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Plasmidos, su construccion y su uso en la preparacion de interleuquina-4 y de muteinas de interleuquina-4.
ES2269027T3
Spain
- Other languages
English - Inventor
Heiner Dr. Apeler Hermann Dr. Wehlmann - Current Assignee
- Bayer AG
Description
translated from
Plásmidos, su constitución y uso en la
preparación de interleuquina-4 y de muteínas de
interleuquina-4.
La presente invención se refiere a la
construcción y uso de plásmidos de expresión en la elaboración de
interleuquina-4 recombinante (IL-4)
y muteínas de interleuquina-4.
La interleuquina-4 humana
(IL-4) está compuesta de 129 aminoácidos con un 50%
de homología con la IL-4 del ratón.
IL-4 es la única citoquina conocida para dirigir la
diferenciación de células T ayudantes a un fenotipo T_{H2}
(Mosmann y Sad, Immunol. Today 17, 138-146,
1996). Las señales de IL-4 sobre linfocitos y otras
células a través de un complejo heterodimérico de dos receptores de
citoquina, el IL-4R\alpha y la cadena \gamma
común (\gammac). Se han descrito mutantes antagonistas
IL-4 (Kruse y col., EMBO J. 11,
3237-3244, 1992). Tres aminoácidos cerca del
extremo C-terminal (R121, Y124 y S125) son
importantes para unión a la cadena \gammac. La introducción de
Asp (D) en estas posiciones bloquea la dimerización del receptor y
la señalización transmembrana.
La doble muteína de
interleuquina-4 (IL-4 DM) es una
variante de IL-4 con 2 cambios de aminoácidos en
posiciones 121 y 124 llamados IL-4 R121D Y124D.
IL-4 DM es capaz de bloquear tanto las actividades
de IL-4 como las de IL-3. En
contraste con todos los mutantes de sitio único no se ha encontrado
nunca ninguna actividad agonista residual para esta muteína. Se
cree que estas propiedades antagonistas de IL-4 DM
son útiles para el tratamiento de enfermedades las cuales implican
desarrollo de T_{H2} y/o producción de IgE (Ryan, J., Allergy
Clin. Immunol. 99, 1-5, 1997).
Como se describe en diversas publicaciones, los
organismos procariotas se pueden usar para producir
IL-4 recombinante y muteínas de
IL-4. Desafortunadamente, los sistemas descritos
tienen un número de inconvenientes (expresión de bajo nivel, baja
estabilidad del vector de expresión) los cuales hacen la producción
a gran escala de IL-4 y muteínas de
IL-4 imposible o económicamente no factible.
Ptitsyn L.R. y Altman I.B.: Bulletin of
Experimental Biology and Medicine, vol. 119, nº. 1, enero 1995,
páginas 77-79; se titula "Recombinant
Escherichia coli strains provide high-level
expression of human Interleukin-3 and
Interleukin-4". La materia sujeto de la
presente invención difiere de esta cita en que un promotor T5 de
E. coli se refiere al operón reivindicado. La patente de los
Estados Unidos 4.689.409 se refiere a potenciación de expresión
microbiana de polipéptidos y Makrides S.C.: Microbiological
Reviews, vol. 60, nº. 3, septiembre 1996, páginas
512-538, se refiere a "Strategies for achieving
high-level expression of genes in Escherichia
coli".
Los criterios principales para un sistema de
expresión eficiente y segura son:
- \bullet
- producción de alto rendimiento
- \bullet
- expresión estable regulable
- \bullet
- estabilidad del vector de expresión.
Varias características de un plásmido de
expresión son importantes para los criterios enumerados
anteriormente (Hanning y col., TIBTECH. 16,
54-60, 1998). Estos son:
- \bullet
- promotor
- \bullet
- sitio de unión al ribosoma (rbs)
- \bullet
- uso de codon del gen correspondiente
- \bullet
- terminador transcripcional
- \bullet
- gen de resistencia
- \bullet
- regulación de expresión
- \bullet
- origen de replicación (ori).
Se generaron plásmidos de expresión de
IL-4 y muteínas de IL-4 con
modificaciones en todos los elementos relevantes para un sistema de
expresión eficiente y seguro. La calidad y adecuabilidad del sistema
de expresión correspondiente se evaluó principalmente de acuerdo
con los criterios siguientes:
- \bullet
- producción de IL-4 y muteínas IL-4
- \bullet
- estabilidad de plásmido
- \bullet
- mantenimiento de capacidad de inducción.
El objeto de la presente invención es, por lo
tanto, hacer disponible un procedimiento para la construcción y uso
de plásmidos de expresión en la elaboración a gran escala de
interleuquina-4 recombinante (IL-4)
y muteínas de interleuquina-4. Además el sistema
recién desarrollado huésped/vector sería bien adecuado para la
expresión de otras proteínas (citoquinas, factores de crecimiento,
receptores solubles, anticuerpos, etc.).
Sorprendentemente, se ha encontrado que
bacterias transformadas con plásmidos de acuerdo con la presente
invención dan velocidades de expresión, valores de estabilidad de
plásmidos y valores de estabilidad de expresión muchas veces
superiores a aquellos observados después de transformar los
huéspedes idénticos con plásmidos conocidos en la técnica. Por lo
tanto, los plásmidos de esta invención son con mucho más útiles para
la preparación de interleuquina-4 recombinante y
muteínas de interleuquina-4 que todos los plásmidos
previamente conocidos.
El sistema vector recién desarrollado contiene
los siguientes elementos:
\vskip1.000000\baselineskip
El promotor T5 de fago de E. coli
conjuntamente con dos secuencias de operador lac se deriva del
plásmido pQE30 (Quiagen) perteneciente a la familia de plásmidos
pDS (Bujard y col., Methods Enzymol. 155,
416-433, 1987 t Stüber y col., Immunological
Methods, I. Lefkovits y B. Pernis, eds. Academic Pres,
Inc., vol. IV, 121-152, 1990).
\vskip1.000000\baselineskip
El sitio de unión al ribosoma (rbs) se deriva de
la región anterior en la cadena del gen 10 del fago T7 (T7 g 10
líder). El gen 10 de fago T7 codifica para la proteína de cobertura,
la cual es la proteína principal expresada después de infección con
T7. El rbs de T7 g10 se obtuvo a partir del vector
pET-9a (Studier y col., Methods Enzymol.
185, 60-89, 1990). La secuencia líder de T7 g10
abarca ahora una región de aproximadamente 100 pares de bases
(Olins y col., Gene 227-225, 1998). En la
construcción de expresión final se elimina la región anterior en la
cadena del sitio XbaI. La secuencia líder de T7 g10 abarca ahora 42
pares de bases y cobija un intercambio de bases de G a A en
posición 3638 del plásmido preferido.
\vskip1.000000\baselineskip
Como una medida efectiva de la predisposición de
uso de codon sinónimo, el índice de adaptación de codones (CAI)
puede ser útil para predecir el nivel de expresión de un gen dado
(Sharp y col., Nucleic Acids Res. 15,
1281-1295, 1987 y Apeler y col., Eur. J.
Biochem. 247, 890-895, 1997). El CAI se calcula
como la media geométrica de los valores de uso de codones sinónimos
relativos (RSCU) correspondientes a cada uno de los codones usados
en un gen, divididos por el CAI máximo posible para un gen de la
misma composición de aminoácidos. Se calculan valores de RSCU para
cada codon a partir de genes expresados muy altamente de un
organismo particular, por ejemplo E. coli, y representan la
frecuencia observada de un codon dividido por la frecuencia esperada
bajo la asunción de uso igual de los codones sinónimos para un
aminoácido. Los genes altamente expresados, por ejemplo genes que
codifican proteínas ribosomales, tienen generalmente altos valores
de CAI \geq 0,46. Los genes pobremente expresados como lac1 y
trpR en E. coli tienen valores de CAI bajos \leq 0,3.
El valor de CAI de E. coli calculado para
la secuencia de IL-4 natural es 0,733. Esto prueba
que el gen natural sería adecuado para expresión alta en E.
coli. Sin embargo un gen sintético con uso de codon de E.
coli óptimo (valor de CAI = 1) tiene el potencial para
incrementar adicionalmente el nivel de expresión. Por lo tanto se
diseñan y clonan los genes de IL-4 sintética y
muteína de IL-4.
\vskip1.000000\baselineskip
Un fragmento de DNA de T7 que contiene el
terminador de transcripción T\Phi se deriva del vector
pET-9a (Studier y col., Methods Enzymol.
185, 60-89, 1990). Los terminadores
transcripcionales determinan los puntos donde se disocia el
complejo mRNA-RNA polimerasa-DNA,
terminando por lo tanto la transcripción. La presencia de un
terminador transcripcional al final de un gen altamente expresado
tiene varias ventajas: minimiza secuestro de RNA polimerasa que se
podría involucrar en transcripción innecesaria, restringe la
longitud de mRNA al mínimo, limitando así gasto de energía, como
transcripción fuerte puede interferir con el origen de replicación,
un terminador transcripcional incrementa estabilidad de plásmido
debido a mantenimiento de número de copias (Balbas y Bolivar,
Methods Enzymol. 185, 14-37, 1990).
El gen de resistencia a kan se deriva del vector
pET-9a (Studier y col., Methods Enzymol. 185,
60-89, 1990). Originalmente, este es el gel kan de
Tn903 del vector pUC4KISS (Barany, Gene 37,
111-123, 1985). En el plásmido preferido el gen kan
y el gen de IL-4 y el gen de la muteína de
IL-4 tienen orientaciones opuestas, así no debería
haber un incremento en producto de gen kan después de inducción
debido a transcripción de lectura a través del promotor T5. Se
eligió kanamicina como un marcador selectivo porque es el
antibiótico preferido para propósitos de GMP. Además, los vectores
basados en gen kan son más estables que plásmidos resistentes a
ampicilina (bla). La selección con ampicilina tiende a perderse en
cultivos según el fármaco se degrada por la enzima segregada
\beta-lactamasa. El modo de resistencia bacteriana
a kanamicina depende de una aminoglicósido fosfotransferasa que
inactiva el antibiótico.
\vskip1.000000\baselineskip
La expresión de genes controlada es
absolutamente necesaria para el establecimiento de un sistema de
plásmidos estable, particularmente si la proteína de interés es
deletérea para la célula huésped. El plásmido preferido usa un
sistema inducible basado en lac que consta de un gen represor lac
(lacI) y dos secuencias operadoras de lac sintéticas fusionadas más
adelante en la cadena que el promotor del fago T5 de E. coli.
El promotor lacI^{q} y el gen estructural lacI se aislaron a
partir del vector pTrc99A (Amman y col., Gene 69,
301-315, 1988). I^{q} es una mutación del
promotor la cual conduce a sobreproducción del represor lacI. El
represor lac que se da en la naturaleza es una molécula tetramérica
que comprende cuatro subunidades idénticas de 360 aminoácidos cada
una. El tetrámero del represor lac es un dímero de dos dímeros
funcionales. Las cuatro subunidades se mantienen juntas mediante un
haz de cuatro hélices formadas a partir de los residuos
340-360. Debido al aislamiento del gen lacI del
vector pTrc99A mediante un corte con NarI se eliminan los residuos
más allá del aminoácido 331 y se añaden 10 aminoácidos no
codificados normalmente en el gen lacI. Se sabe que pueden tener
lugar mutaciones o deleciones en la parte C-terminal
de lacI, más allá del aminoácido 329, dando como resultado dímeros
funcionales que aparecen fenotípicamente similares al represor que
se encuentra en la naturaleza (Pace y col., TIBS 22,
334-339, 1997).
\vskip1.000000\baselineskip
El origen de replicación (ori) del plásmido
preferido se deriva del vector pET-9a, el ori del
cual se origina a partir de pBR322. El plásmido preferido por lo
tanto lleva el replicón pMB1 (ColE1). Los plásmidos con este
replicón son plásmidos multicopia que se replican en una manera
"relajada". Se mantienen un mínimo de 15-20
copias de plásmido en cada célula bacteriana bajo condiciones de
crecimiento normales. El número actual para el plásmido preferido
está en este intervalo. La replicación del ori tipo Co1E1 es inicia
por un trascrito de RNA del nucleótido 555, RNA II, el cual forma
un híbrido persistente con su DNA de plantilla cerca del ori. El
híbrido RNA II-DNA se escinde después mediante RNAsa
H en el ori para producir un 3' OH libre que sirve como un cebador
para DNA polimerasa I. Este cebado de síntesis de DNA se regula
negativamente por RNA I, una molécula de RNA de 108 nucleótidos
complementaria al extremo 5' del RNA II. La interacción del RNA I
antisentido con RNA II causa un cambio conformacional en RNA II que
inhibe la unión de RNA II al DNA de plantilla y previene
consecuentemente la iniciación de síntesis de DNA plasmídico. La
unión entre RNA I y II se potencia mediante una proteína pequeña de
63 aminoácidos (la proteína Rop, siglas en inglés de Represora de
cebador), la cual está codificada por un gen situado 400 nucleótidos
más adelante en la cadena desde el origen de replicación (Sambrook
y col., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor, 1989). La
deleción del gen rop conduce a un incremento en número de copias y
debido a un efecto dosificador de gen a niveles de expresión
potenciados del plásmido codificó gen heterólogo. Esta observación
fue hecha también para los vectores de expresión de
IL-4 probados. Pero ello resulta en que los
plásmidos de rop son inestables y se pierden muy rápidamente
durante la fermentación bajo condiciones no selectivas. Por lo tanto
el replicón del plásmido preferido contiene el gen rop para
asegurar estabilidad plasmídica alta. El plásmido preferido carece
del gen mob que se requiere para movilización y es por lo tanto
incapaz de dirigir su propia transferencia por conjugación de una
bacteria a otra.
En el plásmido se eliminaron preferiblemente
todos los elementos no necesarios para la replicación plasmídica,
la resistencia y la expresión regulable.
Por ejemplo, se puede usar un gen de
interleuquina-4 natural o de muteína de
interleuquina-4 en lugar de uno sintético con uso
de codon de E. coli optimizado. El terminador de
transcripción preferido es T\Phi, pero se pueden usar también
otros terminadores como rrmB T2 o aspA.
Los procedimientos empleados en el transcurso
del establecimiento del sistema de expresión se dan a
continuación.
Las endonucleasas de restricción, la fosfatasa
alcalina intestinal de ternero, la polinucleótidoquinasa T4 y la
DNA ligasa T4 se compraron de Boehringer Mannheim y
GIBCO-BRL y se usaron como se recomendó por el
fabricante.
Se han descrito procedimientos de clonación
estándar en Sambrook y col. (Molecular Cloning, Cold Spring
Harbor, 1989). Las transformaciones se llevaron a cabo de acuerdo
con M. Scott (Seed y Aruffo, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84,
3365-3369, 1987). Como huéspedes para
transformaciones se usaron ante todo las cepas de E. coli
DH5\alpha (GIBCO BRL) y W3110 (ATCC 27325). El genotipo de W310
es K12, F, [N(rrnD-rrnE)]\lambda^{-}.
Los aislamientos a gran escala de DNA plasmídico
se llevaron a cabo con puntas de Quiagen (Quiagen). La extracción
de fragmentos de DNA a partir de geles de agarosa se llevó a cabo
usando Jetsorb (Genomed) como se recomienda por el
suministrador.
Los oligonucleótidos para mutagénesis dirigida a
sitio, las reacciones de PCR y secuenciación se obtuvieron de MGW
Biotech, Pharmacia Biotech o GIBCO BRL.
Los experimentos de mutagénesis se llevaron a
cabo mediante le procedimiento de Deng y Nickoloff (Deng y
Nickoloff, Anal. Biochem. 200, 81-88, 1992)
usando el sistema de "Mutagénesis por Eliminación de Sitio
Único" de Pharmacia Biotech. El cebador usado para la recreación
del rbs T7 g10 tiene la secuencia siguiente:
5'TCAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACATCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAA3'
\hskip0,25cm(Seq. 1).
Todas las construcciones y secuencias de DNA se
confirmaron usando Secuenciación de Ciclo Terminador de Tinción con
DNA polimerasa AmpliTaq, FS sobre un secuenciador ABI 313A (Applied
Biosystems).
La invención se explica en más detalle mediante
los siguientes ejemplos, figuras e información de secuencias:
Fig. 1 a Fig. 4: Construcción del plásmido de
expresión preferido. (Abreviaturas: IL-4 TM,
muteína triple IL-4; IL-4 DM,
muteína doble IL-4).
Fig. 5: Estabilidad de plásmidos de los
vectores de expresión de muteínas de IL-4 pRO21.1.O
y pRO2.1.O. El vector pRO2.1.O permanece totalmente estable durante
78 generaciones sin selección con antibióticos. En contraste el
vector de expresión pRO21.1.O, el cual se basa en el plásmido
comercialmente disponible pET-30a (Novagen), se
pierde muy rápidamente. Sólo el 16% de las colonias contienen el
plásmido después de 78 generaciones sin selección de
kanamicina.
Fig. 6: Mantenimiento de capacidad de inducción
y expresión del vector de expresión de muteínas de
IL-4 e IL-4 preferido.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
La prueba de estabilidad de plásmidos se comenzó
siempre con un cultivo congelado en nitrógeno líquido. Se determinó
la DO_{600} del cultivo descongelado, el cultivo se diluyó hasta
10^{-4} en tampón PBS y se plaqueó en placas de agar LB sin
antibiótico.
Se inoculó 1 ml de cultivo descongelado en 100
ml de medio peptona (peptona de soja 30 g, extracto de levaduras 20
g, KH_{2}PO_{4} 5 g, glicerol 20 g, MgSO_{4} x 7H_{2}O 1 g
por litro, pH 7,0) y se incubó a 37ºC con 280 rpm durante 24
horas.
Se determinó la DO_{600} del cultivo crecido,
el cultivo se diluyó hasta 10^{-6} en tampón PBS y se plaqueó en
placas de agar LB sin antibiótico para conseguir colonias bien
separadas.
Se inocularon 100 \mul del cultivo crecido en
100 ml de medio de peptona y se incubaron a 37ºC con 280 rpm
durante 24 horas. Este procedimiento se repitió ocho veces.
Se pusieron en rejilla 100 colonias bien
separadas sobre placas LB con kanamicina (25 \mug/ml) y placas LB
sin kanamicina y se incubaron a 37ºC durante toda una noche. El
porcentaje de colonias resistentes se determinó cada día.
El número de generaciones por día se calculó de
acuerdo con la siguiente fórmula: log[DO_{600 \
FINAL}/DO_{600 \ PRINCIPIO}]/
log 2.
log 2.
Para los estudios de expresión se diluyó 1 ml de
cultivo crecido 100 veces en medio LB y se manejó como se describe
(véase ejemplo 2).
Ejemplo
2
Para expresión a pequeña escala de
interleuquina-4 y muteínas de
interleuquina-4 las células se crecieron en medio
LB (bactotriptona 10 g, extracto de levadura 5 g, NaCl 10 g por
litro, pH 7,5) hasta que la DO_{600} alcanzó
0,8-1,0. Se indujo expresión por adición de IPTG a
una concentración final de 0,5 mM e incubación continuada durante 5
horas. Las células se cosecharon mediante centrifugación.
Para análisis de SDS-PAGE se
resuspendieron sedimentos de células en tampón de carga de
SDS-PAGE a una concentración de 1 unidad de
DO_{600}/100 \mul.
<110> Bayer AG
\vskip0.400000\baselineskip
<120> PLÁSMIDOS, SU CONSTRUCCIÓN Y SU USO
EN LA ELABORACIÓN DE INTERLEUQUINA-4 Y MUTEÍNAS DE
INTERLEUQUINA-4
\vskip0.400000\baselineskip
<130> Plásmidos para muteínas de
IL-4
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PantentIn Ver. 2.0
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 60
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Desconocido
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Organismo
Desconocido: cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptcaattgtga gcggataaca atttcacaca tctagaaata attttgttta actttaagaa
\hfill60
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4202
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Desconocido
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Descripción de Organismo
Desconocido: humano
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (4)
Hide Dependent
translated from
Claims (4)
Hide Dependent
translated from
1. Un vector para la elaboración de
IL-4 y muteínas de IL-4 en una cepa
de Escherichia coli, que comprende en orden de 5' a 3' los
siguientes elementos operativamente unidos: un promotor regulable
que consta del promotor del fago T5 de E. coli y dos
secuencias de operador lac, un sitio de unión al ribosoma del fago
T7 g10 de E. coli, un codon de partida traduccional, un gen
estructural para IL-4 o una muteína
IL-4 y más adelante en la cadena del gen
estructural un terminador de la transcripción.
2. Construcción de DNA la cual comprende la
secuencia de DNA mostrada en la Seq. ID Nº: 2.
3. Escherichia coli transformada con el
vector de la reivindicación 1 o con la construcción de DNA de la
reivindicación 2.
4. Uso del vector de acuerdo con la
reivindicación 1 o de la construcción de DNA de acuerdo con la
reivindicación 2 en un procedimiento de preparación de
IL-4 y muteínas de IL-4.