HU224491B1 - Plazmidok, előállítási eljárásaik, valamint alkalmazásuk interleukin-4 és interleukin-4-muteinek előállítására - Google Patents
Plazmidok, előállítási eljárásaik, valamint alkalmazásuk interleukin-4 és interleukin-4-muteinek előállítására Download PDFInfo
- Publication number
- HU224491B1 HU224491B1 HU0000185A HUP0000185A HU224491B1 HU 224491 B1 HU224491 B1 HU 224491B1 HU 0000185 A HU0000185 A HU 0000185A HU P0000185 A HUP0000185 A HU P0000185A HU 224491 B1 HU224491 B1 HU 224491B1
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- expression
- interleukin
- plasmid
- muteins
- gene
- Prior art date
Links
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 title claims abstract description 62
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 title claims abstract description 43
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims abstract description 14
- 102000004388 Interleukin-4 Human genes 0.000 title abstract description 56
- 229940028885 interleukin-4 Drugs 0.000 title abstract description 56
- 238000010276 construction Methods 0.000 title 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 34
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 16
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 claims 1
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 claims 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 abstract description 6
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 28
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 15
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 14
- 238000000034 method Methods 0.000 description 13
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 12
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 12
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 11
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 8
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 7
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 7
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 7
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 7
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 7
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 7
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 6
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 6
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 5
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 5
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 5
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 5
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 5
- 101100398597 Botryotinia fuckeliana lcc1 gene Proteins 0.000 description 4
- 108700010070 Codon Usage Proteins 0.000 description 4
- 101100068374 Gibberella zeae (strain ATCC MYA-4620 / CBS 123657 / FGSC 9075 / NRRL 31084 / PH-1) GIP1 gene Proteins 0.000 description 4
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 4
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010054278 Lac Repressors Proteins 0.000 description 3
- 108091030071 RNAI Proteins 0.000 description 3
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 3
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 3
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 3
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 2
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 2
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 2
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 2
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 2
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 2
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 2
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 2
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 2
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 2
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 2
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 2
- 230000002688 persistence Effects 0.000 description 2
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 2
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 238000013112 stability test Methods 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- 238000000844 transformation Methods 0.000 description 2
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- CTRXDTYTAAKVSM-UHFFFAOYSA-N 3-{[ethyl({4-[(4-{ethyl[(3-sulfophenyl)methyl]amino}phenyl)(2-sulfophenyl)methylidene]cyclohexa-2,5-dien-1-ylidene})azaniumyl]methyl}benzene-1-sulfonate Chemical compound C=1C=C(C(=C2C=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=2C(=CC=CC=2)S(O)(=O)=O)C=CC=1N(CC)CC1=CC=CC(S(O)(=O)=O)=C1 CTRXDTYTAAKVSM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 241000908115 Bolivar Species 0.000 description 1
- 241000282465 Canis Species 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 108090000204 Dipeptidase 1 Proteins 0.000 description 1
- 102100031780 Endonuclease Human genes 0.000 description 1
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 241001302584 Escherichia coli str. K-12 substr. W3110 Species 0.000 description 1
- 101001002709 Homo sapiens Interleukin-4 Proteins 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 1
- 101710203526 Integrase Proteins 0.000 description 1
- 102000018682 Interleukin Receptor Common gamma Subunit Human genes 0.000 description 1
- 108010066719 Interleukin Receptor Common gamma Subunit Proteins 0.000 description 1
- 108010025815 Kanamycin Kinase Proteins 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 241000157426 Pernis Species 0.000 description 1
- 108010021757 Polynucleotide 5'-Hydroxyl-Kinase Proteins 0.000 description 1
- 102000008422 Polynucleotide 5'-hydroxyl-kinase Human genes 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 108020005091 Replication Origin Proteins 0.000 description 1
- 102000002278 Ribosomal Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010000605 Ribosomal Proteins Proteins 0.000 description 1
- 101100288418 Staphylococcus xylosus lacP gene Proteins 0.000 description 1
- 108700005078 Synthetic Genes Proteins 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 1
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000007815 allergy Effects 0.000 description 1
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 1
- 102000006646 aminoglycoside phosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- 230000003042 antagnostic effect Effects 0.000 description 1
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000006635 beta-lactamase Human genes 0.000 description 1
- 229940105402 brillant blue Drugs 0.000 description 1
- 244000309464 bull Species 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 239000004020 conductor Substances 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 102000003675 cytokine receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010057085 cytokine receptors Proteins 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 210000002443 helper t lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000000833 heterodimer Substances 0.000 description 1
- 102000055229 human IL4 Human genes 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000012261 overproduction Methods 0.000 description 1
- 108700010839 phage proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 101150078341 rop gene Proteins 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 230000010473 stable expression Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 description 1
- 101150006320 trpR gene Proteins 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/54—Interleukins [IL]
- C07K14/5406—IL-4
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
- C12N15/72—Expression systems using regulatory sequences derived from the lac-operon
Abstract
A találmány tárgyát interleukin-4 (IL–4) és IL–4-muteinekelőállítására alkalmas expressziós plazmidok képezik. Szintén atalálmány tárgyához tartozik az ilyen plazmidok alkalmazásarekombináns interleukin-4 és interleukin-4- muteinek előállítására. Atalálmány szerinti plazmidok alkalmasak rekombináns interleukin-4 ésinterleukin-4-muteinek előállítására.
Description
A leírás terjedelme 14 oldal (ezen belül 6 lap ábra)
HU 224 491 Β1
A találmány tárgyát interleukin-4 (IL-4) és IL-4-muteinek előállítására alkalmas expressziós plazmidok képezik. Szintén a találmány tárgyához tartozik az ilyen plazmidok alkalmazása rekombináns interleukin-4 és interleukin-4-muteinek előállítására.
A találmány szerinti plazmidok sokkal nagyobb mértékű expresszíót, illetve plazmidstabilitást és expressziós stabilitást biztosítanak, mint az eddig ismert egyéb plazmidok, ezáltal sokkal alkalmasabbak a rekombináns interleukin-4 és az interleukin-4-muteinek előállítására.
Az érett humán interleukin-4 (IL-4) 129 aminosavból áll, és 50%-ban homológ az egéreredetű interieukin-4gyel. Az IL-4 az egyetlen olyan ismert citokin, amely a T-segítő- („helper”-) sejtek TH2-fenotípusú sejtekké történő differenciálódását szabályozza [Mosmann és Sad: Immunoi. Today 17, 138 (1996)]. Az IL-4 a limfocitákra és egyéb sejttípusokra két citokinreceptor, az IL-4Ra és a közös γ-lánc (yc) heterodimer komplexén keresztül fejti ki hatását. Kruse és munkatársai [EMBO J. 11, 3237 (1992)] antagonista aktivitású IL-4-mutánsokat írtak le. A yc-lánchoz történő kötődés szempontjából három C-terminálishoz közeli - aminosavnak (R121, Y124 és S125) van nagy jelentősége. Ha ezekre a helyekre aszparaginsavat (Asp, D) helyettesítünk, a receptordimerizáció és a transzmembrán-jelátvitel gátlás alá kerül.
Az interleukin-4 dupla mutein (IL-4 DM) olyan IL-4-változat, amely a 121. és 124. pozícióban aminosavszubsztitúciót hordoz (R121D és Y124D). Az IL-4 DM az IL-4 és az IL-13 aktivitását egyaránt képes gátolni. E mutein esetében - szemben az egy mutációt hordozó mutánsokkal - soha nem mutattak ki maradék agonista aktivitást. Úgy véljük, hogy az IL-4 antagonista tulajdonságai hasznosak a TH2-fenotípus kialakulásával és/vagy az IgE-termelődéssel kapcsolatos betegségek kezelésére [Ryan: J. Allergy Clin. Immunoi. 99, 1 (1997)].
Mint ahogy az számos forrásból ismeretes, a rekombináns IL-4 és IL-4-muteinek termelésére prokarióta mikroorganizmusok alkalmazhatók. A korábban leírt expressziós rendszereknek sajnos számos hátránya van (alacsony expressziós szint, az expressziós vektor nem megfelelő stabilitása), ami az IL-4 és az IL-4-muteinek nagy mennyiségben történő előállítását lehetetlenné vagy gazdaságtalanná teszi. Ilyen expressziós rendszerek és a bennük használt regulációs elemek leírását megtalálhatjuk többek között: Ptitsyn és munkatársai, Bull. Exp. Bioi. Med., 119: 77-79. oldalán és US 4689406 számú szabadalmi leírásban; ám az említett publikációkban ismertetett adatok nem adnak - még együttes figyelembevétel esetén sem - szakember számára kellő útmutatást a találmány szerinti expressziós rendszerek lehetséges kifejlesztésére vonatkozóan, és a leírásban ismertetett találmány szerinti expressziós rendszerek lényegesen előnyösebbek a fenti publikációkban ismertetetteknél.
A hatékony és biztonságos expressziós rendszer fő kritériumai a következők:
- nagy hozam;
- szabályozható, stabil expresszió;
- az expressziós vektor stabilitása.
A fenti kritériumok szempontjából az alkalmazott expressziós plazmid több komponense is fontos [Hannig és munkatársai: TIBTECH 16, 54 (1998)], melyek a következők:
- promoter;
- riboszómakötő helyek;
- a megfelelő gén kodonfelhasználása;
- transzkripciós terminátorszignál;
- rezisztenciagén;
- expressziós szabályozóelemek;
- replikációs kezdőhely (őri).
A találmány szerinti megoldás értelmében olyan
- IL-4 és IL-4-muteinek expresszáltatására alkalmas expressziós plazmidokat állítottunk elő, amelyek valamennyi lényeges eleme - a hatékony és biztonságos expresszió érdekében - módosítva van. A megfelelő expressziós rendszer minőségét és alkalmasságát a következő kritériumok alapján ítéltük meg:
- az IL-4 és az IL-4-muteinek hozama;
- plazmidstabilitás;
- indukciós képesség fennmaradása.
A találmány szerinti megoldás kidolgozása során a rekombináns interleukin-4 (IL-4) és az interleukin-4-muteinek nagy mennyiségben történő előállítására alkalmas expressziós plazmidok előállítási és alkalmazási eljárásának kidolgozását tűztük ki célul. Az újonnan kifejlesztett gazda/vektor rendszernek más proteinek (citokinek, növekedési faktorok, oldékony receptorok, antitestek stb.) expresszáltatására is alkalmasnak kell lennie.
Felismertük, hogy a találmány szerinti plazmidokkal transzformált baktériumok, meglepő módon, sokkal nagyobb mértékű expressziót, illetve plazmidstabilitást és expressziós stabilitást biztosítanak, mint az ismert plazmidokkal transzformált, ugyanezen gazdasejtek. Ennek megfelelően a találmány szerinti plazmidok sokkal alkalmasabbak a rekombináns interleukin-4 és az interleukin-4-muteinek előállítására, mint bármely, korábban ismert plazmid.
A találmány szerinti, újonnan kifejlesztett vektorrendszer a következő elemeket tartalmazza:
T5-promoter
A T5 E. coli fág promotere - két lac-operátorszekvenciával együtt - a pDS plazmidcsaládba [Bujard és munkatársai: Methods Enzymol. 155, 416 (1987); Stüber és munkatársai: „Immunological Methods” szerk.: Lefkovits és Pernis, Academic Press, Inc. IV. kötet, 121. old. (1990)] tartozó pQE30 plazmidból (Qiagen) származik.
T7-g10 riboszómakötő hely
Ez a riboszómakötő hely (rbs) a T7-fág 10. génjétől 5’-irányban elhelyezkedő régióból (T7-g10 vezetőszekvencia) származik. A T7-fág 10. génje a fág burokproteinjét kódolja, amely a T7-fertőzés után expresszálódó fő protein. A T7-g10 riboszómakötő helyet a pET-9a-vektorból [Studier és munkatársai: Methods Enzymol. 185, 60 (1990)] nyertük. A T7-g10 vezetőszekvencia kb. 100 bp-os régiót ível át [Olins és mun2
HU 224 491 Β1 katársai: Gene 227, 235 (1988)]. A végső expressziós konstrukcióban az Xbal-helytől 5’-irányban lévő régiót delécióval eltávolítottuk, így a T7-g10 vezetőszekvencia 42 bp hosszúságú, és a találmány szerinti előnyös plazmid 3638. pozíciójában egy G^A szubsztitúciót hordoz.
A természetes IL-4-szekvencia kodonfelhasználása
A szinonim kodonfelhasználásra vonatkozó hajlam hatékony mérőszámaként kodonadaptációs index (CAI) határozható meg, amely alkalmas lehet egy adott gén expressziója mértékének megjóslására [Sharp és munkatársai: Nucleic Acids Rés. 15, 1281 (1987); Apelerés munkatársai: Eur. J. Biochem. 247, 890 (1997)]. A CAl-érték úgy számítható ki, hogy az adott génben alkalmazott egyes kodonoknak megfelelő relatív szinonim kodonfelhasználási (RSCU) értékek geometriai átlagát elosztjuk az ugyanolyan aminosav-összetételű aminosavszekvenciát kódoló gén maximális lehetséges CAl-értékével. Az egyes kodonokra vonatkozó RSCU-értékeket egy adott organizmusban (például E. coliban) nagyon nagy mennyiségben expresszálódó génekből számítjuk ki; az RSCU-érték jelentése: a kodon megfigyelt gyakorisága, osztva az egy aminosavat kódoló szinonim kodonok egyenlő felhasználását feltételezve várt gyakorisággal. A nagy mennyiségben expresszálódó (például riboszomális proteineket kódoló) gének CAl-értéke általában magas (>0,46), míg a kis mennyiségben expresszálódó gének (mint például a lacl- és trpR-gén) E. coliban kis CAl-értékűek (<0,3).
A természetes IL-4-szekvenciára kiszámított E. coli CAl-érték 0,733. Ez azt jelenti, hogy a természetes gén E. coliban alkalmas a nagy mennyiségben történő expresszióra. Mindazonáltal E. coliban optimális kodonfelhasználású szintetikus génnel (amelynek CAl-értéke 1) tovább növelhető az expresszió nagysága. Ennek megfelelően szintetikus IL—4- és IL-4-mutein-géneket terveztünk és klónoztunk.
Transzkripciós terminátorszignál
A Τφ transzkripciós terminátorszignált tartalmazó T7-DNS-fragmens a pET-9a-vektorból [Studier és munkatársai: Methods Enzymol. 185, 60 (1990)] származik. A transzkripciós terminátorszignálok határozzák meg az mRNS/RNS-polimeráz/DNS komplex disszociációjának - s ezáltal a transzkripció befejezésének - helyét. Egy nagy mennyiségben expresszálódó gén végén a transzkripciós terminátorszignál jelenlétének több előnye is van: minimálisra csökkenti az RNS-polimeráz szükségtelen transzkripcióban való - lefoglaltságát; minimálisra korlátozza az mRNS hosszúságát, korlátozva ezáltal az energiaveszteséget, mivel a nagymértékű transzkripció zavarhatja a replikációs kezdőhelyet, egy transzkripciós terminátor - a kópiaszám fenntartása révén - növeli a plazmidstabilitást [Balbas és Bolivár: Methods Enzymol. 185, 14 (1990)].
Rezisztenciagén
A kan-rezisztenciagén a pET-9a-vektorból [Studier és munkatársai: Methods Enzymol. 185, 60 (1990)] származik. Eredetileg ez a gén a pUC4KISS-vektorból [Bárány, Gene 37, 111 (1985)] származó Tn903 kangénje. A találmány szerinti előnyös plazmidban a kan-gén és az IL-4-, illetve IL-4-muteingén ellentétes orientációban helyezkedik el, miáltal a kan-gén-termék mennyisége a T5-promoterről kiinduló, túlszaladó („read-through”) transzkripciónak köszönhető indukció után nem növekedhet. A kanamicint azért választottuk szelekciós markerként, mert GMP-célokra ez az előnyös antibiotikum. Ezenfelül a kan-génen alapuló vektorok stabilabbak, mint az ampicillinrezisztencia-géneket hordozó (bla) plazmidok. Az ampicillines szelekció a tenyészetben kiválasztott β-laktamáz-enzim antibiotikumot lebontó hatásának következtében lehetetlenné válik. A baktériumok kanamicinnel szembeni rezisztenciája amino-glikozid-foszfotranszferázon alapul, amely inaktiválja az antibiotikumot.
Expressziós szabályozóelemek
Stabil plazmidrendszer létrehozása céljából feltétlenül szükség van szabályozott génexpresszióra, különösen olyan esetben, ha az expresszáltatni kívánt protein káros a gazdasejtre. A találmány szerinti előnyös plazmidban lac-alapú, indukálható rendszert alkalmazunk, amely lac-represszorgénből (lacl) és két szintetikus lac-operátorszekvenciából áll, melyek az E. coli T5-fágjának promoterének 3’-végéhez vannak kapcsolva. A lacP-promotert és a lacl-struktúrgént a pTrc99A-vektorból [Armann és munkatársai: Gene 69, 301 (1988)] izoláltuk. Az H egy promotermutáció, amely a lacl-represszor túltermelődését eredményezi. A vad típusú lac-represszor egy tetramer molekula, amely négy azonos, egyenként 360 aminosavas alegységből áll. A lac-represszor tetramer két funkcionális dimerből álló dimer. A négy alegységet a 340-360. aminosavakból álló, négy hélixes köteg tartja össze. Mivel a lacl-gént a pTrc99A-vektorból Narl-endonukleázzal végzett hasítással izoláltuk, a 331. aminosav utáni aminosavakat kódoló nukleotidok hiányoznak, és 10 további - a lacl-gén által normális esetben nem kódolt - aminosavat kódoló nukleotid van hozzákapcsolva. Ismeretes, hogy a lacl C-terminális részén - a 329. aminosav után - található mutációk vagy deléciók olyan működőképes dimereket eredményeznek, amelyek fenotípus szintjén hasonlóak a vad típusú represszorhoz [Pace és munkatársai: TIBS 22, 334 (1997)].
Replikációs kezdőhely (őri)
A találmány szerinti előnyös plazmid replikációs kezdőhelye (őri) a pET-9a-vektorból származik (melynek replikációs kezdőhelye viszont a pBR322 plazmidból való). Ennek megfelelően a találmány szerinti előnyös plazmid a pMB1-(ColE1-)replikont hordozza. Az e replikont tartalmazó plazmidok sokkópiás plazmidok, amelyek „relaxált” módon replikálódnak. Normális tenyésztési feltételek mellett minden egyes baktériumsejtben minimum 15-20 plazmidkópia marad fenn. A találmány szerinti előnyös plazmid tényleges példányszáma e tartományon belül esik. A Co1E1 típusú őri replikációját egy 555 nukleotidos RNS-transzkrip3
HU 224 491 Β1 tűm, az RNS-II indítja be, amely - az őri közelében lévő - templát-DNS-ével állandó hibridet alkot. Az RNS-II/DNS hibridet ezután - az őri pozíciójában RNáz-H hasítja, miáltal szabad 3'OH-csoport képződik, amely a DNS-polimeráz-l láncindítójaként szolgál. A DNS-szintézis ilyenfajta beindítása az RNS-I (amely az RNS-II 5’-végével komplementer, 108 nukleotidos RNS-molekula) negatív szabályozása alatt áll. Az antiszensz RNS-I és az RNS-II közötti kölcsönhatás az RNS-II konformációs változását eredményezi, ami gátolja az RNS-II templát-DNS-hez történő kötődését, s ezáltal gátolja a plazmid-DNS szintézisének beindítását. Az RNS-I RNS-ll-höz történő kötődését egy 63 aminosavas protein (Rop-protein; „Repressor of primer”) serkenti; ezt a proteint a replikációs kezdőhelytől 3’-irányban, 400 nukleotidnyi távolságra lévő gén kódolja [Sambrook és munkatársai: „Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, Cold Spring Harbor (1989)]. A Rop-proteint kódoló rop-gén deléciója a kópiaszám fokozódásához és - a gén dózishatásának következtében - a plazmid által hordozott heterológ gén megnövekedett expressziós szintjéhez vezet. Az IL-4 tesztelt expressziós vektorai esetében ugyanezt tapasztaltuk, azonban kiderült, hogy a rop-plazmidok instabilak, és nem szelektív feltételek mellett végzett fermentáció során nagyon gyorsan elfogynak. A találmány szerinti előnyös plazmidból hiányzik a mobilizációhoz szükséges mob-gén, ezáltal nem képes saját - egyik baktériumsejtről a másikra történő - konjugációs átjutásának vezérlésére.
A találmány szerinti előnyös plazmidból valamennyi olyan elemet eltávolítottuk, amely a plazmid replikációjához, a rezisztenciához és a szabályozható expresszióhoz nem szükséges.
A találmány szerinti előnyös plazmid előállítása során nincs szükség valamennyi, fentebb felsorolt elemet a plazmidba foglalnunk. Például interleukin-4 vagy az interleukin-4-mutein szintetikus - optimalizált E. coli kodonfelhasználású - génje helyett természetes gént is alkalmazhatunk. A plazmidban előnyösen Τφ transzkripciós terminátort alkalmazunk, de egyéb terminációs szignálok (például rrnB-T2 vagy aspA) is alkalmasak. Hasonlóan, a találmány szerinti előnyös plazmid előállításához a fentebb említett, kereskedelmi forgalomban beszerezhető vektoroktól eltérő vektorokból származó elemek is alkalmazhatók.
A következőkben az expressziós rendszer létrehozása során alkalmazott eljárásokat ismertetjük.
Anyagok és módszerek
Enzimek
A restrikciós endonukleázokat, a borjúbél-eredetű alkalikus foszfatázt, a T4-polinukleotid-kinázt és a T4-DNS-ligázt a Boehringer-Mannheimtől és a GIBCO-BRL-től vásároltuk, és ezeket a forgalmazók által megadott használati útmutatás szerint alkalmaztuk.
Rekombináns DNS-technikák
A szokványos klónozási eljárások leírását lásd Sambrook és munkatársai: „Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor (1989). A transzformálásokat M. Scott módszerével végeztük [Seed és Aruffo: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 3365 (1987)]. A transzformálások gazdasejtjeiként elsősorban az E. coli DH5a-törzset (GIBCO BRL) és az E. coli W3110-törzset (ATCC 27 325) alkalmaztuk. A W1330sejtek genotípusa K12, F~, [N(rrnD-rmE)]X~.
A plazmid-DNS nagy mennyiségben történő izolálására Qiagen-pipettahegyeket (Qiagen) alkalmaztunk. A DNS-fragmenseket „Jetsorb” (Genomed) alkalmazásával - a forgalmazó útmutatásai szerint - vontuk ki az agarózgélekről.
A helyspecifikus mutagenezis, a polimeráz-láncreakciók és a nukleotidszekvenálások végrehajtására alkalmas oligonukleotidokat az MWG Biotechtől, a Pharmacia Biotechtől és a GIBCO BRL-től szereztük be.
A mutagenizálási kísérleteket Deng és Nickoloff eljárásával hajtottuk végre [Deng és Nickoloff: Anal. Biochem. 200, 81 (1992)], melynek során a Pharmacia Biotechtől származó „Unique Site Elimination Mutagenesis” rendszert alkalmaztuk. A T7-g10 riboszómakötő hely újjáalakítására alkalmazott láncindító nukleotidszekvenciája a következő:
5’TCAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACATCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAA3' (1. azonosító számú szekvencia).
Valamennyi konstrukció és DNS-szekvencia nukleotidszekvenciáját ABI 373A típusú szekvenálókészülékkel („Applied Biosystems”), „Dye Terminator Cycle Sequencing” reagenskészlet, „AmpliTaq” DNS-polimeráz, FS alkalmazásával határoztuk meg.
A találmány szerinti megoldást a következőkben a kísérleti példák, az ábrák és a szekvenciainformációk segítségével ismertetjük részletesen.
Az 1-4. ábrákon a találmány szerinti előnyös expressziós plazmid előállításának vázlatát mutatjuk be (IL-4 TM=IL-4 tripla mutein; IL-4 DM=IL-4 dupla mutein).
Az 5. ábrán az IL-4-muteint expresszáló pR021.1.0 és pR02.1.0 expressziós vektorok plazmidstabilitásának tanulmányozására végzett kísérlet eredményeit mutatjuk be. A pRO2.1.O-vektor - antibiotikumos szelekció nélkül 78 generáción keresztül stabil marad, míg a kereskedelmi forgalomban beszerezhető pET-30a plazmidon (Novagen) alapuló pR021.1.0-vektor nagyon gyorsan elfogy (ezt a vektort kanamicines szelekció nélkül, 78 generáció után csak a telepek 16%-a tartalmazta).
A 6. ábrán a találmány szerinti előnyös IL-4 és IL-4-mutein expressziós vektor indukció utáni expressziós képességének fennmaradását mutatjuk be. A különböző számú generációkon keresztül, antibiotikumos szelekció nélkül tenyésztett E. co///pRO2.1.O-sejtek teljes kivonatainak 15%-os poliakril4
HU 224 491 Β1 amid-gélen végzett SDS-PAGE-analízise 0,5 mM végkoncentrációjú IPTG-vel öt óra hosszat végzett indukció után. A gél üregeibe az újraszuszpendált sejtüledék 10-10 μΙ-ét töltöttük. A gélt redukáló feltételek mellett futtattuk, majd „Coomassie brillant blue” színezékkel festettük.
1. sáv: Molekulatömeg-marker („Low Rangé”, Life Technologies);
2. sáv: IL^Í-muteinek (5 μg);
3. sáv: E. co///pRO2.1.0 (8 generáció) indukció előtt;
4. sáv: E. co///pRO2.1.0 (8 generáció) indukció után;
5. sáv: E. co///pRO2.1.O (18 generáció) indukció után;
6. sáv: E. co///pRO2.1.0 (28 generáció) indukció után;
7. sáv: E. co//7pRO2.1.0 (38 generáció) indukció után;
8. sáv: E. co///pRO2.1.O (48 generáció) indukció után;
9. sáv: E. co///pRO2.1.0 (58 generáció) indukció után;
10. sáv: E. co//7pRO2.1.0 (68 generáció) indukció után;
11. sáv: E. coli/pRO2.1.0 (78 generáció) indukció előtt;
12. sáv: E. co///pRO2.1.O (78 generáció) indukció után;
13. sáv: Molekulatömeg-marker („Low Rangé”, Life Technologies);
14. sáv: Molekulatömeg-marker („High Rangé”, Life Technologies).
1. példa
Plazmidstabilitási teszt
A plazmidstabilitási teszteket minden esetben folyékony nitrogénben lefagyasztott tenyészettel kezdtük. Először meghatároztuk a felolvasztott tenyészet OD600-értékét, majd a tenyészetet PBS-pufferben 10^-szeres koncentrációra hígítottuk, és antibiotikumok nélkül LB-agarlemezekre kentük.
A felolvasztott tenyészet 1 ml-ét 100 ml peptontápközegbe (30 g/liter szójapepton; 20 g/liter élesztőkivonat; 5 g/liter KH2PO4; 20 g/liter glicerin; 1 g/liter
MgSO4.7H2O; pH=7,0) oltottuk, és percenkénti 280-as fordulatszámmal keverve, 37 °C-on 24 óra hosszat inkubáltuk.
A tenyészet optikai denzitását 600 nm-nél mértük, majd a tenyészetet PBS-pufferben 10~6-szoros koncentrációra hígítottuk, és antibiotikum nélküli LB-agarlemezekre szélesztettük, hogy jól elkülönült telepeket kapjunk.
A tenyészet 100 μΙ-ét 100 ml peptontápközegbe oltottuk, és percenkénti 280-as fordulatszámmal keverve, 37 °C-on 24 óra hosszat inkubáltuk.
Az LB-lemezekről származó 100, jól elkülönült telepet kanamicint (25 μg/ml) tartalmazó LB-lemezeken, illetve kanamicin nélküli LB-lemezeken kialakított rácsozatba helyeztük, 37 °C-on egy éjszakán át inkubáltuk, majd naponta meghatároztuk a rezisztens telepek százalékos arányát.
A naponkénti generációszámot a következő képlettel számítottuk ki: log[kiindulási OD600/vég OD600]/log2.
Az expressziós vizsgálatokhoz a tenyészet 1 ml-ét LB-tápközegben 100-szoros térfogatra hígítottuk, és a
2. példában leírtak szerint kezeltük.
2. példa
Expressziós vizsgálat
Az interleukin-4 és az interleukin-4-muteinek kis mennyiségben történő expresszáltatása céljából a sejteket LB-tápközegben (10 g/liter Bactotripton; 5 g/liter élesztőkivonat; 10 g/liter NaCI; pH=7,5) addig tenyésztettük, míg a 600 nm-nél mért optikai denzitás (OD600) 0,8-1,0 értéket nem ért el. Az expressziót 0,5 mM végkoncentrációjú IPTG hozzáadásával indukáltuk, és az inkubálást 5 óra hosszat folytattuk. A sejteket centrifugálással gyűjtöttük össze.
Az SDS-PAGE-analízis elvégzéséhez a sejtüledéket SDS-PAGE felvivőpufferben - 1 OD600-egység/100 μΙ koncentrációra - hígítottuk.
SZEKVENCIALISTA <210> 1 <211 >60 <212> DNS <213> ismeretlen <220>
<223> ismeretlen élőlény leírása: primer <400> 1 tcaattgtga gcggataaca atttcacaca tctagaaata attttgttta actttaagaa 60 <210>2 <211 >4202 <212> DNS <213> ismeretlen <220>
<223> ismeretlen élőlény leírása: ember <400> 2 ttagaaaaac tcatcgagca tcaaatgaaa ctgcaattta ttcatatcag gattatcaat 60 accatatttt tgaaaaagcc gtttctgtaa tgaaggagaa aactcaccga ggcagttcca 120 taggatggca agatcctggt atcggtctgc gattccgact cgtccaacat caatacaacc 180 tattaatttc ccctcgtcaa aaataaggtt atcaagtgag aaatcaccat gagtgacgac 240
HU 224 491 Β1 tgaatccggt gagaatggca aaagcttatg catttctttc cagacttgtt caacaggcca 300 gccattacgc tcgtcatcaa aatcactcgc atcaaccaaa ccgttattca ttcgtgattg 360 cgcctgagcg agacgaaata cgcgatcgct gttaaaagga caattacaaa caggaatcga 420 atgcaaccgg cgcaggaaca ctgccagcgc atcaacaata ttttcacctg aatcaggata 480 ttcttctaat acctggaatg ctgttttccc ggggatcgca gtggtgagta accatgcatc 540 atcaggagta cggataaaat gcttgatggt cggaagaggc ataaattccg tcagccagtt 600 tagtctgacc atctcatctg taacatcatt ggcaacgcta cctttgccat gtttcagaaa 660 caactctggc gcatcgggct tcccatacaa tcgatagatt gtcgcacctg attgcccgac 720 attatcgcga gcccatttat acccatataa atcagcatcc atgttggaat ttaatcgcgg 780 cctcgagcaa gacgtttccc gttgaatatg gctcataaca ccccttgtat tactgtttat 840 gtaagcagac agttttattg ttcatgacca aaatccctta acgtgagttt tcgttccact 900 gagcgtcaga ccccgtagaa aagatcaaag gatcttcttg agatcctttt tttctgcgcg 960 taatctgctg cttgcaaaca aaaaaaccac cgctaccagc ggtggtttgt ttgccggatc 1020 aagagctacc aactcttttt ccgaaggtaa ctggcttcag cagagcgcag ataccaaata 1080 ctgtccttct agtgtagccg tagttaggcc accacttcaa gaactctgta gcaccgccta 1140 catacctcgc tctgctaatc ctgttaccag tggctgctgc cagtggcgat aagtcgtgtc 1200 ttaccgggtt ggactcaaga cgatagttac cggataaggc gcagcggtcg ggctgaacgg 1260 ggggttcgtg cacacagccc agcttggagc gaacgaccta caccgaactg agatacctac 1320 agcgtgagct atgagaaagc gccacgcttc ccgaagggag aaaggcggac aggtatccgg 1380 taagcggcag ggtcggaaca ggagagcgca cgagggagct tccaggggga aacgcctggt 1440 atctttatag tcctgtcggg tttcgccacc tctgacttga gcgtcgattt ttgtgatgct 1500 cgtcaggggg gcggagccta tggaaaaacg ccagcaacgc ggccttttta cggttcctgg 1560 ccttttgctg gccttttgct cacatgttct ttcctgcgtt atcccctgat tctgtggata 1620 accgtattac cgcctttgag tgagctgata ccgctcgccg cagccgaacg accgagcgca 1680 gcgagtcagt gagcgaggaa gcggaagagc gcctgatgcg gtattttctc cttacgcatc 1740 tgtgcggtat ttcacaccgc aatggtgcac tctcagtaca atctgctctg atgccgcata 1800 gttaagccag tatacactcc gctatcgcta cgtgactggg tcatggctgc gccccgacac 1860 ccgccaacac ccgctgacgc gccctgacgg gcttgtctgc tcccggcatc cgcttacaga 1920 caagctgtga ccgtctccgg gagctgcatg tgtcagaggt tttcaccgtc atcaccgaaa 1980 cgcgcgaggc agctgcggta aagctcatca gcgtggtcgt gaagcgattc acagatgtct 2040 gcctgttcat ccgcgtccag ctcgttgagt ttctccagaa gcgttaatgt ctggcttctg 2100 ataaagcggg ccatgttaag ggcggttttt tcctgtttgg tcactgatgc ctccgtgtaa 2160 gggggatttc tgttcatggg ggtaatgata ccgatgaaac gagagaggat gctcacgata 2220 cgggttactg atgatgaaca tgcccggtta ctggaacgtt gtgagggtaa acaactggcg 2280 gtatggatgc ggcgggacca gagaaaaatc actcagggtc aatgccagcg ctcatgagcc 2340 cgaagtggcg agcccgatct tccccatcgg tgatgtcggc gatataggcg ccagcaaccg 2400 cacctgtggc gccggtgatg ccggccacga tgcgtccggc gtagaggatc gagatccatt 2460 tacgttgaca ccatcgaatg gtgcaaaacc tttcgcggta tggcatgata gcgcccggaa 2520 gagagtcaat tcagggtggt gaatgtgaaa ccagtaacgt tatacgatgt cgcagagtat 2580 gccggtgtct cttatcagac cgtttcccgc gtggtgaacc aggccagcca cgtttctgcg 2640 aaaacgcggg aaaaagtgga agcggcgatg gcggagctga attacattcc caaccgcgtg 2700 gcacaacaac tggcgggcaa acagtcgttg ctgattggcg ttgccacctc cagtctggcc 2760 ctgcacgcgc cgtcgcaaat tgtcgcggcg attaaatctc gcgccgatca actgggtgcc 2820 agcgtggtgg tgtcgatggt agaacgaagc ggcgtcgaag cctgtaaagc ggcggtgcac 2880 aatcttctcg cgcaacgcgt cagtgggctg atcattaact atccgctgga tgaccaggat 2940 gccattgctg tggaagctgc ctgcactaat gttccggcgt tatttcttga tgtctctgac 3000 cagacaccca tcaacagtat tattttctcc catgaagacg gtacgcgact gggcgtggag 3060 catctggtcg cattgggtca ccagcaaatc gcgctgttag cgggcccatt aagttctgtc 3120 tcggcgcgtc tgcgtctggc tggctggcat aaatatctca ctcgcaatca aattcagccg 3180 atagcggaac gggaaggcga ctggagtgcc atgtccggtt ttcaacaaac catgcaaatg 3240 ctgaatgagg gcatcgttcc cactgcgatg ctggttgcca acgatcagat ggcgctgggc 3300 gcaatgcgcg ccattaccga gtccgggctg cgcgttggtg cggatatctc ggtagtggga 3360 tacgacgata ccgaagacag ctcatgttat atcccgccgt taaccaccat caaacaggat 3420 tttcgcctgc tggggcaaac cagcgtggac cgcttgctgc aactctctca gggccaggcg 3480 gtgaagggca atcagctgtt gcccgtctca ctggtgaaaa gaaaaaccac cctggctcga 3540 gaaatcataa aaaatttatt tgctttgtga gcggataaca attataatag attcaattgt 3600 gagcggataa caatttcaca catctagaaa taattttatt taactttaag aaggagatat 3660 acatatgcac aaatgcgata tcaccctgca ggaaatcatc aaaaccctga attctctgac 3720 cgaacagaaa accctgtgca ccgaactgac cgttaccgac atcttcgctg cttcgaaaaa 3780 caccaccgaa aaagaaacct tctgccgtgc tgctaccgtt ctgcgtcagt tctactctca 3840
HU 224 491 Β1 ccacgaaaaa gctgatccgt ctgcccggtt catcatggac cccgaaagga gggcctctaa te gacacccgtt ttcctgaaac aaagaageta gaaaaagact agetgagttg acgggtcttg gcctgggtgc gtctggaccg accagtctac etaaatgete gctgctgcca aggggttttt taccgctcag taacctgtgg cctggaaaac ttcttaataa ccgctgagca tgctgaaagg cagttccacc ggtctggctg ttcctggaac ggatccggct ataactagca aggaactata gtcacaaaca gtctgaacag gtctgaaaac gctaacaaag taaccccttg teeggataat
3900
3960
4020
4080
4140
4200
4202
Claims (4)
- SZABADALMI IGÉNYPONTOK1. Plazmid IL—4 és IL-4-muteinek Escherichia coli 15 törzsben történő előállítására, amely 5'->3' irányban tartalmazza a következő - egymáshoz működőképesen kapcsolt - elemeket: E. coli T5-fág promoterből és két lac-operátorszekvenciából álló, vezérelhető promoter; E. coli T7-fágból származó T7-g10 riboszómakötő 20 hely; transzlációs kezdőkodon; az IL—4 vagy IL-4-mutein strukturális génje; valamint a strukturális géntől 3’-irányban egy transzkripciós terminációs szignál.
- 2. A 4. ábrán bemutatott szerkezetű pR02.1.0 plazmidot tartalmazó E. coli-sejt
- 3. Escherichia coli, amely 1. igénypont szerinti vagy a 2. igénypontban említett plazmiddal van transzformálva.
- 4. Az 1. igénypont szerinti vagy a 2. igénypontban említett plazmid alkalmazása IL—4 vagy IL-4-muteinek előállítási eljárásában.HU 224 491 Β1Int. Cl.7: C 12 N 15/70 . ábraHU 224 491 Β1Int. Cl.7: C 12 N 15/702. ábraHU 224 491 Β1Int. Cl.7: C 12 N 15/703. ábraHU 224 491 Β1Int. Cl.7: C 12 N 15/704. ábraHU 224 491 Β1Int. Cl.7: C 12 N 15/70 (3 S S 3 eAu^je so-% >|ads|8i suaizsizayGenerációk száma80+HU 224 491 Β1Int. Cl.7: C 12 N 15/706. ábra
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP99100967A EP1022339B1 (en) | 1999-01-20 | 1999-01-20 | Plasmids, their construction and their use in the manufacture of interleukin-4 and interleukin-4 muteins |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HU0000185D0 HU0000185D0 (en) | 2000-04-28 |
| HUP0000185A2 HUP0000185A2 (en) | 2002-09-28 |
| HU224491B1 true HU224491B1 (hu) | 2005-09-28 |
Family
ID=8237378
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU0000185A HU224491B1 (hu) | 1999-01-20 | 2000-01-20 | Plazmidok, előállítási eljárásaik, valamint alkalmazásuk interleukin-4 és interleukin-4-muteinek előállítására |
Country Status (15)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6506590B1 (hu) |
| EP (1) | EP1022339B1 (hu) |
| JP (2) | JP2000210091A (hu) |
| KR (1) | KR100665148B1 (hu) |
| AT (1) | ATE334202T1 (hu) |
| AU (1) | AU772897B2 (hu) |
| CA (1) | CA2294575C (hu) |
| CZ (1) | CZ294279B6 (hu) |
| DE (1) | DE69929638T2 (hu) |
| DK (1) | DK1022337T3 (hu) |
| ES (1) | ES2269027T3 (hu) |
| HU (1) | HU224491B1 (hu) |
| NO (1) | NO327317B1 (hu) |
| PT (1) | PT1022337E (hu) |
| SK (1) | SK285603B6 (hu) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE10022258A1 (de) | 2000-05-08 | 2001-11-15 | Bayer Ag | Reinigung von Proteineinschlusskörpern durch Querstrom-Mikrofiltration |
| KR100443570B1 (ko) * | 2001-07-31 | 2004-08-09 | 크레아젠 주식회사 | 재조합 인간 인터루킨-4의 제조방법 |
| EP1314739A1 (en) | 2001-11-22 | 2003-05-28 | Bayer Ag | Process for renaturation of recombinant, disulfide containing proteins at high protein concentrations in the presence of amines |
| JP2006055082A (ja) * | 2004-08-20 | 2006-03-02 | National Institute Of Advanced Industrial & Technology | 発光甲虫由来赤色発光酵素安定体の生産及び精製法 |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4689406A (en) * | 1983-08-10 | 1987-08-25 | Amgen | Enhancement of microbial expression of polypeptides |
| AU597951B2 (en) * | 1986-03-27 | 1990-06-14 | Monsanto Company | Enhanced protein production in bacteria by employing a novel ribosome binding site |
| ATE123526T1 (de) * | 1987-08-17 | 1995-06-15 | Hoffmann La Roche | Hochreprimierbare expressionskontrollsequenzen. |
| FR2724665B1 (fr) * | 1994-09-16 | 1996-12-20 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Procede de production de proteines recombinantes, plasmides et cellules modifiees |
| MY124565A (en) * | 1996-07-19 | 2006-06-30 | Bayer Corp | High-affinity interleukin-4-muteins |
-
1999
- 1999-01-20 EP EP99100967A patent/EP1022339B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1999-01-20 DE DE69929638T patent/DE69929638T2/de not_active Expired - Lifetime
-
2000
- 2000-01-07 AT AT00100129T patent/ATE334202T1/de active
- 2000-01-07 DK DK00100129T patent/DK1022337T3/da active
- 2000-01-07 ES ES00100129T patent/ES2269027T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2000-01-07 PT PT00100129T patent/PT1022337E/pt unknown
- 2000-01-14 JP JP2000006477A patent/JP2000210091A/ja active Pending
- 2000-01-14 US US09/483,419 patent/US6506590B1/en not_active Expired - Fee Related
- 2000-01-17 CA CA002294575A patent/CA2294575C/en not_active Expired - Fee Related
- 2000-01-19 KR KR1020000002310A patent/KR100665148B1/ko not_active IP Right Cessation
- 2000-01-19 CZ CZ2000214A patent/CZ294279B6/cs not_active IP Right Cessation
- 2000-01-19 NO NO20000262A patent/NO327317B1/no not_active IP Right Cessation
- 2000-01-19 SK SK76-2000A patent/SK285603B6/sk unknown
- 2000-01-20 AU AU12507/00A patent/AU772897B2/en not_active Ceased
- 2000-01-20 HU HU0000185A patent/HU224491B1/hu not_active IP Right Cessation
-
2010
- 2010-08-27 JP JP2010190917A patent/JP2010284174A/ja not_active Withdrawn
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DK1022337T3 (da) | 2006-11-06 |
| AU772897B2 (en) | 2004-05-13 |
| ATE334202T1 (de) | 2006-08-15 |
| DE69929638T2 (de) | 2006-09-21 |
| CA2294575C (en) | 2009-04-07 |
| SK762000A3 (en) | 2000-08-14 |
| HU0000185D0 (en) | 2000-04-28 |
| EP1022339B1 (en) | 2006-02-01 |
| PT1022337E (pt) | 2006-11-30 |
| HUP0000185A2 (en) | 2002-09-28 |
| KR20000053523A (ko) | 2000-08-25 |
| NO20000262D0 (no) | 2000-01-19 |
| KR100665148B1 (ko) | 2007-01-09 |
| DE69929638D1 (de) | 2006-04-13 |
| CZ2000214A3 (cs) | 2000-08-16 |
| NO327317B1 (no) | 2009-06-08 |
| JP2000210091A (ja) | 2000-08-02 |
| CA2294575A1 (en) | 2000-07-20 |
| CZ294279B6 (cs) | 2004-11-10 |
| EP1022339A1 (en) | 2000-07-26 |
| ES2269027T3 (es) | 2007-04-01 |
| US6506590B1 (en) | 2003-01-14 |
| AU1250700A (en) | 2000-07-27 |
| NO20000262L (no) | 2000-07-21 |
| JP2010284174A (ja) | 2010-12-24 |
| SK285603B6 (sk) | 2007-04-05 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Paluh et al. | High level production and rapid purification of the E. coli trp repressor | |
| Maeda et al. | Heat shock protein 60 (GroEL) from Porphyromonas gingivalis: molecular cloning and sequence analysis of its gene and purification of the recombinant protein | |
| Price et al. | Molecular analysis of lcrGVH, the V antigen operon of Yersinia pestis | |
| JPH05227951A (ja) | Ｌ−フェニルアラニル−ｔＲＮＡシンテターゼ変異体、その製造法および非タンパク質誘発性アミノ酸のペプチドまたはタンパク質へのインビボでの組込みのためのその使用 | |
| HU203579B (en) | Process for producing fusion-proteins | |
| HU195535B (en) | Process for producing dna transfer vector comprising base sequence determining cattle growth hormone or prehormone | |
| JPH0656894A (ja) | 豚成長ホルモンのポリペプチドおよびその製造方法 | |
| JPH10108675A (ja) | コリネバクテリウム・アンモニアゲネス由来の新規な細胞表層蛋白質 | |
| US7868148B2 (en) | Plasmids, their derivatives and fragments, their methods of manufacture and application | |
| de Haan et al. | The nucleotide sequence of a regulatory gene present on a plasmid in an enterotoxigenic Escherichia coli strain of serotype O167: H5 | |
| HU224491B1 (hu) | Plazmidok, előállítási eljárásaik, valamint alkalmazásuk interleukin-4 és interleukin-4-muteinek előállítására | |
| NL8602960A (nl) | Humaan mangaansuperoxydedismutase cdna, expressie daarvan in bacterien en werkwijze voor het winnen van enzymatisch actief humaan mangaansuperoxydedismutase. | |
| JPH08173169A (ja) | ニトリラーゼ遺伝子発現のための調節因子およびその遺伝子 | |
| US7070989B2 (en) | Escherichia coli strain secreting human granulocyte colony stimulating factor (G-CSF) | |
| NO174631B (no) | Fremgangsmaate ved fremstilling av homogent rekombinant immuninterferon-fragment, replikerbar vektor samt mikroorganisme | |
| CN110195070B (zh) | 大肠杆菌全局调控因子的突变基因crp及应用 | |
| Stieglitz et al. | Cloning, sequencing, and expression in Ficoll-generated minicells of an Escherichia coli heat-stable enterotoxin gene | |
| Theisen et al. | Cloning and characterization of the pyrF operon of Salmonella typhimurium | |
| JPH0142279B2 (hu) | ||
| JP2534968B2 (ja) | フラビン還元酵素遺伝子 | |
| JP3709422B2 (ja) | ニトリラーゼ遺伝子発現に関わる調節因子およびその遺伝子 | |
| RU2260049C2 (ru) | Рекомбинантная плазмидная днк pes3-7, кодирующая полипептид с последовательностью гранулоцитарного колониестимулирующего фактора человека, и штамм escherichia coli bl21(de3)/pes3-7 - продуцент рекомбинантного гранулоцитарного колониестимулирующего фактора человека | |
| RU2671099C1 (ru) | Рекомбинантная плазмида, экспрессирующая клонированный ген гемолизина Vibrio cholerae, и штамм Escherichia coli - суперпродуцент прогемолизина Vibrio cholerae | |
| EP1461437B1 (en) | Expression vectors and promoters for heterologous gene expression | |
| Cox et al. | Altered translation of the uncC gene coding for the epsilon subunit of the F1F0-ATPase of Escherichia coli |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| HFG4 | Patent granted, date of granting |
Effective date: 20050808 |
|
| GB9A | Succession in title |
Owner name: BAYER SCHERING PHARMA AG, DE Free format text: FORMER OWNER(S): BAYER AG., DE |
|
| MM4A | Lapse of definitive patent protection due to non-payment of fees |