KR102410382B1 - YbeD 단백질을 과발현하는 고온 내성 미생물 및 이를 이용한 고온 내성 미생물의 배양 방법 - Google Patents

YbeD 단백질을 과발현하는 고온 내성 미생물 및 이를 이용한 고온 내성 미생물의 배양 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 미생물이 고온에서 균체 생장을 유지할 수 있도록 하는 YbeD 단백질의 신규 용도를 제공한다. 대장균에서 YbeD 단백질을 암호화하는 ybeD 유전자를 제거하였을 때, 고온에서 균체 생장이 저해되는 반면, ybeD를 과발현하였을 때 야생형 균주보다 고온에서 균체 생장 속도가 증가하므로, YbeD 단백질은 미생물이 고온에서 균체 생장을 할 수 있도록 하는 열충격 단백질의 기능을 하는 것으로 확인할 수 있다. 따라서, 상기 YbeD 단백질을 과발현한 형질전환체는 고온의 배양 조건에서도 유의적으로 균체 생장을 나타내는 고온 내성 미생물로서 제공될 수 있으며, 상기 고온 내성 미생물을 이용해 고온에서 미생물을 배양하는 방법을 제공할 수 있다.

Description

YbeD 단백질을 과발현하는 고온 내성 미생물 및 이를 이용한 고온 내성 미생물의 배양 방법{High-temperature resistant microorganism overexpressing YbeD protein and method for culturing of high-temperature resistant microorganism using the same}
본 발명은 미생물이 고온에서도 생장할 수 있도록 열 충격 단백질(heat-shock protein)의 기능을 하는 YbeD 단백질의 용도를 제공하고자 하는 것으로, 보다 상세하게는 YbeD를 과발현하는 고온 내성 미생물 및 이를 이용한 고온 내성 미생물의 배양 방법을 제공한다.
대장균(Escherichia coli)은 빠른 생육 속도, 용이한 취급 및 다양한 숙주/벡터 시스템으로 인해 재조합 단백질 제조를 위해 널리 사용되는 숙주 미생물이다. 대장균의 최적 생장 온도는 37℃로 잘 알려져 있으며, 42℃ 이상의 고온에서는 세포 내 단백질 변성으로 인해 목적단백질의 합성 및 균체생장이 저해되기 때문에, 대장균 배양시 온도를 유지하는 것은 균체 생장에 있어서 중요한 배양 조건 중 하나로 꼽힌다. 그러나, 미생물을 고농도 배양할 때 반응기의 온도가 상승하기 때문에, 이러한 반응기 내 온도를 적절하게 유지하는 것은 반응기 부피가 커질수록 어렵거나 불가능해지게 된다. 따라서 미생물을 이용한 생물 공정에 있어서, 고온에서도 잘 생장할 수 있는 미생물 숙주를 개발하는 것이 매우 중요한 과제로 제시될 수 있다.
이를 위해, 세포가 고온의 환경에 노출되었을 때 단백질 폴딩(protein folding)을 도와주는 열충격 단백질(heat shock protein) 자체를 과발현하거나, σ 인자 H(sigma factor H)와 같이 열충격 단백질의 발현을 유도하는 조절 유전자를 과발현하는 것에 대한 연구들이 제안되었지만, 이러한 시도에도 불구하고 세포 생장이 저해된다는 점 등의 치명적인 한계를 나타내는 것으로 보고된 바 있다(Blum et al. (1992) J. Bac.174: 7436-7444; Martinez-Alonso et al. (2010) Microbial Cell Factories 9:64). 따라서, 대장균과 같은 미생물 세포가 고온의 환경에서 배양될 때 생장에 유용한 기능을 하도록 하는 신규 유전자를 발굴하는 것이 하나의 과제로 제시되고 있으며, 이를 이용하여 균체를 고온에서 배양하는 방법에 대한 연구가 계속되고 있다.
이에 따라, 본 발명자들은 미생물이 고온에서 생장을 유지할 수 있도록 하는 신규 유전자를 발굴하기 위해 노력한 결과, 고온에서 대장균을 배양할 때 ybeD 유전자가 유의적인 수준으로 발현이 증가하는 것으로 확인하였고, 대장균에서 ybeD 유전자를 제거하였을 때 고온에서 균체 생장이 저해되는 반면, ybeD를 과발현하였을 때 야생형 균주보다 고온에서 균체 생장 속도가 증가하므로, YbeD 단백질은 미생물이 고온에서 생장하는데 유용한 역할을 하는 기능을 가지는 것으로 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 고온에서 균체 생장을 유의적으로 나타내는 고온 내성 미생물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 상기 고온 내성 미생물을 이용한, 고온 내성 미생물을 배양하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되는 YbeD 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된, 고온 내성의 형질전환체를 제공한다.
또한, 본 발명은 하기 i) 및 ii)의 단계를 포함하는, 미생물을 고온에서 배양하는 방법을 제공한다:
i) 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되는 YbeD 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제조하는 단계; 및
ii) 상기 단계 i)에서 제조한 숙주세포를 배양 배지에 접종하여 배양하는 단계.
본 발명의 바람직한 일실시예에서, 상기 YbeD 단백질을 암호화하는 유전자는 서열번호 2의 염기서열로 구성되는 ybeD 유전자일 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에서, 상기 재조합 벡터는 도 4의 개별지도로 구성되는 재조합 벡터이며, 람노스로 발현이 유도되는 람노스 프로모터(Rha promoter)를 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에서, 상기 숙주세포는 대장균(E.coli)또는 효모(yeast)인 것일 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에서, 상기 고온은 40℃ 이상의 온도일 수 있으며, 상기 고온 내성은 40℃ 이상의 온도에서 형질전환체가 생장하는 것일 수 있다.
따라서, 본 발명은 미생물이 고온에서 균체 생장을 유지할 수 있도록 하는 YbeD 단백질의 신규 용도를 제공한다. 대장균에서 YbeD 단백질을 암호화하는 ybeD 유전자를 제거하였을 때, 고온에서 균체 생장이 저해되는 반면, ybeD를 과발현하였을 때 야생형 균주보다 고온에서 균체 생장 속도가 증가하므로, YbeD 단백질은 미생물이 고온에서 균체 생장을 할 수 있도록 하는 열충격 단백질의 기능을 하는 것으로 확인할 수 있다.
따라서, 상기 YbeD 단백질을 과발현한 형질전환체는 고온의 배양 조건에서도 유의적으로 균체 생장을 나타내는 고온 내성 미생물로서 제공될 수 있으며, 상기 고온 내성 미생물을 이용해 고온에서 미생물을 배양하는 방법을 제공할 수 있다.
도 1은 대장균을 고온에서 배양할 때 유전자의 발현 수준의 변화를 확인한 결과이다:
도 1a는 본 발명의 ybeD 유전자의 발현 수준 변화를 확인한 결과이고; 및
도 1b는 종래 보고된 열충격 단백질인 groESL, dnaKJ, hslVU 및 ibpAB유전자의 발현 수준 변화를 확인한 결과이다.
도 2는 ybeD 결손 대장균주의 제작 과정을 나타내는 전기영동 결과를 나타낸다.
도 3은 야생형 대장균주 및 ybeD 결손 대장균주의 유전체 및 전사체 수준에서 ybeD 및 이에 인접한 lipB 유전자 발현을 확인한 결과이다.
도 4는 ybeD 과발현 균주를 제작하기 위해 구축한 pAR-ybeD 플라스미드의 벡터맵이다.
도 5는 액체 배지에서 배양했을 때 ybeD 결손 또는 과발현에 따른 균체의 생장 곡선을 나타낸다:
도 5a는 37℃에서 배양한 ybeD 결손 균주 및 ybeD 과발현 균주의 생장 곡선을 나타내며; 및
도 5b는 46℃에서 배양한 ybeD 결손 균주 및 ybeD 과발현 균주의 생장 곡선을 나타낸다.
도 6은 고체 배지에서 배양했을 때 ybeD 결손 또는 과발현에 따른 콜로니 형성 여부를 나타낸다:
도 6a는 37℃에서 배양한 ybeD 결손 균주 및 ybeD 과발현 균주의 콜로니 형성 정도를 나타내며; 및
도 6b는 46℃에서 배양한 ybeD 결손 균주 및 ybeD 과발현 균주의 콜로니 형성 정도를 나타낸다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
상술한 바와 같이, 대장균과 같이 재조합 단백질의 생산을 위해 널리 사용되는 숙주 세포는 대량 배양시 반응기 내부의 온도 등의 조건에 의해 균체 생장에 유의적인 영향을 미칠 수 있으므로, 미생물이 고온 배양의 환경에서도 내성을 가질 수 있도록 하는 것이 생물 공정에서 중요한 과제로 제시되고 있다.
따라서, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되는 YbeD 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된, 고온 내성의 형질전환체를 제공한다.
또한, 본 발명은 하기 i) 및 ii)의 단계를 포함하는, 미생물을 고온에서 배양하는 방법을 제공한다:
i) 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되는 YbeD 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제조하는 단계; 및
ii) 상기 단계 i)에서 제조한 숙주세포를 배양 배지에 접종하여 배양하는 단계.
본 발명에 있어서, 상기 “YbeD 단백질”은 대장균에서 ybeD 유전자에 의해 암호화되는 단백질인 것이 바람직하며, 구체적으로 상기 ybeD 유전자는 서열번호 2의 염기서열로 구성되는 유전자인 것이 가장 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 상기 YbeD 단백질과 관련하여, 종래의 일부 연구에 의해, 지방산 생합성 경로 또는 글리신 절단 시스템에서 역할을 할 수 있을 것으로 공지된 바 있으나(Kozlov, Guennadi, et al., Journal of bacteriology 186.23 (2004): 8083-8088), 보다 명확한 기능에 대하여는 보고된 바 없다.
본 발명에 있어서, 상기 “재조합 벡터”는 당업계의 통상의 기술자에 의해 YbeD 단백질을 암호화하는 유전자를 과발현 할 수 있도록 설계 및 구축될 수 있는 구조의 벡터라면 제한없이 사용될 수 있다. 구체적으로, 상기 재조합 벡터는 도 4의 계열 지도로 구성되는 것이 바람직하나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명에서 제공하는 상기 도 4의 계열 지도는 L-람노스에 의해 유전자 발현이 유도되는 L-람노스 프로모터; 플라스미드의 수(low copy number)를 결정하는 서열인 p15A origin; 및 클로람페니콜 저항성 서열을 포함하고 있으나, 이러한 구성 요소는 필수적인 것은 아니며, 통상의 기술자의 필요에 따라 유사 또는 동일한 기능을 하는 구성 요소로 대체 또는 추가될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 “숙주세포”는 당업계에서 재조합 단백질의 대량 생산을 위해 형질전환체로 제조하여 사용될 수 있는 세포라면 제한없이 사용될 수 있으며, 구체적으로 대장균(E.coli) 또는 효모(yeast)인 것이 바람직하다. 보다 구체적으로, 본 발명의 ybeD가 대장균 유래의 유전자라는 점 등을 통해, 상기 숙주세포는 대장균인 것이 가장 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 “고온”은 40℃ 이상의 온도인 것이 바람직하며, 구체적으로 42℃ 내지 60℃인 것이 보다 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
또한, 본 발명에 있어서, 미생물이 “고온 내성”을 가진다는 것은, 40℃ 이상의 온도에서 형질전환체를 배양하였을 때, 균체 생장이 유의적으로 나타난다는 것을 의미할 수 있다.
따라서, 본 발명은 미생물이 고온에서 균체 생장을 유지할 수 있도록 하는 YbeD 단백질의 신규 용도를 제공한다. 본 발명에서 확인한 바와 같이, YbeD 단백질을 과발현한 형질전환체는 고온의 배양 조건에서도 유의적으로 균체 생장을 나타내는 고온 내성 미생물로서 제공될 수 있으며, 상기 고온 내성 미생물을 이용해 고온에서 미생물을 배양하는 방법을 제공할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다.
이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해당되지 않는 것은, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
대장균의 고온 배양시 발현 수준이 변화하는 유전자 ybeD 의 탐색
먼저, 본 발명자들은 대장균을 고온에서 배양할 때 발현 패턴이 변하는 유전자를 선별하였다.
구체적으로, 대장균을 37℃에서 연속 배양(continuous culture)하고, 대장균의 배양 단계가 정상 상태(steady-state)가 됨을 확인하면, 배양 온도를 42℃로 급격히 상승시키고 40 시간 동안 추가 배양하였다. 배양 온도를 42℃로 상승시킨 시점으로부터 2분, 10분, 30분, 60분, 2시간, 4시간, 8시간 및 40시간의 시점에서 각각 배양액을 수득하였다. 수득한 배양액은 고밀도 타일링 어레이 분석(tiling array)을 수행하여 대장균 내의 총 전사체(transcriptome)를 분석하였다. 분석한 전사체 발현 수준은 대장균에서 대표적으로 열충격 단백질(heat shock protein)인 것으로 알려져 있는 groESL, dnaKJ, hslVU 및 ibpAB의 발현 수준을 시간의 흐름에 따라 확인하였다. 이와 함께, ybeD 유전자의 발현 수준 역시 확인하였다. 확인한 발현 수준은 각각의 유전자가 37℃에서 나타내는 발현량을 기준으로 하여 상대적인 값으로 나타내었다.
그 결과, 도 1에서 나타난 바와 같이 각각의 유전자가 37℃에서 발현되는 수준을 기준으로 하여 42℃에서의 발현량을 상대적인 값으로 나타내었을 때, ybeD 유전자의 주요 열충격 단백질의 유전자 발현 패턴처럼 초기 10 분간 급격히 발현 되는 것을 확인하였다. ybeD 유전자 전후에 위치한 lipB 및dacA 유전자는 37℃에 비해 42℃에서 발현 수준이 감소되며, 대장균이 고온에서 배양될 때 ybeD 유전자가 주변 유전자와 관계없이 독립적으로 발현 수준이 증가하며, 이러한 발현 수준의 증가는 배양 온도의 변화 초기 10 분 동안 급격히 증가하였다가 이후에 발현 수준이 다시 급격히 감소하는 양상을 나타내는 것으로 확인하였다. 이를 통하여, 본 발명자들은 현재까지 기능이 보고되지 않은 유전자인 ybeD가 열충격 단백질의 기능을 할 수 있을 것으로 예상하였다.
ybeD 결손 대장균주의 제작
ybeD 유전자가 열충격 단백질을 암호화할 것으로 예상하였으므로, ybeD 유전자를 발현하지 못하는 변이체 균주를 제작하였다.
구체적으로, E.coli BL21(DE3) 균주를 기반으로 하여 Lambda red 시스템(DatsenkoandWanner (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 6640-6645)을 이용하여 ybeD 결손 대장균을 제작하였다. 먼저, pKD3 플라스미드를 이용하여 클로람페니콜 아세틸트란스퍼라제(chloramphenicol acetyltransferase) 카세트(이하, cm 카세트)를 제작하였다. cm 카세트의 양 옆에는, 하기 [표 2]에 기재된 서열의 ybeD del-F 및 ybeD del-R 프라이머쌍을 이용하여, ybeD 인식 서열을 삽입하였다(바이오닉스 사에서 합성)(도 2a). 그런 다음, 람다 레드 재조합효소(Lambda red recombinase)를 생성하도록 pKD46 플라스미드로 형질전환된 대장균주인 pKD46/BL21(DE3) 균주에, 상기 제작한 ybeD 인식 서열이 삽입된 cm 카세트를 삽입하여, pKD46/BL21(DE3) 균주의 유전체 상에서 ybeD 유전자가 삭제되고 cm 카세트가 삽입되도록 유도하였다. 대장균의 유전체 중 ybeD 유전자좌에 cm 카세트가 정상적으로 삽입되었는지 확인하기 위해, 하기 [표 2]에 기재된 서열의 ybeD-confirm-F 및 ybeD-confirm-R 프라이머쌍을 이용하여, ybeD 유전자로부터 전방(upstream) 172 bp 및 후방(downstream) 184 bp 떨어진 서열을 증폭할 수 있도록 PCR 반응을 수행한 후, 전기영동을 수행하여 증폭된 서열의 크기를 확인하였다(도 2b). 그런 다음, cm 카세트는 FLP 재조합효소를 발현하는 pcp20을 이용하여 제거함으로써, 유전체 상에서 ybeD가 결손된 대장균주(SHY1201)를 제작하였다.
제작된 ybeD 결손 균주의 유전체를 주형으로 하고, ybeD-confirm-F 및 ybeD-confirm-R 프라이머쌍을 이용해 PCR 반응을 수행하여 cm 카세트가 제거됨을 확인한 후(도 2c), 정확한 변이 여부를 서열분석을 통해 확인하였다. 최종적으로 제작된 ybeD 결손 균주는 LB 배지에서 약 20 시간 동안 배양한 다음, 배지 내 글리세롤의 농도가 10%가 되도록 글리세로를 첨가한 다음 -80℃에서 보관하였다.
또한, 제작된 ybeD 결손 균주에서 ybeD만 결손되었음을 확인하기 위해서, ybeD 결손 균주에서 ybeD 인접 유전자인 lipB의 발현 수준을 확인하였다. ybeD 결손 균주를 LB 배지에서 배양한 다음, 균체로부터 염색체를 추출하였다. 또한, 상기 균체로부터 mirVana miRNA 추출 키트를 이용하여 총 RNA를 추출하고, ReverTra Ace qPCR RT Master Mix with gDNA Remover를 이용하여 총 RNA를 주형으로 하는 cDNA를 합성하여, 이를 전사체 발현 수준 확인을 위한 주형 DNA로 사용하였다. ybeD 및 lipB의 발현을 확인하기 위한 프라이머는 하기 [표 2]에 기재된 ybeD-RT1 및 ybeD-RT2의 프라이머쌍; 및 lipB-RT1 및 lipB-RT1의 프라이머쌍을 사용하여 각각 RT-PCR 반응을 수행하여 염색체 수준 및 전사체 수준에서 해당 유전자 서열의 증폭 여부를 확인하였다. 그 결과, 도 3에서 나타난 바와 같이 야생형 대장균에서는 ybeD 및 lipB의 발현이 확인되는 반면, ybeD 결손 균주에서는 ybeD은 발현되지 않고 lipB 만 발현되는 것을 확인하였다(도 3).
본 발명에서 사용된 균주명 및 플라스미드명
구분 명칭 특성 출처
대장균주 BL21(DE3) Wild-type
SHY1201 BL21(DE3) ΔybeD 본 발명
DH5α F- endA1 recA1 hsdR17(rK- mK+) supE44 thi-1 gvrA96 relA1 Φ80dlacZM15 Δ(lacZYA-argF)U169 RBC
플라스미드 pACYC184 Low-copy-number cloning vector,TetrCmr NEB
pAR pACYCDuet-1 derivative with　NdeI/XhoI fragment of　l-rhamnose inducible promoter amplified with primer pair RhamL-F and RhamL-R from　E.　coliK-12 MG1655 genomic DNA (gDNA) (Kim et al. 2017)
pAR-ybeD pAR derivative with　NdeI/NarI fragment of wild-type　ybeD　amplified with primer pair ybeD-F and ybeD-R from　E.　coli　BL21(DE3) genomic DNA 본 발명
본 발명에서 사용된 프라이머 정보
프라이머 명 서열(5'→3') 용도
ybeD-del-F ATGAAAACCAAACTTAACGAACTGCTTGAATTCCCTACTCgtgtaggctggagctgcttc Δ ybeD 변이체
제작
ybeD-del-R TTACAGAACCATGCGGACAATATCGATTTTGCCCAGTTCTcatatgaatatcctccttag
ybeD-confirm-F GGTAACTTCTTCGGCAAAATCATTGA ybeD 결손 여부
확인
ybeD-confirm-R AGGGTACTATCATCGCGGGT
ybeD-RT1 AAAGTTATGGGGCAGGCGTT RT-PCR 수행
ybeD-RT2 GCGGACAATATCGATTTTGCCC
lipB-RT1 CGGTCTTCAGCCTTACGAGC
lipB-RT2 GATAAGTCACCTGCCCACCG
ybeD-over-F CCCCCATATGAAAACCAAACTTAACGAACTGCT pAR-ybeD
플라스미드
구축
ybeD-over-R CCCCGGCGCCTTACAGAACCATGCGGACAA
pAR confirm-F TAATTCTCATGTTAGTCATGCCCCG
pAR confirm-R AACCACGTAAAAAACGTCGA
(상기 표 2의 ybeD-del-F 및 ybeD-del-R 서열에 있어서, 대문자로 기재한 서열은 ybeD를 인식하는 서열에 해당하며, 소문자로 기재한 서열은 cm 카세트를 인식하는 서열에 해당한다.)
ybeD 과발현 대장균주의 제작
ybeD가 고온에서 미생물 생장에 유용한 유전자로서 기능을 가지는지를 증명하기 위해, ybeD로 암호화되는 단백질인 YbeD을 과발현하는 균주를 제작하였다. ybeD 과발현 균주를 제작하기 위해서, 도 4의 개별지도를 가지는 YbeD 과발현 플라스미드인 pAR-ybeD를 구축하였다.
구체적으로, 대장균 BL21(DE3) 균주의 유전체 DNA를 추출하여, 이를 주형으로 하고 ybeD-over-F 및 ybeD-over-R 프라이머쌍을 이용해 PCR 반응을 수행하여 ybeD 유전자 서열을 증폭하였다. 주형 플라스미드로는 pAR 벡터(Kim et al.(2017) ACS Synthetic Biology 6(9): 1766-1773)를 사용하였다. 상기 pAR 벡터는 L-람노스에 의해 유전자 발현이 유도되는 L-람노스 프로모터; 플라스미드의 수(low copy number)를 결정하는 서열인 p15A origin; 및 클로람페니콜 저항성 서열을 포함하고 있어, 이를 741본 발명의 ybeD 과발현을 위한 주형 플라스미드로서 사용하였다. pAR 벡터를 NdeI 및 NarI 제한효소로 절단하여 pAR 벡터의 lacI를 삭제하고, 동일 제한효소로 절단한 ybeD 유전자 서열을 삽입하여, pAR-ybeD 플라스미드를 구축하였다. 구축된 플라스미드는 pAR 벡터 서열을 이용하는 pAR confirm-F 및 pAR confirm-R 프라이머쌍을 이용하여 서열을 분석해, 삽입된 ybeD 유전자 염기서열을 확인하였다. 그런 다음, 구축된 pAR-ybeD 플라스미드는 E.coli BL21(DE3) 야생형 균주에 전기천공법으로 삽입하여 형질전환균주(pAR-ybeD/WT)를 제작하였다. 또한, 상기 [실시예 2]에서 제조한 ybeD 결손 균주에 pAR-ybeD 플라스미드 삽입하여 pAR-ybeD/△ybeD 균주를 제작하였다.
ybeD 결손 균주 및 ybeD 과발현 균주의 생장 곡선 비교
<4-1> 액체 배지에서 배양하였을 때 ybeD 결손 또는 과발현에 따른 생장 비교
상기 [실시예 2] 및 [실시예 3]에서 각각 제조한 균주를 사용하여, 고온에서 배양하였을 때 ybeD 발현 여부에 따라 대장균의 생장 정도에 차이를 나타내는지 확인하고자 하였다.
먼저, 상기 [실시예 2]에서 제조한 ybeD 결손 균주(△ybeD)에 클로람페니콜 항생제 내성을 유도하기 위해 pACYC184 플라스미드를 삽입하여 형질전환균주를 준비하였다(pACYC184/△ybeD). ybeD 결손 균주에 대한 정상 대조군으로는 야생형 대장균주에 pACYC184 플라스미드로 형질전환한 균주(pACYC184/WT)를 이용하였다. ybeD 과발현 균주로는, 상기 [실시예 3]에서 제조한 pAR-ybeD/△ybeD 균주 및 pAR-ybeD/WT 균주를 이용하였다.
상기 pACYC184/△ybeD 균주, pACYC184/WT 균주, pAR-ybeD/△ybeD 균주 및 pAR-ybeD/WT 균주를 각각 LB 배지에 접종하고 총 14 시간 동안 배양하였다. LB 배지는 모두 동일하게 1 mM L-람노즈 및 25 ㎍/mℓ 클로람페니콜을 첨가하여 사용하였다. 배양 온도는 대장균의 일반적인 생장 온도로서 37℃에서 배양한 대조군; 및 고온으로서 46℃에서 배양한 실험군으로 나누어 각각 배양을 수행하였다. 생장 곡선은 시간의 흐름에 따라 수득한 배양액의 흡광도를 600 ㎚에서 측정하였다.
그 결과 도 5에서 나타난 바와 같이, 37℃에서 배양한 균주의 경우 ybeD 결손 균주(pACYC184/△ybeD)의 생장이 다소 저하되었고 pACYC184/WT 균주, pAR-ybeD/△ybeD 균주 및 pAR-ybeD/WT 균주는 유사한 수준의 생장을 나타내는 것으로 확인하였다(도 5a). 이에 비해, 46℃에서 배양한 경우에 ybeD 결손 균주(pACYC184/△ybeD)는 생장이 현저히 저하되었고, ybeD의 과발현을 유도한 pAR-ybeD/△ybeD 균주 및 pAR-ybeD/WT 균주의 생장이 촉진됨을 확인하였다(도 5b). 이를 통해, ybeD 유전자는 대장균의 고온 생장에 유용한 유전자임을 확인하였다.
<4-2> 고체 배지에서 배양하였을 때 ybeD 결손 또는 과발현에 따른 생장 비교
ybeD 유전자가 대장균의 고온 생장에 유용한 유전자임을 확인하였으므로, 고체 배지에서 배양하는 경우에서도 유사한 효과를 나타내는지 재확인하였다.
구체적으로, 1 mM L-람노스 및 25 ㎍/mℓ 클로람페니콜을 첨가하여 제조한 LB 고체배지에 상기 실시예 <4-1>에서 사용한 pACYC184/△ybeD 균주, pACYC184/WT 균주, pAR-ybeD/△ybeD 균주 및 pAR-ybeD/WT 균주를 접종하였다. 각각의 균주는 LB 액체 배지에서 배양하여 OD600가 0.2가 되도록 배양하여 동일한 세포 농도로 준비한 다음, 이를 1 배, 10 배, 100 배 및 1000 배로 희석한 시료를 상기 LB 고체 배지에 5 ㎕씩 접종하여 spot assay를 수행하였다. 접종 후에는 37℃ 또는 46℃에서 총 24 시간 동안 균주를 배양한 후, 콜로니 형성을 관찰하였다.
그 결과 도 6에서 나타난 바와 같이, 37℃에서 배양한 경우에는 모든 균주에서 유사한 크기의 콜로니가 형성됨을 관찰하였다(도 6a). 그러나, 고온인 46℃에서 배양하였을 때에는 100 배 및 1000 배로 희석하여 접종한 경우에서 ybeD 결손 균주의 콜로니가 형성되지 않음을 확인하였다(도 6b). 이에 비해 ybeD 과발현 균주에서는 46℃에서 배양하였을 때 모든 희석 조건에서 유의적으로 콜로니가 형성됨을 확인하였다(도 6b). 따라서, 이를 통해 액체 배지에서 배양한 결과와 마찬가지로 고체 배지에서 배양하는 경우에서도 ybeD 유전자가 대장균의 고온 생장에 유용한 유전자임을 확인하였다.
<110> KONKUK UNIVERSITY INDUSTRIAL COOPERATION CORP <120> High-temperature resistant microorganism overexpressing YbeD protein and method for culturing of high-temperature resistant microorganism using the same <130> 1063580 <160> 2 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 87 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 1 Met Lys Thr Lys Leu Asn Glu Leu Leu Glu Phe Pro Thr Pro Phe Thr 1 5 10 15 Tyr Lys Val Met Gly Gln Ala Leu Pro Glu Leu Val Asp Gln Val Val 20 25 30 Glu Val Val Gln Arg His Ala Pro Gly Asp Tyr Thr Pro Thr Val Lys 35 40 45 Pro Ser Ser Lys Gly Asn Tyr His Ser Val Ser Ile Thr Ile Asn Ala 50 55 60 Thr His Ile Glu Gln Val Glu Thr Leu Tyr Glu Glu Leu Gly Lys Ile 65 70 75 80 Asp Ile Val Arg Met Val Leu 85 <210> 2 <211> 264 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 2 atgaaaacca aacttaacga actgcttgaa ttccctactc cttttactta caaagttatg 60 gggcaggcgt tacctgagct ggttgatcag gtggttgaag tggtacagcg ccatgcgcca 120 ggtgactaca ccccaacggt aaaaccaagc agcaaaggca actaccactc ggtatctatc 180 actatcaacg ccactcatat cgagcaggtt gaaacactgt atgaagaact gggcaaaatc 240 gatattgtcc gcatggttct gtaa 264

Claims (10)

  1. 대장균을 고온에서 배양하는 방법에 있어서,
    i) 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되는 YbeD 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 대장균을 제조하는 단계; 및
    ii) 상기 단계 i)에서 제조한 대장균을 배양 배지에 접종하여 배양하는 단계를 포함하고,
    상기 고온은 40℃내지 46℃인, 대장균을 고온에서 배양하는 방법.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 YbeD 단백질을 암호화하는 유전자는 서열번호 2의 염기서열로 구성되는 ybeD 유전자인 것을 특징으로 하는, 대장균을 고온에서 배양하는 방법.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 재조합 벡터는 도 4의 개별지도로 구성되는 재조합 벡터인 것을 특징으로 하는, 대장균을 고온에서 배양하는 방법.
  4. 제 3항에 있어서, 상기 재조합 벡터는 람노스 프로모터(Rha promoter)를 포함하는 것을 특징으로 하는, 대장균을 고온에서 배양하는 방법.
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 고온 내성의 형질전환체에 있어서,
    상기 형질전환체는 대장균(E.coli)이 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되는 YbeD 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 것으로,
    상기 고온은 40℃ 내지 46℃인, 고온 내성의 형질전환체.
  8. 제 7항에 있어서, 상기 YbeD 단백질을 암호화하는 유전자는 서열번호 2의 염기서열로 구성되는 ybeD 유전자인 것을 특징으로 하는, 고온 내성의 형질전환체.
  9. 제 7항에 있어서, 상기 재조합 벡터는 도 4의 개별지도로 구성되는 재조합 벡터인 것을 특징으로 하는, 고온 내성의 형질전환체.
  10. 삭제
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