DE69431715T2

DE69431715T2 - Hybride gene zur verwendung in der herstellung von helfer-t-zell-unabhängigen zytotoxischen t-zellen

Info

Publication number: DE69431715T2
Application number: DE69431715T
Authority: DE
Inventors: James M. Allen; Andrew L. Feldhaus; Stephen D. Lupton
Original assignee: Targeted Genetics Corp
Current assignee: Ampliphi Biosciences Corp
Priority date: 1993-04-06
Filing date: 1994-04-04
Publication date: 2003-07-03
Anticipated expiration: 2014-04-05
Also published as: JPH08510901A; WO1994022489A1; EP0693940B1; EP0693940A1; ATE227772T1; CA2159898A1; EP0693940A4; PT693940E; AU695615B2; DK0693940T3; DE69431715D1; AU6624894A; ES2186685T3; US6593124B1; US5874556A

Description

Technisches Gebiet

Die Erfindung betrifft Materialien zur Verwendung in der Immuntherapie, genauer Lymphocyten, die rekombinante Gene enthalten, die bei Expression das Wachstum oder die Proliferation verstärken.

Hintergrund

T-Lymphocyten sind in erster Linie für den Schutz vor intrazellulären Pathogenen oder malignen Veränderungen verantwortlich. Individuen mit einem schweren Defekt der T-Zell- Immunität erliegen häufig überschwemmenden Infektionen durch Organismen wie dem Cytomegalievirus, Pneumocystis carinii, Candida und anderen offensichtlich "opportunistischen" Pathogenen, einschliesslich Bakterien, Viren und Pilzen. Diese Individuen können auch malignen Veränderungen wie B-Zell-Lymphomen erliegen, was auf die Wichtigkeit der T-Zell-Immunität bei der Suppression oder Elimination von bestimmten Tumoren hinweist. Immunsuppression kann eine Reihe von Gründen haben, einschliesslich viraler Infektionen (zum Beispiel mit dem HIV-Virus), als Folge einer Chemotherapie und maligner Veränderungen (besonders von Typen, die das hämatopoietische System schädigen).
Alle reifen T-Lymphocyten exprimieren das CD3-Zelloberflächenmolekül, bestehen aber aus zwei grundlegenden Unterklassen, basierend auf ihrer gegenseitigen ausschliesslichen Expression der Zelloberflächenmoleküle CD4 und CD8. Die funktionale Unterscheidung zwischen CD4+- und CD8+-T-Zellen basiert auf der Fähigkeit von CD4+-Zellen, Antigen zu erkennen, das in Verbindung mit Klasse II-MHC-Molekülen präsentiert wird, und CD8+- Zellen, Antigen zu erkennen, das in Verbindung mit Klasse I-MHC-Molekülen präsentiert wird. CD8+-Zellen sind an "Effektor"-Funktionen der Immunantwort beteiligt, wie etwa der direkten cytotoxischen Zerstörung von Zielzellen, die fremde Antigene tragen, und stellen einen wichtigen Mechanismus für die Resistenz gegen virale Infektionen und Tumore dar. Die CD8+-Zellen, die diese lyrische Funktion vermitteln, werden als cytotoxische Lymphocyten (CTLs) bezeichnet. CD4+-T-Zellen sind grundsätzlich an "Helfer"-Funktionen der Immunantwort beteiligt und sekretieren Cytokin-Moleküle, besonders IL-2, von dem die cytotoxischen CD8+-T-Zellen abhängig sind. CD4+-T-Zellen werden oft als T-Helferzellen (TH) bezeichnet. Obwohl die meisten CTLs dem CD8-Phänotyp angehören, sind auch einige CTLs des CD4-Phänotyps beschrieben worden. Allgemein sind individuelle CTLs (entweder CD8+ oder CD4+) Antigen-spezifisch.
Lymphocytenklassen, zum Beispiel CTLs, sind für Wachstum und Proliferation als Antwort auf fremde Antigene abhängig von T-Helferzell-(TH)-stämmigen Cytokinen wie etwa IL-2 (Zinkernagel und Doherty, Adv. Imunol. 27: 51, 1979; Male et al., Advanced Immunology, Kap. 7, Gower Veröff., London, 1987; Jacobson et al., J. Immunol. 133: 754, 1984). IL-2 ist zum Beispiel ein wirkungsvolles Mitogen für cytotoxische T-Lymphocyten (Gillies and Smith, Nature 268: 154, 1977), und die Kombination von Antigen und IL-2 bewirkt in vitro die Proliferation von primären CD8+-Zellen. Die Wichtigkeit von IL-2 für Wachstum und Erhaltung von CD8+-CTLs in vivo wurde in Modellen adoptiver Immuntherapie dokumentiert, in denen die therapeutische Wirksamkeit von übertragenen anti-retroviralen CD8+-Zellen bei nachträglicher Verabreichung von IL-2 verstärkt wurde (Cheever et al., J- Exp. Med. 155: 968, 1982; Reddehase et al., J. Virol. 61: 3102, 1987). IL-4 und IL-7 sind ebenfalls in der Lage, die Proliferation reifer CD8+-CTLs zu stimulieren (Alderson et al., J. Exp. Med., 172: 577, 1990).
Erhebliche Forschungsarbeit hat sich auf den Gebrauch von T-Zellen bei der Behandlung maligner Tumore und viraler Infektionen gerichtet. Cytotoxische T-Zellen, die für einen bestimmten Typ von Tumor spezifisch sind, können isoliert und einem Patienten, der einen Tumor hat, mit der Wirkung verabreicht werden, dass die CTLs den Tumor bekämpfen. Es wurde zum Beispiel gezeigt, dass Tumor-spezifische T-Zellen nicht nur für experimentelle Tumore in Mäusen erzeugt werden können, sondern dass T-Zellen mit offensichtlicher Tumor- Spezifität auch aus menschlichen Tumoren isoliert werden können. Solche menschlichen Tumorinfiltrierenden Lymphocyten (TILs) sind in vitro vermehrt und zur Behandlung von Krebspatienten eingesetzt worden, einen bemerkenswerten Enthusiasmus für die adoptive Immuntherapie mit Tumor-spezifischen T-Zellen beim Menschen erzeugend (Rosenberg et al., N. Engl. J. Med. 319: 1767, 1988).
Ähnliche Studien unter Verwendung von cytotoxischen T-Zellen, die spezifisch für virale Antigene sind, wurden ebenfalls an Tiermodellen durchgeführt. Menschliche HIV-spezifische CTLs, sowohl vom CD8+ (Walker et al., Nature 328: 345, 1987, Plata et al.. Nature 328: 348, 1987)- als auch vom CD4+ (Siliciano et al.. Cell 54: 561, 1988) -Phänotyp sind isoliert und charakterisiert worden. HIV-spezifische CD8+-CTLs sind klassische CTLs in dem Sinn, dass ihre proliferativen und cytotoxischen Antworten Antigen-spezifisch und MHC-kontrolliert sind (Walker et al., vorstehend: Chenciner et al., Eur. J. Immuno. 19: 1537, 1989; Walker et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 9514, 1989), zusammen mit den zahlreichen mausstämmigen und menschlichen CTL-Clonen, die charakterisiert worden sind, die für virale, Tumor- oder allospezifische Antigene spezifisch sind.
Die adoptive Übertragung von Antigen (Ag)-spezifischen T-Zellen zur Erlangung von Immunität scheint im Maus-Tiermodell eine wirkungsvolle Therapie für einige virale Infektionen und Tumore zu sein. (Für einen Überblick vgl. P. D. Greenberg in Advances in Immunology, F. Dixon, Hrsg., Academic Press, Inc. Orlando Fla. (1991), S. 280-355.) Ein erfolgreiches Ergebnis einer adoptiven Übertragungsmethode ist jedoch von vielen Faktoren abhängig, einschliesslich der Langlebigkeit der übertragenen Clone und der Nicht-Toxizität für den Wirt der übertragenen Zellen. Obwohl viele Antigen-spezifische T-Zell-Clone isoliert worden sind, zeigte sich, dass die Anwendung von in vitro erzeugten Tumor-spezifischen T- Zell-Clonen deutlichen Grenzen in der Tumortherapie unterliegen. In mehreren therapeutischen Modellen wurde gezeigt, dass die Wirksamkeit von cytolytischen CD8+-T-Zellen von der Abhängigkeit von exogenem IL-2 (von TH-Zellen produziert) begrenzt wird, ein Befund, der in Versuchen zur adoptiven Therapie beim Menschen bestätigt wurde, in denen die Verabreichung von exogenem IL-2 wesentlich für die optimale therapeutische Wirksamkeit zu sein scheint (Rosenberg et al., N. Engl. J. Med. 319: 1767, 1988; Klarnet et al. In Role of Interleukin-2 Activated Killer Cells in Cancer, Lutzova and Heberman (Hrsg.) CRC Press, Florida, Kap. 14, S. 199-218, 1990). Da in vitro T-Zell-Clonierungstechniken ein Verfahren liefern, grosse Mengen von T-Zellen mit nachweisbarer Tumor- oder viraler Spezifität zu erzeugen, scheint daher das volle Potential bei der Anwendung solcher Antigen-spezifischen T- Zellen in der Therapie von ihrer Abhängigkeit von TH-Zellen begrenzt zu sein.
In einigen begrenzten Fällen kann das Problem der TH-Abhängigkeit durch die Verwendung einer bestimmten Klasse von Zellen, von denen bekannt ist, dass sie unabhängig von TH-Zellen funktionieren, umgangen werden. Diese Zellen sind bekannt als Helfer-unabhängige cytolytische CD8+-Zellen (tüTc) (Klarnet et al., J. Immunol. 142: 2187, 1989) und sind in Populationen von primären (d. h. frisch isoliert aus in vivo Quellen) CD8+-CTLs gefunden worden (Sprent and Schaefer, J. Exp. Med. 162: 21068, 1985; Andrus et al., J. Exp. Med. 159: 647, 1984). HITc-Zellen produzieren genügend IL-2, um unabhängig von CD4+-Zellen und den Cytokinen, die sie produzieren, zu wachsen. Es ist weiterhin bekannt, dass HITc- Zellen IL-1-Rezeptoren der Plasmamembran (IL-1R) exprimieren und IL-1 für ihre IL-2- unabhängige Proliferation benötigen (Klarnet et al., 1989, vorstehend). Dies steht im Gegensatz zu herkömmlichen CD8+-CTLs, die keinen nachweisbaren IL-1R auf ihrer Oberfläche exprimieren (Lowenthal and MacDonald, 1987). Es sind HITc-Zellen mit einer Spezfität für eine Reihe von Antigenen erzeugt worden, einschliesslich Tumor-, viraler und Alloantigene (von Boehmer et al., J. Immunol. 133: 59, 1984; Klarnet et al., J. Immunol. 138: 4012, 1987; und Andrus et al., J. Exp. Med. 149: 647, 1984; Mizouchi et al., J. Immunol. 142: 270, 1989). Es wurde gezeigt, dass HITc-Zellen mit Spezifität für einen retroviral transformierten Tumor die Tumorzellen auslöschten und nach ihrer Verankerung lange Zeit in vivo bestanden ((Klarnet et al., 1989, vorstehend). Leider sind HITc-Zellen mit Spezifität für viele wichtige Antigene wie etwa HIV-Antigene oder Tumor-Antigene noch nicht isoliert worden.
Um das volle Potential von Antigen-spezifischen T-Zellen in der Therapie einsetzen zu können, ist es notwendig, ein vollständigeres Repertoire von CTLs zu entwickeln, die eine weniger starke Abhängigkeit von TH-Zellen aufweisen. Ein Ansatz war die Einführung eines rekombinanten Vektors, der einen Cytokin-Rezeptor, zum Beispiel den IL-1-Rezeptor exprimiert, in TH-abhängige CTLs, was die Umwandlung in Zellen mit einem weniger starken Bedarf nach den TH-Zellen und/oder deren Stimulationsfaktoren zum Ergebnis hatte, (PCT/US91/06921, WO 92/05794, veröffentlicht am 16. April 1992). Die vorliegende Erfindung, nachstehend beschrieben, präsentiert einen anderen Ansatz zur Produktion von Lymphocyten mit einer weniger starken Abhängigkeit von TH-Zellen und/oder den Stimulationsfaktoren, die sie produzieren.

Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung liefert Vektoren zur Produktion von Lymphocyten, die relativ zu den Elternzellen ohne den Vektor zu verstärktem Wachstum oder verstärkter Proliferation bei Anwesenheit begrenzter Mengen von TH-Zellen oder Stimulationsfaktoren, die von TH- Helferzellen geliefert werden (z. B. Cytokinen), in der Lage sind.
Die Vektoren enthalten ein rekombinantes Gen, von dem die Expression eines gewünschten Genproduktes, das in der Lage ist, Wachstum und Proliferation zu verstärken, gesteuert wird, zumindestens in Teilen durch eine heterologe transkriptionale Kontrollregion. Die transkriptionale Kontrollregion stammt von einem Gen, das auf Lymphocyten-Aktivierung durch die Anwesenheit eines entsprechenden, mit dem MHC der Zielzelle verbundenen Antigen reagiert. Auf diese Weise liefert die Erfindung den Vorteil der Regulierung von Expression des/der Stimulationsfaktors/en, so dass sie mit der Antigen-Aktivierung des Lymphocyten koordiniert sind.
Die Erfindung liefert auch die die Vektoren enthaltenden Lymphocyten und Verfahren zur Anwendung der Vektoren, um Lymphocyten mit einer weniger starken Abhängigkeit von TH- Zellen und/oder Stimulationsfaktoren, die sie produzieren, herzustellen.
Daher ist eine Ausführungsform der Erfindung ein rekombinantes Polynucleotid, umfassend eine Region, die ein Stimulationsfaktor-Polypeptid codiert, das Proliferation von Lymphocyten stimuliert und funktionell mit einer heterologen transkriptionalen Kontrollregion verbunden ist, wobei das Stimulationsfaktor-Polypeptid aus Cytokinen und anderen Hormonen, Stimulationspeptid-Transkriptionsfaktoren und Oncogenen ausgewählt ist, wobei die Expression des Stimulationsfaktor-Polypeptids in einem aktivierten Lymphocyten die Abhängigkeit von Lymphocyten-T-Helferzellen (TH-Zellen) reduziert und wobei, wenn der Lymphocyt von seinem entsprechenden Antigen aktiviert wird, die transkriptionale Kontrollregion die Transkription der den Stimulationsfaktor codierenden Region veranlasst.
Eine weiterere Ausführungsform der Erfindung ist eine Wirtszelle und deren Nachkommen, wobei die Wirtszelle mit einem rekombinanten Polynucleotid transformiert ist, bestehend aus einer Region, die ein Stimulationsfaktor-Polypeptid enthält, funktionell verbunden mit einer heterologen transkriptionalen Kontrollregion, wobei die Expression des Stimulationsfaktor- Polypeptids in einem aktivierten Lymphocyten die Abhängigkeit von Lymphocyten-T- Helferzellen (TH-Zellen) reduziert und wobei, wenn der Lymphocyt von seinem entsprechenden Antigen aktiviert wird, die transkriptionale Kontrollregion die Transkription der den Stimulationsfaktor codierenden Region veranlasst.
Noch eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist ein Verfähren zum Gebrauch des vorstehend beschriebenen Polynucleotids, umfassend die Transformierung eines Lymphocyten mit dem Polynucleotid, wobei als ein Ergebnis der Transformation der Lymphocyt weniger stark von TH-Zellen zur Proliferation abhängig ist.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist eine nach dem vorstehend beschriebenen Verfahren hergestellte Zelle und deren Nachkommen.

Kurze Beschreibung der Abbildungen

Fig. 1 zeigt schematische Darstellungen der proviralen Strukturen der HyTK/hIL-3/CAT und HyTK/hIL-4/CAT genannten retroviralen Vektoren.
Fig. 2 ist eine Halbton-Reproduktion der Ergebnisse einer Untersuchung der CAT-Aktivität aus der Expression von nicht stimulierten und stimulierten Jurkat-Zellen, die mit den Vektoren HyTK/hIL-3/CAT oder HYTK/hIL-4/CAT transfiziert worden waren.
Fig. 3 zeigt eine schematische Darstellung nicht viraler Vektoren, die eine funktionell mit einer Cytokin codierenden Sequenz verbundene heterologe transkriptionale Kontrollregion enthalten.
Fig. 4A und Fig. 4B zeigen eine schematische Darstellung der proviralen Strukturen retroviraler Vektoren, die die HyTK codierende Sequenz und eine funktionell mit einer heterologen transkriptionalen Kontrollregion verbundene hIL-2-Sequenz enthalten. Fig. 4C und Fig. 4D zeigen eine schematische Darstellung der proviralen Strukturen retroviraler Vektoren, die die HyTK codierende Sequenz und ein Gen (welches zum Beispiel das CAT-Gen oder das IL-2-Gen sein kann), funktionell verbunden mit einer heterologen transkriptionalen Kontrollregion, enthalten. In dem in Fig. 4D abgebildeten retroviralen Vektor ist eine heterologe Enhancer-Sequenz (welche zum Beispiel der CMV-Enhancer sein kann) stromaufwärts der heterologen transkriptionalen Kontrollregion eingefügt.
Fig. 5 zeigt die schematische Darstellung eines AAV-Vektors, der eine mit einer Cytokin codierenden Sequenz funktionell verbundene heterologe transkriptionale Kontrollregion enthält.
Fig. 6 bis 23 sind Diagramme, die die Ergebnisse der in den Beispielen 10 bis 27 beschriebenen Experimente darstellen.
Fig. 6 ist ein Liniendiagramm, das den Zeitverlauf der CAT-Aktivität, exprimiert von menschlichen Jurkat-T-Lymphocyten, die mit den in der Legende angegebenen Vektoren transfiziert wurden, nach der Aktivierung durch PMA und Ionomycin, wie in Beispiel 10 beschrieben, zeigt.
Fig. 7 ist ein Liniendiagramm, das den Zeitverlauf der CAT-Aktivität, exprimiert von menschlichen Jurkat-T-Lymphocyten, die mit den angegebenen Vektoren transfiziert wurden, nach der Aktivierung durch PMA und Ionomycin, wie in Beispiel 11 beschrieben, zeigt.
Fig. 8 ist ein Balkendiagramm, das den Grad der CAT-Aktivierung, exprimiert von menschlichen peripheren T-Lymphocyten, die mit den angegebenen Vektoren transfiziert wurden, mit (+) oder ohne (-) Aktivierung durch PMA und Ionomycin, wie in Beispiel 12 beschrieben, zeigt.
Fig. 9 ist ein Liniendiagramm, das den Zeitverlauf der CAT-Aktivität, exprimiert von menschlichen Jurkat-T-Lymphocyten, die mit den angegebenen Vektoren transfiziert wurden, mit oder ohne Aktivierung durch PMA und Ionomycin, wie in Beispiel 13 beschrieben, zeigt.
Fig. 10 ist ein Liniendiagramm, das den Zeitverlauf der CAT-Aktivität, exprimiert von menschlichen Jurkat-T-Lymphocyten, die mit den angegebenen Vektoren transfiziert wurden, mit oder ohne Aktivierung durch PMA und Ionomycin, wie in Beispiel 14 beschrieben, zeigt.
Fig. 11 ist ein Liniendiagramm, das den Zeitverlauf der CAT-Aktivität, exprimiert von menschlichen Jurkat-T-Lymphocyten, die mit den angegebenen Vektoren transfiziert wurden, mit oder ohne Aktivierung durch PMA und Ionomycin, wie in Beispiel 15 beschrieben, zeigt.
Fig. 12 ist ein Balkendiagramm, das den Grad der CAT-Aktivität, exprimiert von menschlichen peripheren T-Lymphocyten, die mit den angegebenen Vektoren transfiziert wurden, mit (+) oder ohne (-) Aktivierung durch PMA und Ionomycin, wie in Beispiel 16 beschrieben, zeigt.
Fig. 13 ist ein Balkendiagramm, das den Grad der CAT-Aktivität, exprimiert von menschlichen Jurkat-T-Lymphocyten, die mit den angegebenen Vektoren transfiziert wurden, mit oder ohne Aktivierung der Zellen durch Querverknüpfung des T-Zell-Rezeptors mit Hilfe eines Oberflächen gebundenen monocionalen anti-CD3-Antikörpers, wie in Beispiel 17 beschrieben, zeigt.
Fig. 14 ist ein Balkendiagramm, das den Grad der CAT-Aktivität, exprimiert von menschlichen peripheren T-Lymphocyten, die mit den angegebenen Vektoren transfiziert wurden, mit (+) oder ohne (-) Aktivierung der Zellen durch Querverknüpfung des T-Zell- Rezeptors mit einem Oberflächen gebundenen anti-CD3, wie in Beispiel 18 beschrieben, zeigt.
Fig. 15 ist ein Balkendiagramm, das den Grad der CAT-Aktivität, exprimiert von CD3+- Milzzellen der Maus, die mit den angegebenen Vektoren transfiziert wurden, mit oder ohne Aktivierung der Zellen durch Querverknüpfung des T-Zell-Rezeptors mit Hilfe eines anti-CD3- Antikörpers, wie in Beispiel 19 beschrieben, zeigt.
Fig. 16 ist ein Balkendiagramm, das den Grad der CAT-Aktivität, exprimiert von CD3+- Milzzellen der Maus, die mit den angegebenen Vektoren transfiziert wurden, entweder nicht aktiviert durch Inkubation mit bestrahlten C57B1/6-Milzzellen oder aktiviert durch Inkubation mit bestrahlten allogenen DBA/2-Milzzellen, wie in Beispiel 20 beschrieben, zeigt.
Fig. 17 ist ein Balkendiagramm, das den Grad der Expression von CAT-Aktivität durch CD8+-T-Zellen der Maus, die mit den angegebenen Vektoren transfiziert wurden, mit oder ohne Aktivierung, wie in Beispiel 21 beschrieben, zeigt.
Fig. 18 ist ein Balkendiagramm, das den Grad der CAT-Aktivität, exprimiert von CD8+-T- Zellen der Maus, die mit den angegebenen Vektoren transfiziert wurden, entweder nicht aktiviert durch Inkubation mit bestrahlten C57B1/6-Milzzellen, oder aktiviert durch Inkubation mit bestrahlten allogenen DBA/2-Milzzellen, wie in Beispiel 22 beschrieben, zeigt.
Fig. 19 ist ein Balkendiagramm, das den Grad der CAT-Aktivität, exprimiert von menschlichen peripheren T-Lymphocyten, die mit den angegebenen Vektoren transfiziert wurden, mit oder ohne Aktivierung der Zellen durch Querverknüpfung des T-Zell-Rezeptors mit Hilfe eines anti-CD3-Antikörpers, wie in Beispiel 23 beschrieben, zeigt.
Fig. 20 ist ein Balkendiagramm, das den Grad der CAT-Aktivität, exprimiert von menschlichen peripheren CD4+-T-Lymphocyten, die mit den angegebenen Vektoren transfiziert wurden, mit oder ohne Aktivierung der Zellen, wie in Beispiel 24 beschrieben, zeigt.
Fig. 21 ist ein Balkendiagramm, das den Grad der CAT-Aktivität, exprimiert von menschlichen peripheren CD8+-T-Lymphocyten, die mit den angegebenen Vektoren transfiziert wurden, mit oder ohne Aktivierung der Zellen, wie in Beispiel 25 beschrieben, zeigt.
Fig. 22 ist ein Balkendiagramm, das den Zeitverlauf der CAT-Aktivität, exprimiert von dem anti-CMV-spezifischen menschlichen cytotoxischen T-Zell-Clon MRL 1A3, der mit den angegebenen Vektoren transfiziert wurde, mit oder ohne Aktivierung der Zellen durch Querverknüpfung des T-Zell-Rezeptors mit Hilfe eines anti-CD3-Antikörpers, wie in Beispiel 26 beschrieben, zeigt.
Fig. 23 ist ein Balkendiagramm, das das Wachstum des anti-CMV-spezifischen menschlichen cytotoxischen T-Zell-Clon MRL 1A3 nach Transduktion mit einem Kontrollvektor oder einem IL-2 enthaltenden Vektor zeigt. Die Zellen wurden in Abwesenheit von exogenem IL-2, aber bei Anwesenheit von autologen, mit CMV vom Stamm AD 169 infizierten Fibroblasten gezüchtet, um die Antigen-Stimulation zu erhalten. Die Daten zeigen die kumulativen Änderungen der Zellzahlen während zweier Stimulationszyklen über 7 Tage, wie in Beispiel 27 beschrieben.

GENAUE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Die Erfindung liefert Antigen-spezifische Lymphocyten, die sich von den elterlichen TH- abhängigen Lymphocyten durch die Anwesenheit eines rekombinanten Polynucleotids unterscheiden, das wenigstens ein Polypeptid codiert, das die Proliferation von Lymphocyten stimuliert, dessen Expression in den elterlichen TH-abhängigen Lymphocyten normalerweise minimal ist. Die codierende Sequenz ist mit einer transkriptionalen Kontrollregion, die dazu heterolog ist, funktionell verbunden. Die transkriptionale Kontrollregion stammt von einem Gen, das auf Lymphocyten-Aktivierung durch die Anwesenheit eines entsprechenden, mit dem MHC der Zielzelle verbundenen Antigens antwortet. Dadurch gibt die Antigen-Aktivierung der Lymphocyten auch das Signal für die Transkription der codierten Polypeptid-Sequenz. Die das rekombinante Polynucleotid enthaltenden Zellen sind vorzugsweise CD8+-CTLs.
Der hierin verwendete Ausdruck "Lymphocyten" bezeichnet Zellen, die speziell nicht-eigene oder eigene Antigene erkennen und darauf antworten und für die Ausbildung einer spezifischen Immunität verantwortlich sind. Eingeschlossen in den Begriff "Lymphocyten" sind B- Lymphocyten und T-Lymphocyten verschiedener Typen.
"Cytotoxische Lymphocyten" oder "CTLs" sind T-Zellen, die die CD3-Zelloberflächen- Determinante tragen und die Lysis von Zielzellen vermitteln, die die entsprechenden Antigene tragen. CTLs können entweder vom CD8+- oder vom CD4+-Phänotyp sein. CTLs sind im allgemeinen Antigen-spezifisch und insoweit MHC-beschränkt, dass sie Antigen-Peptide nur in Verbindung mit den Molekülen des Haupthistokompatibilitätskomplexes (MHC) auf der Oberfläche von Zielzellen erkennen. CTLs können für einen weiten Bereich von viralen, Tumor- oder allospezifischen Antigenen, einschliesslich HIV-, EBV-, CMV- und einen weiten Bereich von Tumor-Antigenen, spezifisch sein. Einige CTLs jedoch können nicht Antigenspezifisch sein. Zum Beispiel können einige clonierte CTLs durch Kultivierung in abnormal hohen Konzentrationen von IL-2 dazu veranlasst werden, einen Teil ihrer Spezifität für ihr entsprechendes Antigen zu verlieren (Brooks et al., Immunol. Rev. 72: 43, 1983).
Ein "TH-unabhängiger" CTL oder Lymphocyt oder ein "Lymphocyt mit weniger starker Abhängigkeit von einer TH-Zelle" ist einer, der relativ zu den elterlichen Lymphocyten, von denen der betrachtete Lymphocyt abstammt, zu verstärktem Wachstum oder verstärkter Proliferation in Anwesenheit von limitierenden Mengen von CD4+-T-Helferzellen (TH-) und/oder einem oder mehreren TH-Zell-stämmigen Cytokinen oder deren Äquivalenten in der Lage ist. Wachstum oder Proliferation kann zum Beispiel durch jedes Verfahren zur Messung von Proliferation oder Wachstum in vitro oder durch jedes Untersuchungsverfahren gemessen werden, das die Fähigkeit der CTLs misst, in vivo zu überdauern. Spezielle Beispiele von geeigneten Untersuchungsverfahren sind in der Fachwelt bekannt. CTLs, die zu verstärktem Wachstum oder verstärkter Lebensfähigkeit in der Lage sind, können eine verstärkte Fähigkeit aufweisen, fremde Antigene tragende Zielzellen zu zerstören oder ein immunulogisches Langzeitgedächtnis aufzubauen.
Die hierin verwendeten Begriffe "Stimulationsfaktor" oder "Wachstumsfaktor" oder "stimulatorisches Polypeptid" oder "stimulatorischer Polypeptid-Faktor" beziehen sich auf ein Polypeptid, das Zellproliferation stimuliert, einschliesslich Lymphocytenproliferation. Der Ausdruck umfasst zum Beispiel Cytokine, stimulatorische Polypeptid-Transkriptionsfaktoren, Oncogene und andere Hormone, die keine Cytokine sind (z. B. Wachstumshormon, Prolactin und IGF-1).
"Cytokin" bezieht sich auf ein Polypeptid, das ein lösliches, interzelluläres Signalmolekül ist, einschliesslich zum Beispiel der Interleukine, Interferone, Kolonie stimulierenden Faktoren und TNFs.
Der Ausdruck "Polypeptid" bezieht sich auf ein Polymer aus Aminosäuren und bezieht sich nicht auf eine bestimmte Länge des Produktes; damit sind Peptide, Oligopeptide und Proteine in der Definition des Polypeptides eingeschlossen. Dieser Ausdruck bezieht sich auch nicht auf post-translationale Änderungen des Polypeptids, zum Beispiel Glycosylierungen, Acetylierungen Phosphorylierungen und dergleichen oder schliesst diese aus. In die Definition eingeschlossen sind zum Beispiel Polypeptide, die ein oder mehrere Analoga einer Aminosäure tragen (einschliesslich zum Beispiel unnatürliche Aminosäuren, etc.), Polypeptide mit substituierten Bindungen ebenso wie andere Veränderungen, die in der Fachwelt bekannt sind, sowohl natürlich vorkommende als auch nicht natürlich vorkommende.
Der hierin verwendete Ausdruck "Transformation" bezieht sich auf die Insertion eines exogenen Polynucleotids in eine Wirtszelle, unabhängig von der für die Insertion verwendeten Methode, zum Beispiel der direkten Aufnahme, Transduktion, f-Paarung oder Elektroporation. Das exogene Polynucleotid kann als nicht integrierter Vektor, zum Beispiel ein Plasmid, erhalten werden oder kann alternativ in das Genom der Wirtszelle integriert werden.
Der hierin verwendete Begriff "Behandlung" bezieht sich auf Prophylaxe und/oder Therapie.
"Helfer-T-Zellen" oder "Helferzellen" oder "TH-Zellen" sind eine funktionelle Unterklasse der T-Zellen, die helfen können, cytotoxische T-Zellen zu erzeugen, und mit B-Zellen zur Produktion einer Antikörper-Antwort zusammenarbeiten. Helferzellen erkennen Antigen gewöhnlich in Verbindung mit MHC-Molekülen der Klasse II.
Ein "Antigen-spezifischer T-Zell-Clon" besteht aus der Nachkommenschaft einer einzelnen Zelle; die Zellen in diesem Typ eines Clons sind vom gleichen Phänotyp und alle auf das selbe Antigen gerichtet. Verfahren zur Herstellung Antigen-spezifischer T-Zell-Clone sind in der Fachwelt bekannt.
Der Ausdruck "rekombinanter Expressionsvektor" bezieht sich auf eine replizierbare Einheit von DNA oder RNA in einer Form, die durch Transformation, Elektroporation, Transduktion oder virale Infektion in eine Zielzelle eingebracht werden kann und die für die Expression einer heterologen strukturellen Codierungssequenz, zum Beispiel ein Cytokin, codiert, die unter der Kontrolle von Elementen, die eine regulierende Aufgabe bei der Genexpression haben, in mRNA transkribiert und in Protein translatiert wird. Solche Vektoren enthalten vorzugsweise auch geeignete Kontrollsequenzen für Transkription und Translation, einschliesslich Initiationssequenzen, die mit der Codierungssequenz funktionell verbunden sind.
Der hierin verwendete Begriff "rekombinant" bedeutet, dass eine bestimmte DNA-Sequenz das Produkt verschiedener Kombinationen aus Clonierungs-, Restriktions- und Ligierungsschritten ist, die Konstruktion einer strukturellen Codierungssequenz ergebend, die unterscheidbar von homologen, in natürlichen Systemen gefundenen Sequenzen ist. Im allgemeinen können DNA- Sequenzen, die die strukturelle Codierungssequenz codieren, zum Beispiel Cytokine, aus cDNA-Fragmenten und kurzen Oligonucleotid-Linkern oder aus einer Reihe von Oligonucleotiden zusammengestellt werden, um ein synthetisches Gen zu erhalten, das in einer rekombinanten transkriptionalen Einheit exprimiert werden kann. Solche Sequenzen erhält man bevorzugt in der Form eines offenen Leserahmens, nicht unterbrochen von internen nicht- translatierten Sequenzen oder Introns, die in eukaryontischen Zellen typischerweise vorhanden sind. Genomische DNA, die die relevanten Sequenzen enthält, könnte ebenfalls verwendet werden. Sequenzen nicht-translatierter DNA können 5' oder 3' des offenen Leserahmens vorhanden sein, wo solche Sequenzen die Manipulation oder Expression der codierenden Regionen nicht beeinflussen. Daher bezieht sich der Ausdruck "rekombinantes" Polynucleotid oder "rekombinante" Nucleinsäure auf eines, das natürlicherweise nicht vorkommt, oder durch die künstliche Kombination zweier normalerweise getrennter Teilstücke einer Sequenz hergestellt wurde. Die künstliche Kombination wird häufig entweder durch chemische Synthese-Techniken oder durch die künstliche Manipulation isolierter Teilstücke von Nucleinsäuren, z. B. durch Verfähren der Gentechnik, erreicht. Auf diese Weise wird gewöhnlich verfahren, wenn ein Codon durch ein redundantes Codon ersetzt wird, das die gleiche oder eine konservative Aminosäure codiert, während typischerweise eine Sequenz- Erkennungsstelle eingefügt oder entfernt wird. Alternativ ist es üblich, Nucleinsäure-Teilstücke mit der gewünschten Funktion zusammenzufügen, um eine gewünschte Kombination von Funktionen zu erzeugen.
"Rekombinante Wirtszellen", "Wirtszellen", "Zellen", "Zelllinien", "Zellkulturen" und andere solche Ausdrücke, die Mikroorganismen oder höhere eukaryontische Zelllinien bezeichnen, die als unizelluläre Einheiten gezüchtet werden, beziehen sich auf Zellen, die als Empfänger für rekombinante Vektoren oder andere Transfer-Polynucleotide verwendet werden können oder verwendet wurden und umschliessen die Nachkommenschaft der ursprünglichen Zelle, die transfiziert worden ist. Es versteht sich, dass die Nachkommenschaft einer einzelnen Zelle in Morphologie oder genomischer oder Gesamt-DNA-Ausstattung aufgrund natürlicher, versehentlicher oder beabsichtigter Mutation nicht notwendigerweise vollständig identisch mit der Ursprungszelle sein muss.
Ein CTL ist "cytolytisch spezifisch für" Zellen, die Tumor- oder virale Antigene exprimieren, wenn der CTL in der Lage ist, die das Tumor- oder virale Antigen tragenden Zellen selektiv zu erkennen und zu lysieren. Ein CTL ist "cytolytisch reaktiv mit" Zellen, die Tumor- oder virale Antigene exprimieren, wenn der CTL in der Lage ist, die das Tumor- oder virale Antigen tragenden Zellen zu lysieren, ohne seine Fähigkeit zur selektiven Erkennung solcher Zellen in Betracht zu ziehen.
"Aktivierungsinduzierte Expression" bezieht sich auf eine Expression, die stattfindet, wenn die T-Zelle durch eines von einer Reihe der in der Fachwelt bekannten Verfahren stimuliert wird, einschliesslich, aber nicht darauf begrenzt, der Stimulation durch ein entsprechendes Antigen, der Stimulation durch Querverknüpfung des T-Zell-Rezeptors mit einem anti-CD3-Antikörper und der Stimulation mit chemischen Agenzien wie etwa einer Kombination aus Phorbol- Myristinsäure ("PMA") und Ionomycin.
"Antigen-induzierte Expression" oder "Antigen-spezifische Expression" bezieht sich auf eine Expression, die stattfindet, wenn die T-Zelle ihr entsprechendes Antigen erkennt.
"Entsprechendes Antigen" bezieht sich auf ein Antigen, ein Peptid, das, wenn es mit einem MHC-Molekül verbunden ist, einen Liganden bildet, der an einen ihn erkennenden Lymphocyten bindet und die Auslösung von Signalen für die Effektor-Funktion der Zelle und/oder für Proliferation verursacht.
Ein "aktivierter Lymphocyt" ist einer, der als Folge der Stimulation durch eines von einer Reihe der in der Fachwelt bekannten Verfahren, einschliesslich, aber nicht darauf begrenzt, der Stimulation durch ein entsprechendes Antigen, der Stimulation durch Querverknüpfung des T- Zell-Rezeptors mit einem anti-CD3-Antikörper und der Stimulation mit chemischen Agenzien wie etwa einer Kombination aus Phorbol-Myristinsäure ("PMA") und Ionomycin, Genprodukte exprimiert (einschliesslich zum Beispiel Cytokine), und zwar auf einem Niveau, das gegenüber einem Lympphocyten, der nicht auf diese Weise aktiviert wurde, erhöht ist.
Eine "transkriptionale Kontrollregion" (manchmal auch als "transkriptionale Regulierungsregion" bezeichnet) umfasst alle die für die Transkription notwendigen Elemente und kann Elemente umschliessen, die für die Regulation und zellspezifische Transkription notwendig sind. Eine transkriptionale Kontrollregion umschliesst daher mindestens die Promotor-Sequenz und kann auch andere Sequenzen zur Regulation wie etwa Enhancer und Bindungsstellen für den Transkriptionsfaktor umschliessen.
Eine "zu einer Codierungsregion heterologe transkriptionale Kontrollregion" ist eine, die in der Natur normalerweise nicht mit der Codierungsregion verbunden ist.
"Funktionen verbunden" bezieht sich auf eine Zusammenstellung, bei der die so beschriebenen Komponenten in einer Beziehung zueinander stehen, die es ihnen erlaubt, in der für sie vorgesehenen Weise zu funktionieren. Zum Beispiel ist ein Promotor funktionell mit einer Codierungssequenz verbunden, wenn der Promotor deren Transkription oder Expression beeinflusst.
"Regulierungssequenzen" beziehen sich auf jene Sequenzen, die normalerweise mit der Codierungsregion (zum Beispiel innerhalb von 50 kb) eines Genortes verbunden sind und die Expression des Gens beeinflussen (einschliesslich Transkription des Gens und Translation, Spleissen, Stabilität oder dergleichen der Messenger-RNA). Regulierungssequenzen umschliessen unter anderem Promotoren, Enhancer, Spleiss-Stellen und Polyadenylierungsstellen.
Der hierin verwendete Begriff "Individuum" bezieht sich auf Wirbeltiere, besonders Mitglieder von Säugerarten, und umschliesst, ist aber nicht auf diese begrenzt, Haustiere, Sporttiere und Primaten einschliesslich der Menschen.
Bei der Durchführung der vorliegenden Erfindung werden, soweit nicht anders erwähnt, konventionelle Techniken der Molekularbiologie, Mikrobiologie, DNA-Rekombination und Immunologie verwendet, die in der Fachwelt geläufig sind. Solche Techniken sind in der Literatur vollständig erklärt. Vgl. z. B. Sambrook, Fritsch and Maniatis, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL; zweite Auflage (1989), OLIGONUCLEOTIDE SYNTHESIS (M. J. Gait, Hrsg., 1984), ANIMAL CELL CULTURE (R. I. Freshney, Hrsg., 1987), die Serie METHODS IN ENZYMOLOGY (Academic Press, Inc.); GENE TRANSFER VECTORS FOR MAMMALIAN CELLS (J. M. Miller and M. P. Calos, Hrsg. 1987), HANDBOOK OF EXPERIMENTAL IMMUNOLOGY, (D. M. Weir and C. C. Blackwell, Hrsg.); CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, (F. M. Ausubel, R. Brent, R. E. Kingston, D. D. Moore, J. G. Siedman, J. A. Smith, and K. Struhl, Hrsg. 1987); und CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOOY (J. E. Coligan, A. M. Kruisbeek, D. H. Margulies, E. M. Shevach and W. Strober, Hrsg. 1991). Alle hierin erwähnten Patente, Patentanmeldungen und Veröffentlichungen, sowohl vorstehend als auch nachstehend, sind hiermit unter Bezugnahme eingeschlossen.
TH-unabhängige CTLs werden durch Insertion eines rekombinanten Polynucleotids, das mindestens einen funktionell mit einer heterologen Codierungssequenz verbundenen Stimulationsfaktor codiert, aus TH-abhängigen CTLs erzeugt. Der Stimulationsfaktor ist einer, der die Proliferation von CTLs, besonders Antigen aktivierter CTLs stimuliert oder verstärkt. In bevorzugten Ausführungsformen ist der Stimulationsfaktor ein Cytokin, einschliesslich zum Beispiel von Mitgliedern der Familie der Interleukine (ILs), Interferone (IFNs), TGF-β, Tumor-Nekrose-Faktoren (TNFs), Kolonie stimulierenden Faktoren (CSFs) und Wachstumsfaktoren (Gfs). Eine Reihe von Cytokin codierenden Faktoren sind bereits isoliert und sequenziell worden. (Vgl. Zum Beispiel Annual Reviews in Biochemistry 59: 783-836 (1990) für einen Überblick über Cytokine). In einer bevorzugten Anwendungsform sind die zu TH-Unabhängigkeit veränderten Zellen CD8+-Zellen, und der Stimulationsfaktor ist vorzugsweise IL-2. Verfahren zur Bestimmung der Wirkung von Stimulationsfaktoren auf die Proliferation von CTLs sind in der Fachwelt bekannt.
Die transkriptionale Kontrollregion, mit der die den Stimulationsfaktor codierende Region funktionell verbunden ist, ist eine, die regulierbar ist und in T-Zellen funktioniert, und bevorzugt in CD8+-CTLs. Vorzugsweise antwortet die transkriptionale Kontrollregion auf die Aktivierung des T-Lymphocyten, besonders der CD8+-CTLs, durch sein entsprechendes Antigen. Dadurch wird die Aktivierung der transkriptionalen Kontrollregion und die Expression des Stimulationsfaktor-Gens unter Bedingungen ausgelöst, wenn es wünschenswert ist, die Proliferation der aktivierten CTLs zu stimulieren.
Transkriptionale Kontrollregionen sind in der Fachwelt bekannt und umschliessen zum Beispiel aus folgenden Genen isolierte Regionen: das menschliche Cytomegalievirus (HCMV)- IE94 Gen (M. Boshart et al., (1985), Cell 41: 521-530); das menschliche IL-2-Gen (T. Fujita et al. (1986), Cell 46: 401-407); das menschliche IFN-γ-Gen (V. C. Ciccarone et al., (1990), J. Immunol. 144: 725-730); das menschliche IL-3-Gen (S. G. Shoemaker et al., (1990), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 9650-9654); das menschliche IL-4-Gen (N. Arai et al., (1989), J. Immunol. 142: 274-282); das menschliche Lymphotoxin-Gen (G. E. Nedwin, S. L. Nayior, A. Y. Sakaguchi, D. Smith. J. Jarrett-Nedwin, D. Pennica. D. V. Goeddel, and P. W. Gray (1985), Nucl. Acids. Res. 13: 6361-63 73); das Gen des menschlichen Granulocyten-Makrophagen-CSF (GM-CSF) (S. Miyatake et al., (1985), EMBO J. 4: 2561-2568); das Gen für menschliches Perforin (M. G. Lictenheld et al. (1989), J. Immununol. 143: 4267-4274); das Gen für menschliches 519 (W. C. Manning et al., (1992), J. Immunol. 148: 4036-4042); das Gen für menschliches Granzym B (CTLA-1) (P. Haddad et al., (1990), Gene 87: 265-271); das Gen für menschlichen CTLA-4 (K. Harper et al. (1991), J. Immunol. 147: 1397-1044); das Gen für menschliches CGL-2 (J. W. Heusel et al. (1991), J. Biol. Chem. 266: 6152-6158); das Gen für menschliches Granzym-H (P. Haddad et al. (1990), Int. Immunol. 3: 57-66); das Gen für menschlichen IL-2 Rezeptor, α-Kette (S. L. Cross et al. (1987). Cell 49: 47-56); das T-Zell- Aktivierungs-3 (TCA-3)-Gen von murinen Lebewesen (S. D. Willson et al. (1988). J. Immunol. 141: 1563-1570); das CD69-Gen von murinen Lebewesen (F. Ziegler et al. (1994), J. Immunol. 152: 1228-1236); und das menschliche CD69-Gen.
Unter den transkriptionalen Kontrollregionen stammen die, die besonders aktiv in aktivierten CD4+-Helfer-T-Zellen (TH-Zellen) sind, von den IL-2- und IL-4-Genen. Jene, die besonders aktiv in aktivierten CD8+-CTLs sind, sind von den folgenden Genen: Lymphotoxin, Perforin, 519, Granzym H, CTLA-1 und CGL-2. Von besonderem Interesse sind jene, die sowohl in aktivierten CD4+-TH-Zellen als auch in CD8+-CTLs aktiv sind; sie umschliessen unter anderen transkriptionale Kontrollregionen von den folgenden Genen: IFN-γ, IL-3, GM-CSF, CTLA-4, die IL-2-Rezeptor-α-Kette, TCA-3 und CD69.
In einigen Ausführungsformen der Erfindung sind die transkriptionalen Kontrollregionen Hybride. Zum Beispiel können Enhancer-Regionen (z. B. von der transkriptionalen HCMV-IE- Kontrollregion und/oder von der frühen transkriptionalen SV40-Kontrollregion) stromaufwärts oder stromabwärts von den transkriptionalen Kontrollregionen oder in diese hinein inseriert werden. Alternativ oder zusätzlich können multimere Transkriptionsfaktor-Bindungsstellen (z. B. NF-AT und/oder NF-KB) stromaufwärts oder stromabwärts von den transkriptionalen Kontrollregionen oder in diese hinein inseriert werden (vgl. z. B. C. L. Verweijj et al., (1990), J. Biol. Chem. 265: 15788-15795 (NF-AT beschreibend); und K. Briegel et al., (1991) Nucl. Acids Res. 19: 5929-5936 (NF-KB beschreibend). Die stromaufwärts gelegene Region einer transkriptionalen Kontrollregion kann auch mit der benachbarten Region einer anderen kombiniert werden.
Es ist zu erwarten, dass Überexpression eines Stimulationsfaktors (zum Beispiel eines Lymphokins oder eines Cytokins) oder Einbringen einer grossen Menge Antigen-spezifischer CTLs für das behandelte Individuum toxisch sein kann. Es ist daher im Rahmen der Erfindung, Gensegmente einzuschliessen, die die T-Zell-Clone der Erfindung veranlassen, in vivo für eine negative Selektion empfänglich zu sein. Mit "negativer Selektion" ist gemeint, dass die eingebrachte Zelle als eine Folge auf einen Wechsel in den in vivo-Bedingungen des Individuums entfernt werden kann. Der negative selektierbare Phänotyp kann von der Insertion eines Gens stammen, das Sensitivität auf ein verabreichtes Agens, zum Beispiel eine Verbindung, überträgt. Negative selektierbare Gene (auch als "negative selektierbare Marker" oder "Suizid-Gene" bezeichnet, sind in der Fachwelt bekannt und umschliessen neben anderen die Folgenden: das Herpes simplex- Virus-Typ I-Thymidin-Kinase (HSV-I TK)-Gen (Wigler et al., Cell 11: 223, 1977), das Gancidovir-Sensitivität überträgt; das zelluläre Hypoxanthin- Phosphoribosyltransferase (HPRT)-Gen, das zelluläre Adenin-Phosphoribosyltransferase (APRT)-Gen und bakterielle Cytosm-Desaminase (Mullen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 33 (1992)).
Zusätzlich ist es sinnvoll, in die T-Zellen einen positiven Marker einzuschliessen, der die Selektion von Zellen des negativen selektierbaren Phänotyps in vitro möglich macht. Der positive selektierbare Marker kann ein Gen sein, das, nachdem es in die Wirtszelle eingeführt wurde, einen dominanten Phänotyp exprimiert, der eine positive Selektion von Zellen, die dieses Gen tragen, erlaubt. Gene dieses Typs sind in der Fachwelt bekannt und umschliessen neben anderen das Hygromycin-B-Phosphotransferase-Gen (hph), das Resistenz gegen Hygromycin-B überträgt, das Aminoglycosid-Phosphotransferase-Gen (neo oder aph) von TH5, das die Resistenz gegen das antibiotische G418 codiert, das Dehydrofolat-Reduktase (DHFR)-Gen, das Adenosin-Deaminase-Gen (ADA), und das Multidrug-Resistenz (MDR)- Gen.
Bevorzugt sind der positive selektierbare Marker und das negative selektierbare Element in solcher Weise verbunden, dass Gewinn oder Verlust des negativen selektierbaren Elementes notwendigerweise auch von dem Gewinn oder Verlust des positiven selektierbaren Markers begleitet wird. Sogar noch mehr bevorzugt sind die positiven und negativen selektierbaren Marker so miteinander vereinigt, dass Gewinn oder Verlust des einen obligatorisch zum Gewinn oder Verlust des anderen führt. Ein Beispiel für ein vereinigtes Polynucleotid, das als ein Expressionsprodukt ein Polypeptid ergibt, das die beiden gewünschten positiven und negativen vorstehend beschriebenen Selektionsmerkmale überträgt, ist ein Hygromycin- Phosphotransferase-Thymidin-Kinase-Fusionsgen (HyTK). Expression dieses Gens ergibt ein Polypeptid, das Hygromycin-B-Resistenz für die positive Selektion in vitro und Sensitivität auf Ganciciovir für die negative Selektion in vivo vermittelt. Vgl. Lupton S. D., et al., Mol. and Cell. Biology 11: 3374-3378, 1991. Vgl. ebenfalls die Beschreibung von Bifunktional Selectable Fusion Genes von Lupton, S. D., WO 92/08796 (Internationales Datum der Veröffentlichung 29. Mai 1992)
Techniken zur Nucleinsäure-Manipulation sind allgemein beschrieben, zum Beispiel bei Sambrook et al., (1989), vorstehend, Ausubel et al., (1987), vorstehend und in Annual Reviews of Biochemistry (1992) 61: 131-156. Nützliche Reagenzien für die Anwendung solcher Techniken wie etwa Restriktionsenzyme und dergleichen sind in der Fachwelt sehr gut bekannt und von einer Reihe von Händlern zu beziehen.
Grosse Mengen der Polynucleotide, die verwendet wurden, um die Zellen der vorliegenden Erfindung zu erzeugen, können durch Replikation in einer geeigneten Wirtszelle produziert werden. Die natürlichen oder synthetischen Polynucleotid-Teilstücke, die ein gewünschtes Teilstück codieren, können in rekombinante Nucleinsäure-Konstruktionen, typischerweise Polynucleotid-Konstruktionen, eingefügt werden, die zur Einführung in eine und zur Replikation innerhalb einer prokaryontischen oder eukaryontischen Zelle geeignet sind. Gewöhnlich eignen sich die Konstruktionen zur Replikation in einem unizellulären Wirt wie etwa Hefe oder Bakterien, können aber ebenso für die Einschleusung in gezüchtete Säuger- oder Pflanzen- oder andere eukaryontische Zelllinien mit oder ohne Integration in das Genom gedacht sein. Die Reinigung von Nucleinsäuren, die mit den Verfahren der vorliegenden Erfindung hergestellt wurden, sind z. B. bei Sambrook et al. (1989) beschrieben.
Die in der vorliegenden Erfindung verwendeten Polynucleotide können auch zum Teil oder vollständig durch chemische Synthese, z. B. mit dem Phosphoramidit-Verfähren, in Beaucage and Carruthers (1981) Tetra. Letts. 22: 1859-1862 beschrieben, oder mit dem Triester- Verfahren nach Matteucci et al., (1981) J. Am. Chem. Soc. 103: 3185 hergestellt werden, und sie können mit kommerziellen automatischen Oligonucleotid-Synthesegeräten gebildet werden. Ein doppelsträngiges Teilstück kann aus dem einzelsträngigen Produkt der chemischen Synthese entweder durch Synthese des komplementären Stranges und Aneinanderlagerung der Stränge unter geeigneten Bedingungen gebildet werden oder durch Hinzufügen des komplementären Stanges mit Hilfe von DNA-Polymerase mit einer geeigneten Primer- Sequenz.
Polynucleotid-Konstruktionen, die für die Einschleusung in eine prokaryontische oder eukaryontische Wirtszelle zur Replikation hergestellt werden, enthalten typischerweise ein Replikationssystem, das die Wirtszelle erkennt, einschliesslich des interessierenden rekombinanten Polynucleotid-Teilstückes, das das gewünschte Polypeptid codiert. Solche Vektoren können mit rekombinanten Standardtechniken, die in der Fachwelt gut bekannt sind, hergestellt werden, die zum Beispiel bei Sambrook et al., (1989) oder Ausubel et al., (1987) diskutiert werden.
Vorzugsweise wird die Polynucleotid-Konstruktion während der Clonierungsphase einen selektierbaren Marker enthalten, ein Gen, das ein für das Überleben oder das Wachstum der mit dem Vektor transformierten Wirtszelle notwendiges Protein codiert. Die Anwesenheit dieses Gens stellt sicher, dass nur solche Wirtszellen wachsen, die die Insertionen exprimieren. Typische Selektionsgene codieren Proteine, die (a) Resistenzen gegen Antibiotika oder andere toxische Substanzen übertragen, z. B. Ampicillin, Neomycin, Methotrexat etc.; (b) auxotrophische Mängel ergänzen oder (c) kritische Nährstoffe liefern, die aus den komplexen Medien nicht verfügbar sind, z. B. das Gen, das die D-Alanin Racemase für Bacilli codiert. Die Wahl des geeigneten selektierbaren Markers hängt von der Wirtszelle ab, und geeignete Marker für unterschiedliche Wirte sind in der Fachwelt gut bekannt.
Die Polynucleotide, die TH-Unabhängigkeit auf CTLs übertragen, können in den gewünschten Typ der Ag-spezifischen T-Zelle durch in der Fachwelt bekannte Verfahren eingeschleust werden, z. B. Transformation, Elektroporation, Lipofektion und Transduktion, einschliesslich der Verwendung von Adeno-assoziierten viralen (AAV) Vektoren und besonders durch die Verwendung von den in der Fachwelt bekannten Verfahren des retroviralen Gentransfers.
Es sind verschiedene Infektionstechniken entwickelt worden, die rekombinante, infektiöse Virusteile zur Genübertragung benutzen. Dies stellt ein bevorzugtes Verfahren für die vorliegende Erfindung dar. Die viralen Vektoren, die in dieser Weise verwendet wurden, umschliessen Virus-Vektoren, die vom Affen-Virus 40 (SV40; Karlsson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 82: 158, 1985), von Adenoviren (Karlsson et al., EMBO J. 5: 2377, 1986), vom Adeno-assoziierten Virus (AAV) (B. J. Carter, Current Opinion in Biotechnology, 1992, 3: 533-539) und von Retroviren (Coffin, 1985, S. 17-71 in Weiss et al., (Hrsg.), RNA Tumor Viruses, 2. Aufl., Bd. 2, Cold Spring Harbor Laboratory, New York) stammen. So sind die Verfahren für Gentransfer und Expression zahlreich, funktionieren aber im wesentlichen bei der Einführung und Expression von genetischem Material in Säugerzellen. Mehrere der vorstehenden Techniken sind verwendet worden, um hämopoietische oder lymphoide Zellen zu transduzieren, einschliesslich der Calciumphosphat-Transfektion (Hermann et al., vorstehend, 1984), Protoplastenfusion (Deans et al., vorstehend, 1984), Elektroporation (Cann et al., Oncogene 3: 123, 1988) und Infektion mit rekombimantem Adenovirus (Karlsson et al., vorstehend. Reuther et al., Mol. Cell. Biol. 6: 123, 1986), Adeno-assoziiertem Virus (LaFace et al., vorstehend) und Retrovirus-Vektoren (Overell et al., Oncogene 4: 1425, 1989). Primäre T- Lymphocyten sind erfolgreich durch Elektroporation (Cann et al., vorstehend, 1988) und durch retrovirale Infektion (Nishihara et al.. Cancer Res. 48: 4730, 1988; Kasid et al., vorstehend, 1990) transduziert worden.
Retrovirale Vektoren stellen ein hoch wirksames Verfähren zum Gentransfer in eukaryontische Zellen dar und sind das bevorzugte Verfähren für die Einbringung der Polynucleotide der Erfindung in die TH-abhängigen CTLs. Darüber hinaus findet die retrovirale Integration in einer kontrollierten Weise statt und hat die stabile Integration von einer oder mehreren Kopien der neuen genetischen Information pro Zelle zum Ergebnis.
Retroviren sind eine Klasse von Viren, die sich replizieren, indem sie eine Virus codierte, RNA gerichtete DNA-Poymerase oder reverse Transkriptase zur Replikation eines viralen RNA- Genoms verwenden, um ein doppelsträngigens DNA-Zwischenprodukt zu erhalten, das in die chromosomale DNA einer Vogel- oder Säuger-Wirtszelle eingefügt wird. Die meisten retroviralen Vektoren stammen von murinen Retroviren. Retroviren, die für die Verwendung im Einklang mit der vorliegenden Erfindung angepasst werden können, können jedoch von jeder Quelle von Vogel- oder Säugerzellen stammen. Diese Retroviren sind vorzugsweise amphotrop, das heisst, dass sie zur Infektion von Wirtszellen mehrerer Arten in der Lage sind, einschliesslich des Menschen. Ein charakteristisches Kennzeichen retroviraler Genome (und retroviraler Vektoren, die, wie hierin beschrieben, verwendet werden) ist die retrovirale lange terminale Wiederholungssequenz oder LTR, die eine nicht translatierte Region aus etwa 600 Basenpaaren ist und in leicht variierenden Formen an den 5'- und 3'- Enden des retroviralen Genoms gefunden wird. Wenn sie als ein Provirus in die DNA eingeschleust wird, umschliesst die retrovirale LTR eine kurze direkte Wiederholungssequenz an jedem Ende und signalisiert den Beginn der Transkription durch RNA-Polymerase II und die 3'-Spaltung und Polyadenylierung der RNA-Transkriptionen. Die LTR enthält alle anderen cis-agierenden Sequenzen, die für die virale Replikation notwendig sind.
Ein "Provirus" bezeichnet ein reverses DNA-Transkript eines Retrovirus, das stabil in die chromosomale DNA in einer geeigneten Wirtszelle integriert ist, oder eine clonierte Kopie davon oder eine clonierte Kopie von nicht integrierten Zwischenprodukten von retroviraler DNA. Fortlaufende Transkription des Provirus und Zusammenbau zu dem infektiösen Virus findet unter Anwesenheit eines geeigneten Helfer-Virus oder in einer Zelllinie statt, die geeignete Sequenzen enthält, die Einkapselung ohne die gleichzeitige Produktion eines kontaminierenden Helfer-Virus ermöglichen. Mann et al., (Cell 33: 153, 1983) beschreiben die Entwicklung von Zelllinien (z. B. ψ 2), die verwendet werden können. Helfervirus-freie Stämme rekombinanter Retroviren herzustellen. Diese Zelllinien enthalten integrierte retrovirale Genome, denen für die Einkapselung in eis benötigte Sequenzen fehlen, die aber alle nötigen Genprodukte in trans bereitstellen, um intakte Virione herzustellen. Die von dem integrierten mutierten Provirus transkribierte RNA kann nicht selbst verpackt werden, aber diese Zellen können RNA einkapseln, die von einem rekombinanten Retrovirus, das in die gleiche Zelle eingeschleust wurde, transkribiert wurde. Die erhaltenen Viruspartikel sind infektiös aber replikationsdefekt, was sie zu nützlichen Vektoren macht, die nicht in der Lage sind, nach Einschleusung in eine Zelle, der die komplementäre genetische Information zur Einkapselung fehlt, ein infektiöses Virus herzustellen. Einkapselung in einer Zelllinie, die transagierende Elemente beherbergt, die eine Ökotrope virale Hülle codieren (z. B. ψ 2), liefert eine ökotrope (begrenzter Bereich von Wirten) Virus-Nachkommenschaft. Alternativ liefert der Zusammenbau in einer Zelllinie, die amphotrope Verpackungsgene enthält (z. B. PA317, ATCC CRL 9078; Miller and Buttimore, Mol. Cell. Biol. 6: 2895, 1986), eine amphotrope (breiter Bereich von Wirten) Virus-Nachkommenschaft. Solche verpackenden Zelllinien liefern die notwendigen retroviralen Gag-, Pol- und Env-Proteine in trans. Diese Strategie führt zu der Produktion von retroviralen Partikeln, die für Säugerzellen hoch infektiös sind, wobei sie zu weiterer Replikation nicht in der Lage sind, nachdem sie in das Genom der Zielzelle integriert wurden. Das Produkt des env-Gens ist für die Bindung des Retrovirus an virale Rezeptoren an der Oberfläche der Zielzelle verantwortlich und bestimmt daher den Bereich der Wirte des Retrovirus. Die PA317-Zellen produzieren retrovirale Partikel mit einem amphotropen Hüllprotein das in Zellen des Menschen und von anderen Arten eindringen kann. Andere verpackende Zelllinien produzieren Partikel mit ökotropen Hüllproteinen, die nur in Zellen von Mäusen oder Ratten transduziert werden können.
Zahlreiche retrovirale Vektor-Konstruktionen sind erfolgreich eingesetzt worden, um viele fremde Gene zu exprimieren. (vgl. z. B. Coffin, in Weiss et al., (Hrsg.), RNA Tumor Viruses, 2. Aufl., Bd. 2 (Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1985, S. 17-71). Retrovirale Vektoren mit inserierten Sequenzen sind im allgemeinen funktional, und einige Sequenzen, die stets inhibitorisch für die retrovirale Infektion sind, sind identifiziert worden. Funktionale Polyadenylierungs-Motive verhindern die retrovirale Replikation durch Blockierung der retroviralen RNA-Synthese, und es gibt eine obere Grenze für die Grosse der Sequenz bei annähernd 11 kb, die in retrovirale Partikel verpackt werden kann (Coffin, vorstehend, 1985); es stellte sich jedoch heraus, dass die Anwesenheit von multiplen internen Promotoren, die man zunächst als problematisch ansah (Coffin, vorstehend, 1985), in mehreren viralen Konstruktionen gut toleriert wurde (Overell et al., Mol. Cell. Biol. 8: 1803, 1983).
Retrovirale Vektoren sind von mehreren Gruppen als genetische Marker verwendet worden, um die Entwicklung von murinen hämatopoietischen Stammzellen zu verfolgen, die in vitro mit Retrovirus-Vektoren transduziert und in Empfänger-Mäuse transplantiert worden waren (Williams et al.. Nature 310: 476, 1984; Dick et al.. Cell 42: 71, 1985; Keller et al., Nature 318: 149, 1985). Diese Studien haben gezeigt, dass die infizierten hämatopoietischen Zellen das hämatopoietische und lymphatische Gewebe des Empfänger-Tieres wieder herstellen und dass die Zellen in vivo ein normales Entwicklungspotential zeigen. Die markierten Zellen können mit einer Reihe von molekularbiologischen Techniken sichtbar gemacht werden, wodurch die Anwesenheit der retroviralen Vektorsequenzen gezeigt werden kann, besonders zu erwähnen die Southern Analyse und PCR (Polymerase-Kettenreaktion). Die Fähigkeit, Zellen genetisch durch die Verwendung von retroviralen Vektoren zu markieren, ist auch im klinischen Umfeld nützlich, in denen die Technik verwendet werden kann, Transplantate autologer Zellen zu verfolgen. Dieser Ansatz ist bereits verwendet worden, um TILs (Tumor infiltrierende Lymphocyten) in Patienten zu verfolgen, die eine TIL-Therapie zur abschliessenden Krebsbehandlung erhalten hatten, Rosenberg et al., (N. Engl. J. Med. 323: 570, 1990). Die Transduktion dieser Zellen mit dem Marker-Gen war nicht mit einer zellulären Dysfunktion in vitro verbunden (Kasid et al., Proc. Natl. Acad, Sci. USA 87: 473, 1990).
Viele Genprodukte sind in retroviralen Vektoren exprimiert worden. Dies kann entweder erreicht werden, indem die zu exprimierenden Sequenzen unter die transkriptionale Kontrolle des Promotors, der in die retrovirale LTR eingegliedert ist, gestellt werden oder indem sie unter die Kontrolle eines heterologen Promotors, der zwischen die LTRs inseriert ist, gestellt werden. Die letztere Strategie liefert einen Weg der Co-Expression eines dominanten selektierbaren Marker-Gens in dem Vektor, wodurch die Selektion von Zellen ermöglicht wird, die spezifische Vektorsequenzen exprimieren.
Die Lymphocyten-Clone der Erfindung, z. B. jene, die von einer geringeren Abhängigkeit von einem oder mehreren von den TH-Zellen produzierten Stimulationsfaktoren sind, können verwendet werden, um Immunität auf Individuen zu übertragen. Mit "Immunität" ist eine Besserung einer oder mehrerer physischer Symptome, die mit einer Antwort auf die Infektion durch das Pathogen verbunden sind, und/oder von Symptomen gemeint, die mit einer Malignität verbunden sind, auf die die T-Zelle gerichtet ist. Die Menge der verabreichten Zellen liegt normalerweise in dem Bereich, der in normalen Individuen mit Immunität gegen das Pathogen und/oder den Tumor vorhanden ist. Daher werden CD8+- CD4--Zellen normalerweise per Infusion verabreicht, wobei jede Infusion im Bereich von mindestens 10&sup6; bis 10¹&sup0; Zellen/m², bevorzugt im Bereich von mindestens 10&sup7; bis 10&sup9; Zellen/m² liegt. Die Clone können durch eine einzelne Infusion verabreicht werden oder durch mehrere Infusionen über einen bestimmten Zeitbereich. Da jedoch zu erwarten ist, dass unterschiedliche Individuen sich in ihrer Immunantwort unterscheiden, müssen der Typ und die Menge der per Infusion verabreichten Zellen wie auch die Anzahl der Infusionen und der Zeitbereich, über den mehrere Infusionen gegeben werden, vom behandelnden Arzt oder Tierarzt bestimmt werden und können durch Routine-Untersuchungen bestimmt werden.
Die folgenden Veröffentlichungen, auf die in den Beispielen 10-27 Bezug genommen wird, sind hiermit in ihrer Gesamtheit durch Bezugnahme eingeschlossen:
J. M. Allen, K. A. Forbush and R. M. Perlmutter (1992) Functional dissection of the lck proximal promoter. Mol. Cell. Biol. 12: 2758-2768.
N. Arai, D. Nomura, D. Villaret, R. DeWaal Malefijt, M. Seiki, M. Yoshida, S. Minoshima. R. Fukuyama, M. Maekawa, J. Kudoh, N. Shimuzu. K. Yokata, E. Abe, T. Yokata, Y. Takebe, and K. Arai (1989) Complete nucleotide sequence of the chromosomal gene for human IL-4 and its expression. J. Immunol. 142: 274-282.
F. M. Ausubel, R. Brent, R. E. Kingston. D. D. Moore, J. G. Siedman, J. A. Smith. And K. Struhl Hrsg. (1987) Current protocols in molecular biology. Wiley, New York.
M. Boshart, F. Weber, G. Jahn, K. Dorsch-Häsler, B. Fleckenstein, and W. Schaffner (1985) A very strong enhancer is located upstream of an immediate early gene of human cytomegalovirus. Cell 41: 521-530.
V. C. Ciccarone, J. Chrivia, K. J. Hardy, and H. A. Young (1990) Identification of enhancer-like elements in human IFN-γ genomic DNA. J. Immunol. 144: 725-730.
S. L. Cross. M. B. Feinberg, J. V. Wolf. N. J. Holbrook. F. Wong-Staal and W. J. Leonard (1987) Regulation of the human interleukin-2 receptor α chain promoter: Activation of a nonfunctional promoter by the tansactivator gene of HTLV-1. Cell 49: 47-56.
P. W. Gray and D. V. Goeddel (1982) Structure of the human immune interferon gene. Nature 298: 859-863.
J. W. Heusel. R. D. Hanson, G. A. Silverman and T J. Ley (1991) Structure and expression of a cluster of human hematopoietic serine protease genes found in chromosome 14q11.2. J. Biol. Chem. 266: 6152-6158.
S. D. Lupton, L. L. Brunton, V. A. Kalberg and R. W. Overell (1991) Dominant positive and negative selection using a hygromycin phosphotansferase-Thymidine kinase fusion gene. Mol. Cell. Biol. 11: 3374-3378.
R. Mann, R. C. Mulligan and D. Baltimore (1983) Construction of a retrovirus packaging mutant and its use to produce helper-free retrovirus. Cell 33: 153-159.
A. D. Miller and C. Buttimore (1986) Redesign of retrovirus packaging cell lines to avoid recombination leading to helper virus production. Mol. Cell. Biol. 6: 2895-2902.
G. E. Nedwin. S. L. Naylor, A. Y. Sakaguchi, D. Smith, J. Jarrett-Nedwin, D. Pennica, D. V. Goeddel. and P. W. Gray (1985) Human lymphotoxin and tumor necrosis factor genes: Structure, homology and chromosomal localization. Nucl. Acids Res. 17: 6361-6373.
S. R. Riddell and P. D. Greenberg (1990) The use of anti-CD3 and anti-CD28 monoclonal antibodies to clone and expand human antigen-specific T cells. J. Immunol. Methods 128: 189-201.
S. R. Riddell, M. Rabin, A. P. Geballe, W. J. Britt, and P. D. Greenberg (1991) Class I MHCrestricted cytotoxic T lymphocyte recognition of cells infected with human cytomegalovirus does not endogenous viral gene expression. J. Immunol. 146: 2795-2804.
S. G. Shoemaker, R. Hromas, and K. Kaushansky (1990) Transkriptional regulation of interleukin 3 gene expression in T lymphocytes. Proc. Natl. Acad, Sci. USA 87: 9650-9654.
Die nachstehend angeführten Beispiele sollen eine weitere Hilfe für den Praktiker mit durchschnittlichem Fachwissen darstellen und sind nicht angeführt, um die Erfindung in irgendeiner Weise zu begrenzen

Beispiel 1

Präparation von CMV-spezifischen CD3+, CD8+, CD4--T-Zell-Clonen

Die Zellen wurden im Wesentlichen, wie in S. R. Riddell, M. Rabin, A. P. Geballe, W. J. Britt, and P. D. Greenberg J. Immunol. 146: 2795 (1991) beschrieben, hergestellt. Genauer wurden für die Isolation von CMV-spezifischen CD3+, CD8+, CD4-T-Zell-Clonen autologe Fibroblasten mit dem CMV-Stamm AD 169 über 6 Stunden infiziert und dann für 7 Tage mit autologem PBL in RPMI 1640-Medium (JRH Biosciences), ergänzt mit 25 mM HEPES, 11% menschlichem, CMV-seronegativem AB-Serum, 4 mM L-Glutamin und 25 uM 2-ME gezüchtet. Die Kulturen wurden mit autologen, CMV infizierten Fibroblasten und gammabestrahltem (3300 rad) PBL als Nährzellen erneut stimuliert und 2 Tage später mit 2-5 U/ml IL-2 versetzt. Sieben Tage nach der erneuten Stimulation wurden die CD8+-T-Zellen angereichert und auf Kulturträger mit 96 runden Vertiefungen zu 0,3-0,8 Zellen/Vertiefung mit autologen gamma-bestrahlten Nährzellen, autologen CMV infizierten Fibroblasten und 50 U/ml IL-2 plattiert. Vertiefungen mit positivem Wachstum sind nach 10-14 Tagen zu erkennen. Clone, die Klasse I-MHC-begrenzte, CMV-spezifische, cytolytische Reaktivität zeigen, werden mittels indirekter Immunfluoreszenz als CD3+, CD8+ und CD4- bestimmt. Diese Clone werden auf Kulturträger mit 12 Vertiefungen oder in 75 cm²-Gewebe-Kulturflaschen durch eine alle 7-10 Tage durchgeführte erneute Stimulation mit autologen, CMV infizierten Fibroblasten und gamma-bestrahlten Nährzellen und Zugabe von 25-75 U/ml IL-2 2 und 4 Tage nach der erneuten Stimulation zu grossen Mengen herangezogen.

Beispiel 2

Erzeugung von HIV-gag-spezifischen CD8+-T-Zell-Clonen

Periphere mononucleäre Blutzellen (PBL) werden von einem HIV-seropositiven Empfänger von Knochenmarkstransplantat durch Venipunktur eines Volumens von 60 cc und anschliessender Ficoll Hypaque Dichtegradienten-Zentrifugation gewonnen. Die PBL werden zweimal in steriler Phosphat gepufferter Kochsalzlösung gewaschen, in Kulturmedium, bestehend aus RPMI 1640-Medium, 25 mM Hepes und 4 mM L-Glutamin, suspendiert und dann zur Trennung in adhärente und nicht adhärente Populationen in sterile Gewebe- Kulturschalen übertragen und über 2 Stunden bei 37ºC gezüchtet. Die adhärenten Zellen werden mit einem rekombinanten Vaccinia-HIV-gag- Virus (vac/gag), und zwar mit einer Infektionsmultiplizität von 5, in RPMI 1640-Medium, 25 mM Hepes, 10% menschlichem AB- Serum und 4 mM L-Glutamin infiziert. Nach einer 12- bis 14-stündigen Inkubation werden die vac/gag infizierten, adhärenten Zellen unter einer keimtötenden Lampe UV-bestrahlt, um Vaccinia zu inaktivieren, und dann gamma-bestrahlt (3300 rad), bevor sie als Stimulatoren verwendet wurden. Die separierten nicht adhärenten Zellen werden über Nacht bei 37ºC in RPMI 1640-Medium, 25 mM Hepes, 10% menschlichem AB-Serum und 4 mM L-Glutamin gezüchtet und zu den UV-inaktivierten, gamma-bestrahlten, vac/gag infizierten, adhärenten Zellen in einem Antwort-Zell zu Stimulator-Verhältnis von 30 zu 1 dazu gegeben. Die Kulturen werden bei 37ºC in 5,5% CO&sub2; in einem Forma Stericult-Inkubator inkubiert.
Sieben Tage später werden die Kulturen mit Spender-stämmigen, UV-inaktivierten, gammabestrahlten, vac/gag infizierten, adhärenten Zellen erneut stimuliert und mit gamma-bestrahlten (3300 rad) Spender-PBL als Nährzellen ergänzt. Die Kulturen werden 48 bis 96 Stunden nach der erneuten Stimulation mit rekombinantem IL-2 (2-5 U/ml) gefüttert und nach der Stimulation für sieben Tage gezüchtet.
Diese Zelllinien werden in einem Chrom-Freisetzungstest auf ihre lytische Aktivität gegenüber Spender-stämmigen und nicht zum HLA-Typ passenden vac/gag-, vac- und scheininfizierten Fibroblasten vor der T-Zell-Clonierung untersucht, um die Anwesenheit von Klasse I-MHC- begrenzter gag-spezifischer, cytolytischer Aktivität zu bestätigen.
Um HIV-gag-spezifische CD8+-Tc zu clonieren, werden die Zelllinien von CD4+-T-Zellen mit Hilfe des monoclonalen Antikörpers OKT4 (Ortho) plus Kaninchen-Komplement befreit, und die angereicherten CD8+-T-Zellen werden in begrenzender Verdünnung auf Kulturträger mit 96 Vertiefungen mit rundem Boden plattiert. Jede Vertiefung erhält 1,5 · 10³ UV-inaktivierte und gamma-bestrahlte vac/gag-infizierte, Spender-stämmige, adhärente Zellen oder EBV-LCL als Stimulatoren, 5 · 10&sup4; gamma-bestrahlte (3000 rad) Spender-stämmige PBL und 1 · 10&sup4; gamma-bestrahlte (8000 rad) Spender-stämmige LCL als Nährzellen in 0,2 ml Kulturmedium, das 25 bis 50 Einheiten IL-2 pro ml enthält.
Vertiefungen mit positivem Wachstum werden 10 bis 14 Tage nach der Plattierung identifiziert und in einer Mikrocytotoxizitätsuntersuchung durchmustert, um jene Clone mit Klasse I-MHC begrenzter cytolytischer Aktivität für HIV-gog-exprimierende Zielzellen herauszufinden. Positive Clone werden auf Kulturträger mit 24 Vertiefungen übertragen und mit UVinaktivierten und gamma-bestrahlten mc/gag-infizierten LCL erneut stimuliert, wobei bestrahlte Spender-stämmige PBL als Nährzellen zugegeben werden. Die Kulturen werden 48 bis 96 Stunden nach der erneuten Stimulation mit IL-2, 50 U/ml, gefüttert. T-Zell-Clone werden alle sieben Tage erneut stimuliert und auf Kulturträger mit sechs Vertiefungen und in 75 cm²-Flaschen zur Vermehrung übertragen. Alle Clone werden auf Klasse I-MHC begrenzte gag-spezifische cytolytische Aktivität und den Zelloberflächen-Phänotyp (CD3, CD4, CD8 und CD 16) erneut überprüft. T-Zell-Clone, die schnelles in vitro-Wachstum Klasse I-MHC begrenzte gag-spezifische cytolytische Aktivität und einen CD3+, CD8+, CD4-, CD16- - Phänotyp zeigen, werden ausgesucht, um sie mit dem HyTK-Retrovirus zu infizieren, der ein Stimulationsfaktor-Gen unter der Kontrolle einer Antigen regulierten transkriptionalen Kontrollregion enthält.

Beispiel 3

Transduktion von menschlichen HIV-gag-spezifischen CD8+-T-Clonen mit retroviralen Vektoren und deren Selektion

HIV-gag-spezifische CD8+-Tc-Clone, die, wie vorstehend beschrieben, hergestellt wurden, werden mit UV-inaktivierten und gamma-bestrahlten vac/gag-infizierten LCL stimuliert. 24 Stunden später werden 50 U/ml IL-2 zugegeben, um die Prolieferation der T-Zellen zu induzieren. 24 Stunden später v/erden die Zellen geerntet, pelletiert und zu 1 · 10&sup6; Zellen in 1 ml RPMI 1640-Medium, 25 mM Hepes, 10% menschlichem AB-Serum und 4 mM L- Glutamin mit 100 U/ml IL-2 suspendiert. Ein ml des retroviralen Überstandes wird mit Polybrene (5 ug/ml) zugegeben, und die Zellen werden für 48 Stunden bei 37ºC in 5,5% CO&sub2; inkubiert. Die T-Zell-Clone werden dann pelletiert und in frischem Medium mit 25 U/ml IL-2 resuspendiert. Nach einer viertägigen Inkubation werden die T-Zellen durch begrenzende Verdünnung auf Kulturträger mit 96 Vertiefungen mit runden Böden subcloniert. Jetzt wird monoclonaler anti-CD3-Antikörper in den Clonierungskulturen verwendet, um das T-Zell- Wachstum zu stimulieren, wobei im Wesentlichen die in Riddell, SR and Greenberg PD, J. Immunol. Methods 128: 189 (1990) beschriebenen Verfähren angewendet werden. Bestrahlte Spender-stämmige PBL (5 · 10&sup4;/Vertiefung) und LCL (1 · 10&sup4;/Vertiefung) werden als Nährzellen verwendet, und alle Vertiefungen erhalten 50 U/ml rekombinantes IL-2. Am siebten Tag werden alle Vertiefungen mit Hygromycin B bis zu einer endgültigen Konzentration von 300 ug/ml versehen. Am Tag 14 werden wachsende Clone mit monocionalem anti-CD3- Antikörper bei Anwesenheit von Spender-stämmigen PBL und LCL als Hilfszellen erneut stimuliert. Die Clone werden 48 bis 96 Stunden nach der Stimulation mit 50 U/ml rekombinantem IL-2 gefüttert und alle sieben Tage erneut stimuliert. Der geeignete selektive Wirkstoff wird in seiner aktiven Konzentration 48 Stunden nach der Stimulation zu den Kulturen zugegeben und verbleibt dort bis zur nächsten erneuten Stimulation.

Beispiel 4

Regulierte Expression eines Reporter-Gens in T-Zellen, kontrolliert von transkriptionalen Regulatorregionen von Lymphokin-Genen (aktivierungsinduzierte Expression, vermittelt von den transkriptionalen IL-3- und IL-4-Kontrollregionen in menschlichen Jurkat- T-Lymphocyten

Plasmid-DNAs, die transkriptionale Kontrollregionen von menschlichen IL-3- (hIL-3) oder menschlichen I1-4- (hIL-4) Genen enthalten, funktionell mit einem Reporter-Gen verbunden, das Chloramphenicol-Acetyltransferase (CAT) codiert, wurden in HyTK enthaltenden Vektoren hergestellt. Das Folgende beschreibt die Konstruktion von HyTK/hIL-3/CAT und HyTK/hIL-4/CAT. HyTK/hIL-3/CAT wurde unter Verwendung von Standardtechniken wie folgt konstruiert (Ausubel et al., 1987): der menschliche IL-3-Promotor wurde direkt von menschlicher genomischer DNA durch PCR unter Verwendung der Oligonucleotide 5'- CACACACAAGCTTGCCACCCACCAGGACCAAGCAGGGCGGGC-3 und 5'- ACACACACGGATCCGCAGGAGGCACTCTGTCTTGTTCTG-3' amplifiziert. Das PCR- Produkt wurde mit HindIII und BamHI geschnitten und in ein Derivat von tgLS(+)HyTK ligiert (Lupton et al., 1991), das ein CAT-Gen und einmalige HindIII- und BamHI-Stellen 5' vom CAT-Gen enthielt. HyTK/hIL-4/CAT wurde unter Verwendung von Standardtechniken wie folgt konstruiert (Ausubel et al., 1987): der menschliche IL-4-Promotor wurde direkt von menschlicher genomischer DNA durch PCR amplifiziert, unter Verwendung der Oligonucleotide 5'-CACACACAAGCTTCAATAAAAAACAAGCAGGGCGCGTGGT-3' und 5'-ACACACACGGATCCATTTGCAGTGACAATGTGAGGCAATTAGT-3'. Das PCR- Produkt wurde mit HindIII und BamHI geschnitten und in ein Derivat von tgLS(+)HyTK ligiert (Lupton et al., 1991), das ein CAT-Gen und einmalige HindIII- und BamHI-Stellen 5' vom CAT-Gen enthielt.
Die daraus entstehenden Vektoren, HyTK/hIL-3/CAT und HyTK/hIL-4/CAT genannt, haben Strukturen, wie schematisch in Fig. 1 gezeigt. In der Abbildung kennzeichnet "LTR" die langen terminalen Wiederholungsabschnitte des retroviralen Vektors, und HyTK kennzeichnet das Hygromycin-Phosphotransferase-Thymidinkinase Fusionsgen, das funktionell mit der transkriptionalen LTR-Kontrollregion verbunden ist. HIL-3 und hIL-4 sind die transkriptionalen Kontrollregionen für hIL-3 beziehungsweise hIL-4, funktionell verbunden mit dem CAT-Gen. Die Pfeile zeigen die Richtung der Transkription von den transkriptionalen Kontrollregionen an.
Die Plasmid-DNAs (jeweils 50 ug) wurden mittels Elektroporation in getrennte Präparationen von Jurkat-Zellen (4 · 10³ Zellen) in 0,8 ml vollständigem Kulturmedium unter Verwendung einer 0,4 cm-Küvette und einer Biorad-Gene Pulser-Anlage bei 300 V und 960 uF eingebracht. Die Jurkat-Zellen wurden in RPMI 1640-Medium, ergänzt mit 10% fötalem Rinderserum, 0,1 mM nicht-essentellen Aminosäuen, 50 uM 2-Mercaptoethanol, 2 mM L-Glutamin, 50 U/ml Penicillin und 50 ug/ml Streptomycin, bei 37ºC in einer mit 5% CO&sub2; angereicherten, angefeuchteten Atmosphäre gezüchtet. Nach der Elektroporation wurden die Zellen in die Kultur zurückgegeben und entweder unstimuliert (-) gelassen, oder sie wurden stimuliert mit 10 ng/ml Phorbolmyristinsäure (PMA) und 500 ng/ml Ionomycin (+). Nach 72 Stunden in Kultur wurden die Zellen geerntet, und es wurden Extrakte hergestellt und auf CAT-Aktivität unter Verwendung von Standardtechniken (Ausubel et al., 1987) wie folgt untersucht; die transfizierten Zellen wurden durch Zentrifugation gewonnen und in 100 ul 0,25 M Tris (pH 8,0) resuspendiert und drei Gefrier- (-20ºC für 5 min) und Auftau- (37ºC für 5 min) Zyklen unterworfen. Zellreste wurden durch Zentrifugation pelletiert, und der Überstand wurde in ein sauberes Röhrchen überführt. Ein 50 ul-Aliquot des Extraktes wurde mit 78 ul 0,5 M Tris (pH 8,0), 20 ul 24 mM Acetyl-Coenzym A und 2 ul [¹&sup4;C]-markiertem Chloramphenicol vermischt, und das Gemisch bei 37ºC für 20-24 h inkubiert. Das Reaktionsgemisch wurde mit 1 ml Ethylacetat extrahiert, der Ethylacetat-Extrakt wurde bis zur Trockenheit eingedampft und in 30 ul Ethylacetat resuspendiert. Der Extrakt wurde dann auf ein Dünnschicht-Chromatogramm aufgetragen, das in einem Gemisch von 95% Chloroform/5% Methanol entwickelt wurde. Das Chromatogramm wurde dann auf einen Röntgenfilm gelegt oder mittels einer Phosphorabbildungsvorrichtung sichtbar gemacht.
Die Ergebnisse der CAT-Untersuchungen, in Fig. 2 abgebildet, zeigen, dass die transkriptionalen hIL-4- und hIL-3-Kontrollregionen eine Expression in menschlichen T- Lymphocyten bewirken und dass der Grad der Expression des Reporter-Gens bei T-Zell- Aktivierung erhöht ist. Die Ergebnisse zeigen weiter, dass die transkriptionalen hIL-4- und hIL-3-Kontrollregionen funktional sind, wenn sie in einen retroviralen Vektor eingefügt werden.

Beispiele 5

Herstellung von TH-unabhängigem CD8+-CTL

Retrovirale Vektoren werden unter Verwendung von Plasmiden, die wie in Beispiel 4 hergestellt wurden, erzeugt, mit der Änderung, dass die Codierungssequenz für CAT durch die Codierungssequenz für hIL-2 ersetzt ist. Diese Vektoren werden in CMV-spezifische und HIV-spezifische CD8+-CTLs, wie in den Beispielen 1 und 2 hergestellt, eingefügt. Die transduzierten CTLs und Kontroll-CTLs werden auf Proliferation in Abwesenheit von TH- Zellen und in der Gegenwart und Abwesenheit von der für die Proliferation der Kontroll-CTLs notwendigen Menge an IL-2 überwacht. Proliferation der transduzierten CTLs, nicht aber der Kontroll-CTLs in den begrenzenden Mengen von zugegebenem IL-2 weist auf eine weniger starke Abhängigkeit von einem TH-Zell-Stimulationsfaktor, z. B. IL-2, hin.

Beispiel 6

Struktur von nicht-viralen Vektoren, die eine Cytokin codierende Sequenz und eine heterologe transkriptionale Kontrollregion enthalten

Fig. 3 zeigt eine schematische Darstellung von nicht-viralen Vektoren, die eine heterologe transkriptionale Kontrollregion, funktionell mit einer Cytokin codierenden Sequenz verbunden, enthalten. In der Abbildung zeigt "TCR" die heterologe transkriptionale Kontrollregion an. Die Cytokin codierende Sequenz ist jene von hIL-2. Funktionen mit der hIL-2 codierenden Sequenz verbunden ist ein Segment des menschlichen Wachstumshormon (hGH)-Gens, das ein Intron und eine Polyadenylierungs-Signalsequenz liefert. Die Pfeile zeigen die Richtung der Transkription von der transkriptionalen Kontrollregion an.

Beispiel 7

Struktur von retroviralen Vektoren, die eine Cytokin codierende Sequenz und eine heterologe transkriptionale Kontrollregion enthalten

Fig. 4 zeigt eine schematische Darstellung von zwei Typen retroviraler Vektoren, die eine heterologe transkriptionale Kontrollregion, funktionell verbunden mit einer Cytokin codierenden Sequenz, enthalten. Die Vektoren unterscheiden sich in der Richtung der Transkription des hIL-2-Gens. In der Abbildung zeigt "TCR" die heterologe transkriptionale Kontrollregion an. Die Cytiokin codierende Sequenz ist jene von hIL-2. Die Bedeutungen der Symbole LTR und hGH sind wie in den vorstehenden Beispielen beschrieben.

Beispiel 8

Struktur von AAV-Vektoren, die eine Cytokin codierende Sequenz und eine heterologe transkriptionale Kontrollregion enthalten

Fig. 5 zeigt eine schematische Darstellung eines AAV-Vektors, der eine heterologe transkriptionale Kontrollregion, funktionell mit einer Cytokin codierenden Sequenz verbunden, enthält. In der Abbildung zeigt "TCR" die heterologe transkriptionale Kontrollregion an. Die Cytiokin codierende Sequenz ist jene von hIL-2. "ITR" ist eine invertierte terminale AAV- Wiederholungssequenz. "hGH" ist in den vorstehenden Beispielen beschrieben.

Beispiel 9

Herstellung von TH-unabhängigem CD8+-CTL mit einem Vektor, der die transkriptionale IFN- γ-Kontrollregion enthält

Retrovirale Vektoren werden aus den in Beispiel 4 beschriebenen Plasmiden hergestellt, mit der Änderung, dass die Codierungssequenz für CAT durch eine Codierungssequenz für hIL-2 ersetzt ist und die transkriptionale Kontrollregion, mit der die Codierungsregion funktionell verbunden ist, vom menschlichen IFN-γ-Gen stammt. Bevorzugt beinhaltet die transkriptionale Kontrollregion auch einen heterologen Enhancer wie etwa einen CMV-Enhancer. Diese Vektoren werden in CMV-spezifische und HIV-spezifische CD8+-CTLs, wie in Beispiel 1 und 2 hergestellt, eingeschleust. Die transduzierten CTLs und Kontroll-CTLs werden auf Proliferation in der Abwesenheit von TH-Zellen und in der Gegenwart und Abwesenheit von der Menge an IL-2, die für die Proliferation der Kontroll-CTLs notwendig ist, überwacht. Proliferation der transduzierten CTLs, nicht jedoch der Kontroll-CTLs in der Anwesenheit von begrenzenden Mengen von zugegebenem IL-2 weist auf eine weniger starke Abhängigkeit von dem TH-Zell-Stimulationsfaktor, IL-2, hin.
Die vorstehend beschriebenen Prinzipien und Lehren dienen der Erstellung zusätzlicher Ausführungsformen, von denen einige nachstehend beschrieben werden, um zusätzlich die Verwendbarkeit dieser Erfindung aufzuzeigen. Eingeschlossen sind zum Beispiel eine Reihe weiterer Vektoren, die die Nützlichkeit von aktivierungsinduzierter Expression in verschiedenen T-Lymphocyten zeigen, und eine Darstellung des Wachstums von Virus- spezifischen cytotoxischen T-Lymphocyten in der Abwesenheit von exogen zugefügtem IL-2 nach der Transduktion mit Vektoren der vorliegenden Erfindung.

Beispiel 10

Aktivierungsinduzierte Expression, vermittelt durch die transkriptionale Kontrollregion von Lymphotoxin und die transkriptionale Kontrollregion von Lymphotoxin in Verbindung mit dem CMV-Enhancer, in menschlichen Jurkat-T-Lymphocyten

Plasmid-Konstruktionen

Die provirale Struktur des retroviralen Vektors HyTK.lck-7.CAT ist aufgebaut, wie in Fig. 4C gezeigt, wobei "TCR" eine kleine Region darstellt, die die Startstelle der Transkription vom murinen lck-Gen einschliesst, und "Gen" das CAT-Gen darstellt. HyTK.lck-7.CAT wurde mit Hilfe von Standardtechniken (Ausubel et al., 1987, vollständiges Zitat nachstehend) wie folgt konstruiert: ein Paar überlappender Oligonucleotide, 5'- TCGAGGGCTCAGAGGGAACCCAGTCAGGAGCTTGAATCCCACGATTCGGG-3' und 5'-GATCCCCGAATCGTGGGATTCAAGCTCCTGACTGGGTTCCCTCTGAGCCC-3', wurde aneliert, um ein Teilstück von 50 bp zu bilden, das die Startstelle der Transkription des murinen lck-Gens umspannte (Allen et al., 1992) und zwischen die XhoI- und BamHI-Stellen von pBluescript II KS + (Stratagene) ligiert, um pKS/lck-7 zu bilden. Das Teilstück wurde dann mit Hilfe von XhoI und BamHI aus pKS/lck-7 ausgeschnitten und zwischen XhoI- und BamHI- Stellen eines Derivates von tgLS(+)HyTK ligiert (Lupton et al. 1991), das ein stromabwärts des HyTK-Gens inseriertes CAT-Gen und 5' des CAT-Gens einmalige HindIII-, XhoI- und BamHI-Stellen enthielt, um HyTK.lck-7.CAT zu erzeugen. Die minimalen in HyTK.lck-7.CAT inserierten Sequenzen stellen keine funktionelle transkriptionale Kontrollregion dar, und dieser Vektor wurde als eine negative Kontrolle zur Definition des Hintergrundspiegels der CAT-Aktivität eingeschlossen.
Die provirale Struktur des retroviralen Vektors HyTK.CMV.CAT ist, wie in Fig. 4C gezeigt, aufgebaut, wobei "TCR" die transkriptionale CMV-Kontrollregion und "Gen" das CAT-Gen darstellen. HyTK.CMV.CAT wurde mit Hilfe von Standardtechniken (Ausubel et al., 1987) wie folgt gebildet: ein Teilstück, das die transkriptionale HCMV IE94-Kontrollregion umfasst (Boshart et al., 1985), wurde mit Hilfe von HindIII und Nhel aus HyTK.CMV.IL-2 ausgeschnitten (einem Derivat von tgLS(+)HyTK (Lupton et al., 1991), das die transkriptionale HCMV IE94-Kontrollregion und eine stromabwärts vom HyTK-Gen inserierte menschliche DL-2-cDNA enthielt, wobei HindIII- und Nhel-Stellen die transkriptionale HCMV IE94-Kontrollregion flankieren), mit dem Klenow-Fragment von DNA-Polymerase I behandelt, um glatte Enden zu erzeugen und zwischen die HindIII- und BamHI-Stellen (die gleichfalls mit dem Klenow-Teilstück der DNA-Polymerase I behandelt worden waren) von HyTK.lck-7.CAT ligiert, wobei HyTK.CMV.CAT erzeugt wurde. Die Orientierung der transkriptionalen CMV-Kontrollregion wurde durch Restriktionsspaltung bestätigt. Die transkriptionale CMV-Kontrollregion ist in einer breiten Vielzahl von Zelltypen konstitutiv aktiv, einschliesslich T-Lymphocyten. Zusätzlich ist die Aktivität der transkriptionalen CMV- Kontrollregion in T-Lymphocyten bei T-Zell-Aktivierung erhöht. HyTK.CMV.CAT wurde daher als eine positive Kontrolle eingeschlossen.
Die provirale Struktur des retroviralen Vektors HyTK.LT.CAT ist, wie in Fig. 4C gezeigt, aufgebaut, wobei "TCR" die transkriptionale Lymphotoxin-Kontrollregion und "Gen" das CAT-Gen darstellt. HyTK.LT.CAT wurde mit Hilfe von Standardtechniken (Ausubel et al., 1987) wie folgt gebildet: die menschliche transkriptionale LT-Kontrollregion (Nedwin et al., 1985) wurde direkt von NotI gespaltener menschlicher genomischer DNA mittels PCR unter Verwendung der Oligonucleotide 5'-CACACAAAGCTTCTCGAAACTTCCTTTGTAGA-3' und 5'-CACACAGGATCCGGAGAGCCTCACCTGCTGTG-3' amplifiziert. Das PCR- Produkt wurde mit BamHI gespalten und in die BamHI-Stelle von HyTK.lck-7.CAT ligiert, um HyTK.LT.CAT zu erzeugen. Die Orientierung der transkriptionalen LT-Kontrollregion wurde durch Spaltung mit Restriktionsenzymen bestätigt.
Die provirale Struktur des retroviralen Vektors HyTK.CMVe.LT.CAT ist, wie in Fig. 4D gezeigt, aufgebaut, wobei "TCR" die transkriptionale Lymphotoxin-Kontrollregion, "Gen" das CAT-Gen und "ENH" den CMV-Enhancer darstellt. HyTK.CMVe.LT.CAT wurde mit Hilfe von Standardtechniken (Ausubel et al., 1987) wie folgt gebildet: ein den HCMV-IE94- Enhancer umfassendes Teilstück wurde zunächst von einem Plasmid, das die transkriptionale HCMV-IE94-Kontrollregion (Boshart et al., 1985) enthielt, unter Verwendung der Oligonucleotide 5'-CACACACAAGCTTATCGATGATCTCGAGGAGCTTGCCATTGC-3' und 5'-ACACACACAAGCTTAGACCTCCCACCGTACACGCCTAC-3' amplifiziert. Das PCR-Produk wurde mit HindIII gespalten und in die einmalige HindIII-Stelle von HyTK.hPerf.CAT (einem Derivat von tgLS(+)HyTK (Lupton et al., 1991), das die menschliche transkriptionale Perforin-Kontrollregion und ein CAT-Gen, stromabwärts von dem HYTK-Gen inseriert, und eine einmalige HindIII-Stelle 5' der transkriptionalen Perforin- Kontrollregion enthält) ligiert, um HyTK.CMVe.hPerf.CAT zu erzeugen. Das den HCMV- IE94-Enhancer umspannende Teilstück wurde dann mit Hilfe von HindIII aus HyTK.CMVe.hPerf.CAT ausgeschnitten und in die HindIII-Stelle von HyTK.LT.CAT stromaufwärts der transkriptionalen LT-Kontrollregion eingefügt, um HyTK.CMVe.LT.CAT zu erzeugen. Die Orientierung des Enhancers wurde mit Spaltung durch Restriktionsenzyme bestätigt.
Menschliche-Jurkat-T-Lymphocyten wurden in RPMI 1640-Medium, ergänzt mit 10% fötalem Rinderserum, 0,1 mM nicht essentiellen Aminosäuren, 50 uM 2-Mercaptoethanol, 2 mM L-Glutamin, 50 U/ml Penicillin und 50 ug/ml Streptomycin, bei 37ºC in einer mit 5% CO&sub2; angereicherten, befeuchteten Atmosphäre gezüchtet. An Aliquots von Zellen (4 · 10&sup6;) wurde mit 10 ug HyTK.CMV.CAT-, HyTK.lck-7.CAT-, HyTK.LT.CAT- oder HyTK.CMVe.LT.CAT-Plasmid-DNA in 0,8 ml vollständigem Kulturmedium unter Verwendung einer 0,4 cm-Küvette und einer Biorad-Gene Pulser-Anlage bei 300 V und 960 mF die Elektroporation durchgeführt. Nach der Elektroporation wurden die Zellen in die Kultur zurückgebracht und für 18 h inkubiert. Die Kulturen wurden dann mit 350 ug/ml Hygromycin B versehen, um die transfizierten Zellen zu selektieren. Die Zellen wurden mittels Zentrifugation gesammelt und alle 3-4d in frischem Kulturmedium, das 350 ug/ml Hygromycin B enthielt, resuspendiert. Nach 21-28d wurden die selektierten Zellen aktiviert und, wie nachstehend beschrieben, auf CAT-Aktivität untersucht.
Zur Aktivierung der transfizierten Zellen wurden die Kulturen mit 10 ng/ml PMA und 500 ng/ml Ionomycin versetzt. Nach 0 h, 4 h, 8 h, 24 h, 32 h und 48 h nach der Aktivierung wurden die Zellen geerntet, und CAT-Extrakte wurden angefertigt und unter Verwendung von Standardtechniken (Ausubel et al., 1987) wie folgt untersucht: Die transfizierten Zellen wurden durch Zentrifugation gewonnen, in 100 ul 0,25 M Tris (pH 8,0) resuspendiert und drei Gefrier- (-20ºC für 5 min) und Auftau- (37ºC für 5 min) Zyklen unterworfen. Zellreste wurden durch Zentrifugation pelletiert, und der Überstand wurde in ein sauberes Röhrchen überführt. Ein 50 ul -Aliquot des Extraktes wurde mit 78 ul 0,5 M Tris (pH 8,0), 20 ul 24 mM Acetyl-Coenzym A und 2 ul [¹&sup4;C]-gekennzeichnetem Chloramphenicol vermischt, und das Gemisch wurde bei 37ºC für 20-24 h inkubiert. Das Reaktionsgemisch wurde mit 1 ml Ethylacetat extrahiert, der Ethylacetat-Extrakt wurde bis zur Trockenheit eingedampft und in 30 ul Ethylacetat resuspendiert. Der Extrakt wurde dann auf ein Dünnschicht-Chromatogramm aufgetragen, welches in einem Gemisch aus 95% Chloroform/5% Methanol entwickelt wurde. Das Chromatogramm wurde dann auf einen Röntgenfilm gelegt oder mit einer Phosphorabbildungsvorrichtung sichtbar gemacht.
Wie in Fig. 6 angeführt, zeigten Zellen, die mit dem negativen Kontrollvektor HyTK.lck- 7.CAT transfiziert waren, keine signifikanten Spiegel von CAT-Aktivität. Zellen, die mit dem positiven Kontrollvektor HyTK.CMV.CAT transfiziert waren, exprimierten die CAT-Aktivität konstitutiv, und die Höhe der Expression erhöhte sich bei T-Zell-Aktivierung. Zellen, die mit HyTK.LT.CAT oder HyTK.CMVe.LT.CAT transfiziert worden waren und unaktiviert gelassen wurden, exprimierten keine signifikanten Spiegel an CAT-Aktivität. Jedoch exprimierten mit HyTK.LT.CAT oder HyTK.CMVe.LT.CAT transfizierte Zellen signifikante CAT-Aktivitätsspiegel als Folge einer Aktivierung mit PMA und Ionomycin.
HyTK.CMVe.LT.CAT exprimierte eine wesentlich grössere CAT-Aktivität als HyTK.LT.CAT als Folge einer Aktivierung mit PMA und Ionomycin.
Die Ergebnisse zeigen, dass die transkriptionale LT-Kontrollregion und die transkriptionale LT-Kontrollregion in Verbindung mit dem CMV-Enhancer die aktivierungsinduzierte Expression in menschlichen T-Lymphocyten vermitteln und dass der CMV-Enhancer dazu verwendet werden kann, den Grad der aktivierungsinduzierten Expression von der transkriptionalen LT-Kontrollregion in menschlichen T-Lymphocyten zu verstärken. Die Ergebnisse zeigen weiterhin, dass die transkriptionale LT-Kontrollregion und die transkriptionale LT-Kontrollregion in Verbindung mit dem CMV-Enhancer in menschlichen T- Lymphocyten wirksam sind, wenn sie in einen retroviralen Vektor inseriert werden.

Beispiel 11

Aktivierungsinduzierte Expression, vermittelt von der transkriptionalen IL- 2Rα-Kontrollregion in Kombination mit dem CMV-Enhancer, in menschlichen Jurkat-T-Lymphocyten

Plasmid-Konstruktionen

Die Plasmide HyTK.lck-7.CAT und HyTK.CMV.CAT wurden wie in Beispiel 10 konstruiert.
Die provirale Struktur des retroviralen Vektors HyTK.IL-2Rα.CAT ist, wie in Fig. 4C abgebildet, aufgebaut, wobei "TCR" die transkriptionale IL-2Ra-Kontrollregion und "Gen" das CAT-Gen darstellen. HyTK.IL-2Rα.CAT wurde unter Verwendung von Standardtechniken (Ausubel et al., 1987) wie folgt konstruiert: die menschliche transkriptionale IL-2Ra-Kontrollregion (Cross et al., 1987) wurde direkt von NotI gespaltener menschlicher genomischer DNA mittels PCR unter Verwendung der Oligonucleotide 5'- CACACAAAGCTTGACTCCTGAGGACGTTACAG-3' und 5'- CACACAGGATCCGGGCTGTCACCCTTGTGGGT-3' amplifiziert. Das PCR-Produkt wurde mit HindIII und BamHI gespalten und zwischen die HindIII- und BamHI-Stellen von HyTK.lck-7.CAT ligiert, um HyTK.IL-2Rα.CAT zu erzeugen. Die Orientierung der transkriptionalen IL-2Rα-Kontrollregion wurde durch Spaltung mit Restriktionsenzymen und DNA-Sequenzierung bestätigt.
Die provirale Struktur des retroviralen Vektors HyTK.CMVe.IL-2Rα.CAT ist, wie in Fig. 4D abgebildet, aufgebaut, wobei "TCR" die transkriptionale IL-2Ra-Kontrollregion, "Gen" das CAT-Gen und "ENH" den CMV-Enhancer darstellt. HyTK.CMVe.IL-2Rα.CAT wurde unter Verwendung von Standardtechniken (Ausübel et al., 1987) wie folgt konstruiert: Ein den HCMV-IE94-Enhancer umfassendes Teilstück wurde mit Hilfe von HindIII aus HyTK.CMVe.hPerf.CAT ausgeschnitten (vgl. Beispiel 10) und in die HindIII-Stelle von HyTK.IL-2Rα.CAT stromaufwärts von IL-2Rα.CAT ligiert. Die Orientierung des Enhancers wurde durch Spaltung mit Restriktionsenzymen bestätigt.
Menschliche Jurkat-T-Lymphocyten wurden gezüchtet und transfiziert, wie in Beispiel 10 beschrieben, mit der Ausnahme-, dass die Zellen mit 10 ng von HyTK.CMV.CAT-, HyTK.lck- 7.CAT-, HyTK.IL-2Rα.CAT- oder HyTK.CMVe.IL-2Rα.CAT- Plasmid-DNA transfiziert wurden. Präparation und Untersuchung der CAT-Extrakte wurde wie in Beispiel 10 durchgeführt.
Wie in Fig. 7 angeführt, exprimierten Zellen, die mit dem negativen Kontrollvektor HyTK.lck-CAT transfiziert waren, keine signifikanten Spiegel von CAT-Aktivität. Zellen, die mit dem positiven Kontrollvektor HyTK.CMV.CAT transfiziert waren, exprimierten die CAT- Aktivität konstitutiv, und die Höhe der Expression erhöhte sich bei T-Zell-Aktivierung. Zellen, die mit HyTK.IL-2α.CAT oder HyTK.CMVe. IL-2Rα.CAT transfiziert worden waren und unaktiviert gelassen wurden, exprimierten keine signifikanten Spiegel an CAT-Aktivität. Mit HyTK.IL-2Rα.CAT transfizierte Zellen exprimierten keine signifikanten Spiegel von CAT- Aktivität nach Aktivierung mit PMA und Ionomycin. Mit HyTK.CMVe.IL-2Rα.CAT transfizierte Zellen jedoch exprimierten signifikante CAT-Aktivitätsspiegel als Folge der Aktivierung mit PMA und Ionomycin.
Die Ergebnisse zeigen, dass die transkriptionale IL-2Rα-Kontrollregion in Verbindung mit dem CMV-Enhancer aktivierungsinduzierte Expression in menschlichen T-Lymphocyten vermittelt und dass der CMV-Enhancer dazu verwendet werden kann, den Grad der aktivierungsinduzierten Expression von der transkriptionalen IL-2Rα-Kontrollregion in menschlichen T-Lymphocyten zu verstärken. Die Ergebnisse zeigen weiterhin, dass die transkriptionale IL-2Rα-Kontrollregion in Verbindung mit dem CMV-Enhancer in menschlichen T-Lymphocyten wirksam ist, wenn sie in einen retroviralen Vektor inseriert werden.

Beispiel 12

Aktivierungsinduzierte Expression, vermittelt durch die transkriptionale Lymphotoxin- Kontrollregion in Kombination mit dem CMV-Enhancer und die Iranskriptionale IL-2Rα- Kontrollregion in Kombination mit dem CMV-Enhancer, in peripheren Blut-T- Lymphocyten des Menschen

Die Plasmide wurden wie in den Beispielen 10 und 11 konstruiert.
Periphere Blut-T-Lymphocyten des Menschen wurden wie folgt hergestellt. Menschliches peripheres Blut wurde durch Venipunktur von gesunden Freiwilligen entnommen und mit dem gleichen Volumen RPMI 1640-Kulturmedium vermischt. In einem konischen 50 ml-Röhrchen wurde ein 35 ml-Alioquot über 14 ml Isolymphe geschichtet und bei 2000 UpM für 20 min bei 20ºC in einer Sorvall RT6000D-Tischzentrifuge zentrifugiert. Die Zellen in der Grenzschicht wurden durch Zentrifugation bei 1600 UpM für 10 min bei 4ºC in einer Sorvall RT6000D- Tischzentrifuge pelletiert, drei Mal durch Resuspendierung in vollständigem Kulturmedium (RPMI 1640-Medium, ergänzt mit 10% fötalem Rinderserum, 0,1 mM nicht essentiellen Aminosäuren, 50 uM 2-Mercaptoethanol, 2 mM L-Glutamin, 50 U/ml Penicillin und 50 ug/ml Streptomycin) gewaschen und bei 1600 UpM für 10 min bei 4ºC in einer Sorvall RT6000D- Tischzentrifuge zentrifugiert und dann in 10 ml vollständigem Kulturmedium resuspendiert. Ein 0,3 ml-Aliquot von AET-SRBC (AET behandelte rote Blutzellen vom Schaf, wie in Current Protocols in Immunology, J. E. Coligan et al.. Hrsg., 1991 beschrieben) wurde hinzugegeben, die Suspension wurde sanft gemischt, bei der langsamsten Zentrifugengeschwindigkeit für 5 min bei 20ºC in einer Sorvall RT6000D-Tischzentrifuge zentrifugiert und bei Raumtemperatur für 20 min inkubiert. Das Zell-Pellet wurde dann durch sanftes Schütteln resuspensiert, und das Gemisch wurde in einem konischen 50 ml-Röhrchen über 14 ml Isolymphe geschichtet und bei 2000 UpM für 20 min bei 20ºC in einer Sorvall RT6000D-Tischzentrifuge zentrifugiert. Der Überstand wurde entfernt, und die Zellen wurden in 10 ml vollständigem Kulturmedium resuspensiert. Ein zweites 0,3 ml-Aliquot AET-SRBC wurde hinzalgegeben, die Suspension wurde sanft gemischt, bei der langsamsten Zentrifugengeschwindigkeit für 5 min bei 20ºC in einer Sorvall RT6000D-Tischzentrifuge zentrifugiert und bei Raumtemperatur für 20 min inkubiert. Das Zell-Pellet wurde dann durch sanftes Schütteln resuspendiert, und das Gemisch wurde in einem konischen 50 ml-Röhrchen über 14 ml Isolymphe geschichtet und bei 2000 UpM für 20 min bei 20ºC in lysierendem NH&sub4;Cl-Kulturmedium, das auf 37ºC vorgewärmt worden war, inkubiert, bis die Lysis der roten Blutzellen sichtbar war. Das Gemisch wurde dann bei 1400 UpM für 8 min bei 20ºC in einer Sorvall RT6000D-Tischzentrifuge zentrifugiert. Die pelletierten Zellen wurden zwei Mal durch Resuspension in vollständigem Kulturmedium und Zentrifugieren bei 1600 UpM für 10 min bei 4ºC in einer Sorvall RT6000D-Tischzentrifuge zentrifugiert und mit einer Dichte von 5 · 10&sup5; Zellen/ml in vollständigem Kulturmedium resuspendiert. PHA wurde zu einer Konzentration von 1 % zugegeben, und die Zellen wurden in T-75-Flaschen gebracht und bei 37ºC in einer mit 5% CO&sub2; angereicherten befeuchteten Atmosphäre für 8d inkubiert. Die Zellen wurden dann durch Zentrifugation bei 1600 UpM für 10 min bei 4ºC in einer Sorvall RT6000D-Tischzentrifuge pelletiert, einmal durch Resuspendierung in vollständigem Kulturmedium gewaschen und bei 1600 UpM für 10 min bei 4ºC in einer Sorvall RT6000D-Tischzentrifuge zentrifugiert und in vollständigen Kulturmedium mit einer Dichte von 5 · 10&sup6; Zellen/ml resuspendiert. Bei Aliquots der Zellen (4 · 10&sup6;) wurde mit 10 ug des HyTK.CMV.CAT- oder 50 ug HyTK.lck-7.CAT-, HyTK.CMVe.LT.CAT- oder HyTK.CMVe.IL-2Rα.CAT-Plasmid in 0.8 ml vollständigem Kulturmedium unter Verwendung einer 0,4 cm-Küvette und einer Biorad-Gene Pulser-Anlage bei 350 V und 960 uF eine Elektroporation durchgeführt. Nach der Elektroporation wurden die Zellen in die Kultur zurückgegeben und für 1-2 h inkubiert.
Um die transfizierten Zellen zu aktivieren, wurden die Kulturen mit 10 ng/ml PMA und 500 ng/ml Ionomycin versetzt. 24 h nach der Aktivierung wurden die Zellen geerntet, CAT- Extrakte wurden hergestellt und unter Verwendung von Standardtechniken (Ausubel et al. 1987) wie folgt untersucht: Die transfizierten Zellen wurden durch Zentrifugation gewonnen, in 100 ul 0,25 Tris (pH 8,0) resuspendiert und drei Gefrier- (-20ºC für 5 min) und Auftau- (37ºC für 5 min) Zyklen unterworfen. Zellreste wurden durch Zentrifugation pelletiert, und der Überstand wurde in ein sauberes Röhrchen übertragen. Ein 50 ul-Aliquot des Extraktes wurde mit 78 ul 0,5 M Tris (pH 8,0), 20 ul 24 mM Acetyl-Coenzym A und 2 ul [¹&sup4;C]-markiertem Chloramphenicol gemischt, und das Gemisch wurde bei 37ºC für 20-24 h inkubiert. Das Reaktionsgemisch wurde mit 1 ml Ethylacetat extrahiert, der Ethylacetat-Extrakt wurde bis zur Trockenheit eingedampft und in 30 ul Ethylacetat resuspendiert. Der Extrakt wurde dann auf ein Dünnschicht-Chromatogramm aufgetragen, das in einem Gemisch von 95% Chloroform/5% Methanol entwickelt wurde. Das Chromatogramm wurde dann auf einen Röntgenfilm gelegt oder mittels einer Phosphorabbildungsvorrichtung sichtbar gemacht.
Wie in Fig. 8 dargestellt, exprimierten die Zellen, die mit dem negativen Kontrollvektor HyTK.lck-7.CAT transfiziert und unaktiviert gelassen (-) oder aktiviert (+) worden waren, keine signifikanten Spiegel von CAT-Aktivität. Zellen, die mit dem positiven Kontrollvektor HyTK.CMV.CAT transfiziert und unaktiviert gelassen (-) worden waren, exprimierten die CAT-Aktivität konstitutiv, und der Spiegel der Aktivität war durch T-Zell-Aktivierung (+) erhöht. Zellen, die mit HyTK.CMVe.LT.CAT oder HyTK.CMVe.IL-2Rα.CAT transfiziert und unaktiviert gelassen (-) worden waren, exprimierten keine signifikanten Spiegel von CAT- Aktivität. Die mit HyTK.CMVe.LT.CAT oder HyTK.CMVe.IL-2Rα.CAT transfizierten Zellen exprimierten jedoch nach Aktivierung für 24 h (+) signifikante Spiegel von CAT- Aktivität.
Die Ergebnisse zeigen, dass die transkriptionale LT-Kontrollregion in Verbindung mit dem CMV-Enhancer und die transkriptionale IL-2Rα-Kontrollregion in Verbindung mit dem CMV- Enhancer aktivierungsinduzierte Expression in menschlichen T-Lymphocyten vermitteln. Die Ergebnisse zeigen weiterhin, dass die transkriptionale LT-Kontrollregion in Verbindung mit dem CMV-Enhancer und die transkriptionale IL-2Rα-Kontrollregion in Verbindung mit dem CMV-Enhancer in menschlichen T-Lymphocyten wirksam sind, wenn sie in einen retroviralen Vektor inseriert sind.

Beispiel 13

Aktivierungsinduzierte Expression, vermittelt durch die transkriptionale IL-4- Kontrollregion in Verbindung mit dem CMV-Enhancer, in menschlichen Jurkat-T-Lymphocyten

Die Plasmide HyTK.lck-7.CAT und HyTK.CMV.CAT wurden wie in Beispiel 10 konstruiert. Plasmid HyTK.IL-4.CAT wurde wie in Beispiel 4 konstruiert.
Die provirale Struktur des retroviralen Vektors HyTK.CMVe.IL-4.CAT ist, wie in Fig. 4D gezeigt, aufgebaut, wobei "TCR" die transkriptionale IL-4-Kontrollregion, "Gen" das CAT- Gen und "ENH" den CMV-Enhancer darstellen. HyTK.CMVe.IL-4.CAT wurde mit Hilfe von Standardtechniken (Ausubel et al., 1987) wie folgt gebildet: ein Teilstück, das den HCMV- IE94-Enhancer umfasst, wurde mit Hilfe von HindIII aus HyTK.CMVe.hPerf.CAT ausgeschnitten (vgl. Beispiel 10) und in die HindIII-Stelle von HyT.IL-4.CAT stromaufwärts von der transkriptionalen IL-4-Kontrollregion ligiert, um HyTK.CMVe.IL-4.Cat zu erzeugen. Die Orientierung des Enhancers wurde durch Spaltung mit Restriktionsenzymen bestätigt.
Menschliche Jurkat-T-Lymphocyten wurden gezüchtet, wie in Beispiel 10 beschrieben. Aliquots von Zellen (4 · 10&sup6;) wurden mit 25 ug HyTK.CMV.CAT-, HyTK.lck.-7.CAT-, HyTK.IL-4.CAT- oder HyTK.CMVe.IL-4.CAT-Plasmid-DNA in 0.8 ml vollständigem Kulturmedium unter Verwendung einer 0,4 cm-Küvette und einer Biorad-Gene Pulser-Anlage bei 350 V und 960 pF einer Elektroporation unterworfen. Nach der Elektroporation wurden die Zellen in die Kultur zurückgegeben und für 2d inkubiert. Die Kulturen wurden dann mit 350 ug/ml Hygromycin B versetzt, um die transfizierten Zellen zu selektieren. Die Zellen wurden durch Zentrifugation gewonnen und alle 3-4d in frischem Kulturmedium, das 350 ug/ml Hygromycin B enthielt, resuspendiert. Nach 14-21d wurden die selektierten Zellen aktiviert und auf CAT-Aktivität untersucht.
Die CAT-Extrakte wurden hergestellt und untersucht, wie in Beispiel 10 beschrieben, mit der Änderung, dass die Zellen mit PMA und Ionomycin für 0 h, 3 h, 6 h oder 24 h aktiviert wurden.
Wie in Fig. 9 dargestellt, exprimierten die Zellen, die mit dem negativen Kontrollvektor HyTK.lck-7.CAT transfiziert worden waren, keine signifikanten CAT-Aktivitätsspiegel. Zellen, die mit dem positiven Kontrollvektor HyTK.CMV.CAT transfiziert worden waren, exprimierten die CAT-Aktivität konstitutiv. Zellen, die mit HyTK.IL-4.CAT oder HyTK.CMVe.IL-4.CAT transfiziert und unaktiviert gelassen worden waren, exprimierten keine signifikanten Spiegel von CAT-Aktivität nach Aktivierung mit PMA und Ionomycin. Die mit HyTK.CMVe.DL-4.CAT transfizierten Zellen zeigten jedoch nach Aktivierung mit PMA und Ionomycin signifikante Spiegel von CAT-Aktivität.
Die Ergebnisse zeigen, dass die transkriptionale IL-4-Kontrollregion in Verbindung mit dem CMV-Enhancer aktivierungsinduzierte Expression von menschlichen T-Lymphocyten vermitteln und dass der CMV-Enhancer verwendet werden kann, um den Spiegel der aktivierungsinduzierten Expression von der transkriptionalen IL-4-Kontrollregion in menschlichen T-Lymphocyten zu verstärken. Die Ergebnisse zeigen weiterhin, dass die transkriptionale IL-4-Kontrollregion in Verbindung mit dem CMV/-Enhancer in menschlichen T-Lymphocyten wirksam ist, wenn sie in einen retroviralen Vektor inseriert ist.

Beispiel 14

Aktivierungsinduzierte Expression, vermittelt durch die transkriptionale IL-3- Kontrollregion und die transkriptionale IL-3-Kontrollregion in Verbindung mit dem CMV- Enhancer, in menschlichen Jurkat-T-Lymphocyten

Die Plasmide HyTK.lck-7.CAT und HyTK.CMV.CAT wurden wie in Beispiel 10 konstruiert. Plasmid HyTK.hIL-3.CAT wurde wie in Beispiel 4 konstruiert.
Die provirale Struktur des retroviralen Vektors HyTK.CMVe.hIL-3.CAT ist, wie in Fig. 4D gezeigt, aufgebaut, wobei "TCR" die transkriptionale IL-3-Kontrollregion, "Gen" das CAT- Gen und "ENH" den CMV-Enhancer darstellen.
HyTK.CMVe.hIL-3.CAT wurde mit Hilfe von Standardtechniken (Ausubel et al., 1987) wie folgt gebildet: ein Teilstück, das den HCMV-IE94-Enhancer umfasst, wurde mit Hilfe von HindIII aus HyTK.CMVe.hPerf.CAT ausgeschnitten (vgl. Beispiel 10) und in die HindIII- Stelle von HyT.IL-3.CAT stromaufwärts von der transkriptionalen IL-3-Kontrollregion ligiert, um HyTK.CMVe.IL-3.Cat zu erzeugen. Die Orientierung des Enhancers wurde durch Spaltung mit Restriktionsenzymen bestätigt.
Menschliche Jurkat-T-Lymphocyten wurden gezüchtet, wie in Beispiel 13 beschrieben, mit der Änderung, dass die Zellen mit 10 ug HyTK.CMV.CAT-, HyTK.lck-7.CAT-, HyTK.IL-3.CAT- oder HyTK.CMVe.IL-3.CAT- Plasmid-DNA transfiziert wurden.
Präparation und Untersuchung der CAT-Extrakte wurden, wie in Beispiel 13 beschrieben, durchgeführt.
Wie in Fig. 10 dargestellt, exprimierten die Zellen, die mit dem negativen Kontrollvektor HyTK.lck-7.CAT transfiziert worden waren, keine signifikanten CAT-Aktivitätsspiegel. Zellen, die mit dem positiven Kontrollvektor HyTK.CMV.CAT transfiziert worden waren, exprimierten die CAT-Aktivität konstitutiv, und der Spiegel der Expression war bei T-Zell- Aktivierung erhöht. Zellen, die mit HyTK.hIL-3.CAT oder HyTK.CMVe.hIL-3.CAT transfiziert und unaktiviert gelassen worden waren, exprimierten keine signifikanten Spiegel von CAT-Aktivität. Die mit HyTK.hIL-3.CAT oder HyTK.CMVe.hIL-3. CAT transfizierten Zellen exprimierten jedoch nach Aktivierung mit PMA und Ionomycin signifikante Spiegel von CAT-Aktivität. HyTK.CMVe.hIL-3.CAT exprimierte nach Aktivierung mit PMA und Ionomycin eine wesentlich höhere CAT-Aktivität als HyTK.hIL-3.CAT.
Die Ergebnisse zeigen, dass die transkriptionale hIL-3-Kontrollregion und die transkriptionale hCL-3-Kontrollregion in Verbindung mit dem CMV-Enhancer aktivierungsinduzierte Expression in menschlichen T-Lymphocyten vermitteln und dass der CMV-Enhancer verwendet werden kann, um den Spiegel der aktivierungsinduzierten Expression von der transkriptionalen IL-3-Kontrollregion in menschlichen T-Lymphocyten zu erhöhen. Die Ergebnisse zeigen weiterhin, dass die transkriptionale IL-3-Kontrollregion und die transkriptionale IL-3-Kontrollregion in Verbindung mit dem CMV-Enhancer in menschlichen T-Lymphocyten wirksam sind, wenn sie in einen retroviralen Vektor inseriert sind.

Beispiel 15

Aktivierungsinduzierte Expression, vermittelt durch die transkriptionale CTLA-1- Kontrollregion und die transkriptionale CTLA-1-Kontrollregion in Verbindung mit dem CMV- Enhancer, in menschlichen Jurkat-T-Lymphocyten

Die Plasmide HyTK.lck-7.CAT und HyTK.CMV.CAT wurden wie in Beispiel 10 konstruiert.
Die provirale Struktur des retroviralen Vektors HyTK.CTLA-1.CAT ist, wie in Fig. 4C gezeigt, aufgebaut, wobei "TCR" die transkriptionale CTLA-1-Kontrollregion und "Gen" das CAT-Gen darstellen. HyTK.CTLA-1.CAT wurde unter Verwendung von Standardtechniken (Ausubel et al., 1987) wie folgt konstruiert: die menschliche transkriptionale CTLA-1- Kontrollregion (Heusel et al., 1991) wurde direkt von menschlicher genomischer DNA mittels PCR unter Verwendung der Oligonucleotide 5'- CACACACAAGCTTCTATATTTTGAGATATACCATTCCTCA-3' und 5'- ACACACACGGATCCAGGAAGGCTGCCCTGGTTGGAGCTGCT-3' amplifiziert. Das PCR-Produkt wurde mit HindIII und BamHI gespalten und zwischen die HindIII- und BamHI- Stellen von HyTK.lck-7.CAT ligiert, um HyTK.CTLA-1.CAT zu erzeugen. Die Orientierung der transkriptionalen CTLA-1-Kontrollregion wurde durch Spaltung mit Restriktionsenzymen und DNA-Sequenzierung bestätigt.
Die provirale Struktur des retroviralen Vektors HyTK.CMVe.CTLA-1.CAT ist, wie in Fig. 4D abgebildet, aufgebaut, wobei "TCR" die transkriptionale CTLA-1-Kontrollregion, "Gen" das CAT-Gen und "ENH" den CMV-Enhancer darstellen. HyTK.CMVe.CTLA-1.CAT wurde unter Verwendung von Standardtechniken (Ausubel et al., 1987) wie folgt konstruiert: Ein den HCMV-IE94-Enhancer umfassendes Teilstück wurde mit Hilfe von HindIII aus HyTK.CMVe.hPerf.CAT ausgeschnitten (vgl. Beispiel 10) und in die HindIII-Stelle von HyTK.CTLA-1.CAT stromaufwärts der CTLA-1-transkriptionalen Kontrollregion inseriert, um HyTK.CMVe.CTLA-1.CAT zu erzeugen. Die Orientierung des Enhancers wurde durch Spaltung mit Restriktionsenzymen bestätigt.
Menschliche Jurkat-T-Lymphocyten wurden gezüchtet und transfiziert, wie in Beispiel 13 beschrieben, mit der Änderung, dass die Zellen mit 10 ug HyTK.CMV.CAT-, HyTK.lck- 7.CAT-, HyTK.CTLA-1.CAT- oder HyTK.CMVe.CTLA-1.CAT-Plasmid-DNAs transfiziert wurden.
Präparation und Untersuchung der CAT-Extrakte wurden durchgeführt, wie in Beispiel 13 beschrieben.
Wie in Fig. 11 angeführt, exprimierten Zellen, die mit dem negativen Kontrollvektor HyTK.lck-7.CAT transfiziert worden waren, keine signifikanten Spiegel von CAT-Aktivität. Zellen, die mit dem positiven Kontrollvektor HyTK.CMV.CAT transfiziert worden waren, exprimierten die CAT-Aktivität konstitutiv, und die Höhe der Expression erhöhte sich bei T- Zell-Aktivierung. Zellen, die mit HyTK.CTLA-1.CAT oder HyTK.CMVe.CTLA-1.CAT transfiziert worden waren und unaktiviert gelassen wurden, exprimierten keine signifikanten Spiegel an CAT-Aktivität. Mit HyTK.CTLA-1.CAT oder HyTK.CMVe.CTLA-1.CAT transfizierte Zellen jedoch exprimierten signifikante CAT-Aktivitätsspiegel als Folge der Aktivierung mit PMA und Ionomycin.
Die Ergebnisse zeigen, dass die transkriptionale CTLA-1-Kontrollregion und die transkriptionale CTLA-1-Kontrollregion in Verbindung mit dem CMV-Enhancer aktivierungsinduzierte Expression in menschlichen T-Lymphocyten vermitteln. Die Ergebnisse zeigen weiterhin, dass die CTLA-1-transkriptionale Kontrollregion und die transkriptionale CTLA-1-Kontrollregion in Verbindung mit dem CMV-Enhancer in menschlichen T- Lymphocyten wirksam ist, wenn sie in einem retroviralen Vektor inseriert sind.

Beispiel 16

Aktivierungsinduzierte Expression, vermittelt durch die transkriptionale IL-3-Kontrollregion in Kombination mit dem CMV-Enhancer und die transkriptionale CTLA-1-Kontrollregion in Kombination mit dem CMV-Enhancer, in peripheren Blut-T-Lymphocyten des Menschen

Die Plasmide wurden wie in den Beispielen 14 und 15 konstruiert.
Periphere Blut-T-Lymphocyten des Menschen wurden bereitgestellt und transfiziert wie in Beispiel 12, mit dem Unterschied, dass die Zellen mit 50 ug HyTK.CMV.CAT-, HyTK.lck- 7.CAT-, HyTK.CMVe.IL-3.CAT- oder HyTK.CMVe.CTLA-1.CAT- Plasmid-DNA transfiziert wurden.
Die transfizierten Zellen wurden aktiviert und CAT-Extrakte wurden präpariert und untersucht, wie in Beispiel 12 beschrieben, mit dem Unterschied, dass die transfizierten Zellen vor der Aktivierung für 3 h inkubiert wurden und dass die Extrakte nach Aktivierung von 20 h gewonnen wurden.
Wie in Fig. 12 dargestellt, exprimierten die Zellen, die mit dem negativen Kontrollvektor HyTK.lck-7.CAT transfiziert worden waren und unaktiviert gelassen (-) oder aktiviert worden waren (+), keine signifikanten CAT-Aktivitätsspiegel. Zellen, die mit dem positiven Kontrollvektor HyTK.CMV.CAT transfiziert worden und unaktiviert gelassen (-) worden waren, exprimierten die CAT-Aktivität konstitutiv, und der Spiegel der Expression war bei T- Zell-Aktivierung erhöht (+). Zellen, die mit HyTK.CMVe.IL-3.CAT oder HyTK.CMVe.CTLA-1.CAT transfiziert und unaktiviert gelassen (-) worden waren, exprimierten keine signifikanten Spiegel von CAT-Aktivität. Die mit HyTK.CMVe.IL-3.CAT oder HyTK.CMVe.CTLA-1.CAT transfizierten Zellen exprimierten jedoch nach Aktivierung für 24 h (+) signifikante Spiegel von CAT-Aktivität.
Die Ergebnisse zeigen, dass die transkriptionale IL-3-Kontrollregion in Verbindung mit dem CMV-Enhancer und die transkriptionale CTLA-1-Kontrollregion in Kombination mit dem CMV-Enhancer aktivierungsinduzierte Expression in menschlichen T-Lymphocyten vermitteln. Die Ergebnisse zeigen weiterhin, dass die transkriptionale IL-3-Kontrollregion in Verbindung mit dem CMV-Enhancer und die transkriptionale CTLA-1-Kontrollregion in Verbindung mit dem CMV-Enhancer in menschlichen T-Lymphocyten wirksam sind, wenn sie in einen retroviralen Vektor inseriert sind.

Beispiel 17

Aktivierungsinduzierte Expression, vermittelt durch die transkriptionale γ-IFN-Kontrollregion in Verbindung mit dem CMV-Enhancer, in menschlichen Jurkat-T-Lymphocyten

Plasmid-Konstruktionen

Plasmid HyTK.CMV.CAT wurde wie in Beispiel 10 konstruiert.
Die provirale Struktur des retroviralen Vektors HyTK.CMVe.γ-IFN. CAT ist, wie in Fig. 4D abgebildet, aufgebaut, wobei "TCR" die transkriptionale γ-IFN-Kontrollregion, "Gen" das CAT-Gen und "ENH" den CMV-Enhancer darstellen. HyTK.CMVe.γ-IFN. CAT wurde unter Verwendung von Standardtechniken (Ausubel et al., 1987) wie folgt konstruiert: Zuerst wurde das Plasmid tgγ-IFN.cat konstruiert. Dieses Plasmid beinhaltet die Nucleotide -541 bis +128 der menschlichen transkriptionalen γ-IFN-Kontrollregion (Ciccarone et al., 1990); Gray and Goeddel, 1982) gebunden an das CAT-Gen und gefolgt von einer retroviralen LTR-Sequenz zur Lieferung eines Polyadenylierungssignals, und beinhaltet eine 5' der transkriptionalen γ- IFN-Kontrollregion gelegene XhoI-Bindungsstelle. Ein Teilstück, das den HCMV-EE94- Enhancer umfasst, wurde mit Hilfe von XhoI und HindIII aus HyTK.CMVe.CTLA-1.CAT (vgl. Beispiel 15) ausgeschnitten, und T4-DNA-Polymerase wurde verwendet, um das kohäsive Ende von HindIII in ein glattes Ende zu überführen. Dieses Teilstück wurde dann in die XhoI-Stelle von tgγ-IFNcat ligiert, nachdem T4-DNA-Polymerase angewendet wurde, um das eines der kohäsiven XhoI-Enden in glatte Enden zu überführen, um tgCMVe.γ-IFNcat zu erzeugen. Die Orientierung des Enhancers wurde durch Spaltung mit Restriktionsenzymen bestätigt. Ein Teilstück, das den CMV-Enhancer, die transkriptionale γ-IFN-Kontrollregion und das 5'-Ende des CAT-Gens umfasst, wurde dann mit Hilfe von XhoI und EcoRI ausgeschnitten und zwischen die XhoI- und EcoRI-Stellen von HyTK.CMV.CAT ligiert (vgl. Beispiel 10), um HyTK.CMVe.γ-IFN.CAT zu erzeugen.
Um stabile PA317-Zelllinien zu erhalten, die amphotrope HyTK.CMV.CAT- oder HyTK.CMVe.γ-IFN.CAT-Viruspartikel produzieren, wurden die retroviralen Plasmid-DNAs zunächst in Ökotrope Ψ2-Verpackungszellen transfiziert. Ψ2-Zellen (Mann et al., 1983) wurden in DMEM, ergänzt mit 10% Kälberserum, 2 mM L-Glutamin, 50 U/ml Penicillin und 50 ug/ml Streptomycin bei 37ºC in befeuchteter, mit 10% CO&sub2; angereicherter Atmosphäre gezüchtet. Für die Transfizierung wurden Zellen mit exponentiellem Wachstum durch Trypsinisierung gewonnen, Serum-frei gewaschen und mit einer Konzentration von 10&sup7; Zellen/ml in DMEM resuspendiert. Plasmid-DNA (5-20 ug) wurde zu 800 ul Zellsuspension (8 · 10&sup6; Zellen) hinzugegeben, und das Gemisch wurde der Elektroporation mit dem Biorad-Gene Pulser und Capacitance Extender (200-300 V, 960 uF, 0,4 cm Elektrodenabstand bei Umgebungstemperatur) ausgesetzt. Die transfizierten Ψ2-Zellen wurden dann in eine 10 cm- Gewebekulturschale übertragen, die 10 ml des vollständigen Nährmediums, ergänzt mit 10 mM Natriumbutyrat enthielt, wo sie sich über Nacht anheften konnten. Nach 15 h wurde das Kulturmedium entfernt und durch frisches Kulturmedium ersetzt. Nach weiteren 24 h wurde das Kulturmedium, das transient produzierte amphotrope Viruspartikel enthielt, gewonnen, bei 2000 UpM für 10 min zentrifugiert und zur Infektion von amphotropen PA317- Verpackungszellen eingesetzt (Miller and Buttimore, 1986). PA317-Zellen wurden in DMEM, ergänzt mit 10% fötalem Rinderserum, 2 mM L-Glutamin, 50 U/ml Penicillin und 50 ug/ml Streptomycin, bei 37ºC in einer befeuchteten, mit 10% CO&sub2; angereicherten Atmosphäre gezüchtet. Sich exponentiell teilende PA317-Zellen wurden in einer Dichte von 10&sup6; Zellen/10 cm- Gewebekulturschale plattiert, wo sie sich über Nacht anheften konnten. Am folgenden Tag wurde das Kulturmedium entfernt und durch Verdünnungsserien des Virus enthaltenden Überstands (6 ml/Schale) in Kulturmedium ersetzt, ergänzt mit 4 ug/ml Polybrene. Die Infektion konnte über Nacht fortschreiten, und dann wurde der Überstand durch vollständiges Nährmedium ersetzt. Infizierte Zellen wurden nach weiteren 8-24 h Wachstum durch die Zugabe von Hygromycin B in einer Endkonzentration von 500 mg/ ml auf Wirkstoff-Resistenz selektiert. Kolonien von Hmr-Zellen wurden 12-14 Tage später mittels eines Clonierungszylinders isoliert und individuell vermehrt, oder sie wurden gesammelt und als polyclonale Kulturen vermehrt. Die Zellen wurden mit dem Southern-Analyse-Verfahren untersucht, um die Integrität des retroviralen Provirus zu bestimmen, und die Produktion von retroviralen Partikeln wurde durch Titration auf NIH 3T3-Zellen mit Standardtechniken (Ausubel et al., 1987) gemessen. Kulturen, die ein nicht umgelagertes retrovirales Provirus enthielten und einen hohen Titer von infektiösen Retrovirus-Partikeln produzierten, wurden zur Infektion von menschlichen Jurkat-T-Lymphocyten verwendet.
Jurkat-Zellen wurden in RPMI 1640-Medium, ergänzt mit 10% fötalem Rinderserum, 0,1 mM nicht-essentellen Aminosäuen, 50 uM 2-Mercaptoethanol, 2 mM. L-Glutamin, 50 U/ml Penicillin und 50 ug/ml Streptomycin, bei 37ºC in einer angefeuchteten, mit 5% CO&sub2; angereicherten Atmosphäre gezüchtet. Aliquots von (5 · 10&sup6;) Zellen wurden mit 5 ml des Überstandes von den amphotropen Retrovirus produzierenden PA317-Zellen, ergänzt mit 4 ug/ml Polybrene, für 24 h inkubiert. Die Zellen wurden dann durch Zentrifugation bei 1600 UpM für 10 min bei 4ºC in einer Sorvall RT6000D-Tischzentrifuge gesammelt und in 20 ml vollständigem Kulturmedium resuspendiert. Nach Inkubation für 24 h wurden die Zellen auf Platten mit 96 Vertiefungen in Dichten von 50, 10, 1 oder 0,1 Zellen/Vertiefung in vollständigem Kulturmedium mit einem Volumen von 0,2 ml/ Vertiefung plattiert. Nach der Inkubation für 7d wurden 0,1 ml des Kulturmediums von jeder Vertiefung entfernt und durch vollständiges Kulturmedium, ergänzt mit 400 ug/ml Hygromycin B, ersetzt. Nach einer weiteren Inkubation über 7-14d wurden Hmr-Clone der Zellen auf Platten mit 24 Vertiefungen übertragen und zur Analyse vermehrt.
Zur Herstellung und Untersuchung von CAT-Extrakten wurden Aliquots (4 · 10&sup6;) der infizierten Zellen entweder unaktiviert gelassen oder wurden durch Quervernetzung des T-Zell- Rezeptors mit einem oberflächengebundenen monocionalen anti-CD3-Antikörper aktiviert. 24 h nach der Aktivierung wurden die Zellen geerntet, und CAT-Extrakte wurden hergestellt und untersucht, wie in Beispiel 12 beschrieben, mit der Ausnahme, dass die Extrakte in 60 ul 0,25 M Tris (pH 8,0) hergestellt wurden.
Wie in Fig. 13 dargestellt, exprimierten die Zellen, die mit dem positiven retroviralen Kontrollvektor HyTK.CMV.CAT infiziert worden und unaktiviert gelassen worden waren, die CAT-Aktivität konstitutiv, und der Spiegel der Expression war bei T-Zell-Aktivierung erhöht. Zellen, die mit dem retroviralen HyTK.CMVe.γ-IFN.CAT- Vektor infiziert und unaktiviert gelassen worden waren, exprimierten keine signifikanten CAT-Aktivitätsspiegel. Die mit dem HyTK.CMVe.γ-IFN.CAT retroviralen Vektor infizierten Zellen zeigten jedoch nach Aktivierung für 24 h signifikante Spiegel von CAT-Aktivität.
Die Ergebnisse zeigen, dass die transkriptionale γ-IFN-Kontrollregion in Verbindung mit dem CMV-Enhancer aktivierungsinduzierte Expression in menschlichen T-Lymphocyten vermittelt.
Die Ergebnisse zeigen weiterhin, dass die transkriptionale γ-IFN- Kontrollregion in Verbindung mit dem CMV-Enhancer in menschlichen T-Lymphocyten wirksam ist, wenn sie in einen retroviralen Vektor inseriert und über retrovirale Infektion übertragen worden ist.

Beispiel 18

Aktivierungsinduzierte Expression, vermittelt durch die transkriptionale γ- IFN-Kontrollregion in Verbindung mit dem CMV-Enhancer und der transkriptionalen IL-3-Kontrollregion in Kombination mit dem CMV-Enhancer, in peripheren Blut-T-Lymphocyten des Menschen

Die Plasmide HyTK.lck-7.CAT und HyTK.CMV.CAT wurden wie in Beispiel 10 hergestellt. Die Plasmide HyTK.hIL-3.CAT und HyTK.CMVe.hIL-3.CAT wurden hergestellt, wie in Beispiel 4 und Beispiel 14 beschrieben. Das Plasmid HyTK.CMVe.γ-IFN.CAT wurde, wie in Beispiel 17 beschrieben, konstruiert.
Die provirale Struktur des retroviralen Vektors HyTK.γ-IFN.CAT ist, wie in Fig. 4C gezeigt, aufgebaut, wobei "TCR" die transkriptionale γ-IFN-Kontrollregion und "Gen" das CAT-Gen darstellen. HyTK.γ-IFN.CAT wurde mit Hilfe von Standardtechniken (Ausubel et al., 1987) wie folgt gebildet: Ein XhoI-EcoRI Teilstück, das die transkriptionale γ-IFN-Kontrollregion und das 5'-Ende des CAT-Gens umfasst, wurde von tgγ-IFNcat (vgl. Beispiel 17) ausgeschnitten, und ein BstE2-XhoI Teilstück, das das HyTK-Gen umfasst, wurde aus HyTK.CMV.IL-2 (vgl. Beispiel 10) ausgeschnitten. Diese beiden Teilstücke wurden dann zwischen die BstE2- und EcoRI-Bindungsstellen von HyTK.CMV.CAT ligiert (vgl. Beispiel 10), um HyTK.γ-IFN.CAT zu erzeugen.
Periphere Blut-T-Zellen des Menschen wurden vorbereitet und transfiziert, wie in Beispiel 12 beschrieben, mit dem Unterschied, dass die Zellen mit 50 ug, HyTK.lck-7.CAT-, HyTK.CMV.CAT-, HyTK.γ-IFN.CAT, HyTK.CMVe.γ-IFN.CAT, HyTK.IL-3.CAT oder HyTK.CMVe.IL-3.CAT-Plasmid-DNA transfiziert wurden.
Die transfizierten Zellen wurden entweder unaktiviert gelassen (-) oder wurden durch Quervernetzung des T-Zell-Rezeptors mit einem Oberflächen gebundenen monocionalen anti- CD3-Antikörper sofort nach der Transfizierung aktiviert (+). 20 h nach der Aktivierung wurden die Zellen geerntet, und die CAT-Extrakte wurden hergestellt und untersucht, wie in Beispiel 12 beschrieben, mit dem Unterschied, dass ein 5 ul Aliquot des aus den mit HyTK.CMV.CAT transfizierten Zellen hergestellten Extraktes untersucht wurde.
Wie in Fig. 14 dargestellt, exprimierten die Zellen, die mit dem negativen Kontrollvektor HyTK.lck-7.CAT transfiziert worden und unaktiviert gelassen (-) oder aktiviert worden (+) waren, keine signifikanten CAT-Aktivitätsspiegel. Zellen, die mit dem positiven Kontrollvektor HyTK.CMV.CAT transfiziert worden und unaktiviert (-) gelassen worden waren, exprimierten die CAT-Aktivität konstitutiv, und der Spiegel der Expression war bei T-Zell-Aktivierung (+) erhöht. Zellen, die mit dem HyTK.CMVe.γ-IFN. CAT oder HyTK.CMVe.IL-3.CAT transfiziert und unaktiviert gelassen (-) worden waren, exprimierten keine signifikanten CAT- Aktivitätsspiegel. Die mit dem HyTK.CMVe.γ-IFN. CAT oder HyTK.CMVe.IL-3.CAT infizierten Zellen exprimierten jedoch nach Aktivierung für 20 h (+) signifikante Spiegel von CAT-Aktivität.
Die Ergebnisse zeigen, dass die transkriptionale γ-IFN-Kontrollregion in Verbindung mit dem CMV-Enhancer und die transkriptionale IL-3-Kontrollregion in Verbindung mit dem CMV- Enhancer aktivierungsinduzierte Expression in menschlichen T-Lymphocyten-vermitteln und dass der CMV-Enhancer verwendet werden kann, um den Spiegel der akktivierungsinduzierten Expression der transkriptionalen γ-IFN- und IL-3-Kontrollregionen in menschlichen T- Lymphocyten zu erhöhen. Die Ergebnisse zeigen weiterhin, dass die transkriptionale γ-IFN- Kontrollregion in Verbindung mit dem CMV-Enhancer und die transkriptionale IL-3- Kontrollregion in Kombination mit dem CMV-Enhancer in menschlichen T-Lymphocyten wirksam sind, wenn sie in einen retroviralen Vektor inseriert sind.

Beispiel 19

Aktivierungsinduzierte Expression in murinen T-Lymphocyten

Die Plasmide HyTK.lck-7.CAT, HyTK.CMV.CAT und HyTK.CMVe.LT.CAT wurden, wie in Beispiel 10 beschrieben, hergestellt. Die Plasmide HyTK.CMVe.IL-2Rα.CAT, HyTK.CMVe.hIL-3.CAT, HyTK.CMVe.CTLA-1.CAT und HyTK.CMVe.γ-IFN.CAT wurden, wie in den Beispielen 11, 14, 15, bzw. 17 beschrieben, hergestellt.
Herstellung und Transfizierung muriner T-Lymphocyten wurde wie folgt durchgeführt. Von C57 B1/6- und DBA/2-Mäusen wurde die Milz entfernt und in vollständigem Kulturmedium zergliedert (Iscove-Medium, ergänzt mit 10% fötalem Rinderserum, 0,1 mM nicht-essentellen Aminosäuen, 50 uM 2-Mercaptoethanol, 2 mM L-Glutamin, 1 mM Natriumpyruvat, 50 U/ml Penicillin und 50 ug/ml Streptomycin), um Einzelzell-Suspensionen zu bilden. Die Zellen wurden dann in einem konischen 50 ml-Röhrchen über Isolymphe geschichtet und bei 2000 UpM für 20 min bei 20ºC in einer Sorvall RT6000D-Tischzentrifuge zentrifugiert. Die Zellen in der Grenzschicht wurden durch Zentrifugation bei 1600 UpM für 10 min bei 4ºC in einer Sorvall RT6000D-Tischzentrifuge zentrifugiert, zweimal durch Resuspension in vollständigem Kulturmedium gewaschen und bei 1600 UpM für 10 min bei 4ºC in einer Sorvall RT6000D- Tischzentrifuge zentrifugiert und in vollständigem Kulturmedium resuspendiert. Die DBA/2- Zellen wurden dann mit 3500 rad bestrahlt, und es wurde eine gemischte Leukocyten-Kultur (MLC) durch das Mischen von 7,5 · 10&sup7; bestrahlten DBA/2-Zellen mit 7,5 · 10&sup7; C57B1/6- Zellen in einem Volumen von 20 ml in einem T-75 Kulturkolben angesetzt. Nach Inkubation bei 37ºC in befeuchteter, mit 5% CO&sub2; angereicherter Atmosphäre über 3d wurden die Zellen aus der MLC geerntet, durch Zentrifugation bei 1600 UpM für 10 min bei 4ºC in einer Sorvall RT6000D-Tischzentrifuge pelletiert und dann in 30 ml vollständigem Kulturmedium resuspendiert. Die Zellen wurden dann in einem konischen 50 ml-Röhrchen über Isolymphe geschichtet und bei 2000 UpM für 20 min bei 20ºC in einer Sorvall RT6000D- Tischzentrifuge zentrifugiert. Die Zellen in der Grenzschicht wurden durch Zentrifugation bei 1600 UpM für 10 min bei 4ºC in einer Sorvall RT6000D-Tischzentrifuge zentrifugiert, zweimal durch Resuspension in vollständigem Kulturmedium gewaschen und bei 1600 UpM für 10 min bei 4ºC in einer Sorvall RT6000D-Tischzentrifuge zentrifugiert, und dann wurden 7,5 · 10&sup6; Zellen in 30 ml vollständigem Kulturmedium, ergänzt mit 5 ng/ml rekombinantem menschlichen IL-2, in einem T-75 Kulturkolben resuspendiert. Nach einer weiteren Inkubation für 3d bei 37ºC in befeuchteter, mit 5% COs angereicherter Atmosphäre wurden die T- Zellen mit Affinitätschromatographie unter Verwendung einer CD3+-T-Zell-Reinigungsssäule (Biotecx) mit Standardverfahren gereinigt. Aliquots der Zellen (1 · 10&sup7;) wurden mit 50 ug HyTK.lck-7.CAT-, HyTK.CMV.CAT-, HyTK.CMVe.γ-IFN.CAT-, HyTK.CMVe.hIL- 3.CAT-, HyTK.CMVe.LT.CAT-, HyTK.CMVe.CTLA-1.CAT-, HyTK.CMVe.IL-2Rα.CAT- Plasmid-DNA in 0,8 ml vollständigem Kulturmedium unter Verwendung einer 0,4 cm-Küvette und einer Biorad-Gen Pulser-Anlage bei 300 V und 960 uF einer Elektroporation unterworfen.
Zur Herstellung und Untersuchung von CAT-Extrakten wurden die transfizierten Zellen entweder unaktiviert gelassen oder wurden durch Quervernetzung des T-Zell-Rezeptors mit einem Oberflächen gebundenen, monocionalen anti-CD3-Antikörper sofort nach der Transfizierung aktiviert. 24 h nach der Aktivierung wurden die Zellen geerntet, und die CAT- Extrakte wurden hergestellt und untersucht, wie in Beispiel 12 beschrieben, mit dem Unterschied, dass die Extrakte in 60 ul 0,25 M Tris (pH 8,0) hergestellt wurden, und ein 5 ul- Aliquot des aus mit HyTK.CMV.CAT transfizierten Zellen hergestellten Extraktes wurden untersucht.
Wie in Fig. 15 dargestellt, exprimierten die Zellen, die mit dem negativen Kontrollvektor HyTK.lck-7.CAT transfiziert worden und entweder unaktiviert gelassen oder aktiviert worden waren, keine signifikanten CAT-Aktivitätsspiegel. Zellen, die mit dem positiven Kontrollvektor HyTK.CMV.CAT transfiziert worden und unaktiviert gelassen worden waren, exprimierten die CAT-Aktivität konstitutiv, und der Spiegel der Expression war bei T-Zell-Aktivierung erhöht. Zellen, die mit HyTK.CMVe.γ-IFN. CAT oder HyTK.CMVe.IL-3.CAT transfiziert und unaktiviert gelassen worden waren, exprimierten keine signifikanten CAT-Aktivitätsspiegel. Die mit HyTK.CMVe.γ-IFN. CAT oder HyTK.CMVeIL-3.CAT transfizierten Zellen exprimierten jedoch nach Aktivierung für 24 h signifikante Spiegel von CAT-Aktivität. Eine geringe aktivierungsinduzierte Expression war auch bei den Zellen zu sehen, die mit HyTK.CMVe.LT.CAT oder HyTK.CMVe.CTLA-1.CAT transfiziert worden waren.
Die Ergebnisse zeigen, dass die transkriptionale γ-IFN-Kontrollregion in Verbindung mit dem CMV-Enhancer und die transkriptionale IL-3-Kontrollregion in Verbindung mit dem CMV- Enhancer aktivierungsinduzierte Expression in murinen T-Lymphocyten vermitteln. Die Ergebnisse zeigen weiterhin, dass die transkriptionale γ-IFN-Kontrollregion in Verbindung mit dem CMV-Enhancer und die transkriptionale IL-3-Kontrollregion in Kombination mit dem CMV-Enhancer in murinen T-Lymphocyten wirksam sind, wenn sie in einen retroviralen Vektor inseriert sind.

Beispiel 20

Antigen-induzierte Expression, vermittelt durch die transkriptionale γ-IFN- Kontrollregion in Verbindung mit dem CMV-Enhancer, in murinen T-Lymphocyten

Plasmidkonstruktionen

Die Plasmide HyTK.lck-7.CAT und HyTK.CMV.CAT wurden, wie in Beispiel 10, hergestellt. Plasmid HyTK.CMVe.γ-IFN. CAT wurde, wie in Beispiel 17, konstruiert.
Herstellung und Transfizierung muriner T-Lymphocyten wurden durchgeführt, wie in Beispiel 19 beschrieben.
Zur Herstellung und Untersuchung von CAT-Extrakten wurden die transfizierten Zellen entweder unaktiviert gelassen, indem sie in Gegenwart von bestrahlten C57B1/6-Milzzellen inkubiert wurden, oder sie wurden sofort nach der Transfizierung aktiviert, indem sie in Gegenwart von bestrahlten allogenen DBA/2-Milzzellen inkubiert wuren, um eine antigene Stimulation zu erhalten. 24 h nach der Aktivierung wurden die Zellen geerntet, und CAT- Extrakte wurden hergestellt und untersucht, wie in Beispiel 19 beschrieben.
Wie in Fig. 16 dargestellt, exprimierten die Zellen, die mit dem negativen Kontrollvektor HyTK.lck-7.CAT transfiziert worden und unaktiviert gelassen oder mit Antigen aktiviert worden waren, keine signifikanten CAT-Aktivitätsspiegel. Zellen, die mit dem positiven Kontrollvektor HyTK.CMV.CAT transfiziert worden und unaktiviert gelassen worden waren, exprimierten die CAT-Aktivität konstitutiv, und der Spiegel der Expression war bei Antigen- Aktivierung erhöht. Zellen, die mit dem HyTK.CMVe.γ-IFN.CAT transfiziert und unaktiviert gelassen worden waren, exprimierten keine signifikanten CAT-Aktivitätsspiegel. Die mit dem HyTK.CMVe.γ-IFN.CAT transfizierten Zellen exprimierten jedoch nach Aktivierung für 24 h mit Antigen signifikante Spiegel von CAT-Aktivität.
Die Ergebnisse zeigen, dass die transkriptionale γ-IFN-Kontrollregion in Verbindung mit dem CMV-Enhancer Antigen-induzierte Expression in murinen T-Lymphocyten vermittelt. Die Ergebnisse zeigen weiterhin, dass die γ-IFN-transkriptionale Kontrollregion in Verbindung mit dem CMV-Enhancer in murinen T-Lymphocyten wirksam ist, wenn sie in einen retroviralen Vektor inseriert ist.

Beispiel 21

Aktivierungsinduzierte Expression in murinen CD8+-T-Lymphocyten

Plasmidkonstruktionen

Die Plasmide HyTK.lck-7.CAT, HyTK.CMV.CAT und HyTK.CMVe.LT.CAT wurden, wie in Beispiel 10 beschrieben, hergestellt. Die Plasmide HyTK.CMVe.IL-2Rα.CAT, HyTK.CMVe.hIL-3.CAT, HyTK.CMVe.CTLA-1.CAT und HyTK.CMVe.γ-IFN.CAT wurden, wie in den Beispielen 11, 14, 15 bzw. 17 beschrieben, hergestellt.
Zur Herstellung und Transfizierung von murinen CD8+T-Lymphocyten wurden CD8+-T- Lymphocyten, wie in Beispiel 19 beschrieben, hergestellt und transfiziert, mit dem Unterschied, dass die CD8+-Zellen mittels einer CD8+-T-Zell-Reinigungssäule anstatt einer CD3+-T-Zell- Reinigungssäule gereinigt wurden.
Herstellung und Untersuchung der CAT-Extrakte wurden, wie in Beispiel 19 beschrieben, durchgeführt. Wie in Fig. 17 dargestellt, exprimierten die Zellen, die mit dem negativen Kontrollvektor HyTK.lck-7.CAT transfiziert worden und entweder unaktiviert gelassen oder aktiviert worden waren, keine signifikanten CAT-Aktivitätsspiegel. Zellen, die mit dem positiven Kontrollvektor HyTK.CMV.CAT transfiziert worden und unaktiviert gelassen worden waren, exprimierten die CAT-Aktivität konstitutiv, und der Spiegel der Expression war bei T-Zell-Aktivierung erhöht. Zellen, die mit dem HyTK.CMVe.γ-IFN.CAT oder HyTK.CMVe.IL-3.CAT transfiziert und unaktiviert gelassen worden waren, exprimierten keine signifikanten CAT-Aktivitätsspiegel. Die mit HyTK.CMVe.γ-IFN.CAT oder HyTK.CMVe.IL-3.CAT transfizierten Zellen exprimierten jedoch nach Aktivierung für 24 h signifikante Spiegel von CAT-Aktivität. Eine kleine Menge aktivierungsinduzierter Expression war auch in den mit HyTK.CMVe.LT.CAT transfizierten Zellen festzustellen.
Die Ergebnisse zeigen, dass die transkriptionale γ-IFN-Kontrollregion in Verbindung mit dem CMV-Enhancer und die transkriptionale IL-3-Kontrollregion in Verbindung mit dem CMV- Enhancer aktivierungsinduzierte Expression in murinen CD8+-T-Lymphocyten vermitteln. Die Ergebnisse zeigen weiterhin, dass die transkriptionale γ-IFN-Kontrollregion in Verbindung mit dem CMV-Enhancer und die transkriptionale IL-3-Kontrollregion in Kombination mit dem CMV-Enhancer in murinen CD8+-T-Lymphocyten wirksam sind, wenn sie in einen retroviralen Vektor inseriert sind.

Beispiel 22

Antigen-induzierte Expression, vermittelt durch die transkriptionale γ-IFN- Kontrollregion in Verbindung mit dem CMV-Enhancer, in murinen CD8+-T- Lymphocyten

Plasmidkonstruktionen

Die Plasmide HyTK.lck-7.CAT und HyTK.CMV.CAT wurden wie in Beispiel 10 hergestellt. Plasmid HyTK.CMVe.γ-IFN.CAT wurde wie in Beispiel 17 konstruiert.
Herstellung und Transfizierung von murinen T-Lymphocyten wurde durchgeführt, wie in Beispiel 21 beschrieben.
Zur Herstellung und Untersuchung von CAT-Extrakten wurden die transfizierten Zellen entweder unaktiviert gelassen, indem sie in Gegenwart von bestrahlten C57B1/6-Milzzellen inkubiert wurden, oder sie wurden sofort nach der Transfizierung aktiviert, indem sie in Gegenwart von bestrahlten allogenen DBA/2-Milzzellen inkubiert wurden, um eine antigene Stimulation zu erhalten. 24 h nach der Aktivierung wurden die Zellen geerntet, und CAT- Extrakte wurden hergestellt und untersucht, wie in Beispiel 19 beschrieben.
Wie in Fig. 18 dargestellt, exprimierten die Zellen, die mit dem negativen Kontrollvektor HyTK.lck-7.CAT transfiziert worden und unaktiviert gelassen oder mit Antigen aktiviert worden waren, keine signifikanten CAT-Aktivitätsspiegel. Zellen, die mit dem positiven Kontrollvektor HyTK.CMV.CAT transfiziert worden und unaktiviert gelassen worden waren, exprimierten die CAT-Aktivität konstitutiv, und der Spiegel der Expression war bei Antigen- Aktivierung erhöht. Zellen, die mit HyTK.CMVe.γ-IFN.CAT transfiziert und unaktiviert gelassen worden waren, exprimierten keine signifikanten CAT-Aktivitätsspiegel. Die mit HyTK.CMVe.γ-IFN.CAT transfizierten Zellen exprimierten jedoch nach Aktivierung für 24 h mit Antigen signifikante Spiegel von CAT-Aktivität.
Die Ergebnisse zeigen, dass die transkriptionale γ-IFN-Kontrollregion in Verbindung mit dem CMV-Enhancer Antigen-induzierte Expression in murinen CD8+-T-Lymphocyten vermittelt.
Die Ergebnisse zeigen weiterhin, dass die transkriptionale γ-IFN-Kontrollregion in Verbindung mit dem CMV-Enhancer in murinen CD8+-T-Lymphocyten wirksam ist, wenn sie in einen retroviralen Vektor inseriert ist.

Beispiel 23

Aktivierungsinduzierte Expression in peripheren Blut-T-Lymphocyten des Menschen

Plasmidkonstruktionen

Die Plasmide HyTK.lck-7.CAT, HyTK.CMV.CAT und HyTK.CMVe.LT.CAT wurden, wie in Beispiel 10 beschrieben, hergestellt. Die Plasmide HyTK.CMVe.IL-2Rα.CAT, HyTK.CMVe.hIL-3.CAT, HyTK.CMVe.CTLA-1.CAT und HyTK.CMVe.γ-IFN.CAT wurden, wie in den Beispielen 11, 14, 15 bzw. 17 beschrieben, hergestellt.
Menschliche periphere Blut-T-Zellen wurden hergestellt und transfiziert, wie in Beispiel 12 beschrieben, mit dem Unterschied, dass die Zellen mit 100 ug HyTK.lck-7.CAT-, HyTK.CMV.CAT-, HyTK.γ-IFN.CAT-, HyTK.CMVe.γ-IFN.CAT-, HyTK.IL-3.CAT- oder HyTK.CMVe.IL-3.CAT-Plasmid-DNA unter Verwendung einer 0,4 cm-Küvette und einer Biorad-Gene Pulser-Anlage bei 400 V und 960 uF transfiziert wurden.
Zur Herstellung und Untersuchung von CAT-Extrakten wurden die transfizierten Zellen entweder unaktiviert gelassen oder wurden durch Quervernetzung des T-Zell-Rezeptors mit einem Oberflächen gebundenen, monocionalen anti-CD3-Antikörper sofort nach der Transfizierung aktiviert. 24 h nach der Aktivierung wurden die Zellen geerntet, und die CAT- Extrakte wurden hergestellt und untersucht, wie in Beispiel 12 beschrieben, mit dem Unterschied, dass die Extrakte in 60 ul 0,25 M Tris (pH 8,0) hergestellt wurden, und ein 5 ul- Aliquot des aus mit HyTK.CMV.CAT transfizierten Zellen hergestellten Extraktes wurde untersucht.
Wie in Fig. 19 dargestellt, exprimierten die Zellen, die mit dem negativen Kontrollvektor HyTK.lck-7.CAT transfiziert worden und entweder unaktiviert gelassen oder aktiviert worden waren, keine signifikanten CAT-Aktivitätsspiegel. Zellen, die mit dem positiven Kontrollvektor HyTK.CMV.CAT transfiziert worden und unaktiviert gelassen worden waren, exprimierten die CAT-Aktivität konstitutiv, und der Spiegel der Expression war bei T-Zell-Aktivierung vermindert. Zellen, die mit dem HyTK.CMVe.γ-IFN.CAT oder HyTK.CMVe.IL-3.CAT transfiziert und unaktiviert gelassen worden waren, exprimierten keine signifikanten CAT- Aktivitätsspiegel. Diemit HyTK.CMVe.γ-IFN.CAT oder HyTK.CMVe.IL-3.CAT infizierten Zellen exprimierten jedoch nach Aktivierung für 24 h signifikante Spiegel von CAT-Aktivität. Eine geringe aktivierungsinduzierte Expression war auch bei den Zellen zu sehen, die mit HyTK.CMVe.LT.CAT oder HyTK.CMVe.IL-2Rα.CAT transfiziert worden waren.
Die Ergebnisse zeigen, dass die transkriptionale γ-IFN-Kontrollregion in Verbindung mit dem CMV-Enhancer und die transkriptionale IL-3-Kontrollregion in Verbindung mit dem CMV- Enhancer aktivierungsinduzierte Expression in menschlichen T-Lymphocyten vermitteln. Die Ergebnisse zeigen weiterhin, dass die transkriptionale γ-IFN-Kontrollregion in Verbindung mit dem CMV-Enhancer und die transkriptionale IL-3-Kontrollregion in Kombination mit dem CMV-Enhancer in menschlichen T-Lymphocyten wirksam sind, wenn sie in einen retroviralen Vektor inseriert sind.

Beispiel 24

Aktivierungsinduzierte Expression in menschlichen peripheren CD4+-T- Lymphocyten aus Blut

Plasmidkonstruktionen

Die Plasmide HyTK.lck-7.CAT, HyTK.CMV.CAT und HyTK.CMVe.LT.CAT wurden, wie in Beispiel 10 beschrieben, hergestellt. Die Plasmide HyTK.CMVe.IL-2Rα.CAT, HyTK.CMVe.hIL-3.CAT, HyTK.CMVe.CTLA-1.CAT und HyTK.CMVe.γ-IFN.CAT wurden, wie in den Beispielen 11, 14, 15 bzw. 17 beschrieben, hergestellt.
Menschliche periphere Blut-T-Zellen wurden hergestellt, wie in Beispiel 12 beschrieben. Die CD8+-Zellen wurden dann mit Hilfe von CD5-konjugierten Magnetperlen (Dynal) aus der Population entfernt. Aliquots (4 · 10&sup6;) der gereinigten Zellen wurden mit 100 ug HyTK.lck- 7.CAT-, HyTK.CMV.CAT-, HyTK.γ-IFN.CAT-, HyTK.CMVe.γ-IFN.CAT-, HyTK.IL- 3.CAT-, oder HyTK.CMVe.IL-3.CAT-Plasmid-DNA in 0,8 ml vollständigem Kulturmedium in einer 0,4 cm-Küvette unter Verwendung einer Biorad-Gene Pulser-Anlage bei 400 V und 960 uF transfiziert.
Herstellung und Untersuchung der CAT-Extrakte wurden, wie in Beispiel 23 beschrieben, durchgeführt.
Wie in Fig. 20 dargestellt, exprimierten die Zellen, die mit dem negativen Kontrollvektor HyTK.lck-7.CAT transfiziert worden und entweder unaktiviert gelassen oder aktiviert worden waren, keine signifikanten CAT-Aktivitätsspiegel. Zellen, die mit dem positiven Kontrollvektor HyTK.CMV.CAT transfiziert worden und unaktiviert gelassen worden waren, exprimierten die CAT-Aktivität konstitutiv, und der Spiegel der Expression war bei T-Zell-Aktivierung erhöht. Zellen, die mit HyTK.CMVe.IL-3.CAT transfiziert und unaktiviert gelassen worden waren, exprimierten keine signifikanten CAT-Aktivitätsspiegel. Die mit HyTK.CMVe.IL-3.CAT transfizierten Zellen exprimierten jedoch nach Aktivierung für 24 h signifikante Spiegel von CAT-Aktivität. Eine geringere alktivierungsinduzierte Expression war auch in den mit HyTK.CMVe.γ-IFN. CAT oder HyTK.CMVe.LT.CAT, HyTK.CMVe.CTLA-1.CAT oder HyTK.CMVe.IL-2Rα.CAT transfizierten Zellen festzustellen.
Die Ergebnisse zeigen, dass die transkriptionale IL-3-Kontrollregion in Verbindung mit dem CMV-Enhancer aktivierungsinduzierte Expression in menschlichen CD4+-T-Lymphocyten vermittelt. Die Ergebnisse zeigen weiterhin, dass die transkriptionale IL-3-Kontrollregion in Verbindung mit dem CMV-Enhancer in menschlichen CD4+-T-Lymphocyten wirksam ist, wenn sie in einen retroviralen Vektor inseriert ist.

Beispiel 25

Aktivierungsinduzierte Expression in menschlichen peripheren CD8+-T- Lymphocyten aus Blut

Plasmidkonstruktionen

Die Plasmide HyTK.lck-7.CAT, HyTK.CMV.CAT und HyTK.CMVe.LT.CAT wurden, wie in Beispiel 10 beschrieben, hergestellt. Die Plasmide HyTK.CMVe.IL-2Rα.CAT, HyTK.CMVe.hIL-3.CAT, HyTK.CMVe.CTLA-1.CAT und HyTK.CMVe.γ-IFN.CAT wurden, wie in den Beispielen 11, 14, 15 bzw. 17 beschrieben, hergestellt.
Menschliche periphere Blut-T-Zellen wurden hergestellt, wie in Beispiel 24 beschrieben, mit dem Unterschied, dass die CD4+-Zellen dann mit Hilfe von CD4-konjugierten Magnetperlen (Dynal) aus der Population entfernt wurden.
Die Herstellung und Untersuchung der CAT-Extrakte wurden, wie in Beispiel 23 beschrieben, durchgeführt.
Wie in Fig. 21 dargestellt, exprimierten die Zellen, die mit dem negativen Kontrollvektor HyTK.lck-7.CAT transfiziert worden und entweder unaktiviert gelassen oder aktiviert worden waren, keine signifikanten CAT-Aktivitätsspiegel. Zellen, die mit dem positiven Kontrollvektor HyTK.CMV.CAT transfiziert worden und unaktiviert gelassen worden waren, exprimierten die CAT-Aktivität konstitutiv, und der Spiegel der Expression war bei T-Zell-Aktivierung erhöht. Zellen, die mit HyTK.CMVe.γ-DFN.CAT, HyTK.CMVe.IL-3.CAT oder HyTK.CMVe.LT.CAT transfiziert und unaktiviert gelassen worden waren, exprimierten keine signifikanten CAT-Aktivitätsspiegel. Die mit HyTK.CMVe.γ-IFN.CAT, HyTK.CMVe.IL- 3.CAT oder HyTK.CMVe.LT.CAT transfizierten Zellen exprimierten jedoch nach Aktivierung für 24 h signifikante Spiegel von CAT-Aktivität. Eine geringere aktivierungsinduzierte Expression war auch in den mit HyTK.CMVe.CTLA-1.CAT oder HyTK.CMVe.IL-2Rα.CAT transfizierten Zellen festzustellen.
Die Ergebnisse zeigen, dass die transkriptionalen Kontrollregionen von γ-IFN, IL-3, LT, CTLA-1 und IL-2Rα in Verbindung mit dem CMV-Enhancer aktivierungsinduzierte Expression in menschlichen CD8+-T-Lymphocyten vermittelt. Die Ergebnisse zeigen weiterhin, dass die transkriptionalen Kontrollregionen von γ-IFN, IL-3, LT, CTLA-1 und IL- 2Rα in Verbindung mit dem CMV-Enhancer in menschlichen CD8+-T-Lymphocyten wirksam sind, wenn sie in einen retrovirailen Vektor inseriert sind.

Beispiel 26

Aktivierungsinduzierte Expression in einem retroviral infizierten menschlichen CMV- spezifischen cytotoxischen CD8+-T-Lymphocyten-Clon

Die Plasmide HyTK.CMV.CAT und HyTK.CMVe.LT.CAT wurden wie in Beispiel 10 hergestellt. Plasmid HyTK.CMVe.γ-IFN.CAT wurde wie in Beispiel 17 konstruiert.
Amphotrope produzierende PA317-Clone wurden, wie in Beispiel 17 erzeugt und charakterisiert.
Der CMV-spezifische menschliche cytotoxische CD8+-T-Zell-Clon MRL 1A3 wurde von einem freiwilligen CMV-seropositiven Spender mit den vorstehend beschriebenen Verfahren (Riddell et al., 1991) gewonnen. Dieser Clon hatte einen CD3+, CD8+, CD4-Phänotyp in der FACS-Analyse und vermittelte Klasse I-MHC-beschränkte cytolytische Aktivität, die für autologe CMV infizierte Fibroblasten spezifisch war. MRL 1A3 wurde durch zyklische Stimulation mit autologen CMV infizierten Fibroblasten oder monocionalen anti-CD3- Antikörper vermehrt, um Stimulation des T-Zell-Rezeptors und γ-bestrahlte Nährzellen zu erhalten, wie vorstehend beschrieben (Riddell and Greenberg, 1990).
Die Infektion des CMV-reaktiven menschlichen CD8+-CTL-Clons MRL 1A3 wurde in folgender Weise durchgeführt. Für die retrovirale Transduktion wurden Aliquots von 5 · 10&sup5; MRL 1A3-T-Zellen mit monoclonalem anti-CD3-Antikörper und y-bestrahlten Nährzellen stimuliert und die Kulturen mit IL-2 in einer Konzentration von 30 U/ml 1 d nach der Stimulation versetzt. Drei Tage nach der Stimulation wurden die Zellen in einem Verhältnis von 1 : 1 Vol./Vol. Überständen ausgesetzt, die retrovirale Partikel von HyTK.CMV.CAT, HyTK.CMVe.γ-IFN. CAT oder HyTK.CMVe.LT.CAT enthielten. Das Kulturmedium wurde mit Polybrene in einer Konzentration von 5 ug/ml und IL-2 in einer Konzentrration von 20 U/ml ergänzt. Einen Tag, nachdem die T-Zellen retroviralen Überständen ausgesetzt waren (Tag 4 nach der Stimulation), wurden sie gewaschen und auf frisches Kulturmedium plattiert. Am Tag 5 wurden die Zellen den retroviralen Überständen ein zweites Mal unter identischen Bedingungen wie am Tag 3 der Infektion ausgesetzt. Am Tag 6 wurden die Zellen gewaschen und auf Kulturmedium plattiert, das Hygromycin B in einer Konzentration von 250 Hg/ml und IL-2 in einer Konzentration von 20 U/ml enthielt. An Tag 14 wurden die verbleibenden lebensfähigen Zellen mit monoclonalem anti-CD3-Antikörper und y-bestrahlten Nährzellen erneut stimuliert und in der Gegenwart von Hygromycin B in einer Konzentration von 250 ug/ml weitergezüchtet. Nach dem zweiten Kreislauf der Selektion mit Hygromycin B wurden Aliquots von jeder transduzierten Kultur mit dem Southern-Blot-Verfahren analysiert, um eine erfolgreiche Transduktion zu bestätigen. Die transduzierten Kulturen wurden durch zyklische Stimulation mit autologen CMV infizierten Fibroblasten oder monoclonalem anti-CD3- Antikörper angeregt, um eine Stimulation von T-Zell-Rezeptoren und γ-bestrahlten Nährzellen zu erreichen, wie zuvor beschrieben (Riddell and Greenberg, 1990).
CAT-Extrakte wurden wie folgt hergestellt und untersucht. Aliquots (1 · 10&sup4; Zellen) der transduzierten Zellen wurden auf 30 ml-Kulturmedium plattiert, zusammen mit 25 · 10&sup6; γbestrahlten PBL und 5 · 10&sup6; γ-bestrahlten EBV transformierten LCL als Nährzellen und monoclonalen anti-CD3-Antikörpern, um Stimulation des T-Zell-Rezeptors zu erreichen. Am folgenden Tag wurde die Kultur mit 25 U/ml IL-2 ergänzt. Nach Kultivierung für 4d wurden die Zellen gewaschen und in 30 ml frischem Kulturmedium, das 25 U/ml IL-2 enthielt, resuspensiert. Nach weiterer Kultivierung über 3d wurden die Zelle wieder gewaschen und in 30 ml frischem Kulturmedium, das 25 U/ml IL-2 enthielt, resuspendiert. Nach 1-3d wurden die Zellen gewaschen und mit einer Dichte von 1 · 10&sup6; T-Zellen/ml in frischem Kulturmedium resuspendiert und auf Platten mit 24 Vertiefungen mit 1 · 10&sup6; T-Zellen/Vertiefung mit 2 · 10&sup6; γ-bestrahlten PBL plattiert, um zu ruhen. Nach 14d der Ruhe wurden die Zellen entweder zur CAT-Untersuchung ohne Aktivierung geerntet oder wurden wie folgt aktiviert: die transduzierten T-Zellen wurden auf Platten mit 24 Vertiefungen zu 5 · 10&sup6; T-Zellen/Vertiefung plattiert, zusammen mit 5 · 10&sup6; γ-bestrahlten PBL und 5 · 10&sup5; γ-bestrahlten EBVtransformierten LCL als Nährzellen und oberflächengebundenem monoclonalem anti-CD3- Antikörper, um Stimulation der T-Zell-Rezeptoren zu erreichen. 24 h, 48 h oder 96 h nach Aktivierung wurden Extrakte für die CAT-Untersuchung hergestellt. Die Zellen wurden geerntet und CAT-Extrakte wurden hergestellt und untersucht, wie in Beispiel 12 beschrieben, mit der Änderung, dass die Extrakte in 60 ul 0,25 M Tris (pH 8,0) hergestellt wurden.
Wie in Fig. 22 dargestellt, exprimierten Zellen, die mit dem positiven retroviralen Kontrollvektor HyTK.CMV.CAT infiziert und unaktiviert gelassen worden waren, die CAT- Aktivität konstitutiv, und der Spiegel der Expression war bei T-Zell-Aktivierung über 24 h erhöht. Zellen, die mit dem retroviralen HyTK.CMVe.LT.CAT-Vektor infiziert und unaktiviert gelassen worden waren, exprimierten keine signifikanten CAT-Aktivitätsspiegel. Die mit dem retroviralen HyTK.CMVe.LT.CAT- Vektor infizierten Zellen exprimierten jedoch 48 h nach Aktivierung signifikante Spiegel von CAT-Aktivität. Zellen, die mit dem retroviralen HyTK.CMVe.γ-IFN.CAT-Vektor infiziert und unaktiviert gelassen worden waren, exprimierten keine signifikanten CAT-Aktivitätsspiegel. Die mit dem retroviralen HyTK.CMVe.γ-IFN.CAT-Vektor infizierten Zellen exprimierten jedoch 48 h oder 96 h nach Aktivierung signifikante Spiegel von CAT-Aktivität.
Die Ergebnisse zeigen, dass die transkriptionale γ-IFN-Kontrollregion in Verbindung mit dem CMV-Enhancer oder die transkriptionale LT-Kontrollregion in Verbindung mit dem CMV- Enhancer aktivierungsinduzierte Expression in einem CMV-reaktiven menschlichen CD8+- CTL-Clon vermitteln. Die Ergebnisse zeigen weiterhin, dass die transkriptionale γ-IFN- Kontrollregion in Verbindung mit dem CMV-Enhancer oder die transkriptionale LT- Kontrollregion in Verbindung mit dem CMV-Enhancer in einem CMV-reaktiven menschlichen CD8+-CTL-Clon wirksam sind, wenn sie in einen retroviralen Vektor inseriert sind und über retrovirale Infektion übertragen worden sind.

Beispiel 27

Züchtung von CMV-reaktivem menschlichen CD8+-CTLs, transduziert mit HyTK.CMVe.IL- 3.IL-2, HyTK.CMVe.γ-IFN.IL-2 und HyTK.CMVe.IL-2Rα.IL-2, in der Abwesenheit von exogen zugefügtem IL-2

Die Konstruktion und provirale Struktur des retroviralen Vektors tgLS(+)HyTK ist bei Lupton et al., 1991 umfassend beschrieben.
Die provirale Struktur des retroviralen Vektors HyTK.CMVe.IL-3.IL-2 ist, wie in Fig. 4D abgebildet, aufgebaut, wobei "TCR" die transkriptionale IL-3-Kontrollregion, "Gen" die menschliche IL-2-cDNA und "ENH" den CMV-Enhancer darstellt. Das Plasmid HyTK.CMVe.IL-3.IL-2 wurde unter Verwendung von Standardtechniken (Ausubel et al., 1987) wie folgt konstruiert: ein menschlicher IL-2-cDNA-Clon, der durch das Einfügen einer BamHI-Stelle am 5'-Ende und einer SalI-Stelle am 3'-Ende modifiziert worden war, wurde zwischen den BamHI-und SalI-Stellen von HyTK.CMVe.IL-3.CAT (vgl. Beispiel 14) anstelle des CAT-Gens eingefügt.
Die provirale Struktur des retroviralen Vektors HyTK.CMVe.γ-IFN.IL-2 ist wie in Fig. 4D abgebildet, aufgebaut, wobei "TCR" die transkriptionale γ-IFN-Kontrollregion, "Gen" die menschliche IL-2-cDNA und "ENH" den CMV-Enhancer darstellt. Das Plasmid HyTK.CMVe.γ-IFN.IL-2 wurde unter Verwendung von Standardtechniken (Ausubel et al., 1987) wie folgt konstruiert: zuerst wurde das Plasmid HyTK.γ-IFN.IL-2 konstruiert. Diese Konstruktion ist ein Derivat von tgLS(+)HyTK (Lupton et al.,1991), das die Nucleotide -541 bis +128 der menschlichen transkriptionalen γ-IFN-Kontrollregion (Ciccarone et al., 1990; Gray and Goeddel 1982), gebunden an eine stromabwärts des HyTK-Gens inserierte menschliche IL-2-cDNA, und eine XhoI-Stelle direkt 5' der menschlichen transkriptionalen γ- IFN-Kontrollregion enthält. Das XhoI-BstX1-Teilstück, dass den CMV-Enhancer und den 5'- Abschnitt der transkriptionalen γ-IFN-Kontrollregion umfasst, wurde dann aus tgCMVe.γ- IFN.CAT (wie in Beispiel 17 beschrieben) ausgeschnitten und zwischen die XhoI- und BstX1- Stellen von HyTK.γ-IFN.IL-2 ligiert, um die mit HyTK.CMVe.γ-IFN.IL-2 benannte Konstruktion zu erhalten.
Die provirale Struktur des retroviralen Vektors HyTK.CMVe.CTLA-1.IL-2 ist, wie in Fig. 4D abgebildet, aufgebaut, wobei "TCR" die transkriptionale CTLA-1-Kontrollregion, "Gen" die menschliche IL-2-cDNA und "ENH" den CMV-Enhancer darstellt. Das Plasmid HyTK.CMVe.CTLA-1.IL-2 wurde unter Verwendung von Standardtechniken (Ausubel et al., 1987) wie folgt konstruiert: ein menschlicher IL-2-Clon, der durch die Plazierung einer BamHI-Stelle am 5'-Ende und einer SalI-Stelle am 3'-Ende modifiziert worden war, wurde zwischen den BamHI-und SalI-Stellen von HyTK.CMVe.CTLA-1.CAT (vgl. Beispiel 15) anstelle des CAT-Gens eingefügt.
Die provirale Struktur des retroviralen Vektors HyTK.CMVe.IL-2Rα.IL-2 ist, wie in Fig. 4D abgebildet, aufgebaut, wobei "TCR" die transkriptionale IL-2Rα-Kontrollregion, "Gen" die menschliche IL-2-cDNA und "ENH" den CMV-Enhancer darstellt. Das Plasmid HyTK.CMVe.IL-2Rα.IL-2 wurde unter Verwendung von Standardtechniken (Ausubel et al., 1987) wie folgt konstruiert: ein menschlicher IL-2-Clon, der durch die Plazierung einer BamHI-Stelle am 5'-Ende und einer SalI-Stelle am 3'-Ende modifiziert worden war, wurde zwischen den BamHI-und SalI-Stellen von HyTK.CMVe.IL-2Rα.CAT (vgl. Beispiel 11) anstelle des CAT-Gens eingefügt.
Amphotropes Retrovirus produzierende PA317-Clone wurden wie in Beispiel 17 erzeugt und charakterisiert.
Der CMV-spezifische menschliche cytotoxische CD8+-T-Zell-Clon MRL 3C11 wurde, wie in Beispiel 26 beschrieben, erzeugt und mit den retroviralen Partikeln tgLS(+)HyTK, HyTK.CMVe.IL-3.IL-2, HyTK.CMVe.γ-IFN.IL-2 und HyTK.CMVe.CTLA-1.IL-2 oder HyTK.CMVe.IL-2Rα.IL-2 transduziert, wie in Beispiel 26 beschrieben.
Wie nachstehend beschrieben, wurden die transduzierten CMV-spezifischen menschlichen CD8+-CTLs in Abwesenheit von exogenem IL-2 gezüchtet. Aliquots der Kulturen, die mit tgL(S)(+)HyTK, HyTK.CMVe.IL-3.IL-2, HyTK.CMVe.γ-IFN.IL-2, HyTK.CMVe.CTLA 1.IL-2 oder HyTK.CMVe.IL-2Rα.IL-2 transduziert worden waren, wurden auf Kulturträger mit 24 Vertiefungen zu 1· 10&sup6; T-Zellen/Vertiefung mit 1 · 10&sup5; autologen Fibroblasten, die zur Antigen-Stimulation mit dem CMV-Stamm AD 169 infiziert waren, und 1· 10&sup6; γ-bestrahlten PBLs und 1· 10&sup5; γ-bestrahlten EBV transformierten LCLs als Nährzellen plattiert. Exogenes IL-2 wurde den Kulturen nicht zugegeben. Nach 7 Tagen wurden die Zellen geerntet und lebensfähige Zellzahlen durch das Trypan-Blau-Ausschlussverfahren bestimmt. Die T-Zellen wurden dann erneut auf Kulturträger mit 24 Vertiefungen unter identischen Restimulationsbedingungen plattiert. Nach weiteren 7 Tagen wurden lebensfähige Zellzahlen wieder durch das Trypan-Blau-Ausschlussverfahren bestimmt.
Die in Fig. 23 gezeigten Daten zeigen die kumulativen Änderungen der Zellzahlen während der beiden 7-tägigen Stimulationszyklen. Die Ergebnisse zeigen, dass Zellen, die mit HyTK.CMVe.IL-3.IL-2, HyTK.CMVe.γ-IFN.IL-2, und HyTK.CMVe.IL-2Rα.DL-2 transduziert worden waren, relativ zu den mit dem Kontroll-tg LS(+)HyTK-Vektor transduzierten Zellen bei Abwesenheit von exogen zugegebenem IL-2 zur Proliferation in der Lage waren.

Nutzwert

Die Vektoren der vorliegenden Erfindung sind nützlich bei der Erzeugung von Lymphocyten, besonders Antigen-spezifischen CTLs, die eine weniger starke Abhängigkeit von TH-Zellen und/oder von den von TH-Zellen gelieferten Stimulationsfaktoren, zum Beispiel Cytokinen, aufweisen. Die den Vektor enthaltenden Zellen, besonders die CTLs mit einer weniger starken Abhängigkeit von TH-Zellen, verursacht durch die Expression des im Vektor codierten Stimulationsfaktors, sind sinnvoll bei einer adoptiven Transfer-Therapie, um die Immunantwort zu modulieren.

Claims

1. Rekombinantes Polynucleotid, umfassend eine Region die ein Stimulationsfaktor-Polypeptid codiert, welches Lymphocyten-Proliferation stimuliert, funktionell verbunden mit einer heterologen transkriptionellen Kontrollregion, wobei das Stimulationsfaktor-Polypeptid ausgewählt ist aus Cytokinen und anderen Hormonen, stimulatorischen Peptid- Transkriptionsfaktoren und Oncogenen, wobei die transkriptionelle Kontrollregion die Aktivierungs-induzierte Expression der den Stimulationsfaktor codierenden Region verursacht, wenn sie in einem Lymphocyten anwesend ist, der aktiviert worden ist, und wobei die Expression des Stimulationsfaktor-Polypeptids in dem aktivierten Lymphocyten die Abhängigkeit des Lymphocyten von T-Helferzellen (TH-Zellen) reduziert.

2. Polynucleotid nach Anspruch 1, wobei der Stimulationsfaktor ein Cytokin ist, das normalerweise von den aktivierten TH-Zellen hergestellt wird.

3. Polynucleotid nach Anspruch 2, wobei die Expression des codierten Cytokins die Abhängigkeit CD8+-cytotoxischer T-Lymphocyten (CTL) von TH-Zellen für die Proliferation vermindert, und/oder das Cytokin IL-2 ist.

4. Polynucleotid nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die transkriptionelle Kontrollregion einen Promotor umfasst, der von einem Cytokin-Gen abgeleitet ist, das Aktivierungs-induzierte Expression in Lymphocyten aufweist.

5. Polynucleotid nach Anspruch 4, wobei die Lymphocyten CD8+-cytotoxische T- Lymphocyten sind.

6. Polynucleotid nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die transkriptionelle Kontrollregion von einem IL-3-Gen, einem II-4-Gen, einem γ- IFN-Gen, einem GM-CSF-Gen, CTLA-1-Gen, IL-2Rα-Gen, Lymphotoxin-Gen, Perforin-Gen, 519-Gen, Granzym-H-Gen, CGL-2-Gen, CTLA-4-Gen, TCA-3 Gen und CD69-Gen abgeleitet ist.

7. Polynucleotid nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die transkriptionelle Kontrollregion weiterhin einen Enhancer, gegebenenfalls einen HCMV-IE94-Enhancer und/oder eine SV40 frühe transkriptionelle Kontrollregion umfasst.

8. Polynucleotid nach einem der vorangehenden Ansprüche, weiterhin umfassend eine Bindungsstelle für einen multimeren Transkriptionsfaktor.

9. Polynucleotid nach Anspruch 8, wobei die Bindungsstelle für den multimeren Transkriptionsfaktor ausgewählt ist aus NF-AT- und/oder NF-KB- Bindungsstellen.

10. Polynucleotid nach einem der vorangehenden Ansprüche, weiterhin umfassend eine Region, die einen positiven selektierbaren Marker, einen negativen selektierbaren Marker oder einen negativen selektierbaren Marker, der an einen positiven selektierbaren Marker fusioniert ist, codiert.

11. Polynucleotid nach Anspruch 10, wobei der negative selektierbare Marker ausgewählt ist aus Herpes-Simplex-Virus-Typ-1-Thymidinkinase-Gen, dem zellulären Hypoxanthin-Phosphoribosyl-Transferase-Gen, zellulären Adenin- Phosphoribosyl-Transferase-Gen und dem bakteriellen Cytosin-Desaminase- Gen.

12. Rekombinanter Expressionsvektor, umfassend ein rekombinantes Polynucleotid nach einem der vorangehenden Ansprüche.

13. Vektor nach Anspruch 12, der ein retroviraler Vektor, ein AAV-Vektor oder ein nicht viraler Vektor ist.

14. Wirtszelle, die einen Vektor nach Anspruch 12 oder 13 enthält.

15. Wirtszelle nach Anspruch 14, wobei die Zelle eine CD8+-CTL-Zelle ist.

16. Polynucleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 11 oder ein Vektor nach Anspruch 12 oder 13 zum Transformieren eines CD8+-CTL, der als Ergebnis der Transformation für Proliferation oder Wachstum von TH-Zellen oder den Stimulationsfaktoren, die von TH-Zellen sekretiert werden, weniger abhängig ist.

17. Polynucleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 11 oder ein Vektor nach Anspruch 12 oder 13, zur Verwendung in einem Verfahren zur Behandlung eines Patienten durch Immuntherapie.

18. Verwendung eines Polynucleotides nach einem der Ansprüche 1 bis 11, oder eines Vektors nach Anspruch 12 oder 13, für die Herstellung eines Medikaments zur Therapie einer Immunerkrankung.