和分子生物学领域中进展的结果，任何给定的小细胞，不管其来自哪种亲代细胞种类，现在都可以被“改造”并随后用作体内或体外靶向递送或成像的媒介。

小细胞特别适合于作为体内递送和成像的媒介，因为它们将许多其他的递送技术的单独的优势组合成单一的通用递送媒介。小细胞可以被“改造”为优先封装、偶联或吸收包括各种核酸、蛋白和小分子药物的生物活性分子，以用于随后的治疗和预防医药应用。如下文更为详细描述的，因为通过使用几种不同的抗体或基于亲和力的方法，它们可以靶向于特定的细胞、组织和器官类型，所以小细胞具有更多优势。

发明概述

一些实施方案提供了产生小细胞的细菌，所述细菌包含：编码产生小细胞的基因产物的可表达基因，该基因产物调节隔膜形成、二分裂和染色体分离中的一个或多个；和编码核酸内切酶的可表达基因，其中所述产生小细胞的细菌的染色体包含一个或多个核酸内切酶的识别位点。在一些实施方案中，产生小细胞的基因是细胞分裂基因。细胞分裂基因包括但不限于ftsZ、sulA、ccdB以及sfiC。在一些实施方案中，在诱导型启动子的控制下，表达所述产生小细胞的基因。在一些实施方案中，核酸内切酶基因位于产生小细胞的细菌的染色体上。在一些实施方案中，核酸内切酶是归巢核酸内切酶(homingendonuclease)。所述归巢核酸内切酶包括但不限于I-CeuI、PI-SceI、I-Chul、I-CpaI、I-SceIII、I-CreI、I-MsoI、I-SceII、I-SceIV、I-CsmI、I-DmoI、I-PorI、PI-TliI、PI-TliII和PI-ScpI。在一些实施方案中，在诱导型启动子的控制下，表达所述核酸内切酶。在一些实施方案中，产生小细胞的细菌是革兰氏阴性细菌。革兰氏阴性细菌包括但不限于空肠弯曲菌(Campylobacterjejuni)、乳杆菌属种(Lactobacillusspp.)、淋病奈瑟氏菌(Neisseriagonorrhoeae)、嗜肺军团菌(Legionellapneumophila)、沙门氏菌属种(Salmonellaspp.)、志贺氏菌属种(Shigellaspp.)、铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)和大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)。在一些实施方案中，产生小细胞的细菌包含编码参与脂多糖合成的基因产物的基因，与相应的野生型基因相比，所述基因是遗传修饰的。在一些实施方案中，所述基因是msbB基因，该基因编码基因产物，与相应的野生型细菌中的脂质A分子相比，所述基因产物引起细菌产生改变的脂质A分子。在一些实施方案中，与相应的野生型细菌中的脂质A分子相比，对于将肉豆蔻酸(myristolicacid)添加至脂多糖分子的脂质A部分而言，所述改变的脂质A分子是有缺陷的。产生小细胞的细菌可以是革兰氏阳性细菌。革兰氏阳性细菌包括但不限于葡萄球菌属种(Staphylococcusspp.)、链球菌属种(Streptococcusspp.)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)或蜡样芽胞杆菌(Bacilluscereus)。在一些实施方案中，产生小细胞的细菌包含参与同源重组的基因，其中与相应的野生型基因相比，这一基因是遗传修饰的，其中所述产生小细胞的细菌在DNA损伤修复方面是有缺陷的。

一些其他的实施方案提供了制备小细胞的方法，包括培养本文所公开的产生小细胞的细菌和将小细胞与产生小细胞的亲代细胞基本分离，因此产生包含小细胞的组合物。在一些实施方案中，所述方法还包括由产生小细胞的亲代细胞诱导小细胞的形成。在一些实施方案中，所述方法还包括诱导编码核酸内切酶的基因的表达。在一些实施方案中，通过一种或多种选自异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)、鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、果糖、蜜二糖(melbiose)和四环素的化学化合物的存在诱导小细胞形成。在一些实施方案中，通过温度变化诱导编码核酸内切酶的基因的表达。在一些实施方案中，所述方法还包括由所述组合物纯化小细胞。在一些实施方案中，通过选自离心、超速离心、密度梯度、免疫亲和性和免疫沉淀的方法将所述小细胞与亲代细胞基本分离。

一些其他的实施方案提供了包含外膜的真细菌小细胞，其中所述外膜包含没有肉豆蔻酸部分的脂质A分子。在一些实施方案中，本文所公开的真细菌小细胞的外膜具有这样的成分：与来自相应的野生型细菌的真细菌小细胞的外膜相比，所述成分导致哺乳动物宿主中促炎症免疫反应的减少。在一些实施方案中，所述真细菌小细胞还包含一种或多种生物活性化合物。在一些实施方案中，至少一种生物活性化合物选自放射性同位素、多肽、核酸和小分子。生物活性化合物可以是小药物分子、小分子成像剂、化学治疗剂或前体药物转化酶。生物活性化合物也可以是核酸和小分子的组合，小分子成像剂和小分子药物的组合，小分子药物、小分子成像剂和核酸的组合，或核酸和多肽的组合。在一些实施方案中，本文所公开的真细菌小细胞还包含细胞表面定位的靶向部分(cell-surfacelocalizedtargetingmoiety)。在一些实施方案中，细胞表面定位的靶向部分是融合蛋白，其中所述融合蛋白是所述真细菌的外膜锚定结构域和抗体片段的融合物。在一些实施方案中，细胞表面定位的靶向部分是融合蛋白，其中所述融合蛋白是淋病奈瑟氏菌IgAP和识别哺乳动物细胞表面抗原的抗体片段的融合物。在一些实施方案中，哺乳动物细胞表面抗原选自脂肪分化相关蛋白(adipophilin)、AIM-2、BCLX(L)、BING-4、CPSF、细胞周期蛋白D1、DKKl、ENAH、Ep-CAM(上皮细胞粘附分子)、EphA3、FGF5(纤维母细胞生长因子5)、G250/MN/CAIX、HER-2/neu、IL-13Rα2、肠羧基酯酶、甲胎蛋白(alpha-foetoprotein)、M-CSF(巨噬细胞集落刺激因子)、MCSP、mdm-2、MMP-2(基质金属蛋白酶-2)、MUC-1、p53、PBF、PRAME、PSMA(前列腺特异性膜抗原)、RAGE-1、RGS5(G蛋白信号调节蛋白5)、RNF43(环指蛋白43)、RU2AS、分离蛋白1(secernin1)、SOX10、STEAPl、生存素(survivin)、端粒酶(Telomerase)、WT1(肾母细胞瘤1)、Cdc27、CDK4(细胞周期蛋白依赖性激酶4)、CDKN2a(细胞周期蛋白依赖性激酶2a)、BCR-ABL、BAGE-1、GAGE1-8、GnTV、HERV-K-MEL、KK-LC-1、KM-HN-1、LAGE-1、MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A6、MAGE-A9、MAGE-A9、粘蛋白(mucin)、NA-88、NY-ESO-1、LAGE-2、SAGE、Sp17、SSX-2、SSX-4、TRAG-3、CD-166和TRP2-INT2。

附图简要说明

图1是显示I-CeuI对E.coli培养物生长影响的图。

图2是显示I-CeuI对E.coli生存力影响的图。

图3A和3B是显示与单独的minCDE突变体或ftsZ超表达相比，同时ftsZ超表达和I-CeuI诱导导致更高的小细胞产量的柱状图。

图4A-D是显示基于ftsZ超表达和I-CeuI诱导的自杀系统使亲代细胞丝状形成增加的图。

图5是显示基于I-CeuI的自杀系统引入不可修复的双链染色体断裂的柱状图。

图6是显示基于I-CeuI的自杀系统减少纯化的小细胞中的亲代细胞污染的柱状图。

图7是显示鼠伤寒沙门氏菌(S.Typhimurium)中msbb基因的缺失改变脂多糖(LPS)谱的银染色的SDS-PAGE(十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳)凝胶。

图8是显示msbb的缺失引起J774.A1小鼠巨噬细胞样细胞产生较低水平的抗鼠伤寒沙门氏菌LPS的肿瘤坏死因子α(TNFα)的柱状图。

图9显示单链I-CeuIDNA识别序列和双链I-CeuIDNA切割位点。

发明的详细描述

定义

本文所使用的术语“细胞分裂基因”指的是编码参与细胞分裂过程的基因产物的基因。在本领域中已发现并表征了许多细胞分裂基因。所述细胞分裂基因的实例包括但不限于zipA、sulA、secA、dicA、dicB、dicC、dicF、ftsA、ftsI、ftsN、ftsK、ftsL、ftsQ、ftsW、ftsZ、minC、minD、minE、seqA、ccdB、sfiC和ddlB。

本文所使用的术语“转基因”指的是天然地或通过许多基因工程技术的任何一种从一个生物体转移到另一个生物体的基因或遗传物质。在一些实施方案中，所述转基因是含有基因序列的DNA区段，所述基因序列已被从一个生物体分离出来并被引入到不同的生物体中。这种非天然的DNA区段可以保留在转基因生物体中产生RNA或蛋白的能力，或它可以改变转基因生物体遗传密码的正常功能。在一些实施方案中，所述转基因是人工构建的DNA序列，不管它是否包含基因编码序列，将所述DNA序列引入到其中之前不存在该转基因的生物体。

如本文所使用的，如果相对于进行纯化前的组合物，在组合物中该试剂的浓度增加和/或一种或多种不期望的污染物的浓度减少，则说已纯化这一试剂。因此纯化包括富集组合物中的试剂和/或从所述组合物中分离试剂。

本文所使用的术语“结构域”或“蛋白结构域”指的是具有共同的物理和/或化学特征的分子或结构的区域。蛋白结构域的非限制性实例包括疏水的跨膜或外周膜结合区、球状的酶促区或受体区、蛋白-蛋白相互作用结构域和/或核酸结合结构域。

本文所使用的术语“真细菌”和“原核生物”如本领域技术人员所使用的那些术语一样。本文所使用的术语“真细菌”和“原核生物”包括真细菌，其包括革兰氏阴性细菌和革兰氏阳性细菌、原核病毒(例如噬菌体)和专性细胞内寄生虫(例如立克次体(Richettsia)、衣原体(Chlamydia)等)。

本文所使用的术语“核酸”指的是不同核酸分子的任何集合。核酸可以是ssDNA(单链DNA)、dsDNA(双链DNA)、ssRNA(单链RNA)、dsRNA(双链RNA)、tRNA(转运RNA)(包括稀有密码子使用的tRNA)、mRNA(信使RNA)、核糖体RNA(rRNA)、肽核酸(PNA)、DNA-RNA杂合体、反义寡核苷酸、核酶或适体。

本文所使用的术语“超表达”指的是宿主细胞中DNA所编码的多肽或蛋白的表达，其中所述多肽或蛋白不是宿主细胞中正常存在的，或其中所述多肽或蛋白在宿主细胞中的存在水平高于编码所述多肽或蛋白的内源性基因所正常表达的多肽或蛋白的水平。

本文所使用的术语“调节”指直接或间接与靶标相互作用以至于改变所述靶标活性来调节生物学过程。“调节”的模式包括但不限于增强靶标的活性、抑制靶标的活性、限制靶标的活性或扩展靶标的活性。

描述

真细菌小细胞非常适于用作靶向递送载体和成像载体。因为它们来自通常是固有致病的或至少条件致病的细菌，所以在体内系统给药特别是静脉内给药之前，从给定的群体中功能性地消除污染性亲代细胞是有利的。因此，理想的小细胞制剂将是这样的制剂，在所述制剂中，随着小细胞被处理和纯化，残余的活亲代细胞计数应尽可能低。实现这一目的的一种方法是，在物理分离步骤已完成后，引入自杀机制以杀死残余的亲代细胞。这种增强的安全特性减少了感染和败血症的风险，降低了通过与其他细菌的重组事件而导致的遗传回复突变的可能性，并且使宿主中插入事件的风险最小化。优选的是从产生小细胞的亲代细胞菌株的细菌染色体中除去抗生素抗性标记物。从产生小细胞的细菌株中除去抗生素抗性基因标记物是理想的，因为这样可以满足美国食品和药品管理局(FDA)对人类应用的监管要求。对于最终产品意图应用于人类的菌株而言，FDA只允许出于选择细菌或细菌生产株的目的而使用的卡那霉素(Kanamycin)抗性基因标记物。而且，FDA要求用于分析药物产品和最终的小细胞制剂的某些证明标准必须满足USP(美国药典)和ICH(国际协调会议)对纯度、聚集物缺乏和特定物质缺乏的指标。因此，药物产品的上游和下游加工都归入公司的化学、生产和控制(CMC)药物产品产生活动。

对更好的纯化方法的需求是研发来自致病菌的小细胞的难题。本发明的实施方案涉及可调型基因自杀机制的引入和用途，一旦暴露于适当的信号，该机制就将不可修复的双链断裂引入至产生小细胞的亲代细胞的染色体中，从而导致亲代细胞死亡。与其他的产生小细胞的菌株相比，自杀机制的激活也增加了小细胞的产量，而且同时使所有产生小细胞的亲代细胞转化为不可逆的丝状表型。因此，本文所公开的自杀机制不限于促进携带染色体的亲代细菌细胞的死亡，而是能具有其他多功能作用，即共同作用以改进小细胞产生。在一些实施方案中，本文所公开的多功能自杀机制即“MSM”系统所发挥的作用是，杀死携带染色体的亲代细胞。在一些实施方案中，本文所公开的“MSM”系统所发挥的作用是，增加小细胞的产量。在一些实施方案中，本文所公开的“MSM”系统所发挥的作用是，专门地诱导亲代细胞的不可逆的丝状表型以辅助亲代细胞与小细胞分离。在一些实施方案中，本文所公开的“MSM”系统同时发挥以下作用：(i)杀死携带染色体的亲代细胞，(ii)增加小细胞的产量，和(iii)专门地诱导亲代细胞的不可逆的丝状表型以辅助亲代细胞与小细胞分离。所述MSM系统的多功能作用能利用本文所述的技术改善小细胞的产生和纯度。

一些实施方案涉及组合物和方法，所述组合物和方法用于通过将多功能基因自杀机制即“MSM”系统引入至产生小细胞的亲代细胞系，从而减少或消除可存活的污染性产生小细胞的活真细菌亲代细胞的数量，同时优化所产生的小细胞的产量和纯度。一些实施方案还涉及MSM系统用于在合成生物学应用中的用途。

污染性的活亲代细胞在最终的小细胞制剂中的存在，尤其对于来自活致病细菌和条件致病细菌的小细胞来说，是有问题的。当由细菌产生意图在人类或其他的哺乳动物中使用的生物制剂或药物时，因为细菌可能引起疾病、严重炎症和在某些情况下导致死亡，因此与污染性亲代细菌相关的安全性和CMC问题是至关重要的。本文所述的产生细菌小细胞的组合物和方法不但改进了小细胞的产生和纯度，而且同时改善了用于体内和其他用途的小细胞制剂的安全特性。不限于下文的实施例，高纯度和安全的小细胞制剂的体内应用可以用于靶向生物成像和癌症、遗传病症和感染性疾病的治疗性预防和治疗。本发明公开内容的一些实施方案涉及可调型基因MSM机制的引入和用途，即一旦暴露于适当的信号，所述可调型基因MSM机制就会将不可修复的损伤引入至产生小细胞的亲代细胞的染色体。所述自杀机制同时有利于纯化技术，所述纯化技术旨在从意图用于多数靶向递送应用中的小细胞制剂中更好地消除可存活的亲代细胞。

本文所用的术语“可调型基因自杀机制”指的是这样一种机制，其中一个细胞或一组细胞受已知的和外部的来源刺激产生一种或多种基因产物，所述基因产物可以不可逆地损伤细胞的生物学必需组件或细胞过程，从而使得所述细胞不再有存活力，也不能从所述事件中恢复。术语“多功能自杀机制”即MSM，指的是使用可调型基因自杀机制同时诱导高水平的小细胞产生、诱导亲代细胞死亡和在诱导自杀元件期间专门在亲代细胞中诱导产生丝状表型。

本文所用的术语“靶向小细胞”或“靶向递送”指的是这样的小细胞组合物，其中所述小细胞封装一个或多个所选择的生物活性分子而且展现小细胞的外部表面上的靶向部分，不管小细胞是(i)完全完整的，(ii)原生质体(外膜和细胞壁被移除)或(iii)原生质体(外膜被移除或可通透的)，从而使得所述部分特异性结合、被结合或通过一些其他的方法特异性识别并因此在特定的细胞、器官或组织类型中递送、定位或聚集以递送所述小细胞的分子内容物至体外或体内的所述靶细胞、组织和器官类型。意图通过这种特异的靶向来使用小细胞来递送有效载荷至靶细胞或组织。

这种利用小细胞的体内递送应用包括但不限于：生物活性的(与生物学上有活性的同义)小分子药物、生物活性核酸、生物活性蛋白和生物活性脂多糖的靶向递送，用以在动物中产生“生物学效应”(与生物学反应同义)。所述生物学效应包括但不限于：杀死靶细胞(例如癌细胞)的效应、取代在特定靶向细胞类型中可能缺陷的或功能异常的基因的效应、减少在特定靶细胞中失调的蛋白或信号传导分子的表达和/或活性的效应、减少或增加来自特定细胞的激素的分泌的效应、刺激针对一种或多种抗原的适应性细胞免疫反应的效应、刺激针对一种或多种抗原的适应性体液反应的效应、同时刺激针对一种或多种抗原的适应性体液反应和细胞免疫反应的效应、刺激或抑制一种或多种固有性免疫反应的效应；积极地或消极地影响动物体内的生物学过程的效应，以及影响致病寄生虫、细菌、病毒或其他的致病微生物中的生物学过程以治疗或预防所述动物体内的疾病的效应。生物活性元件本身并不一定就具有免疫原性而诱导宿主动物中的免疫反应，但可以是因为其生物活性的结果而间接地引起免疫反应。

真细菌小细胞对于递送而言的独特优势是它们可以被改造从而靶向并将生物活性分子递送至体内的特定细胞类型。通过与特异性针对靶细胞表面分子的小细胞抗体或抗体衍生物的表面偶联实现所述靶向。可选地，靶向可以通过产生小细胞的亲代菌株的基因工程来完成，从而使得它们产生的小细胞在小细胞外膜上表达并展现与靶细胞特异性表面分子有亲和力的抗体片段或其他多肽。在这后一种情况下，可以通过制备细胞表面定位的靶向部分和例如来自淋病奈瑟氏菌的IgAP的跨膜蛋白序列间的嵌合融合蛋白，从而将所述小细胞表面上经修饰的靶向部分固定在膜上(见下文)。在它们的表面上展现所述抗体和靶向部分的小细胞被用于靶向体内的特定细胞类型以优先地将它们的生物活性有效载荷递送至靶组织、器官和细胞类型。

意图用于辅助将小细胞靶向至特定的组织、器官和细胞类型的抗体或其任何部分可以来自免疫球蛋白或免疫球蛋白亚类，或是其一部分，包括但不限于IgA、IgM、IgD、IgG或IgE。意图用于促进小细胞的靶向功能的任何亚类的抗体可以是“人源化的”，但是也可以在已知能够通过适应性免疫产生抗体反应的任何动物以内产生抗细胞特异性抗原的任何亚类的任何抗体，也能够达到相同的目标的。本质上，所产生的抗体应使得它们包含两个单独的具有针对它们各自抗原的独特特异性的臂。没有受下文所限，修饰小细胞表面的靶向部分可以来自噬菌体显示文库，或可以是来自识别靶细胞上的配体的细胞外受体片段的嵌合融合蛋白。

抗体可以被改造为独立地特异性针对不同抗原，从而使得单个的抗体同时靶向两种单独的抗原。这被称为‘双特异性’抗体或‘双特异性’靶向部分。作为非限制性实例，所述抗体可以被改造为其中一个Fab’识别给定的真细菌小细胞的推定的表面组分(例如LPSO-抗原)，并且所述双特异性抗体的另一个Fab’可以被改造为识别诸如下文所列举的那些细胞特异性表面抗原。另外，本领域技术人员容易认识到，可以通过将具有各自特异性的两个单独的抗体与蛋白A/G(ProteinA/G)相偶联而将它们非共价性连接，从而形成能够粘附于小细胞表面的双特异性抗体衍生物，其中所述复合物中的一个抗体特异性粘附于所述小细胞的表面，而另一个抗体被展现，从而特异性识别并因此在体内“靶向”特定的细胞、组织或器官类型。类似地，本领域技术人员将认识到，可以利用各种交联技术将具有单独特异性的两个单独的抗体共价连接，以达到相同的效果。

在一些实施方案中，小细胞被遗传“改造”为在其表面表达并展现重组靶向蛋白。这已经通过利用包含抗原43-α外膜蛋白锚定结构域与具有Chlam12或CTP3特异性的单链FcV(scFv)抗体片段融合的融合蛋白，成功地在肠沙门氏菌(Salmonellaenterica)中实现。相似的研究已经表明，表达并展现针对冠状病毒(Coronavirus)表位的单链FcV抗体片段与淋病奈瑟氏菌的外膜定位的IgA蛋白酶相融合的融合蛋白的E.coli细胞能够在体外中和冠状病毒和预防感染。可以利用相同类型的策略以产生并在小细胞表面展现靶向融合蛋白。其他的包括LamB、OmpF、OmpC、OmpA、OmpD、PhoE、PAL和各种鞭毛蛋白的天然的外膜蛋白已被用作革兰氏阴性肠杆菌科(Enterobacteriacea)成员中的膜锚定和展现结构域。通常，相同的方法可以用于在来自任何肠杆菌科(Enterobacteriaceae)或芽孢杆菌科(Bacillaceae)成员的小细胞表面上表达和显示抗体片段，从而使得所述小细胞成为针对存在于涉及各种临床指征的细胞、组织或器官类型表面的抗原的“特异性”靶向递送媒介。实现上述目标的主要问题是产生一个编码融合蛋白的核酸序列，所述融合蛋白含有推定的或预测的外膜蛋白或外膜定位序列和对存在于给定的细胞、组织或器官类型中的表面分子有亲和力的抗体、抗体衍生物或其他多肽序列。

小细胞作为递送媒介(靶向或非靶向的)的另一个优势是可以组合递送生物活性分子。例如，已证明了当小细胞被用作质粒DNA疫苗的递送媒介时，所述小细胞可以成功地产生抗异源性抗原的体液免疫反应。当小细胞被用于同时递送DNA疫苗和相应的蛋白时，体液反应被极大地改进，说明了小细胞对于递送选择的灵活性的益处。在相似的方法中，所述小细胞被用于封装并递送特异性针对不同mRNA转录物的不同核酸类型的组合，所述核酸类型诸如质粒DNA或各种反义干扰RNA(例如shRNA、siRNA)分子，从而使得在单次递送事件中沉默多个基因。小细胞也用于同时递送两种或多种小分子药物，从而使得在单次事件中定位多个细胞内的靶标。

本文所公开的一些实施方案描述了能够共同或单独地递送几类生物活性有效载荷的靶向真细菌小细胞，其中借助应用于常规分离技术的诱导型基因自杀机制的组合效应，所述小细胞最终制剂基本上不含任何剩余的可存活的污染性亲代细胞。

1.小细胞的产生

小细胞是非染色体的、被膜包裹的生物纳米粒子(＜400nm)，该纳米粒子在细菌细胞的正常分裂器破坏后，由细菌形成。本质上，小细胞是正常细菌细胞的小的、新陈代谢活跃的复制品，但是它们不含有染色体DNA并因此为非分裂的和无存活力的。尽管小细胞不包含染色体DNA，质粒、RNA分子、天然和/或重组表达蛋白和其他的代谢物都已显示可分离出小细胞。在2002年5月24日提交的美国专利申请第10/154,951号中详细讨论了一些产生小细胞的细菌菌株的构建方法，在此通过引用将其全文并入。

染色体复制和细胞分裂之间的协调的破坏导致从大多数杆状原核生物的极性区形成小细胞。通过一些涉及隔膜形成和二分裂的基因的超表达可以促进染色体复制和细胞分裂之间的协调的破坏。或者，小细胞可以产生于在调节隔膜形成和二分裂的基因中含有突变的菌株中。已在许多不同的原核生物中证明，受损的染色体分离机制也可以导致小细胞的形成。

类似地，通过参与初期染色体分离至子细胞的过程的基因的超表达或突变可以实现小细胞的产生。例如已证明E.coli的parC或mukB基因座的突变可产生小细胞。这两者分别影响肠杆菌科的染色体分离过程中的独立的且不可缺少的步骤。与本文所述的细胞分裂基因相似，任何对参与染色体分离过程的给定基因的野生型水平进行改造并导致小细胞产生的操作也会在其他的家族成员中具有相似的效应。

因为细胞分裂和染色体复制过程对于细胞存活十分关键，所以在原核家族成员中负责这些过程的基因在遗传上和功能上的保守性均很高。一个家族成员中可以驱动小细胞产生的细胞分裂基因的超表达或突变可以被用于在另一个家族成员中产生小细胞。例如，已证明E.coliFtsZ基因在其他肠杆菌科成员诸如沙门氏菌属种(Salmonellaspp.)和志贺氏菌属种(Shigellaspp.)以及其他类别的成员诸如假单胞菌属种(Pseudomonasspp.)中的超表达将导致相似水平的小细胞的产生。

以上事实同样可以在肠杆菌科的基于突变的产生小细胞的菌株中得到证明。例如任何肠杆菌科成员的min基因座的缺失都导致小细胞的产生。肠杆菌科的其中突变可以导致小细胞形成的细胞分裂基因包括但不限于min基因(MinCDE)。尽管可以由min突变菌株产生小细胞，但这些菌株作为产生菌株而言的商业价值有限。这是因为具有min基因中的缺失或突变的菌株使得小细胞处于组成性低水平。这就会出现商业化和规模经济方面的两个问题。第一个问题是是来自这些菌株的小细胞产率低，这就增加了产生成本。第二个问题是突变菌株的小细胞产率是高度易变的，而且批次之间的差异性对与生产质量控制和监管保证相关关的可变生产成本具有极大的影响。首先通过亲代细胞使用突变菌株制备以产生已封装生物活性分子诸如蛋白、RNA、DNA和其他的代谢物用于递送的小细胞，所以所产生的封装所述生物活性分子的小细胞是有问题的。突变菌株中小细胞的产生的启动不能控制而且发生率处于低水平，所以最终的结果是一些小细胞将不包含生物活性分子同时其他的小细胞则包含高度可变数量的生物活性分子。这些缺点一起或单独地大大地限制了使用这些突变菌株产生商业上可用的产率和/或质量的小细胞的可能性。

超表达细胞分裂基因的产生小细胞的菌株(“超表达体”)相对于基于突变的菌株而言是优选的，因为当待被超表达的细胞分裂基因被置于诱导型或其他条件活性真细菌的启动子系统的控制下时，这种产生小细胞的表型是可控的。利用基于质粒的互补研究在鉴定E.coli中的基本细胞分裂基因时，研究者发现超表达细胞分裂基因ftsZ的菌株能够产生小细胞。在这些研究中，ftsZ基因的存在量超过10拷贝/细胞。证明ftsZ的多基因拷贝的存在可产生小细胞和非常长的丝状细胞。最终，这种向不可逆的丝状表型的转变消极地影响了超表达来自多拷贝质粒的ftsZ的菌株的小细胞的产量，但是所产生的小细胞的数量仍然比任何突变菌株所产生的小细胞的数量高。目前已经证实，通过将ftsZ基因拷贝的数量减少至单个(染色体双倍)产生的小细胞的数量增加的量比ftsZ位于多拷贝质粒上的那些菌株要高，而且丝状表型的数量更少。因此，一些优选的组合物是可被诱导而产生小细胞的菌株，该菌株超表达来自ftsZ的双倍染色体整合拷贝的ftsZ基因。所使用的双倍ftsZ基因可以直接来自其中产生小细胞表型经过改造的细菌种类，也可以来自其他细菌种类的ftsZ基因序列。作为非限制性实例，大肠埃希菌的ftsZ基因的超表达可以用于产生来自大肠埃希菌和鼠伤寒沙门氏菌的小细胞。所得到的菌株含有野生型的ftsZ基因和位于染色体上的分离的双倍诱导型ftsZ基因拷贝，以及下文中更详细描述的诱导型基因自杀机制。

这种使用诱导型表型产生小细胞的方法比起突变系统来具有几个独特的优势。首先，因为在这些菌株中没有基因突变，所以正常生长期间不存在选择性压力，而且培养细胞在小细胞表型被诱导之前都保持非常稳定和正常的生理机能。最终的结果是产生型小细胞的诱导型菌株更健康且更稳定，这最终导致了如图3所示的较高的小细胞产量。另一个使用诱导型表型产生小细胞的方法的独特的优势是：如果小细胞被用于递送产生小细胞的亲代细胞自身所能够制备的诸如蛋白、RNA、DNA和其他的代谢物的生物活性分子，所产生的小细胞能够封装那些生物活性分子。在上述情况下，一种优选的方法是在诱导小细胞表型之前先诱导亲代细胞内形成生物活性分子，这样所有产生的小细胞都将包含足够数量的所需分子以便于封装递送。当这些优势被组合使用时，可获得更高质量和数量的小细胞。作为非限制性实例，可以在肠杆菌科中被超表达而产生小细胞的分裂基因包括但不限于：FtsZ、MinE、SuIA、CcdB和SfiC。优选的组合物含有双倍拷贝的细胞分裂基因，所述双倍拷贝的细胞分裂基因处于诱导型启动子的控制之下，并稳定整合至给定的真细菌菌株的染色体中。如果这种诱导型细胞分裂基因盒存在于质粒、粘粒、细菌人工染色体(BAC)、重组噬菌体或存在于细胞中的其他的游离体DNA分子上，那么也可以进行这一相同的策略。也可以使用来自其他生物体的这些基因的或基因产物的类似物。

本文所述的新颖的诱导型MSM系统更进一步地增加了诱导型小细胞菌株的小细胞产量。MSM系统的激活与其他仅靠过多产生ftsZ而促进小细胞形成的菌株相比，小细胞产量增加了10倍以上(实施例3)。将MSM系统与在MinCDE中含有突变或缺失的产生小细胞的菌株组合起来是可能的。一种优选的实施方案是使用MSM系统控制产生小细胞的诱导型表型，增加小细胞的产率，导致不可修复的细胞损伤和促进亲代细胞群中的丝状表型。一种优选的MSM基因组合含有超表达ftsZ或任何其功能性类似物的产生小细胞的诱导型菌株和归巢核酸内切酶的诱导型表达，如下文更详细描述的，所述归巢核酸内切酶优选地为来源于藻类Chlamydomonasmoewusii的I-CeuI基因。

能够产生小细胞并可由诱导型MSM系统的激活导致亲代细胞自杀/丝状表型不限于肠杆菌科，而是可以在包括革兰氏阴性或革兰氏阳性来源的任何杆状细菌中产生。例如，已详细地研究了枯草芽孢杆菌和芽孢杆菌科的其他成员的产生小细胞的菌株。与肠杆菌科的产生小细胞的菌株类似，所有芽孢杆菌科的产生小细胞的菌株都是参与细胞分裂或染色体分离过程的基因的突变或超表达的结果。因此，存在足够的证据支持这一构想：对参与任何杆状细菌科或属的细胞分裂或染色体分离过程的保守基因的操作，也可以用于在同一科或属的生物体的其他成员中制备能够产生小细胞的菌株。同样地，如下表1所证明的那样，用于产生MSM系统的基因类别可以识别并破坏许多不同杆状革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌种类的染色体。

诱导型启动子

诱导型启动子可以用于通过在生物体发育的某些阶段启动或关闭基因转录而调节基因表达。这些启动子的活性可以被生物或非生物因素的存在或不存在所诱导。

诱导型启动子包括但不限于化学调节的启动子和物理调节的启动子。化学调节的启动子的转录活性包括启动子可以受一种或多种化合物的存在或不存在调节。所述化合物包括但不限于小分子、核酸、多肽和蛋白。所述化合物的非限制性实例有异丙基-β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)、鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、果糖、蜜二糖、四环素、乙醇、类固醇、金属和其他化合物。物理调节的启动子包括其转录活性受一种或多种物理因素的存在或不存在调节的启动子，所述物理因素诸如水压力或盐压力、照明、光亮或黑暗、辐射、低温或高温、氧气和氮气。

2.小细胞与亲代细胞的分离和小细胞的纯化

因为小细胞来自通常是固有致病的或条件致病的细菌，在给药前从给定群体中功能性地除去任何污染性亲代细胞是有利的。常规地通过物理方法或者生物学方法除去活的亲代细胞。

物理方法包括使用基于离心作用的分离方法、过滤方法、色谱方法、密度梯度、免疫亲和性、免疫沉淀反应或其任何组合。上述方法尽管有效，但每一种都也有缺点，并没有一种物理分离方法可以完全适于从小细胞中除去可存活的亲代细胞。最终，对于商业生产而言，由于过滤方法或其组合的简易性、实用性、低成本和规模可控性，使过滤方法或其组合成为最优选的技术。然而，当前的过滤方案是受到限制的，因为许多污染性亲代细胞会穿过过滤器，而当尽力避免这一问题时，就会导致最终的小细胞产量的减少。最终，通过设计和使用影响亲代细胞大小和存活力的生物因素，并与常规过滤方法相结合，将能够实现除去活细胞的最佳效果。如下文所示，本文公开的MSM系统使得可以诱导性地发育出细长丝状的亲代细胞，这种细长丝状的亲代细胞在生产期间更容易与小细胞相分离。

生物性除去可以通过包括但不限于下列的手段而实现：亲代细胞的优先裂解、营养缺陷型亲代菌株的使用、抗生素处理、紫外辐射(UV辐射)处理、二氨基庚二酸(DAP)的耗尽、亲代细胞的选择性吸附和使用其他DNA损伤剂的处理。

通常通过诱导溶原性原噬菌体(lysogenicprophage)的裂解周期来介导亲代细胞的优先裂解。就产生小细胞的菌株而言，最有用的是使用有裂解能力但在再感染能力上有缺陷的原噬菌体，从而使得溶解表型激活期间小细胞不会随后被感染和裂解。或者作为非限制性实例，可以表达诸如那些被分类为holin基因家族成员的单独的基因，以实现相似水平的裂解而不需担心使用溶原性原噬菌体所固有的再感染。这两种方法都受限于下述事实：裂解事件，不管使用哪种方法实现，都会将不可接受数量的游离内毒素驱除进入到介质中。清除如此大量的游离内毒素既耗费时间，又会受批次之间的变异性的影响并且最终成本高昂。

营养缺陷型菌株的使用会导致有关回复的问题，而且因此它只能用于由共生的或非致病性细菌菌株产生小细胞的情况。因此，对于被用作除去小细胞产生中的活亲代细胞的方法而言，它们的应用是受限的。

用抗生素处理小细胞制剂会导致发展出对抗生素的抗性的问题，尤其当从致病的或条件致病的亲代菌株中制备小细胞时这一问题更为重要。当使用抗生素在给定的小细胞产生过程中除去亲代细胞时，有关监管和费用的问题也是值得重视的。

UV辐射的处理可以用于在产生小细胞的过程中除去活的亲代细胞，但是UV辐射是随机的，而且结果在批次之间是高度可变的。另外，当使用小细胞递送治疗的或预防的核酸时，这种方法不是优选的，因为UV辐射是不加区分地随机损伤核酸。例如，质粒DNA也非常容易受UV辐射的影响而造成DNA损伤，这样一来即使它被有效地递送，也仍然没有治疗或预防效果。

DAP耗尽可以用于除去活的亲代细胞，但是这种方法受限于它能够应用物种的数量。换句话说，并不是所有能够产生小细胞的亲代细胞种类都需要依赖DAP而存活，而对于不依赖DAP存活的物种使用这种方法就没有意义。DAP依赖性菌株的回复突变也是这种方法的一个问题。

对于从活的亲代细胞中纯化小细胞而言，还必须利用选择性吸附的方法。选择性吸附被定义为凭借亲代细胞对基质的亲和力而使亲代细胞被优先地吸附到基质的任何过程。作为非限制性实例，高亲和力的蛋白-蛋白相互作用可被用于这一用途。作为非限制性实例，来自革兰氏阴性种类假结核耶尔森氏菌(Yersiniapseudotuberculosis)的外膜蛋白侵袭素对嵌入到β-整合素的蛋白序列中的RGD基元具有高亲和力。可以容易地在产生小细胞的菌株中引入受诱导型启动子控制的编码侵袭素的基因。可以在侵袭素基因表达激活前从这一菌株中产生小细胞，从而使得所产生的小细胞不在它们的细胞表面表达或展现侵袭素。当从所述菌株中产生所需数量的小细胞后，就可以给予培养中的活细胞信号以产生侵袭素蛋白，从而使得所述侵袭素只被表达或展现在活细胞上。当所述侵袭素在可存活的亲代细胞的表面被表达后，亲代细胞就可以容易地被吸附至包被有β-整合素或RGD基元的基质上，所述RGD基元嵌入到合成多肽或其他的重组蛋白中。在被吸附后，就可以根据所使用的基质类型，通过许多不同的方法选择性地从可存活的亲代细胞中纯化走所述小细胞。所述基质包括但不限于用于重力过滤应用的固相色谱柱、磁珠、离子交换柱或高压液相色谱(HPLC)柱。这种方法受限于这一缺点：没有一种蛋白-蛋白相互作用能够有效地用于所有产生小细胞的亲代细胞的种类。例如，上文所述的侵袭素-整合素方法可以用于大多数的革兰氏阴性肠杆菌科成员，但不能用于产生小细胞的革兰氏阳性芽孢杆菌科成员。

以上所提及的产生小细胞的亲代菌株的丝状表型的使用，在辅助常规的、基于大小的物理分离技术诸如过滤方面表现出一个非常独特的优势，因为它优先地将污染性活细胞的大小从约1μM的长度增加至约10-15μM的长度。然而小细胞仍保持它们约400nM的典型大小。小细胞和丝状亲代细胞间增加的大小差异极大地简化了过滤方案，并使其可以作为除去可存活的亲代细胞的优选方法。通过几种方法可以在杆状真细菌中诱导丝状形成，所述几种方法中，最常见的方法包括通过以下手段给予细胞生理应激：加入高浓度的盐或通过增加或减少培养物的pH，细胞分裂基因(诸如上文所述的fts基因)的超表达和SOS反应的诱导。细菌中SOS应激反应的诱导通常通过引入重要染色体损伤来诱导，但是已证明其他的机制也可以起作用。但对细胞培养物施加生理应激以诱导丝状形成的问题是，并不是细胞群中所有的细胞都平等地响应这种应激，从而导致细胞大小差异很大，有的亲代细胞完全不受影响，有的细胞部分地丝状形成，还有的细胞彻底地丝状形成。这种群体中不平等的反应限制了这种方法在纯化过程中的可重复性。这种现象在通过外源性DNA损伤剂的添加诱导SOS反应中同样存在，因为并不是细胞群中所有的细胞都平等地响应所述损伤剂并产生细丝。

考虑到上文所列举的所有生物学方法的局限性，为改进用于体内应用的小细胞的安全特性，还是亟需研发普遍可靠且有效的方法来除去可存活的产生小细胞的亲代细胞。为此，本发明的实施方案满足了这一需求并提供方法，所述方法通过利用现有技术中未记载的可调型基因自杀机制，能够不可修复地损伤可存活的产生小细胞的亲代细胞的染色体。所述基因自杀机制的激活同时且不可逆地杀死细胞同时诱导丝状表型，该丝状表型用于辅助常规的，基于过滤技术，将可存活的污染性亲代细胞与小细胞分离。

一种优选且新颖的方法能够确保群体中所有的可存活的产生小细胞的亲代细胞都一致地变为丝状，所述方法通过基因工程的手段将处于诱导型启动子控制之下的一个基因或一组基因引入到产生小细胞的菌株的染色体上，一旦使用诱导物进行激活，所述一个或一组基因就会引起如本文所述的MSM系统所实现的丝状形成(实施例4)。可以确定的是，本文所述的基因自杀(MSM)机制的激活引起广泛而深度的丝状形成(实施例4)。因此，通过确保任何可存活的细胞(具有染色体的细胞)都将在人为控制下变成丝状，本发明的实施方案克服了其他方法所表现出的丝状形成一致性的问题。理想的是，为了确保在给予适当信号时给定群体中的所有细胞都进入自杀程序，应避免与诱导物摄取和其他影响启动子活性的生理学因素有关的自杀机制表达的问题。为避免启动子活性不足并确保群体中的每个细胞都能变成丝状，一种优选地用于激活基因自杀机制的启动子系统是温度调节的，例如CI857ts启动子系统。一些实施方案包含革兰氏阴性或革兰氏阳性细菌菌株，所述细菌菌株含有以下核酸：一种核酸包含与诱导型原核表达信号可操作地连接的针对产生小细胞的基因编码的基因(优选ftsZ)，另一种核酸包含与诱导型原核表达信号(优选CI857ts)可操作地连接的针对不裂解亲代细胞的自杀基因编码的基因(优选归巢核酸内切酶I-CeuI)。与产生小细胞的基因和自杀基因相连接的原核表达信号可以处于相同的原核表达信号或不同的原核表达信号的控制下。而且，产生小细胞的基因和自杀基因可以位于细胞中相同的或不同的核酸上，该核酸的其中一个可以是游离的核酸(例如质粒)。在一些其他的实施方案中，产生小细胞的基因和自杀基因被可操作地连接在转录融合物中(即在相同的mRNA转录物上)，而且处于共同的诱导型原核表达信号的控制之下。产生小细胞的基因和自杀基因都可位于每细胞多于一个的基因拷贝中。

在一些实施方案中，在包含小细胞的组合物中，基本将小细胞和产生小细胞的亲代细胞分离。分离后，少于约99.9％、99.5％、99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％、90％、89％、88％、87％、86％、85％、84％、83％、82％、81％、80％、79％、78％、77％、76％、75％、74％、73％、72％、71％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％或30％的包含小细胞的组合物不含有产生小细胞的亲代细胞。

3.诱导不可修复的染色体损伤的方法

已通过UV辐射的使用最佳地阐明了如下概念：给定细胞的不可修复的大量染色体损伤将导致不可逆的细胞死亡。UV辐射引起给定的DNA分子中邻近的胸腺嘧啶核苷酸间的胸腺嘧啶二聚体的形成。如果胸腺嘧啶二聚体的数量达到某一阈值，而其中又没有足够数量的蛋白参与这些加合物的DNA修复，细胞就会有效地死亡。然而，如上文所提及的，因为这种方法对于染色体中加合物形成的位点之间缺乏特异性，对所有核酸类型都不加区分地影响，以及不依赖暴露时间的差异性，所以这种方法是严重受限的。

不可修复的染色体损伤也可以通过核酸内切酶的超表达而实现。核酸内切酶可以在序列特异的切割位点处切割双链DNA。根据所使用的限制酶，切割可以产生平端或粘端的切割产物。

4.Chlamydomonasmoewusii的I-CeuI基因

Chlamydomonasmoewusii的叶绿体DNA(SEQIDNO：1)所编码的I-CeuI限制酶特别可用于在许多种产生小细胞的真细菌的亲代菌株的染色体中引入不可修复的损伤。所述的I-CeuI属于内含子编码的I型限制酶的独特家族，这一家族通常被称为归巢核酸内切酶。I-CeuI归巢限制酶23S核糖体RNA(rRNA)的rrn操纵子位点(SEQIDNO：2)的15-19碱基对保守序列内特异地切割。因为23SrRNA序列在真细菌中十分保守，所以I-CeuI可以用于在许多种产生小细胞的亲代细胞种类中引入不可修复的染色体损伤。在大多数真细菌中，23SrRNA位点位于4-10个不同位置中的任何位置(见表1)，这一系列位点均可支持不可修复的损伤。通常，常见的质粒DNA分子序列内没有23SrRNA位点，因此I-CeuI可以用于在消除亲代细胞的同时仍使得质粒能够增殖和分离到小细胞中，使其能够作为治疗的或预防的有效载荷而被递送。而且，I-CeuI归巢核酸内切酶在42-47℃时操作最有效，因此使得它专一地适合于使用温度调节启动子系统，诸如来自噬菌体λ的CI857ts启动子系统。在温度39℃以下时，所述CI857ts启动子系统是失活的，当温度变化为42-45℃时，该系统会具有极高的活性，这使得培养物中的每个产生小细胞的亲代细胞都快速、持久且一致地暴露于I-CeuI。这一启动子系统的激活很大程度上与许多抑制的生理学因素诸如诱导物摄取无关。

表1.不同的真细菌基因组内I-CeuI识别位点的列表

最初，从Chlamydomonasmoewusii中分离出I-CeuI用以消化纯化的真细菌染色体DNA分子，以用于脉冲场凝胶电泳的基因组分析。它可以商购以作研究使用，并且微生物学家多年以来已经利用它研究基因组排列、基因组重排、进行BAC克隆和进行其他的真细菌染色体DNA分析。I-CeuI及其I型家族成员都是唯一的，因为它们不受在真细菌中变化很大的不同的DNA甲基化模式的影响。因此，I-CeuI可以用于许多种不同的产生小细胞的亲代菌株。作为非限制性实例，I-CeuI已用于体外分析沙门氏菌属、志贺氏菌属、大肠埃希菌、假单胞菌属种、气单胞菌属种(Aeromonasspp.)、梭菌属种(Clostridiumspp.)、葡萄球菌属种、芽孢杆菌属种(Bacillusspp.)和奈瑟氏菌属种(Neisseriaspp.)的基因组，所有都有相同的效果。

而且，I-CeuI是被称为LAGLIDADG家族的归巢核酸内切酶的亚家族成员。这一家族的成员数量超过100个而且所有的成员都包含保守的氨基酸序列基元LAGLIDADG，这一序列基元用作同型二聚体相互作用的界面以及形成和功能的活性位点。

对于它们所识别并在其中进行它们各自的切割反应的序列而言，所述I-CeuI和其他的I型限制酶并不如更典型的II型限制性核酸内切酶那样严格。尽管在15-19碱基对序列中的一些碱基是进行切割所必需的，但其他的碱基则是非必要的。因此，可通过基因工程设计某些15-19碱基对序列的变体，从而使得它们在非关键的碱基处的序列不同但仍然是功能性切割位点。这类位点可同样地被改造并被引入到产生小细胞的亲代菌株的染色体中。这些经修饰的切割位点也可作为I-CeuI体内或体外所识别的靶标，并可用于在染色体中引入不可修复的损伤。

5.I-CeuI的功能等同物的使用

如前所述，Chlamydomonasmoewusii的I-CeuI基因是被称为LAGLIDADG家族的归巢核酸内切酶的亚类成员。因此，一些实施方案包括通过利用其他的LAGLIDADG归巢核酸内切酶家族成员的其中一个来构建并利用相似的基因自杀机制。可以替代I-CeuI的LAGLIDADG成员包括但不限于PI-SceI、I-ChuI、I-CpaI、I-SceIII、I-CreI、I-MsoI、I-SceII、I-SceIV、I-CsmI、I-DmoI、I-PorI、FI-TliI、PI-TliII和PI-ScpI。

另一个I型归巢核酸内切酶的亚家族被称为GIY-YIG家族。这一家族的成员包括但不限于噬菌体T4核酸内切酶I-TevI、Am腺苷三磷酸酶-6和SegA。

又另一个I型归巢核酸内切酶的亚家族被称为H-N-H家族，它的成员包括但不限于EcoCoE8、EcoCoE9、EcoCoE2、EcoMcr、I-HmuI、I-TevIII、CpclgpII、Cpc2gpII、AvigpII、SobgpII和ScegpII。

最后的I型归巢核酸内切酶的亚家族被称为组氨酸-半胱氨酸盒(His-Cysbox)家族，它的成员包括但不限于I-DirI、I-NaaI和I-PpoI。

任何的或所有的这4类归巢核酸内切酶和它们各自的DNA靶序列或其功能变体都可以用于构建本文所述的可调型基因自杀系统，以用于从小细胞中除去污染性可存活的亲代细胞。

6.基因自杀机制的激活与ftsZ的超表达相结合，产生高产量的产生小细胞的菌株

如图3所示，I-CeuI激活和产生小细胞表型的诱导同时共同作用，以对小细胞产生和产率具有积极影响，并使得污染性亲代细胞的存力下降和丝状形成。实施例3表明获得了高产量的产生小细胞的菌株，因为当ftsZ和I-CeuI同时超表达时，所产生的小细胞的数量增加了10倍。高产量的产生小细胞的菌株被定义为从100ml的起始培养物中产生10⁹个或更多小细胞的菌株。除了产生高产量的小细胞以外，一旦如图4所示的I-CeuI和ftsZ基因被激活，所述亲代细胞就会一致地变为丝状。所产生的丝状表型有利于更好地促进基于过滤的小细胞纯化方案。

7.同源重组和其他的DNA损伤修复途径

真细菌中的同源重组途径在功能和作用机制方面是高度保守的。本质上，同源DNA重组由以下过程介导：在双链DNA引入双链断裂，随后5′至3′核酸外切酶活动产生单链的DNA粘端以用于被称为链侵入的酶依赖性过程。链侵入期间，两个分离的双链DNA分子的同源区的碱基相互配对。新的DNA合成代替被核酸外切酶所降解的区域，结果生成是短期存在的被称为霍利迪连结体(Hollidayjunction)的4-臂异聚双链DNA结构。这种霍利迪连结体再经过一个依赖于解旋酶的被称为分支迁移的过程，在这一过程中，异聚双链DNA结构的中心可以沿着霍利迪连结体的4个臂中任一个的长度方向从它的初始位置移动至任何其他的位置。一旦稳定下来，异聚双链的霍利迪连结体就会被称为解离酶的酶所“解离”，从而产生两个单独的双链DNA分子。在一些情况下，大量的DNA被从一个DNA分子转移到另一个DNA分子，因此被称为重组。

众所周知的是，在某些情况下，双链断裂的修复受真细菌的同源重组途径所介导。如前所述，I-CeuI和其他的I型归巢核酸内切酶家族成员引入双链断裂，而且所述双链断裂通过同源重组而被修复。因此，消除细胞进行同源重组的能力也就消除了I型归巢核酸内切酶家族成员所引入的双链断裂将被修复的可能性。染色体修复对于双链断裂情况下的回复是必不可少的，因此，将同源重组途径缺失突变体或条件突变体连同所述基因自杀机制一起使用，将在减少可存活的污染性产生小细胞的亲代细胞中起很大的作用。一些实施方案使用DNA重组和损伤修复途径来阻止包含基因自杀机制的细胞修复由于所述自杀机制激活的而导致的任何染色体损伤。

在真细菌肠杆菌科中，可对参与同源重组或本文所述过程的任何步骤的基因进行突变、失活、使其条件性表达或以任何方式被修饰，以便在基因自杀机制激活后辅助除去可存活的污染性产生小细胞的亲代细胞，所述基因包括但不限于：recA、recBCD、uvrABC、lexA、recN、recQ、recR、ruv、gyrAB、helD、lig、polA、ssb、recO、mutH、mutL、mutS、topA、uvrD、xseA、srfA、recF、recJ、recE、recT、rusA、dam、dut、xth或rdgB。可以在其他的属和单独的真细菌科中破坏任何所述基因的同系物。

影响这些基因表达的突变可以单独存在或相互组合。所述基因的转录水平可以受到染色体缺失、启动子破坏、启动子置换、启动子修饰或RNA介导的启动子干扰的影响。所述基因的翻译可以受到反义mRNA、shRNA、siRNA表达或夏因-达尔加诺序列(ShineDalgarnosequence)修饰的影响。所述基因产物的功能可以受到所述基因的显性失活类型或所述基因的其他抑制基因的超表达的影响，导致功能受损。

一些实施方案提供了任何和所有参与同源重组或上文所列举的双链断裂修复途径的基因被所述基因的等位基因置换，所述基因的等位基因是已被充分表征的温度敏感突变体。在这类实施方案的示例性实例中，例如基因产物RecA在温度低于39℃时功能正常，从而允许正常的生长、生理机能和小细胞产生，但是它在温度高于39℃时就会失去功能，从而使得当产生小细胞的培养温度变化为42-45℃以激活I-CeuI基因时，细胞内存在的RecA分子就不能在足以辅助修复双链染色体损伤的水平上进行它们所必需的功能。这种方法促进了I-CeuI的有效杀死，同时通过不提供细胞修复机制，而保证了有助于除去可存活的产生小细胞的亲代细胞。

在一些实施方案中，lexA基因的野生型拷贝被切割缺陷的突变等位基因所取代。LexA蛋白是一种真细菌中SOS反应基因的球状调节蛋白，它通过并列占据SOS反应基因的启动子区域内的转录起始位点，从而充当调节子内的基因的抑制剂。因此，当LexA抑制剂结合到SOS反应基因的启动子区域时，由于LexA介导的空间位阻，转录因子不能接近启动子区域，从而使所述基因失活。如果细胞经受应激，例如当双链染色体DNA断裂被引入时，LexA就被切割。作为切割的结果，LexA不再能结合并抑制SOS反应基因的活性。切割可以通过两种机制发生。第一种机制是RecA介导的切割，该切割在存在单链DNA的条件下受RecA蛋白活性所刺激。单链DNA由RecBCD核酸外切酶复合物产生，并且紧随着双链染色体断裂的引入而产生。第二种机制被称为“自体切割”，它响应于温度或pH的变化在分子内反应中自发地发生。这两种切割机制都依赖于丝氨酸蛋白酶活性，该丝氨酸蛋白酶活性由氨基酸位置119的丝氨酸残基(S-119)和氨基酸位置156的赖氨酸残基(L-156)所介导。切割发生在氨基酸位置84的丙氨酸残基(A-84)和邻近的氨基酸位置85的甘氨酸残基(G-85)之间。这种已被充分表征的切割缺陷的lexA基因的突变等位基因被称为lexA3，而且它的对应物lexA33可以用于本发明的一些实施方案。

8.靶向小细胞

在产生小细胞、激活基因自杀机制并随后经过纯化之后，小细胞被用作靶向的递送媒介。在它们的表面上展现抗体、抗体衍生物和其他的靶向部分的小细胞被用于体内靶向特定的细胞类型，以优先地将它们的生物活性有效载荷递送至靶向的组织、器官和细胞类型。

意图用于辅助将小细胞靶向至特定的组织、器官和细胞类型的抗体或其任何部分可以来自免疫球蛋白或免疫球蛋白亚类，或是其一部分，包括但不限于IgA、IgM、IgD、IgG或IgE。意图用于促进小细胞的靶向功能的任何亚类的抗体可以是“人源化的”，但是也可以在已知能够通过适应性免疫产生抗体反应的任何动物以内产生针对细胞特异性抗原的任何亚类的任何抗体，以达到相同的目标。本质上，所生成的抗体应使得它们包含两个单独的具有针对它们各自抗原的独特特异性的臂。

抗体可以被改造为独立地特异性针对不同抗原，从而使得单个的抗体可同时靶向于两种单独的抗原。作为非限制性实例，抗体的其中一个臂可以被改造为识别给定的真细菌小细胞的推定的表面组分(例如LPSO-抗原)，而另一个臂被改造为识别细胞特异性表面抗原。在这种方法中，有用的小细胞表面分子包括但不限于天然存在的分子诸如脂多糖、外膜蛋白(OMPs)、鞭毛蛋白、菌毛蛋白和孔蛋白。或者，产生小细胞的亲代菌株可以被改造为在其表面表达并展现非天然存在的或存在于其他的生物体中的蛋白或LPS分子，从而使得所述分子被一个或多个抗体的臂所识别，该抗体用于将靶向抗体或其他的靶向部分和小细胞表面相偶联。例如，可以设计并利用被改造为表达和展现FLAG表位的蛋白，从而使得抗体的一个臂识别FLAG表位，而另一个臂识别所选择的特定细胞的选择性抗原。另外，本领域技术人员容易认识到，可以通过将具有各自特异性的两个单独的抗体和蛋白A/G相偶联，而将它们非共价性连接，从而形成可以粘附小细胞表面的双特异性抗体衍生物，所述复合物中的其中一个抗体特异性粘附于所述小细胞的表面，而另一个抗体被展现，从而特异性识别并因此在体内“靶向”特定的细胞、组织或器官类型。类似地，本领域技术人员将认识到，可以利用各种交联技术将具有单独的特异性的两个单独的抗体共价连接，以达到相同的效果。本领域技术人员可以容易地认识到所有这些潜在的靶向方法。

对于外源性加入抗体和抗体衍生物而言，可选的和优选的是，通过产生展现基于多肽的靶向部分的外膜融合蛋白，小细胞可以被“改造”为在其表面表达并展现重组靶向蛋白。这可以利用任何来自革兰氏阴性细菌的外膜蛋白来实现，但是有些外膜蛋白或其区域更适于展现。这已经通过利用包含抗原43-α外膜蛋白锚定结构域与带有Chlam12或CTP3特异性的单链FcV抗体片段融合的融合蛋白，成功地在肠沙门氏菌(Salmonellaenterica)中实现。相似的研究已经表明，表达并展现针对冠状病毒表位的单链FcV抗体片段与淋病奈瑟氏菌的外膜定位的自转运IgA蛋白酶(IgAP)相融合的融合蛋白的E.coli细胞能够在体外中和冠状病毒和预防感染。可以利用相同类型的策略以产生并在小细胞表面展现靶向融合蛋白。其他的包括LamB、OmpF、OmpC、OmpA、OmpD、PhoE、PAL和各种鞭毛蛋白的天然的外膜蛋白已被用作革兰氏阴性肠杆菌科成员中的膜锚定和展现结构域。通常，相同的方法可以用于在来自任何肠杆菌科或芽孢杆菌科成员的小细胞表面上表达和显示抗体片段，从而使得所述小细胞成为针对存在于涉及各种临床指征的细胞、组织或器官类型表面的抗原的“特异性”靶向递送媒介。本领域技术人员将认识到，实现上述目标的主要问题是产生一个编码融合蛋白的核酸序列，所述融合蛋白含有针对推定的或预测的外膜蛋白或外膜定位的序列和对存在于给定的细胞、组织或器官类型中的表面分子有亲和力的抗体、抗体衍生物或其他多肽序列。

展现本文所述的小细胞表面的抗体、抗体片段和任何其他的基于多肽的靶向部分的一个优选实施方案是通过与“自转运蛋白”家族的外膜融合。属于自转运蛋白分泌系统5型亚类(通常被分类为5a型)的单聚体自转运蛋白是最优选的。在这些被分类为5a型的自转运蛋白中，淋病奈瑟氏菌的IgA蛋白酶(IgAP)是优选的。IgAP自转运蛋白载客结构域(passengerdomain)易于被可变的抗体轻链和抗体重链所取代，该可变的抗体轻链和抗体重链被一个含有8-10个重复的脯氨酸的短连接序列所隔开。本领域普通技术人员将容易地认识到，可以从B细胞杂交瘤或任何其他常规的可变的轻链和重链序列的重组DNA或RNA来源，容易地鉴定、分离、测序和克隆来自于可变的重链(VH)和可变的轻链(VL)的序列。虽然利用E.coli中的IgAP系统已展现并表征了几种不同的抗体片段和抗体片段类型，但是就它们用于靶向组织、器官或细胞类型的用途以及在小细胞中的用途而言，这一方法是完全新颖的。因此，通过鉴定抗体。

本领域技术人员将认识到，除了展现对小细胞表面的细胞特异性表面抗原具有特异性的抗体或抗体衍生物以外，还有其他的方法也可以实现将小细胞的靶向至特定的细胞、器官或组织类型的目的。这类方法的其中一种是在小细胞的最外层表面上表达并展现靶向细胞特异性抗原的非抗体来源的多肽。这些多肽可以来源于但并不限于天然存在的序列或其有用的部分以及合成的衍生序列。

天然存在的序列包括本领域中已知的能够与细胞特异性表面抗原相互作用的序列。这些相互作用的类型的实例包括但不限于：天然存在的配体和受体相互作用，例如已被充分表征的血管内皮生长因子(VEGF)和VEGF受体的相互作用。例如，可以通过用VEGF蛋白的受体结合结构域修饰小细胞，从而使得展现于内皮或其他细胞表面的VEGF受体被靶向，因此提供用于将小细胞递送至内皮细胞的靶向部分靶向。利用抗VEGF受体的scFv片段作为靶向部分是一个可供替代的选择。在一些实施方案中，可以利用标准的分子生物学技术，对上文所列举的小细胞的相同的天然存在的表面定位的分子进行改造，以产生展现这些配体的结合部分的融合蛋白，从而使得所述小细胞可以特异性识别、定位和并将它们各自的有效载荷递送至的特定的目的细胞类型、组织和器官。

可以识别选择性结合诸如哺乳动物细胞表面抗原的细胞特异性表面抗原的合成分子，并将其引入到本发明的一些实施方案中以作为靶向部分。例如，可以容易地将噬菌体显示文库所识别的肽序列和上文所述的任何天然的小细胞外膜蛋白克隆为融合物，以用作靶向分子。同样地，利用标准的化学缀合或交联技术，合成的靶向分子可以与小细胞的表面相偶联。

癌细胞是被高度重视的可以利用小细胞而被靶向的细胞类型。许多癌症显示了细胞表面蛋白的变体或其他的免疫学上可区别的细胞表面标志物，这些被统称为肿瘤特异性抗原或有时候被称作肿瘤选择性抗原(TSA)。因此许多特异性识别TSAs的抗体和可变区的核酸序列是本领域中已知的。任何这些抗体都可以被用作发明的外源性抗体，或可选地，如上文所述作为膜结合融合蛋白表达并展现于小细胞的表面上。已鉴定了许多TSA，由于它们没有抗体，因此目前无法应用那些抗体可变区的核酸序列。然而，产生所述TSA的抗体的方法是本领域中熟知的，而且本文所公开的方法被设计为针对TSA或任何其他的细胞特异性表面抗原的任何和所有抗体都可以被结合到所述组合物中。

肿瘤选择性抗原包括但不限于：脂肪分化相关蛋白、AIM-2、BCLX(L)、BING-4、CPSF、细胞周期蛋白D1(CyclinD1)、DKK1、ENAH、Ep-CAM、EphA3、FGF5(纤维母细胞生长因子5)、G250/MN/CAIX、HER-2/neu、IL-13Rα2(白细胞介素-13受体α2)、肠羧基酯酶、α-甲胎蛋白、M-CSF(巨噬细胞集落刺激因子)、MCSP、mdm-2、MMP-2、MUC-1、p53、PBF、PRAME、PSMA(前列腺特异性膜抗原)、RAGE-1、RGS5、RNF43、RU2AS、分离蛋白1、SOX10、STEAP1、生存素、端粒酶、WT1、Cdc27、CDK4(细胞周期蛋白依赖性激酶4)、CDKN2a(细胞周期蛋白依赖性激酶N2a)、BCR-ABL、BAGE-1、GAGE1-8、GnTV、HERV-K-MEL、KK-LC-1、KM-HN-1、LAGE-1、MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A6、MAGE-A9、MAGE-A9、粘蛋白、NA-88、NY-ESO-1、LAGE-2、SAGE、Sp17、SSX-2、SSX-4、TRAG-3和TRP2-INT2。

除了靶向癌细胞和来源于所述癌细胞的肿瘤以外，本发明的实施方案也包括任何展现选择性细胞表面抗原的细胞类型。例如，理想的是使小细胞靶向至胰腺以递送糖尿病药物，或使小细胞靶向至树突状细胞或其任何亚类以递送蛋白、碳水化合物或编码用于发展疫苗或固有性免疫调节的抗原的核酸。上文描述了针对内皮细胞的基于VEGF的靶向系统。同样地，使小细胞靶向至粘膜上皮的特定细胞类型，诸如小肠的派亚氏淋巴结(Peyer′spatches)是理想的。

9.有效载荷类型

真细菌小细胞可以封装并递送几种类型的具有对动物有治疗、预防或诊断效果的生物活性化合物。可以被小细胞递送的生物活性化合物(有效载荷)的类型包括但不限于小分子、核酸、多肽、放射性同位素、脂类、脂多糖、以及它们的任何组合。

本文所使用的术语“小分子”包括任何可以积极或消极地影响生物过程的化学制剂或其他部分。小分子可以包括目前已知并使用的任何数量的治疗剂，或是出于筛选生物功能的目的，在此类分子的文库中合成的小分子。小分子通过大小与大分子相区别。本文所公开的小分子通常具有小于约5000道尔顿(Da)的分子量，优选小于约2500Da，更优选小于1000Da，最优选小于约500Da。

小分子没有限制地包括有机化合物、模拟肽和其缀合物。如本文所使用的，术语“有机化合物”指的是除了大分子核酸和多肽之外的任何基于碳的化合物。除了碳以外，有机化合物可以包含钙、氯、氟、铜、氢、铁、钾、氮、氧、硫和其他元素。有机化合物可以以芳香族或脂肪族形式存在。所述有机化合物的非限制性实例包括酮类、醇类、苯胺类、碳水化合物、单糖类、寡糖类、多糖类、氨基酸、核苷、核苷酸、脂类、类视黄素、类固醇、蛋白多糖、酮类、醛类、饱和的、不饱和的和多不饱和的脂肪、油类和蜡类、烯类、酯类、醚类、硫醇类、硫化物、环状化合物、杂环化合物、咪唑类和酚类。本文所使用的有机化合物也包括硝化的有机化合物和卤化的(例如氯化的)有机化合物。

“小分子”可以是合成的、天然存在的和从自然来源纯化的。小分子包括但不限于小分子药物和小分子成像剂。小分子药物的类型包括预防、抑制、刺激、模拟或修饰细胞、组织类型或器官内的生物学或生物化学过程从而有利于患病动物的那些药物，不管所患的疾病是躯体性的、生殖性的、感染性的还是其他方面的。所述药物的实例包括化学治疗剂(抗癌药)、抗生素、抗病毒药、抗抑郁药、抗组胺药、抗凝剂和医生用药指南(PhysiciansDeskReference)中所列举的其任何其他种类或亚类。小分子也包括被统称为荧光团的分子种类。包含荧光团并展现细胞特异性靶向部分的小细胞可以被用于动物体内细胞类型、组织、器官或肿瘤的体内成像。小分子荧光团包括但不限于二脒基苯基吲哚(DAPI)、CybrGold、CybrGreen、溴化乙锭、AlexaFlour、德克萨斯红(TexasRed)、CFSE(羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂)等等。利用展现靶向分子的小细胞，所述小分子化学治疗剂可以被靶向并递送至组织、细胞和器官。本文所使用的术语“化学治疗剂”指的是抗癌的、抗转移的、抗血管形成的和其他的抗过度增生的制剂。简言之，“化学治疗剂”指的是意图用于破坏细胞和组织的化学制剂。此类制剂包括但不限于：(1)DNA损伤剂和抑制DNA合成的制剂，诸如蒽环类药物(阿霉素(doxorubicin)、donorubicin、表阿霉素(epirubicin))、烷基化剂(苯达莫司汀(bendamustine)、白消安(busulfan)、卡铂(carboplatin)、卡莫司汀(carmustine)、顺铂(cisplatin)、瘤可宁(chlorambucil)、环磷酰胺(cyclophosphamide)、达卡巴嗪(dacarbazine)、六甲嘧胺(hexamethylmelamine)、异环磷酰胺(ifosphamide)、洛莫司汀(lomustine)、氮芥(mechlorethamine)、美法仑(melphalan)、米托坦(mitotane)、丝裂霉素(mytomycin)、哌泊溴烷(pipobroman)、甲基苄肼(procarbazine)、链脲菌素(streptozocin)、塞替派(thiotepa)和三胺嗪(triethylenemelamine))、铂衍生物(顺铂、卡铂、顺氯氨铂(cisdiamminedichloroplatinum))、端粒酶和拓扑异构酶抑制剂(伊立替康(Camptosar))，(2)微管蛋白解聚剂诸如紫杉烷类(taxoids)(紫杉醇(Paclitaxel)、多烯紫杉醇(docetaxel)、BAY59-8862)，(3)代谢拮抗剂诸如卡培他滨(capecitabine)、氯脱氧腺苷(chlorodeoxyadenosine)、阿糖胞苷(cytarabine)(和它的活化形式ara-CMP)、胞嘧啶阿糖胞苷(cytosinearabinoside)、氮烯咪胺(dacabazine)、氟脲苷(floxuridine)、氟达拉滨(fludarabine)、5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)、5-去氧氟脲苷(5-DFUR)、吉姆赛它宾(gemcitibine)、羟基脲(hydroxyurea)、6-巯基嘌呤(6-mercaptopurine)、甲氨蝶呤(methotrexate)、喷司他丁(pentostatin)、三甲曲沙(trimetrexate)和6-巯鸟嘌呤(6-thioguanine))，(4)抗血管形成剂(阿瓦斯丁(Avastin)、沙利度胺(thalidomide)、苏尼替尼(sunitinib)、雷利度胺(lenalidomide))、血管破坏剂(类黄酮/黄酮类(flavonoids/flavones)、DMXAA、康普立停(combretastatin)衍生物诸如CA4DP、ZD6126、AVE8062A等等)，(5)生物药剂诸如抗体或抗体片段(赫塞丁(Herceptin)、阿瓦斯丁(Avastin)、单抗17-1A(Panorex)、美罗华(Rituxan)、泽娃灵(Zevalin)、吉妥单抗(Mylotarg)、坎帕斯(Campath)、Bexar、爱必妥(Erbitux)、Lucentis)，和(6)内分泌治疗剂诸如芳香酶抑制剂(4-氢化雄烯二酮(4-hydroandrostendione)、依西美坦(exemestane)、氨鲁米特(aminoglutethimide)、阿那曲唑(anastrozole)、letozole)、抗雌激素类(三苯氧胺(Tamoxifen)、托米芬(Toremifine)、Raoxifene、氟维司群(Faslodex))、类固醇诸如地塞米松(dexamethasone)，(7)免疫调节剂：细胞因子诸如IFN-β和IL2、整合素抑制剂、其他的粘附蛋白和基质金属蛋白酶，(8)组蛋白脱乙酰酶抑制剂，(9)信号传导抑制剂诸如像伊马替尼(格列卫(Gleevec))的酪氨酸激酶抑制剂，(10)热激蛋白抑制剂，(11)类视黄素诸如全反式维甲酸(alltransretinoicacid)，(12)生长因子受体或生长因子自身的抑制剂，(13)抗有丝分裂化合物诸如温诺平(navelbine)、紫杉醇(Paclitaxel)、泰素帝(taxotere)、长春花碱(vinblastine)、长春新碱(vincristine)和长春瑞宾(vinorelbine)，(14)抗炎药诸如环氧合酶(COX)抑制剂，和(15)细胞周期调节剂诸如检查点(checkpoint)调节剂和端粒酶抑制剂。

核酸包括DNA和RNA以及它们的结构等同物，诸如利用与天然存在的磷酸双酯骨架相反的磷酸双酯骨架的RNA分子或DNA分子。DNA分子包括游离的DNA(不位于宿主细胞染色体上或不是宿主细胞染色体的一部分的DNA)，也包括质粒DNA、粘粒DNA、噬菌体DNA和细菌人工染色体(BACs)。如分子生物学的基本原理所述，DNA分子编码蛋白。因此DNA可以编码任何来源的、天然存在的或合成的蛋白。同样地，DNA可以被改造为包含可被宿主细胞机制识别的“启动子序列”以激活所述编码蛋白的表达。启动子序列可以是细胞特异性的、组织特异性的或诱导物特异性的。诱导物是外源性应用的信号，该信号辅助激活所述启动子以产生所述蛋白。诱导物本质上为化学诱导物或物理诱导物。许多启动子系统是本领域技术人员所知的，其中的功能性序列也是已知的。优选的原核表达序列包括但不限于：pRHA系统、pBAD系统、T7聚合酶系统、pLac系统及其各种衍生物、pTet系统和CI857ts系统。优选的真核启动子系统包括但不限于：CMV启动子、SV40启动子系统和BGH启动子系统。RNA包括但不限于信使RNA(mRNA)、转运RNA(tRNA)和小核RNA。许多RNA被分类为反义RNA，包括但不限于小干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA(shRNA)和全长反义RNA。微小RNA也包括在内。

蛋白由多肽组成并且由DNA对其编码。蛋白可以是有生物学功能的，诸如酶或信号蛋白。蛋白可以是结构性的，例如肌动蛋白等。蛋白可以作为免疫原或用于其他的治疗目的(诸如提供或恢复靶细胞、组织、器官或动物中的酶)。蛋白可以辅助其他有效载荷类型的内吞后的细胞内转运。例如，诸如来自于单核细胞增生性李斯特菌(Listeriamonocytogenes)的李斯特菌素O的蛋白可以用于促进小细胞的有效载荷从靶细胞的内吞区室向靶细胞的细胞溶质转运。蛋白也可以是前体药物转化酶。

任何和所有的这些有效载荷类型都可以凭使用者的判断而被组合使用或单独使用。本领域技术人员能够理解并认识到出于哪种目的将使用哪种组合。

10.减少LPS的毒性

脂多糖(LPS)是小细胞外膜的基本组分，通常被称为内毒素，有利的是解决关于LPS的免疫原性和热原效应的安全问题，以改进基于小细胞的靶向递送组合物的商业生活力。有利的是，除了解决上述安全问题之外，还要解决关于基于小细胞的靶向递送组合物与可存活的产生小细胞的亲代细胞一起用于体内用途时可能被污染的安全问题。LPS分子基本上由三部分组成。第一部分是一对将分子锚定在外膜的外层的烃链，所述烃链被统称为分子的“脂质A”部分。第二部分是一系列通常被称为“内核”的糖残基。所述内核在属与属之间不同，但是在属内成员之间是相同的。例如，沙门氏菌属和志贺氏菌属具有不同的内核结构，因为它们不是同一属的成员；然而伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphi)和鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)具有相同的内核结构，因为它们都是沙门氏菌属的成员。LPS分子的第三组分，通常被称为“O抗原”，是一系列糖分子，在各细菌间甚至同一属的成员之间，O抗原的链长度、分支结构、序列和组成都差别很大。许多参与脂多糖合成的基因已被识别和测序。例如，rfa基因簇包含许多用于LPS核合成的基因，包括至少17个基因。

虽然LPS分子整体上而言致热原性很高，但是对上文所述的三种组分而言，主要的致热原性的贡献者是脂质A组分。脂质A组分已被证明可结合并激活Toll样受体，所述Toll样受体是存在于哺乳动物细胞表面的信号分子家族，它们可以辅助识别特异性病原相关分子模式(PAMP′s)，其中LPS是一个经典的成员。脂质A的强致热原效应受脂质A分子的特定部分所介导，该特定部位包含连接于其中一条烃链的一个肉豆蔻酸基团。在革兰氏阴性细菌中，通过单个的、非必需、通常被称为msbB的基因添加这一肉豆蔻酸基团。通过消除msbB基因，就消除了肉豆蔻酸组分，而LPS分子的致热原性也急剧地降低。这一方法已被用于在减毒的、可存活的、发生在肿瘤中拓殖缺氧区的沙门氏菌血清型(Salmonellaserovars)中减少LPS的毒性，从而作为人类临床试验中所使用的实验性癌症治疗。当相同的msbB基因或它的功能等同物被从亲代的产生小细胞的菌株中删除时，导致引入至小细胞中的LPS的毒性减少。毒性减少的LPS已被证明将导致哺乳动物宿主中的促炎性免疫反应的减少。

如图7和8中所示，产生小细胞的沙门氏菌株中的msbB的成功删除产生毒性减少的小细胞，所述毒性通过下述方式测量：将培养的鼠巨噬细胞分别暴露于含msbB突变菌株所产生的小细胞和野生型菌株所产生的小细胞，并比较所产生的TNF-α。

11.游离的内毒素的消除

在大多数体内应用中，理想的是从组合物中消除任何游离的内毒素，所述内毒素主要是游离的LPS的形式。总的来说，通过过滤技术和所用的方法可以促进内毒素的消除。例如，封端过滤步骤能够捕获小细胞并允许小分子诸如LPS穿过膜滤器，因此有效地消除大多数的游离内毒素。理想的是达到用于体内应用的内毒素水平，所述体内应用内毒素水平等于或低于美国食品和药品管理局(www.fda.gov)批准的水平。其他常规且公认的、可以代替或连同基于过滤的内毒素消除所使用的方法为各种色谱方法、免疫色谱方法和免疫沉淀方法。在基于免疫的方法的情况下，典型的方法是使用特异性识别并结合LPS分子的脂质A部分的抗体或其他部分。靶向这一LPS分子区段的优点有两个。第一个优点是当将LPS从小细胞的外膜离析时，只有脂质A是暴露的，并因此产生在同时存在游离的内毒素与完整小细胞的条件下优先消除游离的内毒素的选择性偏好。第二点，许多抗脂质A抗体是市售可得的。将抗体与固体或半固体的基质诸如柱或磁珠的偶联具有进一步的优势，因为游离的内毒素可以被容易地和选择性地被基质吸附或吸附至基质，从而更好地促进内毒素从小细胞组合物中的消除。可以通过使小细胞沉淀，并利用定量的鲎变形细胞裂解物(LAL)试验分析上清液中的内毒素水平，确定最终制剂中的内毒素水平。

12.药物组合物

本发明的另一方面涉及组合物，包括但不限于药物组合物。本文所使用的术语“组合物”指的是包含至少一种载体，优选生理学上可接受的载体和一种或多种小细胞组合物的混合物。本文所使用的术语“载体”指的是不抑制或阻止生物活性肽引入至细胞或组织的化学化合物。载体通常为惰性物质，该惰性物质允许活性成分或被配制或复合为合适的剂型(例如丸剂、胶囊、凝胶、薄膜、片剂、微粒(例如微球)、溶液、膏剂、糊剂、气溶胶、滴剂、胶体或乳剂等等)。“生理学上可接受的载体”是适合于生理状态下使用的载体，该载体不抵消(减少、抑制或阻止)化合物的生物学活性和特性。例如，二甲亚砜(DMSO)是一种载体，因为它促进许多有机化合物被生物体细胞或组织的摄取。优选地，载体是生理学上可接受的载体，优选药学上或兽医学上可接受的载体，小细胞组合物分布在所述载体中。

“药物组合物”指的是其中载体是药学上可接受的载体的组合物，同时“兽医组合物”为其中载体是兽医学上可接受的载体的组合物。本文所使用的术语“药学上可接受的载体”或“兽医学上可接受的载体”包括任何生物学上或其他方面所需要的介质或材料，即所述载体可连同小细胞组合物一起被给予生物体，而不会引起任何不期望的生物学效应或以有害的方式与复合物或其任何组分或生物体相互作用。药学上可接受的试剂的实例由美国药典(TheUnitedStatesPharmacopeia，TheNationalFormulary，UnitedStatesPharmacopeialConvention，Inc.，Rockville，Md.1990)提供，在此通过引用并入本申请。术语“治疗有效量”或“药学有效量”意指足以诱导或引起生物体的靶细胞、组织或躯体中可测量的反应的数量。治疗有效量的具体数值将取决于多种因素，这些因素由有经验的从业人员进行考虑，以达到所需的给药方案。

组合物还可以包含其他的化学组分，诸如稀释剂和赋形剂。“稀释剂”是稀释在优选水溶剂的溶剂中的化学化合物，该化合物促进组合物在溶剂中的溶解，而且它也可以用于稳定组合物或其一种或多种组分的生物活性形式。在本领域中，使用溶解于缓冲溶液中的盐类作为稀释剂。例如，优选的稀释剂是包含一种或多种不同的盐的缓冲溶液。优选的缓冲溶液是磷酸盐缓冲溶液(尤其连同意图用于药物给药的组合物)，因为它能够模拟人血液的盐类条件。因为缓冲盐可以在较低浓度时控制溶液的pH，所以缓冲稀释液很少改变生物活性肽的生物活性。

“赋形剂”是任何或多或少的惰性物质，该物质可以被添加至组合物以赋予合适的特性例如合适的坚硬度或形成药物。合适的赋形剂和载体尤其包括诸如糖类的填充剂，所述糖类包括乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨醇纤维素制剂诸如，例如玉米淀粉、小麦淀粉、大米淀粉、琼脂、果胶、黄原胶、瓜尔胶、刺槐豆胶、透明质酸、马铃薯淀粉酪蛋白、明胶、龙须胶、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、聚丙烯酸酯、羧甲基纤维素钠和/或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。如果需要，其中也可以包括崩解剂，诸如交联的聚乙烯吡咯烷酮、琼脂、或海藻酸或其盐诸如海藻酸钠。其他合适的赋形剂和载体包括水凝胶、可胶凝的水胶体和壳聚糖。壳聚糖微球和微胶囊也可以被用作载体。见WO98/52547(其描述了用于靶向化合物至胃部的微球制剂，所述包含内核的制剂(可选择地包括胶化的水胶体)包含一种或多种活性成分，由不溶于水的聚合物(例如乙基纤维素)组成的膜以控制活性成分的释放速率和由生物粘附的阳离子聚合物组成的外层，所述阳离子聚合物例如阳离子多糖、阳离子蛋白和/或合成的阳离子聚合物)；美国专利4,895,724号。通常，利用合适的试剂，例如，戊二醛、乙二醛、表氯醇和丁二醛使壳聚糖交联。应用壳聚糖作为载体的组合物可以被配制成各种剂型，包括丸剂、片剂、微粒和微球，也包括能够使活性成分受控释放的那些剂型。其他合适的生物粘附的阳离子聚合物包括酸性明胶、聚半乳糖胺、聚氨基酸诸如聚赖氨酸、聚组氨酸、聚鸟氨酸、聚季铵化合物、醇溶谷蛋白、聚亚胺、二乙基氨基乙基葡聚糖(DEAE)、DEAE-亚胺、DEAE-甲基丙烯酸酯、DEAE-丙烯酰胺、DEAE-葡聚糖、DEAE-纤维素、聚对氨基苯乙烯、聚环氧丙烷、共聚甲基丙烯酸酯、聚酰胺胺、阳离子淀粉、聚乙烯吡啶和聚硫基二乙氨基甲基乙烯。

可以以任何合适的方式配制所述组合物。小细胞组合物可一致地(均匀地)或非一致地(不均匀地)分散在所述载体中。合适的制剂包括干制剂和液体制剂。干性制剂包括冷冻干燥的和冻干的粉剂，所述粉剂尤其适用于经气溶胶递送至鼻窦或肺，或适用于长期储存，并在给药之前在合适的稀释剂中重溶。其他优选的干制剂包括这样的制剂：其中本文所公开的组合物被压缩成适用于口服的片剂或丸剂形式或被混合成持续释放的制剂。当所述组合物意图被用于经口服给药而被递送至肠内上皮时，优选的是将所述制剂用肠溶衣封装，以保护所述制剂并阻止包括在其中的小细胞组合物的过早释放。如本领域技术人员应理解的，本发明的组合物可以被置于任何合适的剂型中。丸剂和片剂是这类剂型的代表。，例如通过压缩、浸渍、盘包衣、喷雾干燥等等手段可以将组合物封装到任何合适的胶囊或其他包衣材料中。合适的胶囊包括由明胶和淀粉制成的胶囊。同样，如果需要的话，此类胶囊可以涂有一种或多种附加的材料，例如肠溶衣。液体制剂包括水制剂、凝胶剂和乳剂。

一些优选的实施方案涉及包含生物粘附包衣(优选粘膜粘附包衣)的组合物。“生物粘附包衣”是使物质(例如小细胞组合物)能够粘附到生物表面或使物质比没有包衣存在时更好的包衣。“粘膜粘附包衣”是优选的生物粘附包衣，该包衣使得物质例如组合物比不存在所述包衣时能够更好地粘附到粘膜上。例如，微粉化颗粒(例如具有的平均直径约为5、10、25、50或100μm的颗粒)可以被涂布粘膜粘附剂。然后被包衣的颗粒可以被组装到适用于递送至生物体的剂型中。优选地，根据将被靶向的细胞表面运输部分所表达的位置，将所述剂型涂布上另一包衣以在它到达期望位置前保护所述制剂，在期望位置处粘膜粘附剂能够使所述制剂停留，与此同时，所述组合物与靶细胞表面运输部分相互作用。

本文所公开的组合物可以被给予至任何生物体，优选动物，优选哺乳类、鸟类、鱼类、昆虫类或蜘蛛类动物。优选的哺乳动物包括牛、犬、马、猫、绵羊和猪和非人灵长类动物。人类是特别优选的。在本领域中已有多种用于给予和递送化合物的技术，包括但不限于口服、直肠(例如灌肠剂或栓剂)、气溶胶(例如用于鼻或肺递送)、胃肠外和局部给药。优选地，递送足够数量的生物活性肽以达到预期的效果。待被递送的组合物的具体数量将取决于许多因素，包括将要达到的效果、递送组合物所至的生物体类型、递送途径、给药方案和生物体的年龄、健康状况和性别。同样地，给定的制剂中所含组合物的具体剂量可由普通技术人员判断决定。

本领域技术人员应理解的是，当本发明的组合物作为制剂给药以达到特别期望的可能包括治疗或预防效果(包括预防接种)的生物学结果时，可以将融合蛋白和合适的药物载体相组合。药物载体和作为治疗或预防剂的融合蛋白制剂的选择将取决于预期用途和给药模式。合适的制剂和治疗剂的给药方法包括针对口部的、肺的、鼻的、颊的、眼的、皮肤的、直肠的或阴道的递送的那些方式。

根据所用的递送模式，与上下文相关的功能实体可以以各种药学上可接受的形式被递送。例如，与上下文相关的功能实体可以以固体、溶液、乳剂、分散剂、胶束、脂质体等形式被递送，被引入到丸剂、胶囊、片剂、栓剂、气溶胶、微滴或喷雾剂中。丸剂、片剂、栓剂、粉剂、微滴和喷雾剂可具有复合的、多层结构并具有大范围的尺寸大小。气溶胶、粉剂、微滴和喷雾的大小范围从小尺寸(1微米)至大尺寸(200微米)。

本文所公开的药物组合物可以以固体、冻干粉剂、溶液、乳剂、分散剂、胶束、脂质体等形式使用，其中所得的组合物包含作为活性成分的一种或多种本发明的化合物，并与适用于肠内或胃肠外应用的有机的和无机的载体相混合。例如，活性成分可与常用的无毒的药学上可接受的载体复合成片剂、小球、胶囊、栓剂、溶液、乳剂、悬浮液和任何适于使用的其他形式。可以使用的载体包括葡萄糖、乳糖、甘露糖、阿拉伯胶、明胶、甘露醇、淀粉糊、三硅酸镁、滑石、玉米淀粉、角蛋白、硅胶、土豆淀粉、尿素、中等链长度的甘油三酯、葡聚糖和其他适用于制备制剂的载体，载体的形式可为固体的、半固体的或液体。另外，可以使用辅助剂、稳定剂、增稠剂、着色剂和香料。干稳定剂的实例包括丙酮糖，优选为0.1％或更大的浓度(见，例如美国专利5,314,695号)。所述药物组合物中含有的活性化合物的量为足以产生期望的对疾病过程或状态的效果的量。

13.其他基于细胞的生物试剂的产生

尽管目前为止本公开内容已经提供了对于小细胞/可存活的亲代细胞的比率而言更好地纯化小细胞的方法，但是它显然并不是仅限于这一应用。另外，本公开内容可以作为一种消除可存活的产生细胞的方法用于生产其他的基于细胞的生物试剂。作为非限制性实例，本公开内容可以用于酶和其他蛋白、核酸、细菌膜影、脂质、生物膜、糖类和小分子的产生和制备。

为此，本公开内容满足了这一需求，因为它通过利用早先未曾被描述的可调型基因自杀机制，提供了一种能够不可修复地损伤可存活的亲代细胞的染色体的方法。

14.MSM系统在合成生物学中的用途

本发明的另一方面涉及MSM系统在合成生物学领域中的用途。如本文所使用的，“合成生物学”包括有复制能力的核酸、“合成基因组”或“合成染色体”的构建和使用，其中所述核酸包含维持在确定成分培养基中生长所必需的最小限度的基因组合。合成基因组可包括一个或多个基因，所述基因是构成最小限度的基因组合所必需的，所述最小限度的基因组合中的任何或所有基因都可能存在或不存在于自然界中。利用转座子介导的消减式方法可以产生合成基因组，其中所述起始基因组具有其非必需的基因，所述非必需的基因通过转座子介导的破坏和同源重组被消除或取代。同源重组可以自然地发生，或可以通过各种重组系统被促进，所述重组系统包括但不限于Red重组酶系统、loxP系统、cre重组酶系统等等。或者，合成基因组可以利用添加式方法来产生，其中所述合成基因组被人为地设计并从头开始构建。利用从头开始的添加式方法所构建的合成基因组可以但不必需首先使用计算机芯片(insilico)进行构建。理想的是所述合成基因组还包含能产生经过设计的和所期望的表型的基因或基因组合。例如，通过引入包含能够在替代微生物中有所述代谢的基因或基因组合的合成基因组，可以产生一种新的能够代谢烃类而产生生物燃料诸如氢、乙醇或生物柴油的生物体并使其商业化。其他的实例包括但不限于生产下列微生物：能够直接从大气中固定二氧化碳的微生物，工业化产生其相关的副产品或前体(例如用于硫酸产生的亚硫酸盐)的微生物，或能够添加有益的分子或从环境中消除有毒的分子的微生物。

构建完成之后，就可以利用标准的转化技术将合成基因组引入到来自微生物的细胞中，所述微生物包括但不限于细菌，其中所述合成基因组取代替代微生物的原始基因组。确保合成基因组已取代原始基因组的一种方法是通过选择性基因标记的整合并筛选稳定的转化子，所述基因标记包括但不限于抗体抗性基因。本领域技术人员已知的其他的选择方法也是显而易见的，并应用作为备选的筛选策略。筛选策略可以单独应用或组合应用。筛选的顺序完全由使用者酌情决定并可以以任何顺序、温度和生长条件实施。

为确保来自替代微生物的原始基因组的消除，优选的是在合成基因组转化期间将所述替代微生物的染色体被破坏或使其在一些点上不可修复地被损伤。优选地，染色体不可修复的损伤是诱导型的，而且发生在合成基因组引入到替代微生物中之前。本文所述的MSM系统促进所述细菌染色体的诱导型的和不可修复的破坏，而且所述MSM易于被用作在合成基因组引入之前破坏替代细胞的原始染色体的机制。MSM系统的模式化性质是有利的，因为它使得这一系统可被应用在许多的细菌菌株中，所述细菌菌株包括但不限于表1中所列举的菌株。

15.细菌小细胞在合成生物学中的用途

本发明的另一方面涉及使用细菌小细胞作为替代细胞用于合成生物学应用，所述细菌小细胞与带有已被MSM系统不可修复地损伤的染色体的细菌相反。小细胞是直接来自于亲代细菌细胞的无核细胞。因为细菌细胞同真核细胞相比的区别之一是没有区室化，所以合成基因组的复制所必需的所有DNA合成和复制机制也都存在于小细胞内。这一优势是小细胞(根据其定义)已经“失去了”亲代染色体。利用本领域普通技术人员所容易认识到的标准的转化和筛选方法，用合成的基因组和其他的核酸类型像转化完整细胞的细菌一样地转化小细胞。转化子的筛选可以如上文所述地进行。

在诱导小细胞形成之前，先使产生小细胞的亲代细胞的DNA合成和复制细胞机制蛋白超表达，从而确保在转化后提供给小细胞通过分离得到的充裕的所述组分，使得小细胞能够容易地合成合成基因组。因此，所述小细胞在转化之前富含DNA合成和复制机制。例如，在E.coli中，参与染色体复制的基因包括但不限于dnaA、dnaB、dnaC、ssb、dnaG、polA、dnaE、dnaQ、hole、dnaX、dnaN、dnaX、holA、holB、holC、holD、lig、gyrA和gyrB。这些基因和它们的功能等同物都可以在诱导小细胞表型之前被产生小细胞的亲代细胞超表达，从而使得它们被封装在小细胞中。复制和合成基因可以以任何组合被超表达，并且可以存在于亲代细胞系的染色体或诸如质粒、粘粒、BAC等的游离核酸元件上。

同样地，可以超表达参与染色体分割、分离和细胞分裂本身的基因，并将其包装到小细胞中，从而使得所述小细胞能够进行染色体分割、分离和细胞分裂，以满足完成合成生物体构建的最终要求。

合成基因组的合成需要三磷酸腺苷(ATP)分子形式的能量和游离的核苷酸(例如腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶和尿嘧啶，或任何它们的核苷和核苷衍生物)。这些分子被动地扩散穿过细菌小细胞的脂质双分子层并被被添加以补充被转化的小细胞，直至合成基因组能够被稳定且独立地复制。新引入的多肽的产生需要游离的氨基酸整合到新生的多肽链上。游离的氨基酸被添加至最新转化的小细胞中，以便将足够的游离的氨基酸补充到所述小细胞，从而支持来自合成基因组的新蛋白的合成。一旦合成基因组通过新转化的小细胞已合成足够水平的新陈代谢的蛋白，那么就可以除去所述氨基酸，因为所述小细胞现在已经能够产生它们自己的氨基酸来源而用于蛋白合成。

利用本文所述的方法，来自任何原核来源的小细胞都可被用于合成生物体的构建。

16.小细胞制剂

一些实施方案提供了一种减少可存活的产生小细胞的真细菌亲代细胞数量的方法，以减少给予的感染性颗粒的数量，从而改进意图用于体内递送应用的小细胞制剂的安全性。一些实施方案包含一种革兰氏阴性或革兰氏阳性细菌菌株，所述细菌菌株包含与诱导型原核表达信号可操作地连接的针对产生小细胞的基因(例如ftsZ)编码的核酸，以及包含与诱导型原核表达信号(例如CI857ts)可操作地连接的针对不裂解亲代细胞的自杀基因编码的基因(例如归巢核酸内切酶I-CeuI)的第二核酸。与所述产生小细胞的基因和自杀基因连接的原核表达信号可以处于相同原核表达信号或不同原核表达信号的控制之下。而且，所述产生小细胞的基因和自杀基因可以位于细胞内相同或不同的核酸上，所述核酸的其中一个可以是游离的核酸(例如质粒)。而且，所述产生小细胞的基因和自杀基因还可以被可操作地连接在转录融合物中(即在相同的mRNA转录物中)并处于共同的诱导型原核表达信号的控制之下。所述产生小细胞的基因和自杀基因都可以位于每细胞多于一个的基因拷贝中。包含MSM系统的真细菌菌株具有以下的能力：(i)产生高产量的小细胞(大于10⁹/100ml生长于正常摇瓶中的培养物，图3)，(ii)引入不可修复的不裂解细胞的细胞损伤(图1-2，5-6)，和(iii)进入不可逆的丝状表型(图4)。

意图用于体内递送应用的小细胞产生自真细菌菌株，所述真细菌菌株包含所述可调型MSM基因自杀机制。在产生每一所述应用所需要的期望量的小细胞之后，就可通过暴露于已知的刺激(优选温度的变化)而激活所述基因自杀机制(MSM)，并给予足够的时间以使所述细胞的染色体发生不可修复的损伤，由此使得所述细胞无法存活。

本发明的一些实施方案涉及利用MSM系统从产生小细胞的真细菌菌株中诱导产生小细胞的表型，所述真细菌菌株优选但不限于肠杆菌科菌株，所述菌株中包含编码治疗基因或有害基因或基因产物的DNA分子，从而使得所产生的小细胞通过封装而包含所述DNA分子。在从给定的培养物和培养条件下产生所需量的小细胞之后，通过将所述培养物或细胞暴露于已知的信号而刺激基因自杀机制的激活。所述信号将应用于纯化过程的每个步骤中，以确保在最大程度地杀死最终制剂中的可存活细胞。

本发明的一些实施方案涉及从产生小细胞的优化真细菌菌株中诱导产生小细胞的表型，所述真细菌菌株包括但不限于肠杆菌科菌株，所述菌株中包含包括但不限于siRNA、反义RNA、核酶、shRNA和miRNA的任何亚类的RNA，从而使得所产生的小细胞通过封装而包含浓缩量的所述RNA分子。从给定的培养物和培养条件下产生所需量的小细胞之后，通过将所述培养物或细胞暴露于已知的信号而刺激基因自杀机制(MSM)的激活。所述信号将应用于纯化过程的每个步骤中，以确保在最大程度地杀死最终制剂中的可存活细胞。

本发明的一些实施方案涉及从产生小细胞的优化真细菌菌株中诱导产生小细胞的表型，所述真细菌菌株包括但不限于肠杆菌科菌株，所述菌株中包含蛋白分子，从而使得所产生的小细胞通过封装而包含所述蛋白分子。从给定的培养物和培养条件下产生所需量的小细胞之后，通过将所述培养物或细胞暴露于已知的信号而刺激基因自杀机制的激活。所述信号将应用于纯化过程的每个步骤中，以确保在最大程度地杀死最终制剂中的可存活细胞。

本发明的一些实施方案涉及从产生小细胞的优化真细菌菌株中诱导产生小细胞的表型，所述真细菌菌株包括但不限于肠杆菌科菌株，所述菌株中包含预定的和经过设计的以编码治疗基因或有害基因或基因产物DNA分子，任何亚类的RNA和/或蛋白的组合，从而使得所产生的小细胞通过封装而包含所述分子的组合。从给定的培养物和培养条件下产生所需量的小细胞之后，通过将所述培养物或细胞暴露于已知的信号而刺激基因自杀机制的激活。所述信号将应用于纯化过程的每个步骤中，以确保在最大程度地杀死最终制剂中的可存活细胞。

本发明的一些实施方案涉及从产生小细胞的优化真细菌菌株中诱导产生小细胞的表型，所述真细菌菌株包括但不限于肠杆菌科菌株，从而使得在纯化之后所述小细胞能够“装载”有小分子，所述小分子包括但不限于药物、前体药物或激素。从给定的培养物和培养条件下产生所需量的“空”小细胞之后，通过将所述培养物或细胞暴露于已知的信号而刺激基因自杀机制的激活。所述信号将应用于纯化过程的每个步骤中，以确保在最大程度地杀死最终制剂中的可存活细胞。在纯化之后，通过在4-65℃温度下和高浓度的所述小分子的条件下孵育，所述小细胞将能够“装载”所述小分子。

本发明的一些实施方案涉及从产生小细胞的优化真细菌菌株中诱导产生小细胞的表型，所述真细菌菌株优选但不限于芽孢杆菌科菌株，所述菌株中包含编码治疗基因或有害基因或基因产物的DNA分子，从而使得所产生的小细胞通过封装而包含所述DNA分子。在从给定的培养物和培养条件下产生所需量的小细胞之后，通过将所述培养物或细胞暴露于已知的信号而刺激基因自杀机制的激活。所述信号将应用于纯化过程的每个步骤中，以确保在最大程度地杀死最终制剂中的可存活细胞。

本发明的一些实施方案涉及从产生小细胞的优化真细菌菌株中诱导产生小细胞的表型，所述真细菌菌株包括但不限于芽孢杆菌科菌株，所述菌株中包含包括但不限于siRNA、反义RNA、核酶、shRNA和miRNA的任何亚类的RNA，从而使得所产生的小细胞通过封装而包含浓缩量的所述RNA分子。从给定的培养物和培养条件下产生所需量的小细胞之后，通过将所述培养物或细胞暴露于已知的信号而刺激基因自杀机制(MSM)的激活。所述信号将应用于纯化过程的每个步骤中，以确保在最大程度地杀死最终制剂中的可存活细胞。

本发明的一些实施方案涉及从产生小细胞的优化真细菌菌株中诱导产生小细胞的表型，所述真细菌菌株包括但不限于芽孢杆菌科菌株，所述菌株中包含蛋白分子，从而使得所产生的小细胞通过封装而包含所述蛋白分子。从给定的培养物和培养条件下产生所需量的小细胞之后，通过将所述培养物或细胞暴露于已知的信号而刺激基因自杀机制的激活。所述信号将应用于纯化过程的每个步骤中，以确保在最大程度地杀死最终制剂中的可存活细胞。

本发明的一些实施方案涉及从产生小细胞的优化真细菌菌株中诱导产生小细胞的表型，所述真细菌菌株包括但不限于芽孢杆菌科菌株，所述菌株中包含预定的和经过设计的以编码治疗基因或有害基因或基因产物DNA分子，任何亚类的RNA和/或蛋白的组合，从而使得所产生的小细胞通过封装而包含所述分子的组合。从给定的培养物和培养条件下产生所需量的小细胞之后，通过将所述培养物或细胞暴露于已知的信号而刺激基因自杀机制的激活。所述信号将应用于纯化过程的每个步骤中，以确保在最大程度地杀死最终制剂中的可存活细胞。

本发明的一些实施方案涉及从产生小细胞的优化真细菌菌株中诱导产生小细胞的表型，所述真细菌菌株包括但不限于芽孢杆菌科菌株，从而使得在纯化之后所述小细胞能够“装载”有小分子，所述小分子包括但不限于药物、前体药物或激素。从给定的培养物和培养条件下产生所需量的“空”小细胞之后，通过将所述培养物或细胞暴露于已知的信号而刺激基因自杀机制的激活。所述信号将应用于纯化过程的每个步骤中，以确保在最大程度地杀死最终制剂中的可存活细胞。在纯化之后，通过高浓度的所述小分子的条件下孵育，所述小细胞将能够“装载”所述小分子。

在一实施方案中，产生小细胞的亲代细胞的污染水平是10⁷个小细胞中有1个亲代细胞。

在另一实施方案中，产生小细胞的亲代细胞的污染水平是10⁸个小细胞中有1个亲代细胞。

在另一实施方案中，产生小细胞的亲代细胞的污染水平是10⁹个小细胞中有1个亲代细胞。

在另一实施方案中，产生小细胞的亲代细胞的污染水平是10¹⁰个小细胞中有1个亲代细胞。

在另一实施方案中，产生小细胞的亲代细胞的污染水平是10¹¹个小细胞中有1个亲代细胞。

在另一实施方案中，产生小细胞的亲代细胞的污染水平是10¹²个小细胞中有1个亲代细胞。

在另一实施方案中，产生小细胞的亲代细胞的污染水平是10¹³个小细胞中有1个亲代细胞。

在另一实施方案中，产生小细胞的亲代细胞的污染水平是10¹⁴个小细胞中有1个亲代细胞。

在另一实施方案中，产生小细胞的亲代细胞的污染水平是10¹⁵个小细胞中有1个亲代细胞。

在另一实施方案中，产生小细胞的亲代细胞的污染水平是10¹⁶个小细胞中有1个亲代细胞。

除非另有定义，本文所使用的所有的科学和技术术语的含义均与本领域普通技术人员所通常理解的含义相同。尽管已参考实施方案和实例描述了本发明，但应理解的是在没有背离本发明的精神的情况下，可做各种修饰。本文所引用的所有参考文献都在此明确地通过引用全文并入。

实施例

实施例1：I-CeuI对E.coli生长的影响

将E.coliTOP10细胞用pVX-55表达载体(SEQIDNO：6)转化。pVX-55表达载体包含处于鼠李糖诱导型pRHA启动子系统控制下的I-CeuI基因。转化的E.coli细胞培养物生长于添加有卡那霉素(50μg/ml)的LB培养基中。第0小时时向细胞培养物中添加葡萄糖(0.2％)并在第2.22小时和光密度(OD)为0.3时向细胞培养中添加鼠李糖(10mM)。通过测量600nm处的吸光度监测细菌的生长。图1显示了E.coli细胞培养的生长由于I-CeuI归巢核酸内切酶被诱导而显著地减少。

实施例2：I-CeuI对E.coli存活力的影响

将E.coliTOP10细胞用pVX-55表达载体转化。pVX-55表达载体包含处于鼠李糖诱导型pRHA启动子系统控制下的I-CeuI基因。E.coli细胞被培养于含有卡那霉素(50μg/ml)的LB培养基中，并在LB琼脂平板上点样前向LB培养基中添加葡萄糖(0.2％)或鼠李糖(10mM)。经由LB琼脂平板上的菌落计数确定可存活的细胞群(CFU/ml)。未观察到菌落的恢复。图2显示了可存活的E.coli细胞的数量由于I-CeuI归巢核酸内切酶被诱导而显著地减少。

实施例3：同时的ftsZ超表达和I-CeuI诱导(MSM)导致更高的小细胞产量

包含IPTG诱导型ftsZ的和minCDE缺失突变的E.coli菌株生长于LB培养基中。ftsZ构建体(Ptac::ftsZ)和具有基于热诱导型I-CeuI自杀系统的ftsZ构建体(Ptac::ftsZΩ，CI857ts::I-CeuI)分别被整合到产生小细胞的E.coli细胞的染色体上的attBλ位点。Ptac::ftsZ菌株的小细胞产生在37℃下进行，而Ptac::ftsZΩCI857ts::I-CeuI菌株的小细胞产生在42℃下进行，以诱导基于I-CeuI的自杀系统。小细胞经由差异纯化被纯化。图3A显示了从用于小细胞产生的每ml的LB培养物纯化的小细胞的数量。图3B显示了IPTG诱导型ftsZ菌株的小细胞产量与minCDE菌株的小细胞产量相比的比率。图3A和3B证明了当ftsZ和I-CeuI在产生小细胞的细胞中同时超表达时，所产生的小细胞的数量与minCDE菌株相比增加了36倍，与单独地ftsZ超表达菌株相比增加了10倍。

实施例4：ftsZ超表达和基于I-CeuI的自杀系统(MSM)的诱导引起细胞的丝状形成

具有诱导型ftsZ的产生小细胞系统的E.coli菌株VAX8I3和热诱导型I-CeuI自杀系统(pVX-66(SEQIDNO：5)；Ptac::ftsZΩCI857ts::I-CeuI)生长于LB培养基中。在O.D.A600为0.1时，通过将温度升高至42℃诱导ftsZ和I-CeuI蛋白的产生。诱导24小时后，对细胞进行革兰氏染色。图4A显示了在30℃并存在葡萄糖(0.2％)以抑制I-CeuI和ffsZ超表达的条件下生长的E.coli菌株。图4B中，添加IPTG(20μg/ml)以使ftsZ超表达，但是通过在30℃孵育来抑制I-CeuI的表达。图4C中，在42℃诱导I-CeuI的表达，但是ftsZ的超表达被葡萄糖抑制。图4D显示了同时的ftsZ超表达和I-CeuI诱导，与图4B中的ftsZ的超表达和图4C中单独地I-CeuI诱导表达相比，引起更广泛的细胞的丝状形成。因此，除了产生小细胞的高产量以外，ftsZ和I-CeuI的同时超表达具有使产生小细胞的亲代细胞一致地变成丝状的优势，这种优势可以更好地促进基于过滤的小细胞纯化方案。

实施例5：基于I-CeuI的自杀系统(MSM)的诱导引起具有TUNEL 标记的DNA3′OH末端的细胞的累积，指示了双链类色体断裂

包含处于CI857ts和pTac启动子系统(pVX-66；Ptac::ftsZΩCI857ts::I-CeuI，它们各自控制I-CeuI和ftsZ的表达)控制下的MSM系统的E.coli菌株VAX8I3生长于30℃或42℃的LB培养基中，并添加IPTG24小时。在所示时间点处对细胞进行TUNEL((FITC))染色。作为比较的对照，还对细胞进行FM-464的反染色(所有细胞都被染色)，从而使得可通过荧光激活细胞计数器(FACS)定量总群体中的TUNEL阳性细胞百分比。图5显示了基于I-CeuI的自杀系统成功地在产生小细胞的亲代细胞中引入了不可修复的双链染色体断裂，并导致了超过70％的细胞群体在I-CeuI诱导后12小时内死亡。

实施例6：基于I-CeuI的自杀系统减少了纯化后的小细胞中的亲代细胞污染

将IPTG诱导型ftsZ整合到E.coli染色体上的attBλ位点，以便通过ftsZ的超表达制备产生小细胞的E.coli菌株(Ptac::ftsZ)。利用整合质粒pVX-66(pVX-66；Ptac::ftsZΩCI857ts::I-CeuI)，将基于热诱导型I-CeuI的自杀系统连同IPTG诱导型ftsZ一起整合到attBλ位点，以制备产生小细胞的自杀性E.coli菌株(Ptac::ftsZQCI85ts::I-CeuI)。通过42℃孵育激活I-CeuI自杀系统。小细胞产生于添加IPTG的LB培养基中并经由差异纯化被纯化。将纯化的小细胞铺于添加有葡萄糖(0.2％)的LB琼脂平板上以检验活的亲代E.coli细胞的存在。在30℃孵育48小时后，对菌落进行计数并根据10¹⁰个小细胞中的菌落形成单位(CFU)计算污染性亲代细胞的浓度。图6显示了基于I-CeuI的自杀系统的激活减少亲代细胞的污染超过800倍。

实施例7：鼠伤寒沙门氏菌(S.Typhimurium)中的msbB缺失改变LPS 谱

从具有野生型msbB(WT)和缺失msbB(msbB-)的鼠伤寒沙门氏菌(S.Typhimurium)菌株中纯化LPS。通过经由λ-Red重组酶系统(RedSwap)用FRT-cat-FRT取代msbB进行msbB的缺失。首先用DNA酶I和RNA酶A处理经丙酮干燥的细胞，接下来用蛋白酶K处理。然后通过热水-苯酚提取来提取LPS。通过对水的透析纯化LPS。用SDS-PAGE凝胶电泳分离纯化的LPS并对其银染色。MsbB突变体的LPS具有无肉豆蔻酰基团的脂质A。肉豆蔻酰基团的缺乏降低了分子量，这可以通过LPS条带的移动而观察到。图7显示，msbB基因的缺失导致鼠伤寒沙门氏菌突变菌株的LPS谱与野生型鼠伤寒沙门氏菌菌株相比发生改变。

实施例8：msbB缺失引起J774.A1小鼠的巨噬细胞样细胞与伤寒沙门氏菌LPS一起培养时产生更少数量的肿瘤坏死因子α(TNFα)

分别从具有野生型(WT)msbB的鼠伤寒沙门氏菌菌株和含有msbB缺失突变的鼠伤寒沙门氏菌菌株中纯化LPS。将每种类型的纯化的LPS各0.1ng分别与J774.A1小鼠巨噬细胞样细胞(10⁶个细胞)孵育12小时。通过酶联免疫吸附测定(ELISA)确定TNFα的浓度。图8显示了产生小细胞的沙门氏菌菌株中的msbB缺失导致产生毒性减少的小细胞，所述毒性通过培养的小鼠巨噬细胞的TNFα产生而被检测。

Claims

1.产生小细胞的细菌，所述的细菌包含：

编码产生小细胞的基因产物的可表达的基因，所述基因产物调节隔膜形成、二分裂和染色体分离中的一种或多种，其中所述产生小细胞的基因为ftsZ；和

编码核酸内切酶的可表达的基因，其中所述核酸内切酶为I-CeuI，

其中所述核酸内切酶基因为转基因，并且其中所述产生小细胞的细菌的染色体包含一个或多个所述核酸内切酶的识别位点。

2.如权利要求1所述的产生小细胞的细菌，其中所述产生小细胞的基因为转基因。

3.如权利要求1所述的产生小细胞的细菌，其中所述ftsZ基因编码由SEQIDNO:3序列组成的蛋白。

4.如权利要求1-2中任一项所述的产生小细胞的细菌，其中所述产生小细胞的基因在诱导型启动子的控制下被表达。

5.如权利要求4所述的产生小细胞的细菌，其中所述产生小细胞的基因的启动子为温度敏感启动子。

6.如权利要求4所述的产生小细胞的细菌，其中所述产生小细胞的基因的启动子可被一种或多种化学化合物的存在诱导。

7.如权利要求1所述的产生小细胞的细菌，其中所述核酸内切酶基因位于所述产生小细胞的细菌的染色体上。

8.如权利要求1所述的产生小细胞的细菌，其中所述I-CeuI由SEQIDNO:4的氨基酸序列组成。

9.如权利要求1所述的产生小细胞的细菌，其中所述核酸内切酶在诱导型启动子的控制下被表达。

10.如权利要求9所述的产生小细胞的细菌，其中所述启动子为温度敏感启动子。

11.如权利要求9所述的产生小细胞的细菌，其中所述启动子可被一种或多种化学化合物的存在诱导。

12.如权利要求1所述的产生小细胞的细菌，其中所述产生小细胞的细菌为革兰氏阴性细菌。

13.如权利要求12所述的产生小细胞的细菌，其中所述革兰氏阴性细菌选自空肠弯曲菌(Campylobacterjejuni)、乳杆菌属种(Lactobacillusspp.)、淋病奈瑟氏菌(Neisseriagonorrhoeae)、嗜肺军团菌(Legionellapneumophila)、沙门氏菌属种(Salmonellaspp.)、志贺氏菌属种(Shigellaspp.)、铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)和大肠埃希菌(Escherichiacoli)。

14.如权利要求12所述的产生小细胞的细菌，所述细菌包含编码参与脂多糖合成的基因产物的基因，其中所述基因与相应的野生型基因相比经过遗传修饰。

15.如权利要求14所述的产生小细胞的细菌，其中所述基因为编码基因产物的msbB基因，与相应的野生型细菌中的脂质A分子相比，所述基因产物导致细菌产生改变的脂质A分子。

16.如权利要求15所述的产生小细胞的细菌，其中与相应的野生型细菌中的脂质A分子相比，所述改变的脂质A分子对于肉豆蔻酸添加至所述脂多糖分子的脂质A部分而言是有缺陷的。

17.如权利要求1所述的产生小细胞的细菌，其中所述产生小细胞的细菌为革兰氏阳性细菌。

18.如权利要求17所述的产生小细胞的细菌，其中所述革兰氏阳性细菌选自葡萄球菌属种(Staphylococcusspp.)、链球菌属种(Streptococcusspp.)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)和蜡样芽胞杆菌(Bacilluscereus)。

19.如权利要求1所述的产生小细胞的细菌，所述细菌包含参与同源重组的基因，其中所述基因与相应的野生型基因相比经过遗传修饰，其中所述产生小细胞的细菌在DNA损伤修复中是有缺陷的。

20.产生小细胞的细菌，所述的细菌包含：

其中所述核酸内切酶基因在诱导型启动子的控制下被表达，并且其中所述产生小细胞的细菌的染色体包含一个或多个所述核酸内切酶的识别位点。

21.如权利要求20所述的产生小细胞的细菌，其中所述启动子为温度敏感启动子。

22.如权利要求20所述的产生小细胞的细菌，其中所述启动子可被一种或多种化学化合物的存在诱导。

23.如权利要求20-22中任一项所述的产生小细胞的细菌，其中所述核酸内切酶基因位于所述产生小细胞的细菌的染色体上。

24.如权利要求20-22中任一项所述的产生小细胞的细菌，其中所述核酸内切酶基因为转基因。

25.如权利要求20所述的产生小细胞的细菌，其中所述I-CeuI由SEQIDNO:4的氨基酸序列组成。

26.如权利要求20所述的产生小细胞的细菌，其中所述产生小细胞的基因为转基因。

27.如权利要求20所述的产生小细胞的细菌，其中所述ftsZ基因编码由SEQIDNO:3序列组成的蛋白。

28.如权利要求26或27所述的产生小细胞的细菌，其中所述产生小细胞的基因在诱导型启动子的控制下被表达。

29.如权利要求28所述的产生小细胞的细菌，其中所述产生小细胞的基因的启动子为温度敏感启动子。

30.如权利要求28所述的产生小细胞的细菌，其中所述产生小细胞的基因的启动子可被一种或多种化学化合物的存在诱导。

31.如权利要求20所述的产生小细胞的细菌，其中所述产生小细胞的细菌为革兰氏阴性细菌。

32.如权利要求31所述的产生小细胞的细菌，其中所述革兰氏阴性细菌选自空肠弯曲菌(Campylobacterjejuni)、乳杆菌属种(Lactobacillusspp.)、淋病奈瑟氏菌(Neisseriagonorrhoeae)、嗜肺军团菌(Legionellapneumophila)、沙门氏菌属种(Salmonellaspp.)、志贺氏菌属种(Shigellaspp.)、铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)和大肠埃希菌(Escherichiacoli)。

33.如权利要求31所述的产生小细胞的细菌，所述细菌包含编码参与脂多糖合成的基因产物的基因，其中所述基因与相应的野生型基因相比经过遗传修饰。

34.如权利要求33所述的产生小细胞的细菌，其中所述基因为编码基因产物的msbB基因，与相应的野生型细菌中的脂质A分子相比，所述基因产物导致细菌产生改变的脂质A分子。

35.如权利要求34所述的产生小细胞的细菌，其中与相应的野生型细菌中的脂质A分子相比，所述改变的脂质A分子对于肉豆蔻酸添加至所述脂多糖分子的脂质A部分而言是有缺陷的。

36.如权利要求20所述的产生小细胞的细菌，其中所述产生小细胞的细菌为革兰氏阳性细菌。

37.如权利要求36所述的产生小细胞的细菌，其中所述革兰氏阳性细菌选自葡萄球菌属种(Staphylococcusspp.)、链球菌属种(Streptococcusspp.)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)和蜡样芽胞杆菌(Bacilluscereus)。

38.如权利要求20所述的产生小细胞的细菌，所述细菌包含参与同源重组的基因，其中所述基因与相应的野生型基因相比，经过遗传修饰，其中所述产生小细胞的细菌在DNA损伤修复中为有缺陷的。

39.制备小细胞的方法，所述方法包括：

培养权利要求1、15和20中任一项所述的产生小细胞的细菌；和

将小细胞与所述产生小细胞的亲代细胞分离，由此产生包含小细胞的组合物。

40.如权利要求39所述的方法，所述方法还包括由所述产生小细胞的亲代细胞诱导小细胞形成。

41.如权利要求39-40中任一项所述的方法，所述方法还包括诱导编码所述核酸内切酶的基因的表达。

42.如权利要求40所述的方法，其中通过选自异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)、鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、果糖、蜜二糖和四环素的一种或多种化学化合物的存在，诱导小细胞形成。

43.如权利要求41所述的方法，其中通过温度的变化诱导所述编码核酸内切酶的基因的表达。

44.如权利要求41所述的方法，所述方法还包括从所述组合物中纯化所述小细胞。

45.如权利要求39所述的方法，其中通过选自离心、超速离心、密度梯度、免疫亲和性和免疫沉淀的方法将所述小细胞与所述亲代细胞分离。

46.由权利要求39所述的方法产生的真细菌小细胞。

47.由权利要求1所述的产生小细胞的细菌衍生的真细菌小细胞。

48.由权利要求14所述的产生小细胞的细菌衍生的真细菌小细胞。