CZ294279B6 - Vektor pro výrobu IL-4 a muteinů IL-4 ve kmeni Escherichia coli, vektor obsahující DNA sekvenci, Escherichia coli transformovaná jedním nebo více vektory a použití vektoru - Google Patents

Abstract

Vektor pro výrobu IL-4 a muteinů IL-4 ve kmeni Escherichia coli, sestávající z operativně spojených elementů ve směru 5' ke 3': regulovatelného promotoru sestávajícího z promotoru fága T5 E. coli a dvou lac operátorových sekvencí, vazebného místa pro ribosom z bakteriofága T7g10 E. coli, iniciačního translačního kodonu, strukturního genu pro IL-4 nebo mutein IL-4 a transkripčního terminátoru za strukturním genem. Do rozsahu řešení náleží rovněž Escherichia coli transformovaná jedním nebo více těchto vektorů a použití tohoto vektoru v metodě přípravy IL-4 a muteinů IL-4.ŕ

Description

Vektor pro výrobu IL-4 a muteinů IL-4 ve kmeni Escherichia coli, vektor obsahující DNA sekvenci, Escherichia coli transformovaná jedním nebo více vektory a použití vektoru

Oblast vynálezu

Vynález se týká vektoru pro výrobu IL-4 a muteinů IL-4 ve kmeni Escherichia coli, vektoru obsahujícího DNA sekvenci znázorněnou jako Seq. ID. NO. 2 viz dále, Escherichia coli transformovaného jedním nebo více těmito vektory a použití tohoto vektoru v metodě přípravy IL-4 a muteinů IL-4. Konkrétně se vynález týká konstrukce a použití expresních plazmidů ve výrobě rekombinantního interleukinu-4 (IL-4) a muteinů IL-4.

Dosavadní stav techniky

Zralý lidský interleukin-4 (EL-4) je složen ze 129 aminokyselin a je z 50 % homologní s myším IL-4. IL-4 je jediný známý cytokin, který řídí diferenciaci pomocných T buněk na fenotyp Th2 (Mosmann and Sad. Immimol. Today 17, 138-146, 1996). IL-4 předává signál lymfocytům a dalším buňkám přes heterodimerický aggkomplex dvou receptorů cytokinu. IL-4Rct a běžný γřetězec (yc). V publikacích podle dosavadního stavu techniky byly popsány antagonistické mutanty IL-4 (Kruše a kol., EMBO J. 11, 3237 - 3244, 1992). Tři aminokyseliny blízko C-konce (R121, Y124 a S125) jsou důležité pro vazbu kyc-řetězci. Zavedení Asp (D) do těchto pozic blokuje dimerizaci receptorů a přenos signálů přes membránu.

Dvojitý mutein interleukinu-4 (IL-4 DM) je varianta IL-4 s dvěma změnami aminokyselin v pozicích 121 a 124 nazvaná IL-4 121RD Y124D. IL-4 DM je schopen blokovat obě aktivity IL· 4 a IL-13. Na rozdíl od všech bodových mutantů žádné zbytkové agonistické aktivity nebyly pro tento mutein nikdy nalezeny. Má se za to, že tyto antagonistické vlastnosti IL-4 DM jsou užitečná pro léčbu onemocnění, která zahrnují vývoj TH2 a/nebo produkci IgE (Ryan. J. Allergy Clin. Immunol. 99, 1-5, 1997).

Jak bylo popsáno v různých publikacích, k produkci rekombinantního IL-4 a muteinů IL-4 mohou být využity prokaryotické organismy. Bohužel, popisované systémy mají řadu nedostatků (nízká hladina exprese, nízká stabilita expresního vektoru), které znemožňují produkci IL-4 a muteinů ve velkém měřítku nebo jsou ekonomicky nerealizovatelné.

Hlavní kritéria pro účinný a bezpečný expresní systém jsou:

- vysoký výtěžek produktu;

- regulovatelná stabilní exprese;

- stabilita expresního vektoru.

Pro tato výše uvedená kriteria jsou důležité některé znaky expesního plazmidu (viz Hannig a kol., TIBTECH. 16, 54-60, 1998). Jsou to:

- promotor;

- ribosomální vazebné místo (rbs);

- využití kodonu příslušného genu;

- transkripční terminátor;

- gen pro rezistenci;

-1 CZ 294279 B6

- regulace exprese;

- počátek replikace (ori).

Podstata vynálezu

Podstatou vynálezu je vektor pro výrobu IL-4 a muteinů IL4 ve kmeni Escherichia coli, sestávající z operativně spojených elementů ve směru 5' ke 3': regulovatelného promotoru sestávajícího z promotoru fága T5 Escherichia coli a dvou lac operátorových sekvencí, vazebného místa ío pro ribosom z bakteriofága T7gl0 Escherichia coli, iniciačního translačního kodonu, strukturního genu pro IL-4 nebo mutein IL-4 a transkripčního terminátoru za strukturním genem.

Do rozsahu tohoto řešení podle vynálezu rovněž náleží vektor obsahující DNA sekvenci znázorněnou jako Seq. ID. NO. 2, viz dále.

Do rozsahu řešení podle vynálezu rovněž náleží Escherichia coli transformovaná jedním nebo více výše uvedenými vektory podle vynálezu.

Do rozsahu řešení podle vynálezu rovněž náleží použití tohoto vektoru podle vynálezu v metodě 20 přípravy IL-4 a muteinů IL-4.

Podle vynálezu byly vytvořeny expresní plazmidy pro IL-4 a muteiny EL-4 s modifikacemi ve všech příslušných elementech pro účinný a bezpečný expresní systém. Kvalita a vhodnost příslušného expresního systému byla klasifikována zejména podle následujících kritérií:

- výtěžek ID4 a muteinů IL-4;

- stabilita plazmidu; a

- udržení indukční schopnosti.

Cílem předmětného vynálezu bylo proto vytvoření metody pro konstrukci na použití expresního plazmidu pro výrobu rekombinantního interleukinu-4 (IL-4) a muteinů interleukinu-4 ve velkém měřítku. Navíc by měl nově vytvořený systém hostitele/vektoru být vhodný pro expresi dalších proteinů (cytokinů, růstových faktorů, rozpustných receptorů, protilátek atd.). Podle předmětného vynálezu bylo překvapivě zjištěno, že bakterie transformované plazmidem podle tohoto vyná35 lezu poskytují mnohonásobně větší rychlosti exprese a stabilitu plazmidu a exprese než bylo pozorováno po transformaci stejného hostitele jinými známými plazmidy z dosavadního stavu techniky. Proto je použití plazmidů podle tohoto vynálezu mnohem výhodnější pro produkci rekombinantního interleukinu-4 a muteinů interleukinu-4 ve srovnání se všemi dříve známými plazmidy.

Nově vyvinutý vektorový systém obsahuje následující prvky:

T5 promotor

Promotor bakteriofága T5 E. coli společně se dvěma lac operátorovými sekvencemi je odvozen z plazmidu poE30 (Oiagen), náležícího do skupiny plazmidů pDS (Bujará a kol., Methods Enzymol. 155, 416-433, 1987 aStúber a kol., Immunological Methods, I. Lefkowits and B. Pernis, eds., Academie Press, lne. Vol. IV, 121-152, 1990).

T7 gl0 ribosomální vazebné místo

Vazebné místo ribosomu (rbs) je odvozeno z oblasti před genem 10 bakteriofága T7 (T7gl0 vedoucí sekvence). Gen 10 fága T7 kóduje plášoový protein, který je hlavním proteinem

-2CZ 294279 B6 exprimovaným po infekci fágem T7. T7 glO rbs byl získán z vektoru pET-9a (Studier a kol., Methods Enzymol. 185, 60-89, 1990). T7 glO vedoucí sekvence zahrnuje oblast okolo 100 bp (Olins et al., Gene 227-235, 1988). Ve finálním expresním konstruktu je oblast před Xbal místem odstraněna. T7 glO vedoucí sekvence nyní tedy zahrnuje 42 bp a obsahuje záměnu jedné báze z G na A v pozici 3638 v tomto zde popisovaném plazmidu.

Využití kodonů přirozené sekvence IL-4

Jakožto účinné měřítko využití synonymních kodonů přirozené sekvence může být index adaptace kodonu (codon adaptation index (CAI) použit pro předpovězení hladiny exprese daného genu (Sharp a kol., Nucleic Acids Res. 15, 1281-1295, 1987 and Apeler a kol., Eur. J. Biochem. 247, 890-895, 1997). CAI je počítán jako geometrický střed hodnot relativního využití kodonů (RSCU) odpovídajících každému z kodonů použitých v genu, děleno maximálním možným CAI pro gen pro stejné aminokyselinové složení. RSCU hodnoty jsou pro každý kodon počítány zvelmi vysoce exprimovaných genů určitého organismu, např. E. coli, a reprezentují pozorovanou frekvenci kodonu dělenou frekvencí očekávanou za předpokladu stejného využití synonymních kodonů pro aminokyselinu. Vysoce exprimované geny, například geny kódující ribosomální proteiny, obecně mají vysoké hodnoty CAI > 0, 46. Slabě exprimované geny jako lad a trpR v E. coli mají nízké hodnoty CAI < 0,3.

Vypočítaná hodnota CAI v E. coli je pro přirozenou sekvenci IL-4 0, 733. To znamená, že přirozený gen by měl být vhodný pro vysokou hladinu exprese v E. coli. Nicméně má syntetický gen s optimálním využitím E. coli kodonů (hodnota CAI = 1) potenciál k dalšímu zvýšení hladiny exprese. Proto byly navrženy a klonovány syntetické geny pro IL-4 a muteiny IL-4.

Transkripční terminátor

Fragment z T7 DNA obsahující transkripční terminátor Τφ je odvozen z vektoru c (Studier &Eol., MethodsEnzym&l. 185, 60-89, 1990). Transkripční terminátory urč^mrsta, kde~konrptex mRNA-RNA polymerasa-DNA disociuje a tím končí transkripce. Přítomnost transkripčního terminátoru na konci vysoce exprimovaného genu má několik výhod: minimalizují nedostupnost RNA polymerasy, která by byla zahrnuta v nadbytečné transkripci, omezují délku mRNA na minimální potřebnou délku a tím omezuje výdej energie. Vzhledem k tomu, že silná transkripce by mohla interferovat s počátkem replikace, zvyšuje terminátor transkripce stabilitu plazmidu prostřednictvím udržení počtu kopií (Balbas a Bolivar. Methods Enzymol. 185, 14-37, 1990).

Gen kódující rezistenci

Gen kanamycinové rezistence je odvozen z vektoru pET-9a (Studier a kol., Methods Enzymol. 185, 60-89, 1990). Původně se jedná okan gen Tn903 z vektoru pUC4KISS (Barony, Gene 37, 111-123, 1985). Ve zde popisovaném plazmidu je kan gen v opačné orientaci než geny pro IL-4 a mutein IL-4, takže nedochází ke zvýšení množství produktu kan genu po indukci v důsledku pročtení terminátoru transkripce z T5 promotoru. Kanamycin byl vybrán jako selekční markér nebo je preferovaným antibiotikem pro GMP-ůčely. Navíc jsou vektory založené na rezistenci ke kanamycinu stabilnější než plazmidy s ampicilinovou (bia) rezistencí. Selekce na ampicilinu má tendenci ke ztrátám neboť tato látka je degradována sekretovaným enzymem: β-laktamasou. Způsob bakteriální rezistence ke kanamycinu závisí na aminoglykosidové fosfotranferase, která inaktivuje antibiotikum.

Regulace exprese

Kontrolovaná genová exprese je absolutně nezbytná pro nastavení stabilního plazmidového systému, obzvláště, je-li požadovaný protein zhoubný pro hostitelské buňky. Výhodný plazmid

-3 CZ 294279 B6 podle předmětného vynálezu využívá indukovatelný systém založený na lac systému sestávajícího z genu pro lac represor (lácí) a dvou syntetických sekvencí lac operátoru předcházejících ve fúzi promotor bakteriofága T5 E. coli. Promotor lácí¹ a strukturní gen lácí byl izolován z vektoru pTrc99A (Ammán et al., Gene 69,301-315,1988). I^q představuje promotorovou mutaci vedoucí k nadprodukci lácí represoru. Lac represor standardního typu je tetramemí molekula sestávající ze čtyř identických podjednotek, každá o 360 aminokyselinách. Tetramer lac represoru je dimerem dvou funkčních dimerů. Čtyři podjednotky jsou drženy pohromadě svazkem čtyř helixů tvořených zbytky 340-360. Vzhledem k izolaci lácí genu z vektoru pTrc99A pomocí štěpu Narl byly zbytky za aminokyselinou 331 odstraněny a bylo přidáno 10 aminokyselin které nejsou normálně kódovány lácí genem. Je známo, že mutace nebo delece probíhající v C-terminální části lacl, za aminokyselinou 329, poskytují funkční dimery které se jeví jako fenotypově podobné standardnímu represoru (Páce a kol., TIS 22, 334-339, 1997).

Počátek replikace (ori)

Počátek replikace (ori) zde popisovaného výhodného plazmidu je odvozen z vektoru pET-9a, jehož ori pochází z pBR322. Výhodný plazmid podle předmětného vynálezu proto nese pMBI (COIEI) replikon. Plazmidy s tímto replikonem jsou mnohakopiové plazmidy, které se replikují relaxovaným způsobem. Za normálních růstových podmínek je v každé bakteriální buňce udržováno minimálně 15 až 20 kopií plazmidu. Běžný počet pro výhodný plazmid, popisovaný v tomto textu, je v tomto rozmezí. Replikace ori COIEI-typu je iniciována 555-nukleotidovým transkriptem RNA, RNAII, který tvoří stabilní hybrid se svým DNA templátem poblíž ori. Hybrid RNAII-DNA je poté štěpen RNasou H v ori za vzniku volného 3ΌΗ, který slouží jako primer pro DNA polymerasu I. Tato iniciace syntézy DNA je negativně regulována RNA I, což je 108-nukleotidová molekula RNA komplementární k 5' konci RNA Π. Interakce antisense RNA 1 s RNA II způsobuje konformační změnu RNA II, která inhibuje vazbu RNA Π k DNA templátu a následně zabraňuje iniciaci syntézy plazmidové DNA. Vazba mezi RNA I a Π je zvýšena malým proteinem o velikosti 63 aminokyselin (Rop proteinem, Represor of primer), který je kódován genem umístěným 400 nukleotidů po směru transkripce od počátku replikace (SawúrooA a kol., Molecular Cloning, Čolci Spring Harbor, 1989). Delece rop genu vede ke zvýšení počtu kopií a prostřednictvím dávkovacího efektu genu ke zvýšení hladiny exprese heterologních genů kódovaných plazmidem. Toto zjištění bylo rovněž učiněno v případě zkoušených expresních vektorů pro IL-4. Ale ukázalo se, že rop-plazmidy jsou nestabilní a při fermentaci za neselektivních podmínek dochází k jejich ztrátě. Proto obsahuje replikon zde popisovaného plazmidu rop gen pro zajištění vysoké stability plazmidu. V popisu předmětného vynálezu popisovaný plazmid postrádá mob gen, který je nutný pro mobilizaci a proto není schopen řídit svůj vlastní konjugační přenos z jedné bakterie do jiné.

Ve výhodném provedení podle předmětného vynálezu jsou z plazmidu odstraněny všechny prvky, které nejsou nezbytné pro jeho replikaci, rezistenci a regulaci exprese.

V rozsahu předmětného vynálezu nemusí být pro konstrukci expresního plazmidu podle předmětného vynálezu použity všechny výše uvedené znaky. Například místo syntetického genu pro optimalizované využití kodonů v E. coli, může být použit gen pro přirozený interleukin-4 nebo mutein interleukinu-4. Transkripční terminátor je ve výhodném provedení Τφ, ale rovněž je možno použít i další terminátory jako rmB T2 nebo aspA. Podobně je možné použít pro konstrukci výhodného plazmidu podle předmětného vynálezu prvky z jiných než zde popsaných, komerčně dostupných vektorů.

Metody použité během vývoje expresního systému jsou uvedeny níže.

-4CZ 294279 B6

Materiály a metody

Enzymy

Restrikční endonukleasy, alkalická fosfatása z telecího střeva. T4 polynukleotid kinasa aT4 DNA ligása byly získány od firmy Boehringer Mannheim aGIBCO-BRL a byly použity dle doporučení dodavatele.

Metody práce s rekombinantní DNA

Standardní konovací postupy byly popsány v Sambrook a kol., (Molecular Cloning, Cold Spring Harbor, 1989). Transformace byly provedeny dle M. Scott (Seed and Aruffo, Proč. Nati. Acad. Sci. USa 84, 3365 - 3369, 1987). Kmeny E. coli DH5a (GIBCO BRL) a W3110 (ATCC 27325) byly použity primárně jako hostitelské buňky. Genotyp W3110 je K12, F, [N(rmD-rmE)]lambda.

Pro izolace ve velkém měřítku byly použity špičky Oiagen-tips (Oiagen). Extrakce fragmentů DNA z agarosových gelů byla provedena za použití Jetsorb (Genomed) dle doporučení dodavatele.

Oligonukleotidy pro řízenou mutagenezi, PCR reakce asekvenování pocházely od MWG Biotech, Pharmacia Biotech nebo GIBCO BRL.

Experimenty zaměřené na mutagenezi byla použita metoda Denga aNickoloffa (Deng and Nickoloff, Anal. Biochem. 200, 81 - 88, 1992) používající systém Mutageneze s eliminací unikátního místa od Pharmacia Biotech. Primer používaný pro znovuvytvoření T7gl0 rbs má následující sekvenci:

5'ICAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACATCTAGAAATAATTTTGTTTAAeTTTA AGAA3' (Sekv. 1)

Všechny konstrukty a sekvence DNA byly potvrzeny použitím sekvenování terminační metodou s AmpliTaq DNA polymerasy. FS na ABI3 73A sekvenátoru (Applied Biosystems).

Vynález je detailněji vysvětlen následujícími příklady, obrázky a informacemi o sekvencích.

Přehled obrázků na výkresech

OBR.1 až OBR. 4:

Konstrukce zde popisovaného expresního plazmidu. (Zkratky: DL-4 TM, trojitý mutem IL-4; IL-4 DM, dvojitý mutein IL-4).

OBR.5:

Plazmidová stabilita expresních vektorů muteinu IL-4 pR021.1.0 apRO2.1.O. Vektor pR02.1.0 zůstává zcela stabilní přes 78 generací bez selekce antibiotiky. Na rozdíl od tohoto je expresní vektor pRO21.1.O, kteiý je založen na komerčně dostupném plazmidu pET-30a (Novagen), ztracen velmi rychle. Pouze 16 % kolonií obsahuje plazmid po 78 generacích bez kanamycinové selekce.

-5CZ 294279 B6

0BR.6:

Udržení schopnosti indukce a exprese zde popisovaného expresního vektoru IL-4 a muteinu IL-4. 5

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Test stability plazmidu

Testy stability plazmidu byly vždy startovány kulturou zmraženou v tekutém dusíku. Po roztátí 15 kultury byla stanovena OD₆oo a kultura byla zředěna na 1 θ'⁴ PBS pufrem a poté byla rozetřena na misky s LB médiem ztuženým agarem bez antibiotika.

Při provádění tohoto testu byl 1 mililitr roztáté kultury inokulován do 100 mililitrů peptonového média (30 gramů sojového peptonu, 20 rámů kvasničného extraktu, 5 gramů KH₂PO₄, 20 rámů 20 glycerolu, 1 miligram MgSO₄ x 7 H₂O na litr, pH 7, 0) a inkubován při 37 °C za třepání 280 rpm po dobu 24 hodin.

Byla stanovena OD₆oo narostlé kultury, kultura byla zředěna až do koncentrace 10⁴ v PBS pufřu a poté byla rozetřena na misky s LB médiem ztuženým agarem bez antibiotika aby byly získány 25 dobře oddělené kolonie.

100 μΐ narostlé kultury bylo inokulováno do 100 mililitrů peptonového média a inkubováno při 37 °C za třepání 280 rpm po dobu 24 hodin. Tento postup byl opakován osmkrát.

100 dobře oddělených kolonií zLB misek bylo očkováno na LB misky skanamycinem (25 pg/ml) a LB misky bez kanamycinu a inkubováno při 37 °C po dobu přes noc. Procentuální zastoupení rezistentních kolonií bylo určováno každý den.

Počty generací za den byly vypočteny podle následujícího vzorce: log [OD₆₀o end/ OD₆₀₀ 35 BEG]/log2.

Pro expresní studie byl 1 mililitr narostlé kultury zředěn 100-krát LB médiem a bylo s ním nakládáno dle popisu (viz příklad 2).

Příklad 2

Exprese

Pro expresi interleukinu-4 a muteinu interleukinu-4 v malém měřítku byly buňky kultivovány v LB médiu (10 gramů Bacto tryptonu, 5 gramů kvasničného extraktu, 10 gramů NaCl na litr, pH 7,5) dokud OD₆oo nedosáhla 0,8 až 1,0. Exprese byla indukována přídavkem IPTG do finální koncentrace 0,5 mM a inkubace pokračovala po dobu 5 hodin. Buňky byly z média získány centrifugací.

Pro SDS-PAGE analýzu byly buněčné pelety resuspendovány ve vzorkovém pufru pro SDSPAGE do koncentrace 1 jednotka OD₆oo/100 μΐ.

-6CZ 294279 B6

SEKVENCE <110> Bayer AG <120> PLASM1DY, JEJICH KONSTRUKCE A JEJICH UŽITÍ PŘI VÝROBĚ INTERLEUKINU-4 A MUTEINÚINTERLEUKINU-4 < 130> Plasmidy pro muteinv IL-4 <160> 2 < 170> Patent In Ver. 2.0 <210=* 1 <211> 60 <212> DNA <213> neznámý <220>

<223> Popis neznámého organismu: primer <400> l tcaattgtga gcggataaca atttcacaca tctagaaáta átttgttta actttaagaa 60 <210> 2 <211> 4202 <212> DNA <213> Neznámý <220 <223>Popis neznámého organismu: Člověk <400 2 ttagaaaaac tcatcgagca tcaaatgaaa ctgcaaCtta ttcatatcag gartatcaat60 accatatttt tgaaaaagcc gtttctgtaa tgaaggagaa aactcaccga ggcagthcca120 taggatggca agatcctggt atcggtctgc gattccgact cgtccaacat caacacaacc180 tattaatttc ccctcgtcaa aaataaggtt atcaagtgag aaatcaccat gagtgacgac240 tgaatccggt gagaatggca aaagcttatg catttctttc cagacttgtt caacaggcca300 gccattacgc tcgtcatcaa aatcactcgc atcaaccaa.a ccgrtattca ttcgtgattg360 cgcctgagcg agacgaaata cgcgatcgct gttaaaagga caattacaaa caggaatcga420 atgcaaccgg cgcaggaaca ctgccagcgc atcaacaata ttttcacctg aatcaggata480 ttcttctaat acctggaatg ctgttttccc ggggatcgca gtggtgagta accatgcate540 atcaggagta cggataaaat gcttgatggt cggaagaggc ataaattccg tcagccagtt600 tagtctgacc atctcatctg taacatcatt gacaacgcta cctttgccat gtcccagaaa660 caactctggc gcaccgggct tcccatacaa tcgatagatt gtcgcacctg attgcccgac720 attatcgcga gcccatctat acccatataa atcagcatcc atgttggaat ttaatcgcgg780 cctcgagcaa gacgtttccc gttgaatatg gctcataaca ccccttgtat tactgtttat840 gtaagcagac agttttattg ttcatgacca aaatccctta acgtgagttt tcgttccact900 gagcgtcaga ccccgtagaa aagatcaaag gatcttcttg agatcctttt tttctgcgcg960 taatctgctg cttgcaaaca aaaaaaccac cgctaccagc ggtggtttgt ttgccggatc1020 aagagctacc aactcttttt ccgaaggtaa ccggcttcag cagagcgcag ataccaaata1080 ctgtccttct agtgtagccg taattaggcc accacttcaa gaactctgta gcaccgccta1140 catacctcgc tctgctaatc ccgttaccag tggctgctgc cagtggcgat aagtcgtgcc1200 ttaccgggtt ggactcaaga cgatagttac cggataaggc gcagcggtcg ggctgaacgg1260 gaggttcgtg cacacagccc agcttggagc gaaccaccca caccgaactg agatacctac1320 agcgtgagct atgagaaagc gccacgcttc ccgaagggag aaaggcggac aggtatccgg1380 taagcggcag ggtcggaaca ggagagcgca cgagggagct tccaggggga aacgcctggc1440 atctttatag tcctgtcggg tttcgccacc tctgacttga gcgtcgattt ttgtgatgct 1500 cgteaggggg gcggagccta tggaaaaacg ccagcaacgc ggcettttta cggttcctgg 1560 ccttttgctg gccttttgct cacatgttct ttcctgcgtt atcccctgat tctgtggata 1620 accgtattac cgcctttgag tgagctgata ccgctcgccg cagccgaacg accgagcgca 1680 gcgagtcagt gagcgaggaa gcggaagagc gcctgacgcg gtattttctc cttacgcatc 1740 tgtgcggtat ttcacaccgc aatggtgcac tctcagtaca atctgctctg atgccgcata 1800 gttaagccag tatacactcc gctatcgcta cgtgactggg tcatggctgc gccccgacac 1860 ccgccaacac ccgctgacgc gccctgacgg gcttgtctgc tcccggcatc cgcttacaga 1920 caagctgtga ccgtctccgg gagctgcatg tgtcagaggt tttcaccgtc atcaccgaaa 1980 cgcgcgaggc agctgcggtá aagctcatca gcgtggtcgt gaagcgattc acagatgtct 2040 gcctgttcat ccgcgtccag ctcgttgagt ttctccagaa gcgttaatgt ctggcttctg 2100 ataaagcggg ccatgttaag ggcggtfrttt tcctgtttgg tcactgatgc ctccgtgtaa 2160 gggggatttc tgttcatggg ggtaatgata ccgatgaaac gagagaggat gctcacgata 2220 cgggttactg atgatgaaca tgcccggtta ctggaacgtt gtgagggtaa acaactggcg 2280 gtatggatgc ggcgggacca gagaaaaatc actcagggtc aatgccagcg ctcatgagcc 2340 cgaagtggcg agcccgatct tccccatcgg tgatgtcggc gatataggcg ccagcaaccg 2400 cacctgtggc gccggtgatg ccggccacga tgcgtccggc gtagaggatc gagatccatt 2460 tacgttgaca ccatcgaatg gtgcaaaacc tttcgcggta tggcatgata gcgccčggaa 2520 gagagtcaat tcagggtggt gaatgtgaaa ccagtaacgt tatacgatgt cgcagagtat 2580 gccggtgtct cttatcagac cgtttcccgc gtggtgaacc aggccagcca cgtttctgcg 2640 aaaacgcggg aaaaagtgga agcggcgatg gcggagctga attacattcc caaccgcgtg 2700 gcacaacaac tggcgggcaa acagtcgttg ctgattggcg ttgccacctc -cagtctggcc 2760 ctgcacgcgc cgtcgcaaat tgtcgcggcg attaaatctc gcgccgatca actgggtgcc 2820 agcgtggtgg tgtcgatggt agaacgaagc ggcgtcgaag cctgtaaagc ggcggtgcac 2880 aatcttctcg cgcaacgcgt cagtgggccg atcattaact atccgctgga tgaccaggat 2940 gccattgctg tggaagctgc ctgcactaat cttccgacgt tatttcttga tgtctctgac 3000 cagacaccca tcaacagtat tattttctcc catgaagacg gtacgcgact gggcgtggag 3060 catctggtcg cattgggtca ccagcaaatc gcgctgttag cgggcccatt aagttctgtc 3120 tcggcgcgtc tgcgtctggc tggctggcat aaatatctca ctcgcaatca aattcagccg 3180 atagcggaac gggaaggcga ctggagtgcc atgzccggtt ttcaacaaac catgcaaatg 3240 ctgaatgagg gcatcgctcc cactgcgatg ctcgttgcca acgatcagat gacgctgggc 3300 gcaatgcgcg ccattaccga gtccggcctg cgcgttggtg cggatatctc ggtagtggga 3360 tacgacgata ccgaagacag ctcatgttat aCcacgccgt taaccaccat caaacaggat 3420 tttcgcctgc tggggcaaac cagcgtggac cgcttgctgc aactctctca gggccaggcg 3480 gtgaagggca atcagctgtt gcccgtctca ctggrgaaaa gaaaaaccac cctggctcga 3540 gaaatcataa aaaatttatt tgctttgtga gcggataaca attataataq attcaattgt 3600 gagcggataa caatttcaca catctagaaa taattctatt taactttaag aaggaaatat 3660 acatatgcac aaatgcgata tcaccctgca ggaaatcatc aaaaccctga attctctcac 3720 cgaacagaaa accctgtgca ccgaactgac cgttaccgac atcttcgctc cttcgaaaaa 3780 caccaccgaa aaagaaacct tctgccgtgc tgcíaccgtt ctgcgtcagt tctactctca 3840 ccacgaaaaa gacacccgtt gcctgggtgc taccgctcag cagttccacc gtcacaaaca 3900 gctgatccgt ttcctgaaac gtctgaaccg taacctgtgg ggtctggctg grctgaacag 3960 ctgcccggtt aaagaagcca accagtctac cctggaaaac tecctggaac gtctgaaaac 4020 catcatggac gaaaaagact ctaaatgctc ttcttaataa ggatccggct cctaacaaaa 4080 cccgaaagca agctgagttg gctgctgcca ccgctgaaca ataactagca taaccccttg 4140 gggcctctaa acgggtcttg aggggttttt tgctgaaagg aggaactata tccggataat 4200 fn 4202

Claims (4)

1. Vektor pro výrobu IL-4 a muteinů IL-4 ve kmeni Escherichia coli, sestávající z operativně spojených elementů ve směru 5' ke 3': regulovatelného promotoru sestávajícího z promotoru fága T5 E. coli a dvou lac operátorových sekvencí, vazebného místa pro ribosom z bakteriofága T7gl0 E. coli, iniciačního translačního kodonu, strukturního genu pro IL-4 nebo mutein IL-4 a transkripčního terminátoru za strukturním genem.

2. Vektor obsahující DNA sekvenci znázorněnou jako Seq. ID. NO. 2.

3. Escherichia coli transformovaná jedním nebo více vektory podle nároku 1 nebo 2.

4. Použití vektoru podle nároku 1 nebo 2 v metodě přípravy ILr4 a muteinů IV4.