CZ2000214A3 - Plasmidy, jejich konstrukce a jejich využití ve výrobě interleukinu -4 a muteinů interleukinu-4 - Google Patents

Description

PLASMIDY, JEJICH KONSTRUKCE A JEJICH VYUŽITÍ VE VÝROBĚ INTERLEUKINU-4 A MUTEINŮ INTERLEUKINU-4.

Oblast techniky

Vynález se týká konstrukce a použití expresních plasmidů ve výrobě rekombinantního interleukinu-4 (IL-4) a muteinů interleukinu-4.

Dosavadní stav techniky

Zralý lidský interleukin-4 (IL-4) je složen ze 129 aminokyselin a je z 50 % homologní s myším IL-4. IL-4 je jediný známý cytokin, který řídí diferenciaci pomocných T buněk na fenotyp (Mosmann.and Sad, Immunol. Today 17,

138-146, 1996). IL-4 předává signál lymfocytům a dalším buňkám přes heterodimerický aggkomplex dvou receptorů cytokinů, IL-4Ra a τ-řetězce (tc). Byly popsány antagonistické mutanty IL-4 (Kruše a kol. , EMBO J. 11,

3237 - 3244, 1992). Tři aminokyseliny blízko C-konce (R121, Y124 a S125) jsou důležité pro vazbu k tc-řetězci. Zavedení Asp(D) do těchto pozic blokuje dimerizaci receptorů a přenos signálů přes membránu.

Dvojitý mutein interleukinu-4 (IL-4 DM) je varianta IL-4 s dvěma změnami aminokyselin v pozicích 121 a 124 nazvaná IL-4 R121D Y124D. IL-4 DM je schopen blokovat obě aktivity IL-4 a IL-13. Na rozdíl od všech bodových mutantů žádné zbytkové agonistické aktivity nebyly pro tento mutein nikdy nalezeny. Má se za to, že tyto antagonistické vlastnosti IL-4 DM jsou užitečné pro léčbu onemocnění, která • ·

9

IgE (Ryan,

J. Allergy zahrnuj ί vývoj ^TH2 a/nebo produkci Clin. Immunol. 99, 1-5, 1997).

Jak bylo popsáno v různých publikacích, k produkci rekombinantního IL-4 a muteinů IL-4 mohou být využity prokaryotické organismy. Bohužel, popisované systémy mají řadu nedostatků (nízká hladina exprese, nízká stabilita expresního vektoru), které znemožňují produkci IL-4 a muteinů IL-4 ve velkém měřítku nebo jsou ekonomicky nerealizovatelné.

Hlavní kritéria pro účinný a bezpečný expresní systém jsou:

- vysoký výtěžek produktu

- regulovatelná stabilní exprese

- stabilita expresního vektoru.

Několik aspektů expresního plasmidu je důležitých pro výše uvedená kritéria (Hannig a kol., TIBTECH. 16, 54 - 60, 1998). Jsou to:

- promotor

- ribosomální vazebné místo (rbs)

- využití kodónu příslušného genu

- transkripční terminátor

- gen pro rezistenci

- regulace exprese

- počátek replikace (ori).

Podstata vynálezu

Podle vynálezu byly vytvořeny expresní plasmidy pro IL-4 a muteiny IL-4 s modifikacemi ve všech příslušných elementech pro účinný a bezpečný expresní systém. Kvalita • · · · ·· ··· · • · • · β · α ί, • · ·· ί» · a vhodnost příslušného expresního systému byla klasifikována zejména podle následujících kritérií:

- výtěžek IL-4 a muteinů IL-4

- stabilita plasmidu

- udržení indukční schopnosti.

Předmětem tohoto vynálezu je proto vytvoření metody pro konstrukci na použití expresního plasmidu pro výrobu rekombinantního interleukinu-4 (IL-4) a muteinů interleukinu-4 ve velkém měřítku. Navíc by měl nově vytvořený systém hostitele/vektoru být vhodný pro expresi dalších proteinů (cytokinů, růstových faktorů, rozpustných receptorů, protilátek atd.). Překvapivě bylo zjištěno, že bakterie transformované plasmidem podle tohoto vynálezu poskytují mnohonásobně větší rychlosti exprese a stabilitu plasmidu a exprese než bylo pozorováno po transformaci stejného hostitele jinými známými plasmidy. Proto je použití plasmidů dle tohoto vynálezu mnohem výhodnější pro produkci rekombinantního interleukinu-4 a muteinů interleukinu-4 ve srovnání se všemi dříve známými plasmidy.

Nově vyvinutý vektorový systém obsahuje následující prvky:

T5 promotor

Promotor bakteriofága T5 E. coli společně se dvěma lac operátorovými sekvencemi je odvozen z plasmidu pQE30 (Qiagen) , náležícího do skupiny plasmidů pDS (JBujard a kol., Methods Enzymol. 155, 416 - 433, 1987 a Stiiber a kol., Immunological Methods, I. Lefkowtts and B. Pernis, eds., Academie Press, lne. Vol. IV, 121 - 152, 1990).

• · · · • r • 9

9 • « »· ·· · · » • · · · · · «

9· 99

T7 glO ribosomální vazebné místo

Vazebné místo ribosomu (rbs) je odvozeno z oblasti před genem 10 bakteriofága T7 (T7gl0 vedoucí sekvence). Gen 10 fága T7 kóduje plášťový protein, který je hlavním proteinem exprimovaným po infekci fágem T7. T7 glO rbs byl získán z vektoru pET-9a (Studier a kot., Methods Enzymol.

185, 60 - 89, 1990). T7 glO vedoucí sekvence zahrnuje oblast okolo 100 bp (Olins et al., Gene 227 - 235, 1988). Ve finálním expresním konstruktu je oblast před Xbal místem odstraněna. T7 glO vedoucí sekvence nyní tedy zahrnuje 42 bp a obsahuje záměnu jedné báze z G na A v pozici 3638 v tomto zde popisovaném plasmidu.

Využití kodónů přirozené sekvence IL-4

Jakožto účinné měřítko využití synonymních kodónů přirozené sekvence může být index adaptace kodonu (codon adaptation index - CAI) použit pro předpovězení hladiny exprese daného genu (JSharp a kol., Nucleic Acids Res. 15, 1281 - 1295, 1987 and Apeler a kol., Eur. J. Biochem. 247, 890 - 895, 1997). CAI je počítán jako geometrický střed hodnot relativního využití kodónů (RSCU) odpovídajících každému z kodónů použitých v genu, děleno maximálním možným CAI pro gen pro stejné aminokyselinové složení. RSCU hodnoty j sou pro každý kodón počítány z velmi vysoce exprimovaných genů určitého organismu, např. E. coli, a reprezentují pozorovanou frekvenci kodonu dělenou frekvencí očekávanou za předpokladu stejného využití synonymních kodónů pro aminokyselinu. Vysoce exprimované geny, např. geny kódující ribosomální proteiny, obecně mají vysoké hodnoty CAI >

0,46. Slabě exprimované geny jako lad a trpR v E. coli mají nízké hodnoty CAI < 0,3.

• · · ·

Vypočítaná hodnota CAI v E. coli je pro přirozenou sekvenci IL-4 0,733. To znamená, že přirozený gen by měl být vhodný pro vysokou hladinu exprese v E. coli. Nicméně má syntetický gen s optimálním využitím E. coli kodónů (hodnota CAI = 1) potenciál k dalšímu zvýšení hladiny exprese. Proto byly navrženy a klonovány syntetické geny pro IL-4 a muteiny IL-4.

Transkripční terminátor

Fragment z T7 DNA obsahující transkripční terminátor T0 je odvozen z vektoru pET-9a (Studier a kol., Methods Enzymol. 185, 60 - 89, 1990). Transkripční terminátory určují místa, kde komplex mRNA - RNA polymerasa - DNA disociuje a tím končí transkripce. Přítomnost transkripčního terminátoru na konci vysoce exprimovaného genu má několik výhod: minimalizují nedostupnost RNA polymerasy, která by byla zahrnuta v nadbytečné transkripci, omezuj i délku mRNA na minimální potřebnou délku a tím omezuje výdej energie. Vzhledem k tomu, že silná transkripce by mohla interferovat s počátkem replikace, zvyšuje terminátor transkripce stabilitu plasmidu prostřednictvím udržení počtu kopií (Balbas a Bolivar, Methods Enzymol. 185, 14 - 37, 1990).

Gen kódující resistenci

Gen kanamycinové resistence je odvozen z vektoru pET-9a (Studier a kol., Methods Enzymol. 185, 60 - 89,

1990). Původně se jedná o kan gen Tn903 z vektoru pUC4KISS (Barany, Gene 37, 111 - 123, 1985). Ve zde popisovaném plasmidu je kan gen v opačné orientaci než geny pro IL-4 a mutein IL-4, takže nedochází ke zvýšení množství produktu ·· · 9 * < 9

9 9 9 • · · • ·

kan genu po indukci v důsledku pročtení terminátoru transkripce z T5 promotoru. Kanamycin byl vybrán jako selekční markér neboť je preferovaným antibiotikem pro GMP-účely. Navíc jsou vektory založené na rezistenci ke kanamycinu stabilnější než plasmidy s ampicilinovou (bia) rezistencí. Selekce na ampicilinu má tendenci ke ztrátám neboť tato látka je degradována sekretovaným enzymem: β-laktamasou. Způsob bakteriální rezistence ke kanamycinu závisí na aminoglykosidové fosfotranferase, která inaktivuje antibiotikum.

Regulace exprese

Kontrolovaná genová exprese je absolutně nezbytná pro nastavení stabilního plasmidového systému, obzvláště, je-li požadovaný protein zhoubný pro hostitelské buňky. Výhodný plasmid podle předmětného vynálezu využívá indukovatelný systém založený na lac systému sestávajícího z genu pro lac represor (lad) a dvou syntetických sekvencí lac operátoru předcházejících ve fúzi promotor bakteriofága T5 E. coli. Promotor lacll _a strukturní gen lad byl izolován z vektoru pTrc99A (Ammán et al., Gene 69, 301 - 315, 1988). 1^ představuje promotorovou mutaci vedoucí k nadprodukci lad represoru. Lac represor standardního typu je tetramerní molekula sestávající ze čtyř identických podjednotek o 360 aminokyselinách, každá. Tetramer lac represoru je dimerem dvou funkčních dimerů. Čtyři podjednotky jsou drženy pohromadě svazkem čtyř helixů tvořených zbytky 340-360. Při izolaci lad genu z vektoru pTrc99A pomocí štěpu Narl byly zbytky za aminokyselinou 329 odstraněny a 10 aminokyselin které nejsou normálně kódovány lad genem bylo přidáno. Je známo, že mutace nebo delece probíhající v C-terminální části lad, aminokyselinou 329, poskytují funkční dimery

• · · » • · · · · ·

9 9 *

99

9 « 9 • 9 9 9

9 9 9

9 9.

9 9 9 které se jeví jako fenotypově podobné standardnímu represoru (Páce a kol., TIS 22, 334 - 339, 1997).

Počátek replikace (ori)

Počátek replikace (ori) zde popisovaného plasmidu je odvozen z vektoru pET-9a, jehož ori pochází z pBR322.

Výhodná plasmid podle předmětného vynálezu proto nese pMBl (ColEI) replikon. Plasmidy s tímto replikonem jsou mnohakopiové plasmidy, které se replikují relaxovaným způsobem. Minimálně 15 - 20 kopií plasmidu je udržováno v každé bakteriální buňce za normálních růstových podmínek. Běžný počet zde popisovaného plasmidu je v tomto rozmezí. Replikace počátku replikace ColEI-typu je iniciována 555-nukleotidovým transkriptem RNA, RNAII, který tvoří stabilní hybrid se svým DNA templátem poblíž ori. Hybrid RNAII-DNA je poté štěpen RNasou H v ori za vzniku volného 3ΌΗ, který slouží jako primer pro DNA polymerasu I. Tato iniciace syntézy DNA je negativně regulována RNA I, což je 108-nukleotidová molekula RNA komplementární k 5’ konci RNA

II. Interakce antisense RNA I s RNA II způsobuje konformační změnu RNA II, která ínhibuje vazbu RNA II k DNA templátu a následně zabraňuje iniciaci syntézy plasmidové DNA. Vazba mezi RNA I a II je zvýšena malým proteinem o velikosti 63 aminokyselin (Rop proteinem, Represor of jjrimer), který je kódován genem umístěným 400 nukleotidů po směru transkripce od počátku replikace (Sambrook a kol., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor, 1989) . Delece rop genu vede ke zvýšení počtu kopií a prostřednictvím zvýšení množství genu ke zvýšení hladiny exprese heterologních genů kódovaných plasmidem. Toto zjištění bylo rovněž učiněno v případě zkoušených expresních vektorů pro IL-4. Ale ukázalo se, že rop^--plasmidy jsou nestabilní a při fermentaci za

MM neselektivních podmínek dochází k jejich ztrátě. Proto obsahuje replikon zde popisovaného plasmidu rep gen pro zajištění vysoké stability plasmidu. V popisu předmětného vynálezu popisovaný plasmid postrádá mob gen, který je nutný pro mobilizaci a proto není schopen řídit svůj vlastní konjugační přenos z jedné bakterie do jiné.

Ve výhodném provedení podle předmětného vynálezu j sou z plasmidu odstraněny všechny prvky, které nej sou nezbytné pro jeho replikaci, resistenci a regulaci exprese.

V souladu s rozsahem tohoto vynálezu, pro konstrukci expresního plasmidu podle předmětného vynálezu nemusí být použity všechny výše uvedené znaky. Například gen pro přirozený interleukin-4 nebo mutein interleukinu-4 může být použit místo syntetického genu pro optimalizované využití kodonů v E. coli. Transkripční terminátor je ve výhodném provedení Tp , ale rovněž je možno použít i další terminátory jako rrnB T2 nebo aspA. Podobně je možné použít pro konstrukci výhodného plasmidu podle předmětného vynálezu prvky z jiných než zde popsaných, komerčně dostupných vektorů.

Metody použité během vývoje expresního systému jsou uvedeny níže.

Materiály a metody

Enzymy

Restrikční endonukleasy, alkalická fosfatasa z telecího střeva, T4 polynukleotid kinasa a T4 DNA ligasa byly získány od firmy Boehringer Mannheim a GIBCO-BRL a byly « · · · · · • · použity dle doporučení dodavatele.

Metody práce s rekombinantní DNA

Standardní konovací postupy byly popsány v Sambrook a kol., (Molecular Cloning, Cold Spring Harbor, 1989). Transformace byly provedeny dle M. Scott (Seed and Aruffo, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 84, 3365 - 3369, 1987). Kmeny E. coli DH5a (GIBCO BRL) a V3110 (ATCC 27325) byly použity primárně jako hostitelské buňky. Genotyp V3110 je K12, F’, [N(rrnD-rrnE)]lambda”.

Pro izolace ve velkém měřítku byly použity špičky Qiagen-tips (Qiagen). Extrakce fragmentů DNA z agarosových gelů byla provedena za použití Jetsorb (Genomed) dle doporučení dodavatele.

Oligonukleotidy pro řízenou mutagenezi, PCR reakce a sekvenování pocházely od MVG Biotech, Pharmacia Biotech nebo GIBCO BRL.

Experimenty zaměřené na mutagenezi byla použita metoda Denga a Nickoloffa (Deng and Nickoloff, Anal. Biochem. 200, 81 - 88, 1992) používající systém Mutageneze s eliminací unikátního místa’’ od Pharmacia Biotech. Primer používaný pro znovuvytvoření T7gl0 rbs má následující sekvenci:

’ TCAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACATCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTA AGAA3’ (Sekv. 1)

Všechny konstrukty a sekvence DNA byly potvrzeny použitím sekvenování terminační metodou s AmpliTaq DNA polymerasy, FS na ABI 373A sekvenátoru (Applied Biosystems).

9994 • » φ « ft · * · · • · < · 4

9 4 9

44

Vynález je detailněji vysvětlen následujícími příklady, obrázky a informacemi o sekvencích.

Přehled obrázků na výkresech

OBR.1 až OBR. 4:

Konstrukce zde popisovaného expresního plasmidu. (Zkratky: IL-4 TM, trojitý mutein IL-4; IL-4 DM, dvojitý mutein IL-4).

OBR.5:

Plasmidová stabilita expresních vektorů muteinu IL-4 pR021.1.0 a pRO.2.1.O. Vektor pR02.1.0 zůstává zcela stabilní přes 78 generací bez selekce antibiotiky. Na rozdíl od tohoto je expresní vektor pR021.1.0, který je založen na komerčně dostupném plasmidu pET-30a (Novagen), ztracen velmi rychle. Pouze 16 % kolonií obsahuje plasmid po 78 generacích bez kanamycinové selekce.

OBR.6:

Udržení schopnosti indukce a exprese zde popisovaného expresního vektoru IL-4 a muteinu IL-4.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Test stability plasmidu • · • ·· · • «

4

9 4

4 • · ·

9

Tesly stability plasmidu byly vždy startovány kulturou zmraženou v tekutém dusíku. Po roztátí kultury byla stanovena Οϋ^θθ a kultura byla zředěna na 10“^ PBS pufrem a poté byla rozetřena na misky s LB mediem ztuženým agarem bez antibiotika.

Při provádění tohoto testu byl 1 mililitr roztáté kultury inokulován do 100 mililitrů peptonového media (30 gramů sojového peptonu, 20 rámů kvasničného extraktu, gramů KH₂PO₄, 20 rámů glycerolu, 1 miligram MgS0₄ x 7 H₂0 na litr, pH 7,0) a inkubován při 37 °C za třepání 280 rpm po dobu 24 hodin.

Byla stanovena Οϋ^θθ narostlé kultury, kultura byla zředěna až do koncentrace 10 v PBS pufru a poté byla rozetřena na misky s LB mediem ztuženým agarem bez antibiotika aby byly získány dobře oddělené kolonie.

100 μΐ narostlé kultury bylo inokulováno do 100 mililitrů peptonového media a inkubováno při 37 °C za třepání 280 rpm po dobu 24 hodin. Tento postup byl opakován osmkrát.

100 dobře oddělených kolonií z LB misek bylo očkováno na LB misky s kanamycinem (25 pg/ml) a LB misky bez kanamycinu a inkubováno při 37 °C po dobu přes noc. Procentuální zastoupení resistentních kolonií bylo určováno každý den.

Počty generací za den byly vypočteny podle následujícího vzorce: log [OD_{6Q0 END}/ ^OD600 BEG^/^1o§ ²· • ·· · φ

9999

Pro expresní studie byl 1 mililitr narostlé kultury zředěn 100-krát LB mediem a bylo s ním nakládáno dle popisu (viz příklad 2).

Příklad 2

Exprese

Pro expresi interleukinu-4 a muteinu interleukinu-4 v malém měřítku byly buňky kultivovány v LB mediu (10 gramů Bacto tryptonu, 5 gramů kvasničného extraktu, 10 gramů NaCl na litr, pH 7,5) dokud OD^qq nedosáhla 0,8 - 1,0. Exprese byla indukována přídavkem IPTG do finální koncentrace 0,5 mM a inkubace pokračovala po dobu 5 hodin. Buňky byly z media získány centrifugací.

Pro SDS-PAGE analýzu byly buněčné pelety resuspendovány ve vzorkovém pufru pro SDS-PAGE do koncentrace 1 jednotka Οϋ^θθ/ΙΟΟ μΐ.

4444 · 4 4 • · 4 · 4 ·

4 4 4 4 « · 4 · · « 4

4 4 4 4 4 4

44 4· 44

SEKVENCE <110> BayerAG <120> PLASMIDY, JEJICH KONSTRUKCE A JEJICH UŽITÍ PŘI VÝROBĚ INTERLEUKINU-4 A MUTEINŮ LNTERLEUKINU-4 <130> Plasmidy pro muteiny IL-4 <160> 2 <170> Patent In Ver. 2.0 <210> 1 <211> 60 <212> DNA <213> neznámý <220>

<223> Popis neznámého organismu: primer tcaattgtga gcggataaca atttcacaca tctagaaata atttgttta actttaagaa 60 <210> 2 <211> 4202 <212> DNA <213> Neznámý <220>

<223>Popis neznámého organismu: Člověk <400> 2 ttagaaaaac tcatcgagca tcaaatgaaa ctgcaattta ttcatatcag gattatcaat 60 accatatttt tgaaaaagcc gtttctgtaa tgaaggagaa aactcaccga ggcagttcca 120 taggatggca agatcctggt atcggtctgc gattccgact cgtccaacat caatacaacc 180 tattaatttc ccctcgtcaa aaataaggtt atcaagtgag aaatcaccat gagtgacgac 240 tgaatccggt gagaatggca aaagcttatg catttctttc cagacttgtt caacaggcca 300 gccattacgc tcgtcatcaa aatcactcgc atcaaccaaa ccgttattca ttcgtgattg 360 cgcctgagcg agacgaaata cgcgatcgct gttaaaagga caattacaaa caggaatcga 420 atgcaaccgg cgcaggaaca ctgccagcgc atcaacaata ttttcacctg aatcaggata 480 ttcttctaat acctggaatg ctgttttccc ggggatcgca gtggtgagta accatgcatc 540 atcaggagta cggataaaat gcttgatggt cggaagaggc ataaattccg tcagccagtt 600 tagtctgacc atctcatctg taacatcatt ggcaacgcta cctttgccat gtttcagaaa 660 caactctggc gcatcgggct tcccatacaa tcgatagatt gtcgcacctg attgcccgac 720 attatcgcga gcccatttat acccatataa atcagcatcc atgttggaat ttaatcgcgg 780 cctcgagcaa gacgtttccc gttgaatatg gctcataaca ccccttgtat tactgtttat 840 gtaagcagac agttttattg ttcatgacca aaatccctta acgtgagttt tcgttccact 900 gagcgtcaga ccccgtagaa aagatcaaag gatcttcttg agatcctttt tttctgcgcg 960 taatctgctg cttgcaaaca aaaaaaccac cgctaccagc ggtggtttgt ttgccggatc 1020 aagagctacc aactcttttt ccgaaggtaa ctggcttcag cagagcgcag ataccaaata 1080 ctgtccttct agtgtagccg tagttaggcc accacttcaa gaactctgta gcaccgccta 1140 catacctcgc tctgctaatc ctgttaccag tggctgctgc cagtggcgat aagtcgtgtc 1200 ttaccgggtt ggactcaaga cgatagttac cggataaggc gcagcggtcg ggctgaacgg 1260 ggggttcgtg cacacagccc agcttggagc gaacgaccta caccgaactg agatacctac 1320 agcgtgagct atgagaaagc gccacgcttc ccgaagggag aaaggcggac aggtatccgg 1380 taagcggcag ggtcggaaca ggagagcgca cgagggagct tccaggggga aacgcctggt 1440 ·· ··*· »· ···· *· ·· • · * · · · · · » « •j ♦ · · · · ♦ · · · •l· * · ··· ···*·· • · · · · · 9 · · · · ·· · ·· 99 9· ·· atctttatag tcctgtcggg tttcgccacc cgtcaggggg gcggagccta tggaaaaacg ccttttgctg gccttttgct cacatgttct accgtattac cgcctttgag tgagctgata gcgagtcagt gagcgaggaa gcggaagagc tgtgcggtat ttcacaccgc aatggtgcac gttaagccag tatacactcc gctatcgcta ccgccaacac ccgctgacgc gccctgacgg caagctgtga ccgtctccgg gagctgcatg cgcgcgaggc agctgcggta aagctcatca gcctgttcat ccgcgtccag ctcgttgagt ataaagcggg ccatgttaag ggcggttttt gggggatttc tgttcatggg ggtaatgata cgggttactg atgatgaaca tgcccggtta gtatggatgc ggcgggacca gagaaaaatc cgaagtggcg agcccgatct tccccatcgg cacctgtggc gccggtgatg ccggccacga tacgttgaca ccatcgaatg gtgcaaaacc gagagtcaat tcagggtggt gaatgtgaaa gccggtgtct cttatcagac cgtttcccgc aaaacgcggg aaaaagtgga agcggcgatg gcacaacaac tggcgggcaa acagtcgttg ctgcacgcgc cgtcgcaaat tgtcgcggcg agcgtggtgg tgtcgatggt agaacgaagc aatcttctcg cgcaacgcgt cagtgggctg gccattgctg tggaagctgc ctgcactaat cagacaccca tcaacagtat tattttctcc catctggtcg cattgggtca ccagcaaatc tcggcgcgtc tgcgtctggc tggctggcat atagcggaac gggaaggcga ctggagtgcc ctgaatgagg gcatcgttcc cactgcgatg gcaatgcgcg ccattaccga gtccgggctg tacgacgata ccgaagacag ctcatgttat tttcgcctgc tggggcaaac cagcgtggac gtgaagggca atcagctgtt gcccgtctca gaaatcataa aaaatttatt tgctttgtga gagcggataa caatttcaca catctagaaa acatatgcac aaatgcgata tcaccctgca cgaacagaaa accctgtgca ccgaactgac caccaccgaa aaagaaacct tctgccgtgc ccacgaaaaa gacacccgtt gcctgggtgc gctgatccgt ttcctgaaac gtctggaccg ctgcccggtt aaagaagcta accagtctac catcatggac gaaaaagact ctaaatgctc cccgaaagga agctgagttg gctgctgcca gggcctctaa acgggtcttg aggggttttt tc tctgacttga gcgtcgattt ttgtgatgct ccagcaacgc ggccttttta cggttcctgg ttcctgcgtt atcccctgat tctgtggata ccgctcgccg cagccgaacg accgagcgca gcctgatgcg gtattttctc cttacgcatc tctcagtaca atctgctctg atgccgcata cgtgactggg tcatggctgc gccccgacac gcttgtctgc tcccggcatc cgcttacaga tgtcagaggt tttcaccgtc atcaccgaaa gcgtggtcgt gaagcgattc acagafcgtct ttctccagaa gcgttaatgt ctggcttctg tcctgtttgg tcactgatgc ctccgtgtaa ccgatgaaac gagagaggat gctcacgata ctggaacgtt gtgagggtaa acaactggcg actcagggtc aatgccagcg ctcatgagcc tgatgtcggc gatataggcg ccagcaaccg tgcgtccggc gtagaggatc gagatccatt tttcgcggta tggcatgata gcgcccggaa ccagtaacgt tatacgatgt cgcagagtat gtggtgaacc aggccagcca cgtttctgcg gcggagctga attacattcc caaccgcgtg ctgattggcg ttgccacctc cagtctggcc attaaatctc gcgccgatca actgggtgcc· ggcgtcgaag cctgtaaagc ggcggtgcac atcattaact atccgctgga tgaccaggat gttccggcgt tatttcttga tgtctctgac catgaagacg gtacgcgact gggcgtggag gcgctgttag cgggcccatt aagttctgtc aaatatctca ctcgcaatca aattcagccg atgtccggtt ttcaacaaac catgcaaatg ctggttgcca acgatcagat ggcgctgggc cgcgttggtg cggatatctc ggtagtggga atcccgccgt taaccaccat caaacaggat cgcttgctgc aactctctca gggccaggcg ctggtgaaaa gaaaaaccac cctggctcga gcggataaca attataatag attcaattgt taattttatt taactttaag aaggagatat ggaaatcatc aaaaccctga attctctgac cgttaccgac atcttcgctg cttcgaaaaa tgctaccgtt ctgcgtcagt tctactctca taccgctcag cagttccacc gtcacaaaca taacctgtgg agtctggctg gtctgaacag cctggaaaac ttcctgaaac gtctgaaaac ttcttaataa agatccggct gctaacaaag ccgctgagca ataactagca taaccccttg tgctgaaagg aggaactata tccggataat

1500

1560

1620

1680

1740

1800

1860

1920

1980

2040

2100

2160

2220

2280

2340

2400

2460

2520

2580

2640

2700

2760

2820

2880

2940

3000

3060

3120

3180

3240

3300

3360

3420

3480

3540

3600

3660

3720

3780

3840

3900

3960

4020

4080

4140

4200

4202

• · • ·

• · * ·

Ww-í/γ

Claims (4)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Operon pro výrobu IL-4 a muteinů IL-4 ve kmeni Escherichia coli, sestávající se z operativně spojených elementů ve směru 5’ ke 3’: regulovatelný promotor sestávající se z promotoru fága T5 E. coli a dvou lac operátorových sekvencí, vazebného místa pro ribosom z bakteriofága T7gl0 E. coli, iniciačního translačního kodonu, strukturního genu pro IL-4 a mutein IL-4 a transkripčního terminátoru za strukturním genem.
2. 2. E. coli /pR02.1.0
3. 3. Escherichia coli transformovaná jedním nebo více plasmidy nároků 1 nebo 2.
4. 4. Použití plasmidů dle nároků 1 nebo 2 v metodě přípravy IL-4 a muteinů IL-4