SK285603B6 - Vektor na výrobu IL-4 a muteínov IL-4 v kmeni Escherichia coli, vektor obsahujúci DNA sekvenciu, Escherichia coli transformovaná jedným alebo viacerými vektormi a použitie vektora - Google Patents
Vektor na výrobu IL-4 a muteínov IL-4 v kmeni Escherichia coli, vektor obsahujúci DNA sekvenciu, Escherichia coli transformovaná jedným alebo viacerými vektormi a použitie vektora Download PDFInfo
- Publication number
- SK285603B6 SK285603B6 SK76-2000A SK762000A SK285603B6 SK 285603 B6 SK285603 B6 SK 285603B6 SK 762000 A SK762000 A SK 762000A SK 285603 B6 SK285603 B6 SK 285603B6
- Authority
- SK
- Slovakia
- Prior art keywords
- vector
- escherichia coli
- muteins
- gene
- expression
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/54—Interleukins [IL]
- C07K14/5406—IL-4
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
- C12N15/72—Expression systems using regulatory sequences derived from the lac-operon
Abstract
Vektor na výrobu IL-4 a muteínov IL-4 v kemni Escherichia coli, pozostávajúci z operatívne spojených elementov v smere 5' k 3': regulovateľný promótor pozostávajúci z promótora fágu T5 Escherichia coli a dvoch lac operátorových sekvencií, väzbového miesta pre ribozóm z bakteriofágu T7g10 E.coli, iniciačného translačného kodónu, štruktúrneho génu pre IL-4 alebo muteín IL-4 a transkripčného terminátora za štruktúrnym génom. Do rozsahu riešenia patrí tiež Escherichia coli transformovaná jedným alebo viacerými týmito vektormi a použitie tohto vektora v metóde prípravy IL-4 a muteínov IL-4.
Description
Oblasť techniky
Vynález sa týka vektora na výrobu IL-4 a muteínov IL-4 v kmeni Escherichia coli, vektora obsahujúceho DNA sekvenciu znázornenú ako Seq. ID. NO. 2 pozri ďalej, Escherichia coli transformovaného jedným alebo viacerými týmito vektormi a použitie tohto vektora v metóde prípravy IL-4 a muteínov IL-4. Konkrétne sa vynález týka konštrukcie a použitia expresných plazmidov vo výrobe rekombinantného interleukínu-4 (IL-4) a muteínov IL-4.
Doterajší stav techniky
Zrelý ľudský interleukín-4 (IL-4) je zložený zo 129 aminokyselín aje z 50 % homológny s myším IL-4. IL-4 je jediný známy cytokín, ktorý riadi diferenciáciu pomocných T buniek na fenotyp TH2 (Mosmann a Sad, Immunol. Today 17, 138 - 146, 1996). IL-4 odovzdáva signál lymfocytom a ďalším bunkám cez heterodimerický aggkomplex dvoch receptorov cytokínu, IL-4Ra a bežný γ-reťazec (yc). V publikáciách podľa doterajšieho stavu techniky boli opísané antagonistické mutanty IL-4 (Kruse a kol., EMBO J., 11, 3237 - 3244, 1992). Tri aminokyseliny blízko C-konca (RI21, Y124 a S125) sú dôležité pre väzbu k yc-reťazcu. Zavedenie Asp (D) do týchto pozícií blokuje dimerizáciu receptora a prenos signálov cez membránu.
Dvojitý muteín interleukínu-4 (IL-4 DM) je variant IL4 s dvoma zmenami aminokyselín v pozíciách 121 a 124, nazvaná IL-4 R121D Y124D. IL-4 DM jc schopný blokovať obe aktivity IL-4 a IL-3. Na rozdiel od všetkých bodových mutantov žiadne zvyškové agonistické aktivity neboli pre tento muteín nikdy zistené. Predpokladá sa, že tieto antagonistické vlastnosti IL-4 DM sú užitočné pri liečení ochorení, ktoré zahrnujú vývoj TH2 a/alebo produkciu IgE (Ryan, J., Allergy Clin. Immunol. 99, 1 - 5, 1997).
Ako bolo opísané v rôznych publikáciách, na produkciu rekombinantného IL-4 a muteínov IL-4 sa môžu využiť prokaryotické organizmy. Bohužiaľ, opisované systémy majú rad nedostatkov (nízka hladina expresie, nízka stabilita expresného vektora), ktoré znemožňujú produkciu IL-4 a muteínov IL-4 vo veľkom meradle alebo sú ekonomicky nerealizovateľné.
Hlavné kritériá pre účinný a bezpečný expresný systém sú:
- vysoký výťažok produktu;
- regulovateľná stabilná expresia;
- stabilita expresného vektora.
Pre tieto uvedené kritéria sú dôležité niektoré znaky expresného plazmidu (pozri Hannig a koľ, TIBTECH. 16, 54-60, 1998). Sú to:
- promótor,
- ribozomálne väzbové miesto (rbs);
- využitie kodónu príslušného génu;
- transkripčný terminátor;
- gén pre rezistenciu;
- regulácia expresie;
- počiatok replikácie (ori).
Podstata vynálezu
Podstatou vynálezu je vektor na výrobu IL-4 a muteínov IL-4 v kmeni Escherichia coli, pozostávajúci z operatívne spojených elementov v smere 5' k 3': regulovateľný promótor pozostávajúci z promótora fágu T5 Escherichia coli a dvoch lac operátorových sekvencií, väzbo vého miesta pre ribozóm z bakteriofágu T7gl0 Escherichia coli, iniciačného translačného kodónu, štruktúrneho génu pre IL-4 alebo muteín IL-4 a transkripčného terminátora za štruktúrnym génom.
Do rozsahu tohto riešenia podľa vynálezu taktiež patri vektor obsahujúci DNA sekvenciu znázornenú ako Seq. ID. NO. 2, pozri ďalej.
Do rozsahu riešenia podľa vynálezu taktiež patrí Escherichia coli transformovaná jedným alebo viacerými uvedenými vektormi podľa vynálezu.
Do rozsahu riešenia podľa vynálezu taktiež patri použitie tohto vektora podľa vynálezu v metóde prípravy IL-4 a muteínov IL-4.
Podľa vynálezu boli vytvorené expresné plazmidy pre IL-4 a muteiny IL-4 s modifikáciami vo všetkých príslušných elementoch pre účinný a bezpečný expresný systém. Kvalita a vhodnosť príslušného expresného systému bola klasifikovaná hlavne podľa nasledujúcich kritérií:
- výťažok IL-4 a muteínov IL-4;
- stabilita plazmidu; a
- udržanie indukčnej schopnosti.
Cieľom predmetného vynálezu bolo preto vytvorenie metódy na konštrukciu na použitie expresného plazmidu na výrobu rekombinantného interleukínu-4 (IL-4) a muteínov interleukínu-4 vo veľkom meradle. Navyše by mal novo vytvorený systém hostiteľa/vektora byť vhodný na expresiu ďalších proteínov (cytokínov, rastových faktorov, rozpustných receptorov, protilátok atď.). Podľa predmetného vynálezu sa prekvapivo zistilo, že baktérie transformované plazmidom podľa tohto vynálezu poskytujú mnohonásobne väčšie rýchlosti expresie a stabilitu plazmidu a expresie, ako sa pozorovalo po transformácii rovnakého hostiteľa inými známymi plazmidmi z doterajšieho stavu techniky. Preto je použitie plazmidov podľa tohto vynálezu oveľa výhodnejšie na produkciu rekombinantného interleukínu-4 a muteínov interleukínu-4 v porovnaní so všetkými skôr známymi plazmidmi.
Novovyvinutý vektorový systém obsahuje nasledujúce prvky:
T5 promótor
Promótor bakteriofága T5 E. coli spoločne s dvoma lac operátorovými sekvenciami je odvodený z plazmidu pQE30 (Qiagen), patriaceho do skupiny plazmidov pDS (Bujard a kol., Methods Enzymol. 155, 416 - 433, 1987 a Stuber a kol., Immunological Methods, I. Lefkowits a B. Pemis, eds., Academic Press, Inc. Vol. IV, 121 - 152, 1990).
T7 glO ribozomálne väzbové miesto
Väzbové miesto ribozómu (rbs) je odvodené z oblasti pred génom 10 bakteriofága T7 (T7gl0 vedúcej sekvencie). Gén 10 fága T7 kóduje plášťový protein, ktorý je hlavným proteínom exprimovaným po infekcii fágom T7. T7 glO rbs sa získal z vektora pET-9a (Studier a kol., Methods Enzymol. 185, 60 - 89, 1990). T7 glO vedúca sekvenciazahrnuje oblasť okolo 100 bp (Olins et al., Gene 227 - 235, 1988). Vo finálnom expresnom konštrukte je oblasť pred Xbal miestom odstránená. T7 glO vedúca sekvencia teraz teda zahrnuje 42 bp a obsahuje zámenu jednej bázy z G na A v pozícii 3638 v tomto tu opisovanom plazmide.
Využitie kodónov prirodzenej sekvencie IL-4
Ako účinné meradlo využitia synonymných kodónov prirodzenej sekvencie môže byť index adaptácie kodónu (codon adaptation index - CAI) použitý na predpovedanie hladiny expresie daného génu (Sharp a kol., Nucleic Acids
Res. 15, 1281 - 1295, 1987 a Apeler a kol., Eur. J. Biochem. 247, 890 - 895, 1997). CAI sa počíta ako geometrický stred hodnôt relatívneho využitia kodónov (RSCU) zodpovedajúcich každému z kodónov použitých v géne, delené maximálnym možným CAI pre gén pre rovnaké aminokyselinové zloženie. RSCU hodnoty sú pre každý kodón počítané z veľmi vysoko exprimovaných génov určitého organizmu, napr. E. coli a reprezentujú pozorovanú frekvenciu kodónu delenú frekvenciou očakávanou za predpokladu rovnakého využitia synonymných kodónov pre aminokyselinu. Vysoko exprimované gény, napr. gény kódujúce ribozomálne proteíny, všeobecne majú vysoké hodnoty CAI > 0,46. Slabo exprimované gény ako lacl a trpR v E. coli majú nízke hodnoty CAI < 0,3.
Vypočítaná hodnota CAI v E. coli je pre prirodzenú sekvenciu IL4 0,733. To znamená, že prirodzený gén by mal byť vhodný pre vysokú hladinu expresie v E. coli. Ale má syntetický gén s optimálnym využitím E. coli kodónov (hodnota CAI = 1) potenciál k ďalšiemu zvýšeniu hladiny expresie. Preto boli navrhnuté a klonované syntetické gény pre IL-4 a muteíny IL-4.
Transkripčný terminátor
Fragment z T7 DNA obsahujúci transkripčný terminátor Τφ je odvodený z vektora pET-9a (Studier a kol., Methods Enzymol. 185, 60 - 89, 1990). Transkripčné terminátory určujú miesta, kde komplex mRNA-RNA polymerázaDNA disociujc, a tým končí transkripcia. Prítomnosť transkripčného terminátora na konci vysoko exprimovaného génu má niekoľko výhod. Minimalizuje nedostupnosť RNA polymerázy, ktorá by bola zahrnutá v nadbytočnej transkripcii, obmedzujú dĺžku mRNA na minimálnu potrebnú dĺžku, a tým obmedzuje výdaj energie. Vzhľadom na to, že silná transkripcia by mohla interferovať s počiatkom replikácie, zvyšuje terminátor transkripcie stabilitu plazmidu prostredníctvom udržania počtu kópií (Balbas a Bolivar, Methods Enzymol. 185, 14 - 37, 1990).
Gén kódujúci rezistenciu
Gén kanamycínovej rezistencie je odvodený z vektora pET-9a (Studier a kol., Methods Enzymol. 185, 60 - 89, 1990). Pôvodne ide o kan gén Tn903 z vektora pUC4KlSS (Barany, Gene 37, 111 - 123, 1985). V tu opisovanom plazmide je kan gén v opačnej orientácii ako gény pre IL-4 a muteín IL-4, takže nedochádza k zvýšeniu množstva produktu kan génu po indukcii v dôsledku prečítania terminátora transkripcie z T5 promótora. Kanamycín bol vybraný ako selekčný markér alebo je preferovaným antibiotikom pre GMP-účely. Navyše sú vektory založené na rezistencii ku kanamycínu stabilnejšie ako plazmidy s ampicilínovou (bla) rezistenciou. Selekcia na ampicilíne má tendenciu k stratám, lebo táto látka je degradovaná sekretovaným enzýmom: β-laktamázou. Spôsob bakteriálnej rezistencie ku kanamycínu závisí od aminoglykozidovej fosfotransfcrázy, ktorá inaktivuje antibiotikum.
Regulácia expresie
Kontrolovaná génová expresia je absolútne nevyhnutná na nastavenie stabilného plazmidového systému, najmä ak je požadovaný proteín zhubný pre hostiteľské bunky. Výhodný plazmid podľa predmetného vynálezu využíva indukovateľný systém založený na lac systéme pozostávajúcom z génu pre lac rcprcsor (ZecI) a dvoch syntetických sekvencií lac operátora predchádzajúcich vo fúzii promótor bakteriofága T5 E. coli. Promótor laclq a štruktúrny gén lacl bol izolovaný z vektora pTrc99A (Amman et al., Gene 69, 301 - 315, 1988). lq predstavuje promótorovú mutáciu vedúcu k nadprodukcii lacl represora. Lac represor štandardného typu je tetraméma molekula pozostávajúca zo štyroch identických podjednotiek každá s 360 aminokyselinami,. Tetramér lac represora je dimér dvoch funkčných dimérov. Štyri podjednotky sú držané spolu zväzkom štyroch helixov tvorených zvyškami 340 - 360. Pri izolácii lacl génu z vektora pTrc99A pomocou štepu Narl boli zvyšky za aminokyselinou 329 odstránené a pridalo sa 10 aminokyselín, ktoré nie sú normálne kódované lacl génom. Je známe, že mutácie alebo delécie prebiehajúce v C-terminálnej časti lacl, za aminokyselinou 329, poskytujú funkčné diméry, ktoré sa javia ako fenotypovo podobné štandardnému represoru (Pace a kol., TIS 22, 334 - 339, 1997).
Počiatok replikácie (ori)
Počiatok replikácie (ori) tu opisovaného plazmidu je odvodený z vektora pET-9a, ktorého ori pochádza z pBR322. Výhodný plazmid podľa predmetného vynálezu preto nesie pMBl (ColEI) replikón. Plazmidy s týmto replikónom sú mnohokópiové plazmidy, ktoré sa replikujú „relaxovaným” spôsobom. Za normálnych rastových podmienok sa v každej bakteriálnej bunke udržiava minimálne 15 20 kópií plazmidu. Bežný počet pre výhodný plazmid, opisovaný v tomto texte, je v tomto rozmedzí. Replikácia ori ColEl-typu je iniciovaná 555-nukleotidovým transkriptom RNA, RNAII, ktorý tvorí stabilný hybrid so svojím DNA templátom blízko ori. Hybrid RNA1I-DNA je potom štiepený RNázou H v ori za vzniku voľného 3ΌΗ, ktorý slúži ako primér pre DNA polymerázu I. Táto iniciácia syntézy DNA je negatívne regulovaná RNA I, čo je 108-nukleotidová molekula RNA komplementárna k 5' koncu RNA II. Interakcia antisense RNA I s RNA II spôsobuje konformačnú zmenu RNA II, ktorá inhibuje väzbu RNA II k DNA tcmplátu a následne bráni iniciácii syntézy plazmidovej DNA. Väzba medzi RNA I a II je zvýšená malým proteínom s veľkosťou 63 aminokyselín (Rop proteínom, Represor of primér), ktorý je kódovaný génom umiestneným 400 nukleotidov po smere transkripcie od začiatku replikácie (Sambrook a koľ, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor, 1989). Delécia rop génu vedie k zvýšeniu počtu kópií a prostredníctvom zvýšenia množstva génu k zvýšeniu hladiny expresie heterológnych génov kódovaných plazmidom. Toto sa zistilo rovnako v prípade skúšaných expresných vektorov pre IL-4. Ale ukázalo sa, že ropplazmidy sú nestabilné a pri fermentácii za neselektívnych podmienok dochádza k ich strate. Preto obsahuje replikón tu opisovaného plazmidu rop gén kvôli zaisteniu vysokej stability plazmidu. V opise predmetného vynálezu opisovanému plazmidu chýba mob gén, ktorý je nutný na mobilizáciu, a preto nie je schopný riadiť svoj vlastný konjugačný prenos z jednej baktérie do inej.
Vo výhodnom uskutočnení podľa predmetného vynálezu sú z plazmidu odstránené všetky prvky, ktoré nie sú nevyhnutné na jeho replikáciu, rezistenciu a reguláciu expresie.
V rozsahu predmetného vynálezu nemusia byť na konštrukciu expresného plazmidu podľa predmetného vynálezu použité všetky uvedené znaky. Napríklad namiesto syntetického génu na optimalizované využitie kodónov v E. coli sa môže použiť gén pre prirodzený interleukín-4 alebo muteín interleukínu-4. Transkripčný terminátor je vo výhodnom vyhotovení Τφ, ale rovnako možno použiť i ďalšie terminátory ako rmB T2 alebo aspA. Podobne je možné použiť na konštrukciu výhodného plazmidu podľa predmetného vynálezu prvky z iných ako tu opísaných, komerčne dostupných vektorov.
Metódy použité počas vývoja expresného systému sú uvedené.
Materiály a metódy Enzýmy
Reštrikčné endonukleázy, alkalická fosfatáza z teľacieho čreva, T4 polynukleotid kináza a T4 DNA ligáza boli získané od firmy Boehringer Mannheim a GIBCO-BRL a boli použité podľa odporučenia dodávateľa.
Metódy práce s rekombinantnou DNA
Štandardné klonovacie postupy boli opísané v Sambrook a kol., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor, 1989). Transformácie boli vykonané podľa M. Scott (Seed and Aruffo, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 3365 - 3369, 1987). Kmene E. coli DH5a (GIBCO BRL) a W3110 (ATCC 27325) boli použité primáme ako hostiteľské bunky. Genotyp W3110 je K12, F' [N(rmD-mnE)lambda’.
Na izoláciu vo veľkom meradle sa použili špičky „Qiagen-tips” (Qiagen). Extrakcia fragmentov DNA z agarózových gélov bola vykonaná s použitím Jetsorb (Genomed) podľa odporučenia dodávateľa.
Oligonukleotidy na riadenú mutagenézu, PCR reakcie a sekvenovanie pochádzali od MWG Biotech, Pharmacia Biotech alebo GIBCO BRL.
Pri experimentoch zameraných na mutagenézu bola použitá metóda Denga a Nickoloffa (Deng a Nickoloff, Anál. Biochem. 200, 81 - 88, 1992), používajúca systém „Mutagenéza s elimináciou unikátneho miesta” od Pharmacia Biotech. Primér používaný na znovuvytvorenie T7 glO rbs má nasledujúcu sekvenciu: 5'TCAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACATCTAGAAATAATTTTGTTTAAC TTTA AGAA3' (Sekv. 1).
Všetky konštrukty a sekvencie DNA boli potvrdené použitím sekvenovania terminačnou metódou s AmpliTaq DNA polymerázy, FS na ABI 373A sekvenátore (Applied Biosystems).
Vynález je detailnejšie vysvetlený nasledujúcimi príkladmi, obrázkami a informáciami o sekvenciách.
Prehľad obrázkov na výkresoch
Na obr. 1 až obr. 4 sú znázornené konštrukcie tu opisovaného expresného plazmidu. (Skratky: IL-4 TM, trojitý muteín IL-4, IL-4 DM, dvojitý muteín IL-4).
Na obr. 5 je znázornená plazmidová stabilita expresných vektorov muteínu IL-4 pRO21.1.0 a pRO.2.1.0. Vektor pRO2.1.0 zostáva celkom stabilný cez 78 generácií bez selekcie antibiotikami. Na rozdiel od tohto je expresný vektor pRO21.1.0, ktorý je založený na komerčne dostupnom plazmide pET-30a (Novagen), stratený veľmi rýchlo. Iba 16 % kolónií obsahuje plazmid po 78 generáciách bez kanamycínovej selekcie.
Na obr. 6 je znázornené udržanie schopnosti indukcie a expresie tu opisovaného expresného vektora IL-4 a muteínu IL-4.
Podľa tohto uskutočnenia bola vykonaná SDS-PAGE (15 %) analýza celkových extraktov z£ co/t7pRO2.1.0 pestovaných rôzny počet generácií bez selekcie antibiotikami 5 hodín po indukcii IPTG. 10 μΐ resuspendovaných bunkových peliet bolo aplikované do každej jamky. Elektroforéza prebehla za denaturačných podmienok a gél bol zafarbený pomocou Coomassie brilliant blue.
Vysvetlivky k obr. 6:
Dráha 1: Marker molekulových hmotností (Malý Rozsah, Life Technologies);
Dráha 2: IL-4 muteín (pg)
Dráha 3: E. co/z/pRO2.1.0 (8 generácií) pred indukciou; Dráha 4: E. co/í/pRO2.1.0 (8 generácií) po indukcii; Dráha 5: E. co/z/pRO2.1.0 (18 generácií) po indukcii; Dráha 6: E. co/í/pRO2.1.0 (28 generácií) po indukcii; Dráha 7: E. co/í/pRO2.1.0 (38 generácií) po indukcii; Dráha 8: E. co/z/pRO2.1.0 (48 generácií) po indukcii; Dráha 9: E. colilpR.02.1.0 (58 generácií) po indukcii; Dráha 10: E. co//7pRO2.1.0 (68 generácií) po indukcii; Dráha 11: E. co/z7pRO2.1.0 (78 generácií) pred indukciou; Dráha 12: E. co/z/pRO2.1.0 (18 generácií) po indukcii; Dráha 13: Marker molekulových hmotností (Malý Rozsah, Life Technologies);
Dráha 14: Marker molekulových hmotností (Malý Rozsah, Life Technologies).
Príklady uskutočnenia vynálezu
Príklad 1
Test stability plazmidu
Testy stability plazmidu boli vždy štartované kultúrou zmrazenou v tekutom dusíku. Po roztavení kultúry bola stanovená OD60o a kultúra bola zriedená na 104 PBS pufrom a potom bola rozotretá na misky s LB médiom stuženým agarom bez antibiotika.
Pri vykonávaní tohto testu bol 1 ml roztavenej kultúry inokulovaný do 100 ml peptónového média (30 g sójového peptónu, 20 g kvasničného extraktu, 5 g KH2PO4, 20 g glycerolu, 1 mg MgSO4 x 7 H2O na liter, pH 7,0) a inkubovaný pri 37 °C za trepania 280 rpm počas 24 hodín.
Stanovila sa OD600 narastenej kultúry, kultúra bola zriedená až do koncentrácie 104 v PBS pufri a potom bola rozotrená na misky s LB médiom stuženým agarom bez antibiotika, aby sa získali dobre oddelené kolónie.
100 μΐ narastenej kultúry bolo inokulované do 100 ml peptónového média a inkubované pri 37 °C za trepania 280 rpm počas 24 hodín. Tento postup bol opakovaný osemkrát.
100 dobre oddelených kolónií z LB misiek bolo očkované na LB misky s kanamycínom (25 pg/ml) a LB misky bez kanamycínu a inkubované pri 37 °C počas noci. Percentuálne zastúpenie rezistentných kolónií sa určovalo každý deň.
Počty generácií za deň sa vypočítali podľa nasledujúceho vzorca: log [OD600 eWOD600 Btoplog 2.
Pre expresné štúdie bol 1 ml narastenej kultúry zriedený 1 OO-krát LB médiom a nakladalo sa s ním podľa opisu (pozri príklad 2).
Príklad 2
Expresia
Na expresiu interleukínu-4 a muteínu interleukínu-4 v malom meradle boli bunky kultivované v LB médiu (10 g Bacto tryptónu, 5 g kvasničného extraktu, 10 g NaCl na liter, pH 7,5), kým OD600 nedosiahla 0,8 - 1,0. Expresia bola indukovaná prídavkom IPTG do finálnej koncentrácie 0,5 mM a inkubácia pokračovala počas 5 hodín. Bunky boli z média získané centrifugáciou.
Na SDS-PAGE analýzu sa bunkové pelety resuspendovali vo vzorkovom pufri pre SDS-PAGE do koncentrácie 1 jednotka OD600/1QO μΐ.
Sekvencie | |
<110> | Bayer A G |
<120> | PLAZMIDY, ICH KONŠTRUKCIA A ICH POUŽITIE PRI VÝROBE INTERLEUKÍNU-4 A MUTEINOV INTERLEUKÍNU-4 |
<130> | Plazmidy pre muteíny IL-4 |
<160> | 2 |
<170> | Patent In Ver. 2.0 |
<210> | 1 |
<211> | 60 |
<212> | DNA |
<213> <220> | neznámy |
<223> | Opis neznámeho organizmu: primér |
<400> | 1 |
tcaattgtga gcggataaca atttcacacatctagaaata atttgttta actttaagaa 60 | |
<210> | 2 |
<211> | 4202 |
<212> | DNA |
<213> | Neznámy |
<220> | |
<223> | Opis neznámeho organizmu: Človek |
<400> | 2 |
PATENTOVÉ NÁROKY
Claims (4)
1. Vektor na výrobu IL-4 a muteinov IL-4 v kmeni Escherichia coli, pozostávajúci z operatívne spojených elementov v smere 5' k 3': regulovateľný promótor pozostávajúci z promótora fágu T5 E. coli a dvoch lac operátorových sekvencii, väzbového miesta pre ribozóm z bakteriofágu T7gl0 E. coli, iniciačného translačného kodónu, štruktúrneho génu pre IL-4 alebo muteín IL-4 a transkripčného terminátora za štruktúrnym génom.
2. Vektor obsahujúci DNA sekvenciu znázornenú ako Scq. ID. NO.2.
3. Escherichia coli transformovaná jedným alebo viacerými vektormi podľa nároku 1 alebo 2.
4. Použitie vektora podľa nároku 1 alebo 2 v metóde prípravy IL-4 a muteinov IL-4.
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
EP99100967A EP1022339B1 (en) | 1999-01-20 | 1999-01-20 | Plasmids, their construction and their use in the manufacture of interleukin-4 and interleukin-4 muteins |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
SK762000A3 SK762000A3 (en) | 2000-08-14 |
SK285603B6 true SK285603B6 (sk) | 2007-04-05 |
Family
ID=8237378
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
SK76-2000A SK285603B6 (sk) | 1999-01-20 | 2000-01-19 | Vektor na výrobu IL-4 a muteínov IL-4 v kmeni Escherichia coli, vektor obsahujúci DNA sekvenciu, Escherichia coli transformovaná jedným alebo viacerými vektormi a použitie vektora |
Country Status (15)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US6506590B1 (sk) |
EP (1) | EP1022339B1 (sk) |
JP (2) | JP2000210091A (sk) |
KR (1) | KR100665148B1 (sk) |
AT (1) | ATE334202T1 (sk) |
AU (1) | AU772897B2 (sk) |
CA (1) | CA2294575C (sk) |
CZ (1) | CZ294279B6 (sk) |
DE (1) | DE69929638T2 (sk) |
DK (1) | DK1022337T3 (sk) |
ES (1) | ES2269027T3 (sk) |
HU (1) | HU224491B1 (sk) |
NO (1) | NO327317B1 (sk) |
PT (1) | PT1022337E (sk) |
SK (1) | SK285603B6 (sk) |
Families Citing this family (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE10022258A1 (de) | 2000-05-08 | 2001-11-15 | Bayer Ag | Reinigung von Proteineinschlusskörpern durch Querstrom-Mikrofiltration |
KR100443570B1 (ko) * | 2001-07-31 | 2004-08-09 | 크레아젠 주식회사 | 재조합 인간 인터루킨-4의 제조방법 |
EP1314739A1 (en) | 2001-11-22 | 2003-05-28 | Bayer Ag | Process for renaturation of recombinant, disulfide containing proteins at high protein concentrations in the presence of amines |
JP2006055082A (ja) * | 2004-08-20 | 2006-03-02 | National Institute Of Advanced Industrial & Technology | 発光甲虫由来赤色発光酵素安定体の生産及び精製法 |
Family Cites Families (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4689406A (en) * | 1983-08-10 | 1987-08-25 | Amgen | Enhancement of microbial expression of polypeptides |
AU597951B2 (en) * | 1986-03-27 | 1990-06-14 | Monsanto Company | Enhanced protein production in bacteria by employing a novel ribosome binding site |
ATE123526T1 (de) * | 1987-08-17 | 1995-06-15 | Hoffmann La Roche | Hochreprimierbare expressionskontrollsequenzen. |
FR2724665B1 (fr) * | 1994-09-16 | 1996-12-20 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Procede de production de proteines recombinantes, plasmides et cellules modifiees |
MY124565A (en) * | 1996-07-19 | 2006-06-30 | Bayer Corp | High-affinity interleukin-4-muteins |
-
1999
- 1999-01-20 EP EP99100967A patent/EP1022339B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1999-01-20 DE DE69929638T patent/DE69929638T2/de not_active Expired - Lifetime
-
2000
- 2000-01-07 AT AT00100129T patent/ATE334202T1/de active
- 2000-01-07 DK DK00100129T patent/DK1022337T3/da active
- 2000-01-07 ES ES00100129T patent/ES2269027T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2000-01-07 PT PT00100129T patent/PT1022337E/pt unknown
- 2000-01-14 JP JP2000006477A patent/JP2000210091A/ja active Pending
- 2000-01-14 US US09/483,419 patent/US6506590B1/en not_active Expired - Fee Related
- 2000-01-17 CA CA002294575A patent/CA2294575C/en not_active Expired - Fee Related
- 2000-01-19 KR KR1020000002310A patent/KR100665148B1/ko not_active IP Right Cessation
- 2000-01-19 CZ CZ2000214A patent/CZ294279B6/cs not_active IP Right Cessation
- 2000-01-19 NO NO20000262A patent/NO327317B1/no not_active IP Right Cessation
- 2000-01-19 SK SK76-2000A patent/SK285603B6/sk unknown
- 2000-01-20 AU AU12507/00A patent/AU772897B2/en not_active Ceased
- 2000-01-20 HU HU0000185A patent/HU224491B1/hu not_active IP Right Cessation
-
2010
- 2010-08-27 JP JP2010190917A patent/JP2010284174A/ja not_active Withdrawn
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
HU224491B1 (hu) | 2005-09-28 |
DK1022337T3 (da) | 2006-11-06 |
AU772897B2 (en) | 2004-05-13 |
ATE334202T1 (de) | 2006-08-15 |
DE69929638T2 (de) | 2006-09-21 |
CA2294575C (en) | 2009-04-07 |
SK762000A3 (en) | 2000-08-14 |
HU0000185D0 (en) | 2000-04-28 |
EP1022339B1 (en) | 2006-02-01 |
PT1022337E (pt) | 2006-11-30 |
HUP0000185A2 (en) | 2002-09-28 |
KR20000053523A (ko) | 2000-08-25 |
NO20000262D0 (no) | 2000-01-19 |
KR100665148B1 (ko) | 2007-01-09 |
DE69929638D1 (de) | 2006-04-13 |
CZ2000214A3 (cs) | 2000-08-16 |
NO327317B1 (no) | 2009-06-08 |
JP2000210091A (ja) | 2000-08-02 |
CA2294575A1 (en) | 2000-07-20 |
CZ294279B6 (cs) | 2004-11-10 |
EP1022339A1 (en) | 2000-07-26 |
ES2269027T3 (es) | 2007-04-01 |
US6506590B1 (en) | 2003-01-14 |
AU1250700A (en) | 2000-07-27 |
NO20000262L (no) | 2000-07-21 |
JP2010284174A (ja) | 2010-12-24 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US6291245B1 (en) | Host-vector system | |
CA1316850C (en) | Gram-positive expression control sequences | |
EP0972838B1 (en) | Escherichia coli host/vector system based on antibiotic-free selection by complementation of an auxotrophy | |
Paddon et al. | Expression of Bacillus amyloliquefaciens extracellular ribonuclease (barnase) in Escherichia coli following an inactivating mutation | |
Altenbuchner et al. | Tn1721-encoded tetracycline resistance: mapping of structural and regulatory genes mediating resistance | |
JPH10507368A (ja) | ヘテロローガスなポリペプチドを分泌させるための方法および組成物 | |
JP2010284174A (ja) | プラスミド、それらの構築およびそれらのインターロイキン−4およびインターロイキン−4ムテインの製造における使用 | |
MXPA04005717A (es) | Sistema de expresion. | |
KR100358948B1 (ko) | 인체 과립성 백혈구의 콜로니 자극인자를 분비하는 대장균 | |
EP1022337B1 (en) | Plasmids, their construction and their use in the manufacture of interleukin-4 and interleukin-4 muteins | |
US5654169A (en) | Vectors and transformed host cells for recombinant protein production at reduced temperatures | |
EP0121569B1 (en) | Novel vector | |
EP0105554A1 (en) | DNA and plasmids | |
CN113528415A (zh) | 一种nampt酶生产菌及其应用 | |
Kenri et al. | Construction and characterization of an Escherichia coli mutant deficient in the metY gene encoding tRNAf2Met: either tRNAf1Met or tRNAf2Met is required for cell growth | |
EP2109671B1 (en) | Expression cassette, use of the expression cassette, vector, host cell, a method for producing a polypeptide | |
Bendiak et al. | Fine-structure mapping of the rts, rplK, rplL, and rpoB genes of Escherichia coli | |
Roytrakul et al. | A Rapid and Simple Method for Construction and Expression of a Synthetic | |
Bryant | Phycobilisomes of Synechococcus sp. PCC 7002, Pseudanabaena sp. PCC 7409, and Cyanophora paradoxa: an analysis by molecular genetics | |
CN100379870C (zh) | 冷诱导的表达载体 | |
Beck et al. | The tetracycline-resistance transposon Tn10 inhibits translocation of Tn10 | |
EP1461437B1 (en) | Expression vectors and promoters for heterologous gene expression | |
Takebe et al. | In vitro construction of the tufB-lacZ fusion: analysis of the regulatory mechanism of tufB promoter | |
EP0217327A2 (en) | DNA Sequence encoding variant elongation factor 2 | |
KR20190026426A (ko) | 코돈 최적화된 il-21 및 이의 용도 |