NO327317B1 - Vektor for fremstillingen av IL-4 og IL-4-mutanter, DNA-konstruksjon og E.coli. - Google Patents
Vektor for fremstillingen av IL-4 og IL-4-mutanter, DNA-konstruksjon og E.coli. Download PDFInfo
- Publication number
- NO327317B1 NO327317B1 NO20000262A NO20000262A NO327317B1 NO 327317 B1 NO327317 B1 NO 327317B1 NO 20000262 A NO20000262 A NO 20000262A NO 20000262 A NO20000262 A NO 20000262A NO 327317 B1 NO327317 B1 NO 327317B1
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- vector
- gene
- expression
- mutants
- plasmid
- Prior art date
Links
- 102000004388 Interleukin-4 Human genes 0.000 title claims description 45
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 title claims description 45
- 239000013598 vector Substances 0.000 title claims description 18
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 title claims description 11
- 238000010276 construction Methods 0.000 title claims description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 31
- 238000013518 transcription Methods 0.000 claims description 12
- 230000035897 transcription Effects 0.000 claims description 12
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 10
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 5
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 2
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 claims 1
- 229940028885 interleukin-4 Drugs 0.000 description 37
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 34
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 22
- 238000000034 method Methods 0.000 description 14
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 9
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 7
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 7
- 108700010070 Codon Usage Proteins 0.000 description 6
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 6
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 6
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 5
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 5
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 5
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 5
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 5
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 4
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010054278 Lac Repressors Proteins 0.000 description 3
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 3
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 3
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 3
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 3
- 101150109249 lacI gene Proteins 0.000 description 3
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 3
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 3
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 3
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 3
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 3
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 3
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 101100398597 Botryotinia fuckeliana lcc1 gene Proteins 0.000 description 2
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 2
- 241000701867 Enterobacteria phage T7 Species 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 241000701988 Escherichia virus T5 Species 0.000 description 2
- 101100068374 Gibberella zeae (strain ATCC MYA-4620 / CBS 123657 / FGSC 9075 / NRRL 31084 / PH-1) GIP1 gene Proteins 0.000 description 2
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 2
- 108091030071 RNAI Proteins 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 108700005078 Synthetic Genes Proteins 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 230000003042 antagnostic effect Effects 0.000 description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 2
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 2
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 2
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 101150078341 rop gene Proteins 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000013112 stability test Methods 0.000 description 2
- 238000000844 transformation Methods 0.000 description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 2
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 2
- GOJUJUVQIVIZAV-UHFFFAOYSA-N 2-amino-4,6-dichloropyrimidine-5-carbaldehyde Chemical group NC1=NC(Cl)=C(C=O)C(Cl)=N1 GOJUJUVQIVIZAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 108020005544 Antisense RNA Proteins 0.000 description 1
- 241000908115 Bolivar Species 0.000 description 1
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 101710094648 Coat protein Proteins 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 1
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 description 1
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 1
- 102100021181 Golgi phosphoprotein 3 Human genes 0.000 description 1
- 101001002709 Homo sapiens Interleukin-4 Proteins 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 1
- 101710203526 Integrase Proteins 0.000 description 1
- 102000018682 Interleukin Receptor Common gamma Subunit Human genes 0.000 description 1
- 108010066719 Interleukin Receptor Common gamma Subunit Proteins 0.000 description 1
- 108010025815 Kanamycin Kinase Proteins 0.000 description 1
- 101710125418 Major capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 101001002703 Mus musculus Interleukin-4 Proteins 0.000 description 1
- 101710141454 Nucleoprotein Proteins 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 206010034133 Pathogen resistance Diseases 0.000 description 1
- 108010021757 Polynucleotide 5'-Hydroxyl-Kinase Proteins 0.000 description 1
- 102000008422 Polynucleotide 5'-hydroxyl-kinase Human genes 0.000 description 1
- 101710083689 Probable capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 230000004570 RNA-binding Effects 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 102000002278 Ribosomal Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010000605 Ribosomal Proteins Proteins 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 230000001270 agonistic effect Effects 0.000 description 1
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000007815 allergy Effects 0.000 description 1
- 102000006646 aminoglycoside phosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 230000009920 chelation Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 239000003184 complementary RNA Substances 0.000 description 1
- 102000003675 cytokine receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010057085 cytokine receptors Proteins 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 238000006471 dimerization reaction Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 210000002443 helper t lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 102000055229 human IL4 Human genes 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000012160 loading buffer Substances 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 238000012261 overproduction Methods 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 230000002085 persistent effect Effects 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 230000037452 priming Effects 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 230000010473 stable expression Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 101150006320 trpR gene Proteins 0.000 description 1
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/54—Interleukins [IL]
- C07K14/5406—IL-4
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
- C12N15/72—Expression systems using regulatory sequences derived from the lac-operon
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Description
Foreliggende oppfinnelse vedrører vektor for fremstilling av interleukin-4 (IL-4) og IL-4-mutanter i en Escherichia co/i-stamme samt anvendelse av nevnte vektor i nevnte fremgangsmåte. Oppfinnelsen vedrører videre en DNA konstruksjon samt Escherichia coli som er transformert med nevnte vektor eller nevnte DNA-konstruksjon.
Moden human interleukin-4 (IL-4) består av 129 aminosyrer med 50% homologi til muse-IL-4. IL-4 er det eneste cytokinet som er kjent å dirigere differensieringen av T-hjelpeceller til en Trø-fenotype (Mosmann og Sad, Immunol. Today 17,138-146,1996). IL-4-signaliserer på lymfocytter og andre celler gjennom et heterodimerisk kompleks av to cytokinreseptorer, IL-4Ra og den vanlige y-kjeden (yc). Antagonistiske IL-4-mutanter har blitt beskrevet (Kruse et al., EMBO J. 11, 3237-3244,1992). Tre aminosyrer nær den C-terminale enden (R121, Y124 og S125) er viktige for binding til yc-kjeden. Introduksjonen av Asp (D) inn i disse posisjonene blokkerer reseptordimeriser-ing og transmembransignalisering.
Interleukin-4 dobbeltmutanten (IL-4 DM) er en IL-4-variant med 2 aminosyre-endringer i posisjon 121 og 124, kalt IL-4 R121D Y124D. IL-4 DM er istand til å blokkere både IL-4- og IL-13-aktiviteter. I motsetning til alle enkle setemutanter har ingen residieago-nistisk aktivitet noen gang blitt funnet for denne mutanten. Man tror at disse antagonistiske egenskapene til IL-4 DM er nyttige for behandling av sykdommer som involverer TH2-utvikling og/eller IgE-produksjon (Ryan, J. Allergy Clin. Immunol. 99,1-5,1997).
Som beskrevet i forskjellige publikasjoner, kan prokaryotiske organismer bli benyttet for å produsere rekombinante IL-4 og IL-4-mutanter. Uheldigvis har de beskrevne sys-temene mange ulemper (lavt ekspresjonsnivå, lav stabilitet av ekspresjonsvektoren) som gjør storskalaproduksjon av IL-4 og IL-4-mutanter umulig eller økonomisk lite lønn-som.
Foreliggende oppfinnelse skiller seg fra hva som er beskrevet i Bulletin of Experimental Biology and Medicine, vol. 119, nr.l, 1995, side 77-79 ved at det i kravet er definert at vektoren inneholder en T5-promoter. US4689406 vedrører forbedringer av mikrobiell ekspresjon av polypeptider.
Hovedkriteriene for et effektivt og sikkert ekspresjonssystem er:
høyt produktutbytte
regulerbar stabil ekspresjon
stabilitet av ekspresjonsvektoren
Flere trekk fra et ekspresjonsplasmid er viktig for kriteriene som er nevnt ovenfor (Han-nig et al., TIBTECH. 16, 54-60,1998). Disse er:
Promoter
Ribosomalt bindingssete (rbs)
Kodonbruk av det korresponderende genet
Transkripsjonsterminator
Resistensgen
Regulering av ekspresjon
Start på replikasjon (ori)
Ekspresjonsplasmider for IL-4 og IL-4-mutanter med modifikasjoner i alle de relevante elementene for et effektivt og sikkert ekspresjonssystem, ble fremstilt. Kvaliteten og egnetheten av det korresponderende ekspresjonssysstemet ble listet opp hovedsakelig til de følgende kriterier:
Utbytte av IL-4 og IL-4-mutanter
Plasmidstabilitet
Opprettholdelse av induksjonsevne
Overraskende er det blitt funnet at bakterier transformert med plasmider ifølge foreliggende oppfinnelse gir ekspresjonsrater, plasmid og ekspresjonsstabilitetsverdier mange ganger høyere enn de observert etter transformering av identiske verter med plasmider kjent innen fagfeltet. Derfor er plasmidene ifølge denne oppfinnelsen mye mer nyttige for fremstillingen av rekombinante interleukin-4 og interleukin-4-mutanter enn alle plasmidene som tidligere er kjent.
Det nylig utviklede vektorsystemet inneholder følgende elementer:
T5-promoter
E. co/i'-fag T5-promoteren sammen med to lac-operatorsekvenser er avledet fra pQE30 plasmid (Qiagen) som tilhører pDS-familen av plasmider (Bujard et al., Methods Enzymol. 155,416-433,1987 og Sttlber et al., Immunological Methods, I. Lefkovits og B. Pernis, eds., Academic Press, Inc., vol. IV, 121-152,1990).
T5 glO-ribosomalt bindingssete
Det ribosomale bindingssetet (rbs) er avledet fra regionen oppstrøms fra gen 10 fra fag T7 (T7 glO leder). Gen 10 fra fag T7 koder for kappeproteinet som er hovedproteinet uttrykt etter T7-infeksjon. T7 glO rbs ble ervervet fra vektoren pET-9a (Studier et al., Methods Enzymol. 185, 60-89,1990). T7 glO lederen strekker seg over en region på omtrent 100 bp (Olins et al., Gene 227-235,1988). I den endelige ekspresjonskonstruk-sjonen er regionen oppstrøms for Xbal-setet deletert. T7 glO ledersekvensen rekker nå over 42 bp og har en baseutbytting fra G til A i posisjon 3638 av det foretrakkede plasmidet.
Kodonbruk av den naturlige IL-4-sekvensen
Som et effektivt mål på synonym kodonbruktilbøyelighet, kan kodontilpasningsindek-sen (CAI) være nyttig for å predikere nivået av ekspresjon av et gitt gen (Sharp et al., Nucleic Acids Res. 15,1281-1295,1987 og Apeler et al., Eur. J. Biochem. 247- 890-895,1997). CAI blir beregnet som det geometriske gjennomsnittet av relativ synonym kodonbruk (RSCU) verdier korresponerende til hver av kodonene brukt i ett gen, delt med det maksimalt mulige CAI for et gen av den samme aminosyresammensetningen. RSCU-verdier for hvert kodon blir beregnet fra svært høyt uttrykte gener hos en spesiell organisme, for eksempel E. coli, og representerer den observerte frekvensen til et kodon dividert med frekvensen forventet under antagelsen av lik anvendelse av de synonyme kodonene for en aminosyre. Høyt uttrykte gener, for eksempel gener som koder for ribosomale proteiner, har generelt høye CAI-verdier > 0,46. Dårlig uttrykte gener som lacl og trpR i E. coli, har lave CAI-verdier < 0,3.
Den beregnede E. coli CAI-verdien for den naturlige IL-4-sekvensen er 0,733. Dette betyr at det naturlige genet skulle være vel egnet for høynivåekspresjon i E. coli. Ikke desto mindre har et syntetisk gen med optimal E. co/i-kodonbruk (CAl/verdi = 1) poten-siale til ytterligere å øke ekspresjonsnivået. Derfor ble syntetiske IL-4 og IL-4-mutant-gener fremstilt og klonet.
Transkripsjonen terminator
Et T7 DNA-fragment inneholdende transkripsjonsterminatoren T<|> er avledet fra vektoren pET-9a (Studier et al., Methods Enzymol. 185, 60-89,1990). Transkripsjonene terminatorer bestemmer punktene hvor mRNA-RNA-polymerase-DNA-komplekset disso-sierer, for derved å avslutte transkripsjon. Tilstedeværelsen av en transkripsjonen terminator på enden av et høyt uttrykt gen, har flere fordeler: De minimaliserer kelatering av RNA-polymerase som kan være engasjert i unødvendig transkripsjon, de begrenser mRNA-lengden til det minimale og begrenser dermed energiutgifter, siden sterk transkripsjon kan interferere med startenpunktet for replikasjon, øker en transkripsjonsterminator plasmidstabiliteten på grunn av kopiantallopprettholdelse (Balbas og Bolivar, Methods Enzymol. 185,14-37,1990).
Resistensgen
Kan-resistensgenet er avledet fra vektoren pET-9a (Studier et al., Methods Enzymol. 185, 60-89,1990). Opprinnelig er dette kan-genet av Tn903 fra vektoren pUC4KISS (Barany, Gene 37,111-123,1985). I det foretrakkede plasmidet har kan-genet og IL-4 og IL-4-mutantgenet motsatte orienteringer, slik at det ikke skulle være noen økning i kan-genproduktet etter induksjon som skyldes gjennomlesningstranskripsjon fra T5-promoteren. Kanamycin ble valgt som selektiv markør fordi den er det foretrakkede antibiotika for GMP-formål. I tillegg er kan-genbaserte vektorer mer stabile enn ampi-cillinresistente (bla) plasmider. Ampicillinseleksjon tenderer til å mistes i kulturene siden medikamentet blir degradert ved utskilt B-laktamase-enzymet. Metoden for bakte-riell resistens mot kanamycin baserer seg på aminoglykosid-fosfotransferase som inak-tiverer antibiotika.
Regulering av ekspresjon
Kontrollert genekspresjon er absolutt nødvendig for å sette opp et stabilt plasmidsystem, spesielt hvis proteinet av interesse er skadelig for vertscellen. Det foretrukkede plasmidet bruker et lac-basert induserbart system som består av et lac-repressorgen (lacl) og to syntetiske lac-operatorsekvenser satt nedstrøms for E. coli- fag T5-promoter. Lacl<q->promoteren og det laqf-strukturelle genet ble isolert fra vektoren pTrc99A (Amann et al., Gene 69,301-315,1988). F er en promotermutasjon som fører til overproduksjon av lacl-repressoren. Villtype-lac-repressor er et tetramerisk molekyl som omfatter fire identiske subenheter på 360 aminosyrer hver. Lac-repressor-tetrameren er en dimer av to funksjonelle dimerer. De fire subenhetene blir holdt sammen av en fire-heliksbunt dannet fra residiene 340-360. På grunn av isoleringen av lacl-genet fra vektoren pTrc99A ved et Narl-kutt, blir residiene etter aminosyre 331 deletert, og 10 aminosyrer som ikke normalt blir kodet for av lacl-genet, blir tilsatt. Det er kjent at mutasjoner eller delesjoner kan forekomme i den C-terminale enden av lacl etter aminosyre 329, som resulterer i funksjonelle dimerer som synes fenotypisk lik villtype-represssoren (Pace et al., TfflS 22,334-339,1997).
Start av replikasjon (ori)
Starten for replikasjon (ori) av det foretrukkede plasmidet er avledet fra vektoren pET-9a, orien som stammer fra pBR322. Det foretrukkede plasmidet bærer derfor pMBl (ColEl) replikonet. Plasmider med dette replikonet er multikopi-plasmider som replike-rer på en "relaxed" måte. Et minimum på 15-20 kopier av plasmidet blir opprettholdt i hver bakteriecelle under normale vekstbetingelser. Det aktuelle antallet av det foretrukkede plasmidet er innen dette området. Replikasjon av ColEl-typen ori, blir initiert av et 555-nukleotid RNA-transkript, RNA II, som danner et persistent hybrid med dets templat DNA, nær ori. RNA II-DNA-hybridet blir deretter kuttet med RNase H ved ori, for å gi en fri 3'OH som tjener som en primer for DNA-polymerase I. Denne primingen av DNA-syntese er negativt regulert ved RNA I, et 108-nukleotid RNA-molekyl som er komplementært til 5'enden av RNA IL Interaksjon av antisensen RNA I med RNA II forårsaker en konformasjonsendring i RNA II som inhiberer binding av RNA II til tem-platet DNA, og derved forhindrer initiering av plasmid DNA-syntese. Bindingen mel-lom RNA I og II blir forsterket av et lite protein på 63 aminosyrer (Rop-proteinet, Repressor for primer), som blir kodet for av et gen lokalisert 400 nukleotider nedstrøms fra starten av replikasjon (Sambrook et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor, 1989). Delesjon av rop-genet fører til en økning i kopiantall, og på grunn av en gendose-effekt som øker ekspresjonsnivåene hos det heterogenet genet som kodes for av plasmidet. Denne observasjonen ble også gjort for IL-4-ekspresjonsvektorene som ble testet. Men det viste seg at rop-plasmider er ustabile og tapes svært raskt under fermenteringen under ikke-selektive betingelser. Derfor inneholder replikonet av det foretrukkede plasmidet rop-genet, for å sikre høy plasmidstabilitet. Det foretrukkede plasmidet mangler mob-genet som kreves for mobilisering, og er derfor istand til å dirigere dens egen kon-jugale overføring fra én bakterie til en annen.
I det foretrukkede plasmidet ble alle elementene som ikke var nødvendig for plasmid-replikasjonen, resistens og regulerbar ekspresjon, deletert.
For å falle inn under området av foreliggende oppfinnelse, behøver ikke alle de ovenfor nevnte trekkene å bli inkorporert i konstruksjonen av det foretrukkede ekspresjonsplasmidet. For eksempel kan et naturlig interleukin-4 eller interleukin-4-mutantgen, bli brukt i stedet for et syntetisk gen, med optimalisert E. co/i-kodonbruk. Den foretrukkede transkripsjonsterminatoren er T<|>, men andre terminatorer som rrnB T2 eller asp A kan også bli brukt.
Metodene som anvendes for å etablere ekspresjonssystemet, er gitt nedenfor.
MATERIALER OG METODER
Enzymer
Restriksjonsendonukleaser, kalve-fordøyelse-alkalisk fosfatase, T4 polynukleotidkinase og T4 DNA-ligase ble kjøpt fra Boebringer Mannheim og GIBCO-BRL og brukt som beskrevet av forhandleren.
Rekombinante DNA-metoder
Standard kloningsprosedyrer har blitt beskrevet i Sambrook et al. (Molecular Cloning,
Cold Spring Harbor, 1989). Transformasjoner ble utført ifølge M. Scott (Seed and Aruf-fo, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 84, 3365-3369,1987). Som verter for transformasjonene ble E. co/i-stammene DH5a (GBCO BRL) og W3110 (ATCC 27325) vanligvis brukt. Genotypen til W3110 er Kl2, F", [N(rrnD-rrnE)]X.
Storskala-isoleringer av plasmid DNA ble utført med Qiagen-tips (Qiagen). Ekstraksjon av DNA-fragmenter fra agarosegeler ble utført ved å bruke Jetsorb (Genomed) som an-befalt av forhandleren.
Oligonukleotider for sete-dirigert mutagenese, PCR-reaksjoner og sekvensering, ble ervervet fra MWG Biotech, Pharmacia Biotech eller GIBCO BRL.
Mutagenese-eksperimentene ble utført ved metoden til Deng og Nickoloff (Deng og Nickoloff, Anal. Biochem. 200, 81-88,1992) ved å bruke "Unique Site Elimination Mutagenesis"-system fra Pharmacia Biotech. Primeren som ble brukt for fremstilling av T7 glO rbs har den følgende sekvensen:
Alle konstruksjoner og DNA-sekvenser ble bekreftet ved å bruke "Dye Terminator Cyc-le Sequencing with AmpliTaq DNA Polymerase", FS på en ABI 373A-sekvenserings-maskin (Applied Biosystems).
Oppfinnelsen blir forklart mer detaljert i de følgende eksemplene, figurene og sekvens-informasjonen: FIG.l til FIG. 4: Konstruksjon av det foretrukkede ekspresjonsplasmidet.
(Abbreviations: IL-4 TM, IL-4 trippelmutant; IL-4 DM, IL-4 dobbelmutant).
FIG. 5: Plasmidstabilitet til IL-4 mutantekspresjonsvektorene pR021.1.0 og pR02.1.0. Vektoren pR02.1.0 forblir full-stendig stabil over 78 generasjoner uten antibiotisk seleksjon.
I motsetning til ekspresjonsvektoren pR021.1.0, som er basert på det kommersielt tilgjengelige plasmid pET-30a (Novagen), er tapet svært raskt. Bare 16% av koloniene inneholder plasmidet etter 78 generasjoner uten kanamycinseleksjon.
FIG. 6: Opprettholdelse av induksjon og ekspresjonsevne til den foretrukkede IL-4 og IL-4-mutantekspresjonsvektoren.
EKSEMPLER
Eksempel 1
Plasmidstabilitetstest
Plasmidstabilitetstestene ble alltid startet med en kultur som var frosset i flytende nitro-gen. OD6oo av den tinede kulturen ble bestemt, kulturen fortynnet opptil IO"<4> i PBS-buffer og platet på LB-agarplater uten antibiotika. 1 ml av den tinede kulturen ble inokulert i 100 ml peptonmedium (30 g Soya pepton, 20 g gjærekstrakt, 5 g KH2P04,20 g Glycerol, 1 g MgS04 x 7H20 pr. liter, pG 7,0) og inkubert ved 37°C med 280 rpm i 24 timer.
OD600 til den dyrkede kulturen ble bestemt, kulturen fortynnet opptil IO"<6> i PBS-buffer og platet på LB-agarplater uten antibiotika for å gi godt separerte kolonier.
100 ul fra den dyrkede kulturen ble inokulert i 100 ml peptonmedium og inkubert ved 37°C med 280 rpm i 24 timer. Denne prosedyren ble gjentatt åtte ganger.
100 godt separerte kolonier fra LB-platene ble strøket ut i et gittermønster på LB-plater med kanamycin (25 ug/ml) og LB-plater uten kanamycin og inkubert ved 37°C over-natt. Prosentandelen av resistente kolonier ble bestemt hver dag.
Antallet av generasjoner pr. dag ble beregnet ifølge følgende formel: log [OD600 END/OD600BEG]/lOg 2.
For ekspresjonsstudier ble 1 ml av en dyrkningskultur fortynnet 100 ganger i LB-medium og behandlet som beskrevet (se eksempel 2).
Eksempel 2
Ekspresjon
Ekspresjon for liten skala av interleukin-4 og interleukin-4-mutantceller ble dyrket i LB-medium (10 g Bacto trypton, 5 g gjærekstrakt, 10 g NaCl pr. liter, pH 7,5) inntil OD600 nådde 0,8 - 1,0. Ekspresjon ble indusert ved tilsetting av IPTG til en sluttkon-sentrasjon på 0,5 mM og inkuberingen fortsatt i 5 timer. Cellene ble høstet ved sentrifu-gering.
For SDS-PAGE-analyse ble cellepelletene resuspendert i SDS-PAGE ladningsbuffer til en konsentrasjon på 1 OD600 enhet/100 ul.
Claims (4)
1.
Vektor for fremstilling av IL-4 og IL-4-mutanter i en Escherichia co/i-stamme, karakterisert ved at den i 5'til 3'retning omfatter følg-ende operativt koblede elementer: en regulerbar promoter bestående av E. cø/i-fag T5-promoteren og to lac-operatorsekvenser, et ribosombindingssete fra E. coli- f ag T7gl0, et translasjonsstartkodon, et strukturelt gen for IL-4 eller en IL-4-mutant og én transksripsjonsterminator nedstrøms av det strukturelle genet.
2.
DNA-konstruksjon, karakterisert ved at den omfatter DNA sekvensen vist i SEQ. ID. NR 2.
3.
Escherichia coli, karakterisert ved at den er transformert med vektoren ifølge krav 1 eller med DNA-konstruksjonen ifølge krav 2.
4.
Anvendelse av vektoren ifølge krav 1 eller DNA-konstruksjonen ifølge krav 2, i en metode for fremstilling av IL-4 og IL-4-mutanter.
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
EP99100967A EP1022339B1 (en) | 1999-01-20 | 1999-01-20 | Plasmids, their construction and their use in the manufacture of interleukin-4 and interleukin-4 muteins |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
NO20000262D0 NO20000262D0 (no) | 2000-01-19 |
NO20000262L NO20000262L (no) | 2000-07-21 |
NO327317B1 true NO327317B1 (no) | 2009-06-08 |
Family
ID=8237378
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
NO20000262A NO327317B1 (no) | 1999-01-20 | 2000-01-19 | Vektor for fremstillingen av IL-4 og IL-4-mutanter, DNA-konstruksjon og E.coli. |
Country Status (15)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US6506590B1 (no) |
EP (1) | EP1022339B1 (no) |
JP (2) | JP2000210091A (no) |
KR (1) | KR100665148B1 (no) |
AT (1) | ATE334202T1 (no) |
AU (1) | AU772897B2 (no) |
CA (1) | CA2294575C (no) |
CZ (1) | CZ294279B6 (no) |
DE (1) | DE69929638T2 (no) |
DK (1) | DK1022337T3 (no) |
ES (1) | ES2269027T3 (no) |
HU (1) | HU224491B1 (no) |
NO (1) | NO327317B1 (no) |
PT (1) | PT1022337E (no) |
SK (1) | SK285603B6 (no) |
Families Citing this family (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE10022258A1 (de) | 2000-05-08 | 2001-11-15 | Bayer Ag | Reinigung von Proteineinschlusskörpern durch Querstrom-Mikrofiltration |
KR100443570B1 (ko) * | 2001-07-31 | 2004-08-09 | 크레아젠 주식회사 | 재조합 인간 인터루킨-4의 제조방법 |
EP1314739A1 (en) | 2001-11-22 | 2003-05-28 | Bayer Ag | Process for renaturation of recombinant, disulfide containing proteins at high protein concentrations in the presence of amines |
JP2006055082A (ja) * | 2004-08-20 | 2006-03-02 | National Institute Of Advanced Industrial & Technology | 発光甲虫由来赤色発光酵素安定体の生産及び精製法 |
Family Cites Families (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4689406A (en) * | 1983-08-10 | 1987-08-25 | Amgen | Enhancement of microbial expression of polypeptides |
AU597951B2 (en) * | 1986-03-27 | 1990-06-14 | Monsanto Company | Enhanced protein production in bacteria by employing a novel ribosome binding site |
ATE123526T1 (de) * | 1987-08-17 | 1995-06-15 | Hoffmann La Roche | Hochreprimierbare expressionskontrollsequenzen. |
FR2724665B1 (fr) * | 1994-09-16 | 1996-12-20 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Procede de production de proteines recombinantes, plasmides et cellules modifiees |
MY124565A (en) * | 1996-07-19 | 2006-06-30 | Bayer Corp | High-affinity interleukin-4-muteins |
-
1999
- 1999-01-20 EP EP99100967A patent/EP1022339B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1999-01-20 DE DE69929638T patent/DE69929638T2/de not_active Expired - Lifetime
-
2000
- 2000-01-07 AT AT00100129T patent/ATE334202T1/de active
- 2000-01-07 DK DK00100129T patent/DK1022337T3/da active
- 2000-01-07 ES ES00100129T patent/ES2269027T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2000-01-07 PT PT00100129T patent/PT1022337E/pt unknown
- 2000-01-14 JP JP2000006477A patent/JP2000210091A/ja active Pending
- 2000-01-14 US US09/483,419 patent/US6506590B1/en not_active Expired - Fee Related
- 2000-01-17 CA CA002294575A patent/CA2294575C/en not_active Expired - Fee Related
- 2000-01-19 KR KR1020000002310A patent/KR100665148B1/ko not_active IP Right Cessation
- 2000-01-19 CZ CZ2000214A patent/CZ294279B6/cs not_active IP Right Cessation
- 2000-01-19 NO NO20000262A patent/NO327317B1/no not_active IP Right Cessation
- 2000-01-19 SK SK76-2000A patent/SK285603B6/sk unknown
- 2000-01-20 AU AU12507/00A patent/AU772897B2/en not_active Ceased
- 2000-01-20 HU HU0000185A patent/HU224491B1/hu not_active IP Right Cessation
-
2010
- 2010-08-27 JP JP2010190917A patent/JP2010284174A/ja not_active Withdrawn
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
HU224491B1 (hu) | 2005-09-28 |
DK1022337T3 (da) | 2006-11-06 |
AU772897B2 (en) | 2004-05-13 |
ATE334202T1 (de) | 2006-08-15 |
DE69929638T2 (de) | 2006-09-21 |
CA2294575C (en) | 2009-04-07 |
SK762000A3 (en) | 2000-08-14 |
HU0000185D0 (en) | 2000-04-28 |
EP1022339B1 (en) | 2006-02-01 |
PT1022337E (pt) | 2006-11-30 |
HUP0000185A2 (en) | 2002-09-28 |
KR20000053523A (ko) | 2000-08-25 |
NO20000262D0 (no) | 2000-01-19 |
KR100665148B1 (ko) | 2007-01-09 |
DE69929638D1 (de) | 2006-04-13 |
CZ2000214A3 (cs) | 2000-08-16 |
JP2000210091A (ja) | 2000-08-02 |
CA2294575A1 (en) | 2000-07-20 |
CZ294279B6 (cs) | 2004-11-10 |
EP1022339A1 (en) | 2000-07-26 |
ES2269027T3 (es) | 2007-04-01 |
US6506590B1 (en) | 2003-01-14 |
AU1250700A (en) | 2000-07-27 |
NO20000262L (no) | 2000-07-21 |
JP2010284174A (ja) | 2010-12-24 |
SK285603B6 (sk) | 2007-04-05 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Sharma et al. | Temporal and spatial regulation of the symbiotic genes of Rhizobium meliloti in planta revealed by transposon Tn5-gusA. | |
US6291245B1 (en) | Host-vector system | |
US6117651A (en) | Expression vectors | |
NO324920B1 (no) | Fremgangsmate for a sekretere et aktuelt heterologt polypeptid i en celle, nukleinsyre som koder for en sekresjonssignalsekvensvariant av STII og en variant av STII-sekresjonssignalsekvensen. | |
Yasunobu et al. | Genetic characterization of the gene hupB encoding the HU-1 protein of Escherichia coli | |
Meyer et al. | Properties of R1162, a broad-host-range, high-copy-number plasmid | |
Beard et al. | A stable and efficient transformation system for Butyrivibrio fibrisolvens OB156 | |
Davis et al. | Nucleotide sequence of the mannitol (mtl) operon in Escherichia coli | |
Puyet et al. | Characterization of the Streptococcus pneumoniae maltosaccharide regulator MalR, a member of the LacI-GalR family of repressors displaying distinctive genetic features. | |
EP0195303B1 (en) | Plasmid vectors for expression in escherichia coli and/or bacillus subtilis | |
NO327317B1 (no) | Vektor for fremstillingen av IL-4 og IL-4-mutanter, DNA-konstruksjon og E.coli. | |
MXPA04005717A (es) | Sistema de expresion. | |
EP0688870A1 (en) | Highly-purified recombinant reverse transcriptase | |
US6165746A (en) | Preventing endogenous aminopeptidase mediated n-terminal amino acid cleavage during expression of foreign genes in bacteria | |
EP1022337B1 (en) | Plasmids, their construction and their use in the manufacture of interleukin-4 and interleukin-4 muteins | |
Roytrakul et al. | A Rapid and Simple Method for Construction and Expression of a Synthetic | |
AU663139B2 (en) | A novel translational activating sequence | |
Jackson et al. | Cloning and analysis of pif, replication and leading regions of the F plasmid | |
Ouimet et al. | Transcription reporters that shuttle cloned DNA between high-copy Escherichia coli plasmids and low-copy broad-host-range plasmids | |
AU2001251342A1 (en) | Ketogulonigenium endogenous plasmids | |
EP0471514A2 (en) | Improved bacteriophage lambda pL promoters | |
HUT62336A (en) | Process for increasing structural stability of recombinant dna expression vectors | |
WO1991006656A1 (en) | Promoter, expression vector and polypeptide synthesis | |
Burden et al. | Designing a Cloning Scheme | |
MXPA99004331A (es) | Vectores de expresion mejorados |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM1K | Lapsed by not paying the annual fees |